Phân lập và tuyển chọn chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp chitinase để kiểm soát rệp muội hại cây trồng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---***--- VŨ THỊ THANH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE ĐỂ KIỂM SOÁT RỆ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-*** -

VŨ THỊ THANH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE ĐỂ

KIỂM SOÁT RỆP MUỘI HẠI CÂY TRỒNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-*** -

VŨ THỊ THANH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE ĐỂ

KIỂM SOÁT RỆP MUỘI HẠI CÂY TRỒNG

Chuyên ngành: Khoa học môi trường

Mã số: 60440301

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nghiêm Ngọc Minh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác Luận văn này là một phần nghiên cứu trong đề tài:

“Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế phẩm từ nấm Lecanicillium spp để diệt rệp muội (Aphididae) gây hại cây trồng” do TS Vũ Văn Hạnh làm chủ nhiệm đề tài,

được sự hỗ trợ bởi Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2010-2013

Tác giả

Vũ Thị Thanh

và thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới toàn thể cán bộ nhân viên Phòng Công nghệ Sinh học Môi trường và Phòng Các chất chức năng Sinh học, đặc biệt là

TS Vũ Văn Hạnh – chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế phẩm từ nấm Lecanicillium spp để diệt rệp muội (Aphididae) gây hại trên cây trồng” đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, tạo mọi điều kiện về vật

tư, hóa chất, thiết bị và chỉ bảo tận tình trong quá trình tôi thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để hoàn thành bản luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm bộ môn Công nghệ môi trường, các thầy cô Khoa Môi trường, trường đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong

suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó !

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Rệp muội hại cây trồng 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học của rệp muội hại cây trồng 3

1.1.2 Tình hình rệp muội hại cây trồng trên thế giới và Việt Nam 5

1.2 Thuốc diệt côn trùng có nguồn gốc sinh học 8

1.2.1 Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng trên thế giới 8

1.2.2 Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng ở Việt Nam 11

1.3 Nấm ký sinh côn trùng 12

1.4 Hệ enzyme chitinase từ nấm sợi 14

1.4.1 Định nghĩa 14

1.4.2 Cấu trúc của chitinase 14

1.4.3 Cơ chế hoạt động của chitinase 16

1.4.4 Cơ chất cảm ứng của chitinase 18

1.4.5 Các nguồn thu nhận chitinase 19

1.4.6 Ứng dụng của chitinase 20

1.5 Công nghệ lên men lỏng và lên men xốp 20

1.6 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitinase 22

1.6.1 Nguồn carbon 22

1.6.2 Nguồn nitơ 22

1.6.3 Độ ẩm cơ chất 23

1.6.4 Nhiệt độ nuôi cấy 23

1.6.5 pH môi trường 24

1.6.6 Cơ chất 24

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng 26

2.1.1 Nguyên liệu 26

2.1.2 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Phương pháp phân lập nấm 28

2.2.2.Sàng lọc chủng nấm ký sinh côn trùng có độc lực diệt rệp hại ngô cao 29

2.2.3 Chọn lọc chủng nấm ký sinh côn trùng có hoạt tính chitinase cao 30

2.2.4 Xác định hoạt tính chitinase của chủng nấm ký sinh côn trùng 31

2.2.5 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng nấm có độc lực diệt rệp hại ngô cao 32

2.2.6 Phương pháp phân loại nấm sợi dựa vào xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 18S rRNA 33

2.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm được lựa chọn 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm ký sinh côn trùng có độc lực diệt rệp muội hại ngô cao 38

3.2 Tuyển chọn chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao 41

3.3 Hình thái khuẩn lạc và hình thái bào tử của chủng nấm NM4 42

3.4 Xác định trình tự gene mã hóa 18S rRNA của chủng NM4 43

3.4.1 Tách chiết DNA tổng số của chủng nấm NM4 43

3.4.2 Nhân đoạn gene 18S rRNA của chủng NM4 44

3.5 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm Penicillium sp M4 46

3.5.1 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất 46

3.5.2 Ảnh hưởng của độ dày cơ chất 48

3.5.3 Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất 48

3.5.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 49

3.5.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ 51

3.5.6 Ảnh hưởng của pH môi trường lên men 51

3.5.7 Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ 52

3.5.8 Ảnh hưởng của thời gian lên men 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 2 THÔNG TIN CỦA CHỦNG NẤM PENICILLIUM SP M4 TRÊN NGÂN HÀNG GEN NCBI 70

PHỤ LỤC 3: CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN TỚI 71

LUẬN VĂN 71

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm 38

Bảng 2.2 Các loại môi trường cơ bản 38

Bảng 3.1 Các chủng nấm phân lập được trên môi trường PDA 38

Bảng 3.2 Hoạt tính chitinase của hai chủng nấm NM3 và NM4 42

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu tạo ngoài của rệp 3

Hình 1.2 Rệp ngô Aphis maydis 5

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 (A) và Glycohydrolase 19 (B) 15

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase 16

Hình 1.5 Cấu tạo hóa học của chitin 18

Hình 2.1 Đường chuẩn N-acetyl-β-D-glucosamine 31

Hình 3.1 Kết quả phun bào tử nấm lên rệp ngô 39

Hình 3.2 Độc lực diệt rệp của 6 chủng nấm 40

Hình 3.3 Hoạt tính chitinase của hai chủng nấm NM3 và NM4 41

Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc (A, B), hình thái bào tử (C) của chủng nấm NM4…42 Hình 3.5 DNA tổng số của chủng nấm NM4 43

Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm nhân đoạn gene mã hóa 18S rRNA của chủng NM4 44

Hình 3.7 Trình tự đoạn gene 18S rRNA của chủng nấm NM4 45

Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại của chủng nấm NM4 45

Hình 3.9 Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp M4 47

Hình 3.10 Khả năng phát triển của chủng nấm Penicillium sp M4 trên các nguồn cơ chất khác nhau sau 7 ngày lên men rắn 47

Hình 3.11 Ảnh hưởng của độ dày cơ chất (A), độ ẩm cơ chất (B) đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp M4 49

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất chitin đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp M4 50

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ (A), pH (B) đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp M4 51

Hình 3.14 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ vô cơ (A), nồng độ urê (B) đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp M4 53

Hình 3.15 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp M4 54

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

cm, mm, nm : Centimeters, millimeters, nanometers

PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

Taq-DNA polymerase : Thermus aquaticus DNA polymerase

TE : Đệm Tris – EDTA (Ethylennediaminetetraacetic)

MỞ ĐẦU

Rệp muội là loài côn trùng gây hại lớn đối với cây trồng nói chung và cây lương thực nói riêng Hàng năm, trên thế giới sản lượng nông nghiệp bị tổn thất do nạn rệp gây ra lên tới hàng tỷ đô la Đặc biệt, thế giới mỗi năm đã phải chi nhiều tỷ

đô la Mỹ để khống chế rệp muội phá hại cây trồng Trong số, các loài rệp muội gây

hại phải kể đến rệp ngô (Aphis maydis) là một loại sâu hại phổ biến trên toàn thế giới, chúng ký sinh trên nhiều loại cây trồng như lúa miến (Sorghum), ngô, mía và

lúa mì… với mật độ cao sẽ làm giảm sản lượng hạt và lây truyền virus gây bệnh Rệp có thể trích hút nhựa, làm tổn thương ở tất cả các bộ phận khác nhau của cây dẫn tới giảm năng suất, chất lượng hạt [29] Mặt khác chúng còn là môi giới truyền virus gây một số bệnh cho cây bắp như potyvirus, virus màu vàng, bệnh vàng lùn, bệnh khảm lá, bệnh đỏ lá Do tính chất gây hại của rệp ngô, việc sử dụng các biện pháp phòng trừ rệp ngô là rất cần thiết

Một trong những phương pháp mà nhân dân ta hay sử dụng là dùng thuốc bảo vệ thực vật hóa học để khống chế các nạn dịch bệnh và sâu hại đã tỏ ra có hiệu quả Tuy nhiên, việc gia tăng và thường xuyên sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong những năm gần đây đã ảnh hưởng không nhỏ đến côn trùng có ích, động vật hoang dã, làm ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người Nông nghiệp nước ta đang hướng tới một nền nông nghiệp sạch, nông nghiệp sinh thái, trong đó biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp là nòng cốt Việc sử dụng biện pháp sinh học phòng chống sâu hại cây trồng như nấm ký sinh côn trùng, thiên địch đang mở ra một hướng đi mới trong sản xuất nông nghiệp bởi ưu điểm vượt trội là phát tán rất nhanh và chỉ gây hại trên côn trùng có hại, không gây hại tới nguồn nước môi trường sinh thái và sức khỏe con người, vật nuôi

Nấm ký sinh côn trùng gây bệnh theo con đường chính là bào tử nảy mầm phát triển thành hệ sợi ăn sâu vào khoang bụng, qua đường tiêu hóa, thông qua các khí quản và sợi nấm phủ kín các lỗ khí côn trùng làm chúng chết Nấm còn gây

chitinase thủy phân vỏ và mô cơ quan của côn trùng [44] Hiện nay, trong nhóm enzyme thủy phân, chitinase đang rất được quan tâm vì nó có khả năng thủy phân chitin- nguyên liệu cơ bản cấu thành nên lớp vỏ côn trùng Trong quá trình

ký sinh côn trùng, việc tiết ra chitinase càng mạnh thì tốc độ diệt côn trùng càng nhanh và hiệu quả cao, tiết kiệm thời gian Dựa vào đặc tính này của nấm, việc nghiên cứu cải biển tăng tổng hợp chitinase nhằm tạo ra một lượng lớn enzyme bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất cần thiết

Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp chitinase để kiểm soát rệp muội hại cây trồng” đã được thực hiện

 Mục tiêu của đề tài

Tuyển chọn được chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng diệt rệp muội hại ngô mạnh và tối ưu các điều kiện môi trường sinh tổng hợp cao sản chitinase bởi chủng nấm chọn lọc

 Nội dung nghiên cứu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng diệt rệp muội hại ngô

- Xác định hoạt tính chitinase của chủng nấm ký sinh côn trùng có độc lực diệt rệp hại ngô cao

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng nấm có độc lực diệt rệp muội hại ngô cao

- Phân loại, định tên chủng nấm ký sinh côn trùng có độc lực diệt rệp hại ngô cao dựa vào trình tự đoạn gene mã hóa 18S rRNA

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm được chọn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Rệp muội hại cây trồng

1.1.1 Đặc điểm sinh học của rệp muội hại cây trồng

Trong các loài sâu hại cây trồng có thể nói rệp là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất thế giới, phân bố tập trung nhất ở vùng ôn đới [36], rệp cũng phân bố khá phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới với độ đa dạng thấp hơn Ước tính trên thế giới có khoảng 4000 loài rệp muội đã được phát hiện trong đó vùng Đông Nam Á có hơn 1000 loài Trong số này có khoảng 250 loài rệp

là côn trùng phá hoại nguy hiểm đối với nông, lâm nghiệp cần được kiểm soát [26] Các loài thuộc họ rệp muội gây hại mạnh trong nông nghiệp phải kể đến như: rệp

đào (Myzus persicae) gây hại trên cải, rệp bông (Aphis gossypii) gây hại trên cây bông, rệp muội hại ngô (Aphis maydis) gây hại trên cây ngô…

Các loài thuộc họ rệp muội (Aphididae) có thân mềm, màu sắc khác nhau, từ màu xanh lá cây, vàng, nâu, đen, hồng hoặc hầu như không có màu Rệp muội có kích thước rất nhỏ (từ 1-2 mm), hình quả lê, trần trụi, ở cuối bụng có phiến đuôi và

2 ống bụng ở 2 bên, có ba cặp chân phân đốt, mắt kép và một cặp râu, cơ thể được bao bọc bởi bộ khung kitin Rệp có lớp biểu bì mềm, có cánh (dạng màng) hoặc không cánh [3] (hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu tạo ngoài của rệp

Phương thức dinh dưỡng của rệp là chích hút nhựa cây bằng miệng Chúng làm yếu cây bằng cách hút cạn nguồn dinh dưỡng và gây ảnh hưởng nghiêm trọng

Râu

Mắt

Ống tiết

Đuôi Đầu

Chân

Bụng

Ngực

cho sự phát triển của cây Chúng tiết ra chất đường mật không chỉ làm đóng khí khổng của lá mà còn góp phần tăng sự phát triển của mốc đen, làm ngăn cản ánh sáng đến các mô quang hợp, ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất cây trồng Thêm vào đó, các loài rệp còn là những phương tiện góp phần lây lan virus từ những cây bệnh sang các cây khỏe mạnh [27]

Rệp sinh sản bằng hai hình thức: đơn tính và hữu tính (là sự kết hợp giữa các

cá thể khác nhau tạo ra trứng để tồn tại qua mùa đông) Tại vùng nhiệt đới, chu kỳ sinh trưởng của rệp muội rất ngắn từ 5-7 ngày [3] Mỗi rệp cái đẻ trung bình 30-50 con, quá trình sinh con lặp đi lặp lại trong suốt mùa hè, sinh ra nhiều thế hệ Trong điều kiện nhiệt độ 20-30o

C một năm có thể tới 20-30 thế hệ Tuy nhiên, vòng đời của rệp muội tương đối ngắn, phần lớn từ 15-20 ngày, cá biệt là 25-30 ngày Các loài rệp muội có thể phát triển trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm khá rộng, có một

số loài như rệp cải phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ 10-30oC

Rệp muội là những loài côn trùng có sức tàn phá khủng khiếp trên nhiều loại cây trồng khác nhau như ngô, khoai tây, khoai lang, các cây họ dưa (cucurbitaceae) (dưa chuột, dưa tây, dưa hấu, bầu bí), họ cà (solanaceae) (như ớt chuông, cà tím, thuốc lá, cà chua), cam quýt, bông vải, đào, mận, mơ, táo, bắp cải, cải xanh, rau bina, rau diếp, cà rốt và họ cà rốt Chúng đã gây thiệt hại hàng tỷ đô la Mỹ mỗi năm do cây cho năng suất kém hoặc mất mùa Mặt khác, thế giới mỗi năm cũng phải chi nhiều tỷ đô la Mỹ để khống chế rệp muội phá hại cây trồng Rệp muội gây hại bốn mùa, đặc biệt từ mùa xuân đến mùa thu, nhất là vào thời điểm thời tiết râm mát, độ ẩm không khí cao

Rệp ngô có tên khoa học là Aphis maydis, thuộc họ rệp muội, là một trong

những loại sâu hại quan trọng đối với người trồng ngô Rệp hút nhựa ở trên nõn ngô, bẹ lá, bông cờ, lá bi, làm cho cây ngô mất hết dinh dưỡng, trở nên gầy yếu, bắp

bé đi hoặc không hình thành bắp nếu bị hại từ giai đoạn cây còn nhỏ, chất lượng hạt xấu kém Rệp phá hại làm giảm năng suất và phẩm chất ngô rõ rệt Ngoài cây ngô chúng còn có nhiều loại cây ký chủ khác như: kê, cao lương, mía, cỏ trồng làm thức

ăn cho gia súc… Mặt khác chúng còn là môi giới truyền virus gây một số bệnh cho

cây bắp như potyvirus, virus màu vàng, bệnh vàng lùn, bệnh khảm lá, bệnh đỏ lá…

[17]

Trong quần thể rệp thường thấy nhiều loại hình: Rệp cái không cánh, rệp cái

có cánh và rệp con Rệp trưởng thành có hai loại hình, rệp có cánh và rệp không cánh dài 1,5-2,3 mm, màu vàng nhạt hoặc xanh xám, cơ thể hình bầu dục, thân mềm Chân và tuyến tiết sáp ngắn, màu xanh đen Rệp cái có cánh có đầu, ngực màu đen và bụng màu xanh Rệp non màu xanh sáng, chân và tuyến tiết sáp giống như trưởng thành có màu đen (hình 1.2) Rệp non trải qua 7-10 lần lột xác mới thành rệp trưởng thành Một năm có từ 7-10 lứa

Hình 1.2 Rệp ngô Aphis maydis

Rệp ngô sinh sản theo lối đơn tính và đẻ con Chúng thường đẻ nhiều nhất ở nhiệt độ 30oC và đẻ ít nhất ở nhiệt độ 15o

C [25] Rệp ngô thường phát triển nhiều trong tháng 1 và tháng 2 lúc độ ẩm không khí cao Từ tháng 4 trở đi số lượng rệp giảm dần Trong mùa hè chỉ thấy rệp xuất hiện lẻ tẻ Rệp thường phá hại ở cây ngô

từ giai đoạn 8-10 lá cho tới khi ngô chín sáp Đến cuối vụ khi cây ngô đã già, không còn thức ăn nữa thì các con rệp có cánh di chuyển sang các cây ký chủ, đẻ ra rệp con không có cánh tiếp tục phát triển trên các cây ký chủ này cho tới vụ ngô sau

1.1.2 Tình hình rệp muội hại cây trồng trên thế giới và Việt Nam

Trên thế giới, rệp đang được coi là kẻ thù nguy hiểm đối với cây trồng Rệp cây hại tại nhiều quốc gia và không cố định trong một vùng nhất định Những thiệt hại do rệp gây ra đang ngày càng nghiêm trọng và diễn ra trên diện rộng Sản lượng nông nghiệp thế giới hàng năm bị thiệt hại khoảng 15% do côn trùng [33], ở Mỹ là 13% [59] Mặc dù chưa có thống kê chính thức về thiệt hại nông nghiệp do rệp nhưng trong số 300 loài côn trùng gây hại nghiêm trọng [49] thì có đến 250 loài là rệp Chúng là tác nhân chính gây hại ở nhiều loại cây trồng quan trọng như bông, đậu tương, hướng dương, củ cải đường, khoai tây, ngô, ngũ cốc và rau cải

Theo nghiên cứu của các nhà côn trùng học Úc, ngành du lịch nước này đã thiệt hại 75 triệu USD/năm do nạn rệp hoành hành Tình trạng nạn rệp lan tràn ở xứ

sở này chỉ là một phần của đại dịch toàn cầu với số lượng rệp trên thế giới đã tăng lên gấp đôi mỗi năm Các nhà côn trùng học cho biết, nguyên nhân là việc thay đổi biện pháp diệt côn trùng (không dùng thuốc xịt mà dùng mồi) và do sự gia tăng đáng kể lượng du khách đến từ các nước đang phát triển, nơi rệp vẫn còn đang hoành hành

Tại châu Á, rệp gây thiệt hại nghiêm trọng một số loại cây trồng, đặc biệt là

dưa chuột, hại tiêu và cà chua Các rệp đào Myzus persicae thường phát triển nhanh

trong mùa vụ và phát triển nhanh chóng đến tuổi trưởng thành nên tăng nhanh về số lượng Ước tính thiệt hại hàng tỷ đô la Mỹ mỗi năm do nạn rệp hoành hành Tại 3 tỉnh của Thái Lan, trong tháng 7/2009 nạn rầy nâu hại lúa, rệp hại cây trồng đã bùng phát mạnh và gây thiệt hại khoảng 7,5 ngàn ha mỗi vụ

Đậu tương là loại hạt dầu được trồng nhiều nhất trên thế giới, nhưng năng

suất bị đe dọa nghiêm trọng bởi Aphis glycines (rệp đậu tương) Sản lượng hạt bị

thiệt hại ước tính khoảng 34% [65], theo tính toán của Catangui và cộng sự (2009), con số thiệt hại thậm chí lên đến 48-72% Nguyên nhân do rệp chích hút có thể làm giảm 50% tốc độ quang hợp của lá cây [30]

Lipaphis erysimi (rệp cải dầu) ký sinh trên một số loài cây nhưng chủ yếu là

các loại cải và cải dầu Ngoài ra nó còn ký sinh trên cà chua và bí xanh Ở phía

đông của miền Trung Ấn Độ, Lipaphis erysimi cùng với Myzus persicae và Brevicoryne brassicae là ba loại rệp nguy hiểm đối với cây cải dầu (Brassica juncea) Trong đó Lipaphis erysimi phá hoại nhiều nhất, riêng nó gây thiệt hại 35,4-

91,3 % sản lượng [28] Theo nghiên cứu của Patel và cộng sự (2004), nếu không có

biện pháp bảo vệ, Lipaphis erysimi có thể gây thiệt hại 80,6-97,6% sản lượng cải

dầu [57] Trong một nghiên cứu khác, Razaq và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng,

Lipaphis erysimi và Brevicoryne brassicae cũng gây thiệt hại 75,1-81,9% sản lượng cải dầu ở Multan, Punjab, Pakistan [64] Ngoài cải dầu, Brassica brassicae còn phá

hoại nhiều cây quan trọng khác như súp lơ, cà rốt và củ cải

Rệp làm giảm năng suất cây trồng không chỉ do phá hoại trực tiếp mà còn do

truyền virus gây bệnh rụng lá ở đậu lăng, đậu răng ngựa, đậu gà [54] Myzus persicae là loại nguy hiểm nhất trong 10 loại rệp truyển bệnh virus gây bệnh rụng lá

ở khoai tây Rệp truyền virus gây bệnh khảm có thể làm thiệt hại 60% năng suất dưa chuột [71] Không những phá hoại rau và cây công nghiệp, rệp còn là côn trùng

nguy hiểm đối với cây lương thực Diuraphis noxia (rệp lúa mì Nga) chuyên phá

hoại lúa mì, lúa mạch đen, lúa mạch trắng, yến mạch Theo nghiên cứu của Akhtar

và cộng sự (2010), năng suất lúa mì có thể bị giảm 7,9-34,2 % do Diuraphis noxia

(rệp lúa mì Nga) phá hoại [21]

Như vậy với nguy cơ làm giảm năng suất cây trồng của rệp, yêu cầu phải có biện pháp kiểm soát rệp để bảo vệ mùa màng là cấp thiết Biện pháp kiếm soát rệp

và các loại côn trùng khác được áp dụng chủ yếu trong nhiều thập kỷ qua là sử dụng hóa chất diệt côn trùng tổng hợp Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học đã

và đang làm phá hủy môi trường sống xung quanh và ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của người nông dân

 Tình hình rệp muội hại cây trồng ở Việt Nam

Theo số liệu thống kê ở Việt Nam nếu mỗi năm công tác phòng trừ dịch hại không tốt thì bị hao hụt từ 3-10% sản lượng nông sản dự trữ

Theo nghiên cứu và thống kê của các nhà khoa học, nước ta chịu sự tấn công của hơn 250 loài rệp khác nhau Tại Ninh Thuận và Bình Thuận có tới 25 loài cây trồng đã bị tấn công bởi rệp muội bông Rệp muội bông phát sinh, phát triển quanh năm, gây thiệt hại nghiêm trọng cho năng suất bông Rệp muội bông gây hại phổ biến trên cây mãng cầu xiêm ở Bình Chánh, thành phố Hồ Chí Minh Trong quá trình điều tra nghiên cứu 2 năm gần đây (2008-2010) đã ghi nhận được rệp muội bông gây hại trên cây bằng lăng nước rất phổ biến Rệp muội bông gây hại nặng cây bằng lăng nước trong giai đoạn vườn ươm làm cho ngọn non mang lá bị dị dạng, lá

bị cong gây tổn thất giá trị kinh tế đáng kể cho nhà vườn, làm ảnh hưởng lớn đến kế hoạch nhân giống cây

Theo thống kê các loài gây hại cho cây trồng ở nước ta trong những năm gần đây, rệp đào đang là mối đe dọa cho ngành nông nghiệp với sự gia tăng nhanh chóng về diện tích và số lượng cây trồng bị hại Chúng có thể gây hại trên 300 loài cây trồng khác nhau, trong đó thường thấy trên các cây như: các loại rau họ thập tự (cải trắng, cải củ, cải xanh, cải bắp), một số cây ăn quả như đào, hồng, lê, mận Trong điều kiện nước ta, rệp đào có thể xuất hiện và gây hại quanh năm, trong đó tập trung nhiều khi thời tiết dịu mát, độ ẩm cao vào tháng 4-5 (vụ đông xuân) và tháng 9-10 (vụ thu đông)

Vụ đông xuân 2010-2011, huyện Tân Kỳ - Nghệ An gieo trỉa 1500 ha ngô, nhưng đến có tới hơn 80% diện tích ngô của địa phương đã xuất hiện bệnh rệp cờ gây hại Không chỉ có xã Tân Kỳ mà xã Nghĩa Dũng cũng là một trong những địa phương có diện tích ngô bị nhiễm bệnh rệp cờ khá lớn Vụ đông xuân năm nay toàn

xã gieo trỉa 240 ha ngô, cơ cấu giống chủ yếu là C919, nhưng đã có tới 90 ha xuất hiện bệnh rệp cờ

1.2 Thuốc diệt côn trùng có nguồn gốc sinh học

1.2.1 Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng trên thế giới

Trên trái đất có khoảng 1 triệu loài côn trùng, trong đó có khoảng 5 vạn loại

ăn thực vật và chỉ có khoảng 1% (khoảng 500 loài côn trùng) chuyên ăn hoa màu,

cây ăn quả Tuy số lượng chủng loại không nhiều nhưng chúng rất phàm ăn và ăn rất khoẻ, gây tác hại rất lớn đối với cây lương thực, rau xanh, cây ăn quả Rệp muội (trong đó có rệp ngô) và bọ cánh trắng là những côn trùng gây hại cây trồng rất nghiêm trọng trong nhà kính trên toàn thế giới Chúng gây thiệt hại nặng nề trên nhiều loại cây trồng, đặc biệt trên các cây như dưa chuột, rau cải, ngô… Chúng tăng

số lượng rất nhanh và truyền virut từ cây bệnh sang cây khỏe mạnh

Để kiểm soát chúng, thuốc trừ sâu hóa học được bà con nông dân sử dụng tràn lan với liều lượng cao làm cho các loài côn trùng gây hại biến đổi nhanh chóng

và kháng thuốc Hiệu quả của việc sử dụng thuốc ngày càng thấp ngược lại với chi phí ngày càng cao [31] Thuốc trừ sâu hóa học không chỉ tiêu diệt các loài côn trùng gây hại mà còn tiêu diệt cả những loài có ích như động vật ăn côn trùng, các loài ký sinh côn trùng gây hại cây trồng [59] Mặt khác, phần lớn thuốc diệt côn trùng có thời gian phân hủy lâu, sau khi được phun cho cây trồng sẽ thẩm thấu một phần vào đất và các mạch nước ngầm Các chất này khi đã ngấm vào đất và nước ngầm sẽ tồn tại lâu dài và ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường sống, sức khỏe con người, gia súc và các loài sinh vật khác, đặc biệt là các động vật sống trong nước như cá, tôm, cua và các loài thủy sinh khác Trước thực trạng đó, rất nhiều nước đang cố gắng làm giảm bớt việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học trong nông nghiệp Hơn nữa, kiểm soát sinh học đang là một phương pháp thay thế hiệu quả, bao gồm việc dùng nấm

ký sinh côn trùng (tức sử dụng tác nhân gây bệnh là nấm để tiêu diệt các loài côn trùng) [40]

Việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học có những đặc tính nổi bật sau:

Ưu điểm: (a) Không tạo nên tính kháng thuốc của sâu hại cây trồng, nếu

dùng liều lượng cao (b) Không độc hại cho người và gia súc, không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng đến chất lượng nông sản, không tác dụng tiêu cực đến đất trồng (c) Hiệu quả thuốc vi sinh thường kéo dài vì chúng không chỉ tiêu diệt trực tiếp lứa sâu đang phá hoại mà chúng còn có thể lan truyền cho thế hệ tiếp

các loài thiên địch hữu ích (e) Nếu sử dụng hợp lý, đúng kỹ thuật mang lại hiệu quả kinh tế cao

Nhược điểm: (a) Tác dụng của thuốc trừ sâu vi sinh chậm nên hiệu quả chậm

vì thuốc trừ sâu vi sinh thường có quá trình gây bệnh và nhiễm bệnh khi vào cơ thể sâu thì thời gian ủ bệnh phải mất 1-3 ngày (b) Hiệu quả của thuốc ban đầu không cao, phổ tác dụng của thuốc còn hẹp (c) Một vài loại thuốc trừ sâu vi sinh bị ảnh hưởng bởi điều kiện thời tiết như độ ẩm không khí, gió, ánh sáng mặt trời Nếu như phun trừ sâu không đúng kỹ thuật, phun trong điều kiện không thích hợp sẽ khó đạt hiệu quả cao (d) Giá thành cao và việc bảo quản còn gặp khó khăn

Một số chủng nấm diệt côn trùng mạnh như Beauveria sp., Metarhizium sp., Paecilomyces sp., Nomuraea sp., Verticillium sp., đã được sử dụng làm chất trừ sâu

sinh học ở một số nước trên thế giới Ở các nước như Liên Xô cũ, Mỹ, Anh chi nấm

Beauveria dùng để sản xuất chế phẩm có tên Beauverin, ở Việt Nam có tên thương mại là Beauverit từ chủng Beauveria spp Bào tử nấm Metarhizium anisopliae đã

được phối chế tạo sản phẩm có tên gọi thương mại là “BioBlast” được sử dụng để kiểm soát mối, mọt, côn trùng gây hại [63] Cho đến nay, kết quả nghiên cứu chỉ ra

rằng một số chủng nấm thuộc hai loài nấm Beauveria sp và Metarhizium sp có

tiềm năng rất mạnh để gây bệnh, diệt côn trùng, bướm gây hại ở trên đồng ruộng Tuy nhiên, các nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm này dùng để diệt côn trùng trên đồng ruộng thì rất ít Việc sử dụng bào tử nấm ký sinh côn trùng để xử lý đất trồng cây, để kiểm soát côn trùng có cánh gây hại đã được đề cập [35, 74]

Hiện nay, các nghiên cứu về các chủng nấm Lecanicillium spp được sử dụng

để kiểm soát côn trùng gây hại cây trồng cũng đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu bởi khả năng diệt côn trùng của chúng rất cao Vi nấm

Lecanicillium spp ký sinh trên nhiều loại côn trùng bao gồm bộ cánh đều, bộ cánh cứng, cánh thẳng và bướm [39] Việc sử dụng bào tử nấm Lecanicillium spp đã rất

được quan tâm để kiểm soát côn trùng và sâu bệnh hại cây trồng Bên cạnh đó, giun tròn nang gây hại đậu tương, nấm mốc gây hại dưa chuột và các loại nấm gỉ gây hại

cây hoa cúc cũng có thể được kiểm soát bởi loại nấm này [46] Hơn nữa,

Lecanicillium spp đã được chứng minh có độc tính rất mạnh đối với một số loài rệp muội như rệp đào (Myzus persicae), rệp bông (Aphis gossypii) và Macrosiphum euphorbiae [22], do đó tại Anh, Mỹ và một số nước khác đã nghiên cứu và có chế phẩm thương mại như Vertalec® từ bào tử nấm Lecanicillium longisporum diệt các loài rệp muội, rệp chích hút nhựa cây Ngoài ra, Lecanicillium đã được chứng minh

rằng, nó có các hoạt động chống nấm mốc gây bệnh phấn trắng trên nhiều loại cây trồng [47], diệt các ký sinh trùng khác hại cây trồng như sâu, bọ [37]

1.2.2 Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng ở Việt Nam

Tại Việt Nam quy trình sử dụng vi nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria brassiana đã được nghiên cứu khá thành công và được sản xuất thành

một số chế phẩm Chế phẩm từ hai loại nấm này giúp bảo vệ môi trường và tạo thêm một số mô hình kinh tế mới như trồng lúa kết hợp nuôi tôm Sử dụng biện pháp sinh học này giúp việc kiểm soát rầy nâu giảm bớt chi phí so với dùng thuốc trừ sâu hóa học

Vi nấm Metarhizium anisopliae cũng có hiệu lực cao đối với rệp sáp giả Dysmicoccus sp hại na Phun nấm với nồng độ 9×108 bào tử/ml đã kiểm soát được 82% rệp sáp giả sau 5 ngày xử lý Tuy nhiên, hiệu quả trừ rệp sáp giả của nấm

Metarhizium anisopliae trên cây na ở điều kiện động ruộng ở ngoại ô Thành phố Hồ

Chí Minh thấp hơn so với ở phòng thí nghiệm, nhưng cũng đạt 56-78% [14] Một

chế phẩm khác từ Metarhizium diệt trừ được các loại sâu xanh, bướm trắng, sâu

khoang ăn lá, bọ hung đen ăn mía, mối đất ăn thông trắng, một số loại côn trùng hại

bồ đề, cây điều, cây ăn quả; sâu xanh bướm trắng ăn su hào, bắp cải, sâu khoang hại

cà chua cho kết quả diệt sâu bệnh hơn 70% Chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học 2B có

nguồn gốc từ nấm Beauveria brassiana đã được thử nghiệm kiểm soát rầy nâu hại lúa [10] Các chủng Bacillus thuringiensis được chọn lọc từ tự nhiên ở Việt Nam và

nước ngoài cũng đã được nghiên cứu tạo chế phẩm, chế phẩm Bt do viện Công

nghệ sản xuất có hoạt tính diệt sâu cao đối với côn trùng bộ cánh vảy hại rau hoa quả, nông sản bảo quản [1]

Thuốc trừ sâu vi sinh MVP 10FS, Delfin WG 32BIU, Aztron, Tập Kì 1,8EC

(Abamectin từ Streptomyces avermitilis) có hiệu lực với sâu tơ Plustella xylostella

và sâu khoang Spodoptera litura khá cao, hiệu lực dài Đặc biệt thuốc Tập Kì 1,8EC

có hiệu lực rất cao đối với sâu tơ và sâu xanh bướm trắng, thuốc có mùi dễ chịu và dùng với lượng rất nhỏ trên một hecta, cần đưa vào chương trình quản lý dịch hại tổng hợp IPM Bốn loại thuốc trừ sâu vi sinh này được xếp loại ưu tiên lựa chọn để phòng trừ sâu tơ và sâu khoang hại rau họ thập tự bắp cải, súp lơ, su hào và các loại rau cải Bên cạnh đó thuốc VBt và Bacterin BT cũng có hiệu lực diệt sâu tơ cao [16]

Có thể thấy, xu hướng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc là sinh học trên thế giới và Việt Nam ngày càng nhiều và càng được quan tâm, trong đó có

xu hướng sử dụng nấm ký sinh

1.3 Nấm ký sinh côn trùng

Cũng như vi khuẩn, nhiều loại nấm có quan hệ cộng sinh hoặc hoại sinh với côn trùng, trong đó có nhiều loài nấm thực sự là ký sinh, gây hiện tượng bệnh lý và dẫn đến huỷ diệt côn trùng Nấm gây bệnh cho côn trùng có ý nghĩa rất lớn vì có thể gây chết thường xuyên với tỷ lệ chết cao cho nhiều loài côn trùng hại và là những tác nhân điều hoà tự nhiên rất hiệu quả Côn trùng chết do nấm rất dễ nhận biết bằng mắt thường, vì các sợi nấm mọc qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể côn trùng Cơ thể côn trùng bị chết do nấm không bị tan rã, mà thường giữ nguyên hình dạng ban đầu, toàn bộ bên trong cơ thể chứa đầy sợi nấm

Hầu hết các các loại nấm gây bệnh cho côn trùng đều xâm nhập vào cơ thể vật chủ không qua đường miệng, mà dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp của bào tử với côn trùng Sau khi bám trên vỏ côn trùng (chitin), các bào tử gặp độ ẩm và nguồn dinh dưỡng thích hợp sẽ nẩy mầm và xâm nhập vào cơ thể côn trùng thông qua lớp biểu bì bên ngoài, giữa các bộ phận trong cơ thể Trong quá trình nẩy mầm, bào tử

tổng hợp protease, chitinase và lipase giúp các ống mầm xâm nhập vào lớp biểu bì đồng thời các enzyme hủy hoại hệ thống mô, cơ quan của côn trùng Sợi nấm xâm nhập vào khoang máu, lưu thông qua các chất lỏng của côn trùng và hình thành khối

mô dạng sợi nấm trên cơ thể côn trùng [32] Kết quả là côn trùng bị tổn thương, bị

đa nhiễm bởi nấm gây bệnh và các vi sinh vật gây bệnh khác Sau khi côn trùng chết nấm tiếp tục phát triển và sinh bào tử bên ngoài cơ thể côn trùng và có thể lây truyền bệnh cho côn trùng khác

Nấm cũng có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua đường miệng

Từ miệng, bào tử đi tới ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các tế bào nội quan

để gây bệnh Xâm nhập kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm ở nước Dưới tác động của độc tố do bào tử nấm tiết ra có thể dẫn tới hiện tượng ngừng nhu động

ruột của vật chủ Thí dụ, trường hợp bào tử nấm Aspergillus trong ruột ong mật

Bào tử nấm còn có thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào bên trong

cơ thể côn trùng, nhưng rất ít

Nấm gây bệnh cho côn trùng thuộc nhiều nhóm nấm khác nhau: từ nhóm nấm nguyên thủy sống dưới nước đến nhóm nấm bậc cao sống trên cạn Nấm gây

bệnh cho côn trùng có mặt trong cả 4 lớp nấm: Nấm bậc thấp Phycomycetes, nấm túi Ascomycetes, nấm đảm Basidiomycetes và nấm bất toàn Deuteromycetes

- Lớp nấm bậc thấp Phycomycetes: Trong lớp nấm này, các loài ký sinh trên

côn trùng tập trung ở ba bộ: Chytridiales, Blastocladiales và Entomophthorales

Đặc biệt có những họ nấm gồm tất cả các loài đều là ký sinh trên côn trùng như

Entomophthoraceae và Coelomomycetaceae Những giống nấm ký sinh côn trùng quan trọng của lớp nấm bậc thấp là: Coelosporidum, Chytridiopsis (bộ Chytridiales), Coelomonyces (bộ Blastocladiales) và Entomophthora (bộ Entomoph thorales)

- Lớp nấm túi Ascomycetes: Trong lớp nấm túi có bộ Laboulbiniales là những

nấm ngoại ký sinh côn trùng có chuyên tính cao, còn các loài nấm túi khác đều là

nội ký sinh của côn trùng Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho côn trùng là:

Cordyceps, Aschersonia (bộ Hypocreales)

- Lớp nấm đảm Basidiomycetes: Trong lớp nấm đảm chỉ ở 2 giống có các loài

gây bệnh trên côn trùng Đó là giống Septobasidium và Uredinella

- Lớp nấm bất toàn Deuteromycetes: Phần lớn các loài nấm bất toàn ký sinh côn trùng đều thuộc bộ Moniliales Những giống Beauveria, Paecilomyces, Spicaria, Metarhizium, Cephalosporium và Sorosporella chứa các loài khi xâm nhiễm vào côn trùng đã tạo thành độc tố và gây chết vật chủ trong khoảng thời gian nhất định

1.4 Hệ enzyme chitinase từ nấm sợi

1.4.1 Định nghĩa

Chitinase là enzyme thủy phân chitin thành các đơn phân axetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy phân liên kết β-1,4 glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-axetylglucosamine liên tiếp nhau trong chitin (Synowiecki and Al-Khateeb, 2003) [70]

N-1.4.2 Cấu trúc của chitinase

Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc 3 họ Glycohydrolate

18, Glycohydrolase 19 và Glycohydrolase 20

 Họ Glycohydrolase 18

Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn

có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase

Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, chúng hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer [38] (hình 1.3.A) Các

chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 bị ức chế mạnh bởi allosamidin

Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như:

Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens…

 Họ Glycohydrolase 19

Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở

xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenza… Chúng có cấu

trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển (hình 1.3.B)

Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV

(A) (B)

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 (A)

[69] và Glycohydrolase 19 (B) [72]

 Họ Glycohydrolase 20

Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine

acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người Ngoài ra, dựa vào trình

tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:

Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C)

(peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác

Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương

tự chitinase ở nhóm I Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn

Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I

Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao

1.4.3 Cơ chế hoạt động của chitinase

Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-β- chitobiosidase, N-acetyl-β -D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase [7]

Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và

chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân

tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa (hình 1.4.A)

Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp

lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2 (hình 1.4.B)

β –N- acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách

liên tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc) (hình 1.4.C)

Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng oligosaccharide làm cơ chất Các oligsaccharide thường được thủy phân bên trong trên một vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên Một số enyme chitinase có khả năng thủy phân trisaccharid, một số khác thì không Có hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharid và trisaccharid; một phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharid và tetrasaccharid Tóm lại chitinase thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên

N-acetyl-chito-Endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp cho endochitinase hơn là chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase Chitooligomer (GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều là

cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng β-N-acetylhexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục của huyền phù chitin (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của β-Nacetylhexosaminidase nhưng không là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase Chính vì thế có thể sử dụng để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase Sản phẩm sau cùng của

1.4.4 Cơ chất cảm ứng của chitinase

Cơ chất chủ yếu của chitinase là chitin Chitin được tìm thấy trong thành tế bào của nấm sợi và là chất hữu cơ chiếm khối lượng lớn hình thành nên lớp vỏ ngoài của động vật không xương khớp (côn trùng, giáp xác, thân mềm)

Chitin là polyme sinh học không phân nhánh, cấu thành từ các đơn vị acetyl D-glucosamine (GlcNAc) thông qua liên kết β-(1-4)-glycosyl (hình 1.5) Công thức phân tử của chitin: (C8H13O5N)n, khối lượng phân tử: (203,09)n với thành phần các nguyên tố: C = 47,29%; H = 6,4%; O = 39,4%; N = 6,91%

N-Hình 1.5 Cấu tạo hóa học của chitin

Chitin là một trong các polymer sinh học phổ biến nhất trong tự nhiên chỉ đứng sau cellulose (cấu trúc hóa học của chitin gần giống với cellulose) và đóng vai trò là polysaccharide cấu trúc của các sinh vật như: thành tế bào của nấm, khung vỏ ngoài của động vật chân đốt, vỏ ngoài của các loài giáp xác và giun tròn Trong cấu trúc của chitin, nhóm (-OH) ở nguyên tử C2 được thay thế bằng nhóm axetyl amino (-NHCOCH3)

Liên kết β-(1-4)-glycosyl của mỗi đơn phân trong cấu trúc của chitin lệch nhau một góc 180o tạo nên mạch xoắn và loại liên kết này kém bền, dễ bị cắt đứt bởi tác nhân có tính axit hay enzyme [42]

1.4.5 Các nguồn thu nhận chitinase

Chitinase hiện diện ở hầu hết các giới sinh vật như: vi khuẩn, xạ khuẩn, thực

vật hay trong các loài động vật không xương sống, có xương sống [55]

Chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes [5]

Chitinase cũng được tạo ra bởi các loài nấm sợi thuộc các chi Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia… và cả ở các nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus Tương tự như vi khuẩn, chitinase của nấm đóng vai trò quan trọng về

mặt dinh dưỡng, nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm Chitinase còn giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh nấm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh thực vật

Chitinase được thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại các nấm ký sinh

gây bệnh cho cây trồng Những thực vật bậc cao có khả năng tạo chitinase như thuốc lá (Nicotiana sp.), cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) và đặc biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme chitinase [13]

Từ một số động vật nguyên sinh, từ các mô và tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương như ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt có thể thu nhận được chitinase Đối với động vật có xương sống, chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ

Ngoài ra, chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay

vỏ, lột da Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticun) của chúng trong quá trình biến thái hay lột xác [13]

1.4.6 Ứng dụng của chitinase

Chitinase đã và đang được quan tâm và nghiên cứu nhiều trên thế giới do có khả năng ứng dụng rộng lớn Chitinase được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau trong y học, công nghiệp, nông nghiệp và nghiên cứu Đánh dấu các hạt vàng trên chitinase và chitosanase giúp các nhà khoa học định vị chitin và chitosan trong nghiên cứu cấu trúc, hóa học tế bào và miễn dịch học Trong công nghiệp, chitinase được sử dụng để sản xuất các loại chitooligosaccharide, N-acetyl D-glucosamine có chức năng kháng khuẩn, kích thích enzyme lysozym hoạt động và tăng cường miễn dịch Ngoài ra, chitinase được ứng dụng tạo ra các protein đơn bào; tạo ra các thể nguyên sinh (protoplast) của nấm mốc, nấm men; diệt các nấm gây bệnh; xử lý các chất thải giàu chitin; kiểm soát quá trình lây nhiễm của mầm gây bệnh sốt rét

Trong công tác bảo vệ thực vật, người ta đã đạt được nhiều kết quả tốt trong việc dùng một số loài nấm phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng Cụ thể như nấm

Metarhizium anisopliae dùng phòng trừ sâu xám, sâu đục thân ngô, sâu đục nõn dừa Nấm Beauveria bassiana trừ trên 80 loại sâu hại khác nhau, trong đó có sâu

đục thân ngô, bọ xít, bọ hung Phần lớn các loài nấm xâm nhập vào cơ thể sâu bằng sợi nấm xuyên qua lớp vỏ cutincun (phức hệ protein-chitin) vào trong Các vòi nấm tiết ra chitinase phân giải chitin tạo thành một lỗ để xâm nhập vào trong… Các nhà khoa học đã chứng minh mối liên hệ giữa khả năng tiêu diệt sâu bệnh của vi nấm đối kháng và sự tổng hợp chitinase ở các loài vi nấm này

1.5 Công nghệ lên men lỏng và lên men xốp

Để sản xuất chế phẩm diệt côn trùng trước tiên phải có bào tử nấm ký sinh

côn trùng Tuy nhiên, để tăng hiệu quả của chế phẩm sinh học người ta thường bổ sung một lượng lớn enzyme vào chế phẩm, trong đó phải kể đến chitinase Vì vậy, việc lựa chọn phương pháp lên men và tối ưu các điều kiện lên men là rất cần thiết

để sản xuất được nhiều chitinase với hiệu quả kinh tế cao Hiện nay, có hai phương pháp lên men phổ biến nhất là lên men lỏng và lên men rắn

Phương pháp lên men lỏng: có ưu điểm là dễ pha môi trường lên men với độ

đồng nhất cao, có thể tiếp giống liên tục và đơn giản, dễ kiểm soát pH Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là yêu cầu thiết bị và vận hành phức tạp, đòi hỏi nghiêm ngặt các thông số trong quá trình lên men, sử dụng nhiều năng lượng và nước, nhiều nước thải, khó xử lý khi bị tạp nhiễm và có nguy cơ phải bỏ đi hỗn hợp lên men trong một bồn lên men lớn, chi phí đầu tư thiết bị và vận hành lớn [61]

Phương pháp lên men rắn: mặc dù có một số nhược điểm là khó khăn trộn

môi trường lên men, môi trường lên men có độ đồng nhất ko cao, khó tiếp giống và phải tiếp giống theo từng đợt, việc kiểm soát pH khá phức tạp, độ ẩm cơ chất liên tục thay đổi trong quá trình lên men, khả năng truyền nhiệt của cơ chất kém Nhưng

nó có nhiều ưu điểm quan trọng như yêu cầu thiết bị và vận hành đơn giản, có thể tận dụng các nguồn cơ chất không tan trong nước và sản phẩm phụ của nông nghiệp với chi phí thấp (tinh bột, cellulose, lignin, pectin), bề mặt lên men rộng nên dễ trao đổi nhiệt và không khí, không đòi hỏi kiểm soát nghiêm ngặt các thông số trong quá trình lên men, tiêu thụ ít nước và năng lượng, ít nước thải, dễ dàng kiểm soát sự tạp nhiễm, chi phí đầu tư thiết bị và vận hành rẻ [61]

Từ những ưu điểm và nhược điểm của 2 phương pháp lên men trên, phương pháp lên men rắn được coi là phương pháp phù hợp cho việc sản xuất chitinase để phối trộn với bào từ nấm và các phụ gia tạo thành chế phẩm

Trong quá trình lên men, yếu tố môi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi như nguồn cơ chất, nguồn carbon và nitơ bổ sung, nhiệt độ, độ ẩm, pH, nồng độ cơ chất cảm ứng Khảo sát các yếu tố trên nhằm chọn ra điều kiện tối ưu để nuôi cấy chủng nấm sợi nghiên cứu thu nhận chitinase

có hoạt độ cao nhất

1.6 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitinase

1.6.1 Nguồn carbon

Cũng như nitơ, chất khoáng và nước, carbon là một trong bốn yếu tố không thể thiếu đối với mọi loài nấm cũng như vi sinh vật Tuy nhiên, nồng độ carbon trong môi trường quá cao cũng có thể ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật

Nấm sợi có khả năng đồng hóa nhiều loại carbon khác nhau, trong đó nguồn carbon có thể là các loại carbohydrate đơn giản như đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như tinh bột, cellulose, xylan Nguồn carbon phức tạp này thường tồn tại ở hầu hết các sản phẩm, phế phẩm như: trấu cám, vỏ quýt, sơ dừa, lõi ngô, bột ngô, bã mía, vỏ cà phê, mùn cưa, gạo Những chất này thường được sử dụng làm nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp chitinase Trong trường hợp nguồn carbon là bột ngũ cốc thì ngoài khả năng cung cấp carbon, chúng còn cung cấp cả nitơ, chất khoáng và giữ luôn vai trò làm giá thể

Patidar và cộng sự (2005) khi nghiên cứu trên chủng nấm Penicillium Chrysogenum PPCS1 và PPCS 2 cho thấy nguồn carbon thích hợp nhất để 2 chủng

này sinh tổng hợp chitinase là cám lên meo [58] Parameswaran và cộng sự (2005)

nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ nấm Penicilium aculeatum NRRL 2129 đã

chỉ ra rằng hoạt tính chitinase cao nhất khi sử dụng cám mì làm nguồn carbon [56] Nguyễn Thị Hà (2012) đã sử dụng nguồn carbon là trấu và cám để bổ sung vào môi

trường sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Aspergillus protuberus [6]

1.6.2 Nguồn nitơ

Nguồn nitơ ảnh hưởng mạnh tới tốc độ tiết enzyme của các loài vi sinh vật Nguồn nitơ tồn tại ở dạng vô cơ như urea, ammonium sulfate, natri nitrate và ở dạng các hợp chất hữu cơ cao phân tử như cao thịt, cao thịt bò, bột đậu tương, bột

cá hay peptone Tùy loài vi sinh vật mà nguồn nitơ được sử dụng là khác nhau Đa

số các loài có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ, tuy nhiên mức độ đồng hóa từng loại nitơ để sinh enzyme lại phụ thuộc vào từng loài

Theo Aghaeizadeh Fatemah và cộng sự (2008) khi bổ sung KNO3 vào môi

trường nuôi cấy chủng Penicillium aculeatum PTCC thì hoạt tính chitinae tăng

khoảng hơn 2 lần so với môi trường cơ bản [20] Trong khi, Nguyễn Hồng Minh và cộng sự (2013) đã chọn được NH4Cl với nồng độ 0,1% làm nguồn nitơ phù hợp để

sinh tổng hợp chitinase cho chủng nấm Lecanicillium lecanii N30.8 [11]

1.6.3 Độ ẩm cơ chất

Độ ẩm không khí, độ ẩm vật liệu hay độ ẩm môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và sinh sản của vi sinh vật nói chung và nấm nói riêng bởi vì tất cả cảm ứng sinh hóa ở các cơ thể sống đều diễn ra trong môi trường nước Đa số vi sinh vật phát triển tốt ở độ ẩm >80% và độ ẩm môi trường >20% Nếu hạ thấp độ

ẩm sẽ làm rối loạn quá trình sinh lý bình thường của vi sinh vật Độ ẩm là một trong những yếu tố làm cho vi sinh vật tiếp nhận thức ăn dễ dàng Nhờ có độ ẩm tốt mà các chất dinh dưỡng dễ thâm nhập vào cơ thể, các hệ enzyme thủy phân mới hoạt động được Nếu độ ẩm quá thấp xảy ra hiện tượng thay đổi trạng thái của nguyên sinh chất Từ thay đổi trạng thái như vậy dẫn tới vi sinh vật không phát triển được [15]

Nấm Penicillium Chrysogenum PPCS2 trong nghiên cứu của Patidar và cộng

sự (2005) có khả năng sinh chitinase cao nhất ở độ ẩm 120% [58] Chủng nấm

Aspergillus protuberus trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà (2012) đạt hoạt tính

chitinase cao nhất với độ ẩm ban đầu 80% bổ sung vào môi trường bán rắn [6]

Trong khi đó, chủng nấm Lecanicillium lecanii N30.8 của Nguyễn Hồng Minh và

cộng sự (2013) chỉ cần 50% độ ẩm cho hoạt tính chitinase cao nhất [11]

1.6.4 Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc tới quá trình sống của vi sinh vật nói chung và của nấm mốc nói riêng Mỗi loài vi sinh vật thích nghi với một vùng nhiệt độ khác nhau, căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ, các loài vi sinh vật được chia làm 3 nhóm

là nhóm vi sinh vật ưa lạnh và chịu lạnh sinh trưởng tốt ở trong điều kiện nhiệt độ

nhóm vi sinh vật chịu nhiệt sinh trưởng tốt ở nhiệt độ cao trên 50°C Phần lớn, nấm

là vi sinh vật ưa ấm, phát triển tốt nhất ở 25-30oC Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp

có thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm chí có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzyme sẽ bị ức chế [4]

Ulhoa và Peberdy (1991) đã chỉ ra rằng nấm Trichoderma harzianum cho

sinh chitinase cao nhất ở 28oC [73] Trong khi đó, nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà

(2012) lại chỉ ra rằng 30oC là nhiệt độ thích hợp cho chủng nấm Aspergillus protuberus sinh chitinase cao nhất [6] Trong một số trường hợp đặc biệt, một số

loài nấm vẫn có khả năng sinh tổng hợp chitinase ở nhiệt độ thấp hoặc cao hơn ngưỡng thông thường là 25-30oC Điển hình, trong nghiên cứu của Lê Thị Huệ

(2010) đã chỉ ra rằng nhiệt độ để chủng nấm Aspergillus sp sinh chitinase cao nhất

là 40oC [8]

1.6.5 pH môi trường

Giá trị pH môi trường ban đầu có ảnh hưởng quan trọng tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp chitinase của các chủng nấm sợi pH của môi trường nuôi cấy làm thay đổi hình thái sinh trưởng và bài tiết enzyme của nấm sợi pH có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của tế bào, do chúng ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các chất dinh dưỡng, hình thái màng tế bào, sự vận chuyển của các chất dinh dưỡng qua màng tế bào, hoạt độ enzyme và phản ứng oxi hóa khử [4]

Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là

acid, trung tính hay kiềm Aspergillus protuberus sinh tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện pH 5,5 [6] Nhiều nghiên cứu trên Trichoderma harzianum

chỉ ra rằng pH thích hợp cho nấm này sinh trưởng tạo chitinase có hoạt tính cao khoảng pH = 4-6 [18]

1.6.6 Cơ chất

Chitinase có thể là enzyme cảm ứng hoặc enzyme cấu trúc Tuy nhiên trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật người ta đều bổ sung thêm cơ chất chitin nhằm

tăng khả năng tạo chitinase Nhìn chung sự hiện diện của chitin trong môi trường nuôi cấy hữu ích cho việc tạo chitinase [50] Trong số các cơ chất, chitin huyền phù

có khả năng kích thích tạo chitinase cao nhất

Theo Nguyễn Thị Hà (2012), chủng nấm Aspergillus protuberus sinh tổng

hợp chitinase cao nhất khi bổ sung 15% cơ chất cảm ứng chitin vào môi trường lên

men bán rắn [6] Trong khi chủng Trichoderma hurziunum trong nghiên cứu của

Ulhoa và Peberdy (1991) chỉ cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy 0,5% cơ chất cảm ứng chitin đã cho hoạt tính chitinase cao nhất [71]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu đất được lấy trên bề mặt và xác rệp chết bởi nấm gây bệnh trên đồng ruộng được thu thập ở cánh đồng mía phường Đồng Mai, quận Hà Đông, Hà Nội Các mẫu sau khi thu thập được chúng tôi bảo quản tại phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Thử nghiệm sinh học: Rệp muội hại cây ngô được thu thập từ cánh đồng ngô

ở bãi bồi sông Hồng, Hà Nội đem về phòng thí nghiệm nhân giống Dựa vào đặc

điểm hình thái và cây chủ, rệp này bước đầu được nhận định thuộc loài Aphis maydis

2.1.2 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Các hóa chất sử dụng đều là hóa chất ngoại nhập của các hãng Sigma, Merk,

Invitrogen, Prolab, ICN…

Một số vật liệu cần thiết khác như: khoai tây, lá ngô, gạo, cám gạo, bột ngô,

lõi ngô được mua và thu thập tại khu vực Hà Nội

Chuẩn bị chitin huyền phù 1%: 1g bột chitin được thêm từ từ vào 20 ml dung

dịch HCl đậm đặc, khuấy đều và ủ trong 8 giờ Thêm vào hỗn hợp 200 ml ethanol lạnh (-20oC) và để qua đêm Ly tâm hỗn hợp ở 4000 vòng/phút, trong 20 phút, thu lấy kết tủa và rửa bằng đệm phosphate 0,05 M cho đến khi đạt pH trung tính thì dừng lại Thêm vào tủa 100 ml dung dịch đệm trên cho đến khi thể tích đạt 100 ml

Thuốc thử DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid): Cân 5 g DNS bổ sung thêm 300

ml nước cất, đun từ từ đến khoảng 50o

C Tiếp tục bổ sung 8 g NaOH, khuấy đều, cho thêm 150 g muối Tartrate (Sodium potassium tartrate- KNaC4H4O6) Bổ sung từ

từ nước cất cho đến thể tích 500 ml Đun dần cho đến 100oC, lắc đều cho đến khi các hóa chất tan hết

2.1.3 Thiết bị

Trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị, máy móc đã được sử dụng có độ chính xác cao tại phòng Công nghệ sinh học môi trường, phòng Các chất chức năng sinh học và phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về công nghệ Gene- Viện Công nghệ sinh học, viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

AB applied Biosystems, Gene Amp PCR system 2700, Singapore

Vortex

Tủ lên men rắn Biose, Ldt 1000 l

Trung Quốc Liên doanh

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

Các loại môi trường nuôi cấy cơ bản được sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Các loại môi trường nuôi cấy cơ bản

PDB cải tiến (Potato dextrose broth ) (g/l) Môi trường LB dịch (g/l)

Nước cất vừa đủ : 1 lít

PDA cải tiến (Potato dextrose agar) (g/l) Môi trường lỏng sinh chitinase (g/l)

Thành phần các loại hóa chất giống PDB

nhưng có thêm 18-20 g Agar

Dịch chiết khoai tây NaNO3

: 20 g : 2 g

Dung dịch Tween 80 (0,05%) KH2PO4 : 1 g Hút 500 µl tween 80 và định mức đến 1lít

 Phân lập nấm từ mẫu đất

Cân 1g đất cho vào 10 ml nước muối sinh lý Sau đó, hút 0,5 ml dịch vừa pha loãng trên sang lọ penicillin chứa 4,5 ml dịch sinh lý (ký hiệu là 10-1) và tiến hành đảo trộn đều Tiếp đó, hút 0,5 ml dịch từ lọ penicillin 10-1

sang lọ penicillin 10-2(chứa 4,5 ml dịch sinh lý) rồi đảo trộn Quá trình được thực hiện tương tự tới 10-8

Sau khi pha loãng tới 10-8, hút lần lượt 0,1 ml từ các lọ penicillin từ 10-8 tới

10-1 vào đĩa thạch PDA có bổ sung kháng sinh được chuẩn bị ở trên và tiến hành cấy gạt Các đĩa sau khi được cấy gạt được bao gói cẩn thận và nuôi cấy ở nhiệt độ

30oC trong 3-5 ngày Tập đoàn các chủng nấm sợi trên môi trường PDA được tách sạch riêng từng chủng và tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc

2.2.2 Sàng lọc chủng nấm ký sinh côn trùng có độc lực diệt rệp hại ngô cao

 Chuẩn bị rệp ngô

Hộp nhựa hình trụ (100 mm x 45 mm), nắp đậy có lỗ che bởi lưới để rệp không thoát ra ngoài (đường kính lỗ 45 mm) Đặt 2 lượt giấy lọc thường vào hộp (đường kính 95 mm), thêm tiếp 3 ml nước vào giấy để giữ ẩm Đưa 1 miếng lá ngô vào hộp, nhặt 25 con rệp ngô để lên lá, đậy nắp lại Các hộp được để trong buồng nuôi ở 30oC và độ ẩm 70%, chiếu sáng 16 giờ/ngày Sau 1 ngày tiến hành phun bào

tử lên rệp và hàng ngày xác định tỷ lệ (%) rệp chết bởi nấm

 Chuẩn bị bào tử nấm để phun trên rệp ngô

Các chủng nấm được cấy trên môi trường PDA, ở 30oC trong 12 ngày Dùng

12 ml dung dịch 0,05% Tween 80 cho vào 1 đĩa nấm đã nuôi 12 ngày, dùng bàn trang thủy tinh để trích thu bào tử Dịch chứa bào tử từ đĩa được đổ dồn vào ống falcon 50 ml, sau đó dịch bào tử được lọc qua vải màn, thu bào tử qua vải màn, sợi nấm trên vải màn bỏ đi Dùng kính hiển vi độ phóng đại 40 lần và buồng đếm hồng cầu để đếm số lượng bào tử Phun 10 ml dung dịch (1x108 bào tử /ml) được phun đều dưới dạng sương cách 30 cm lên trên hai mặt lá ngô có diện tích (20-25 cm2) đã

ml dung dịch 0,05% tween 80 Số rệp chết và sống sót được đếm qua từng ngày đến ngày thứ 7, ngày phun được tính là ngày 0 Nhiệt độ và độ ẩm không khí được duy trì trong thời gian thí nghiệm lần lượt là 30oC và 70% Thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần

 Cách tiến hành

Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất chitin dày khoảng 0,5 cm được đục lỗ với đường kính 0,5 cm Một trăm microlit dịch enzyme được cho vào lỗ rồi ủ 12 giờ trong 4oC cho enzyme khuếch tán Sau đó, đĩa thạch được ủ qua đêm ở 37oC lấy ra

và nhuộm bằng lugol 1% Bán kính vòng thủy phân Rhalo= R-r (với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu hiện hoạt tính tương đối của enzyme

2.2.4 Xác định hoạt tính chitinase của chủng nấm ký sinh côn trùng

 Nguyên tắc

Hoạt tính chitinase được xác định dựa vào lượng đường khử glucosamine sinh ra trong phản ứng thủy phân Khi cho chitinase tác dụng với cơ chất là chitin huyền phù, N-acetyl-β-D-glucosamine sinh ra trong phản ứng được định lượng qua phản ứng với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalisylic acid), cho sản

N-acetyl-β-D-phẩm 3-amino-5 nitrosalicylic acid hấp thụ ánh sáng khả kiến ở bước sóng 540 nm

 Xây dựng đường chuẩn

Chuẩn bị dung dịch N-acetyl-β-D-glucosamine chuẩn 10 μmol/ml: cân chính xác 0,0221g N-acetyl-β-D-lucosgamine, cho nước cất vào đủ 10 ml

Từ dung dịch N-acetyl-β-D-glucosamine chuẩn (10 μmol/ml) ra các nồng độ chuẩn khác nhau từ 0-10 µmol/ml Sau đó, bổ sung 100 µl dung dịch DNS vào các ống thí nghiệm để được tỷ lệ 1:1 (100 µl dung dịch chuẩn: 100 µl DNS) Hỗn hợp được lắc đều, đun cách thủy ở 100oC trong 5 phút Để nguội, thêm 1800 ml nước cất vào mỗi ống để đạt thể tích 2 ml/ống, hệ số pha loãng là 20 lần Lắc đều và đo

OD ở bước sóng 540 nm bằng máy đo quang phổ Từ các kết quả đo được, ta lập được đường chuẩn N-acetyl-β-D-glucosamine như hình 2.1

y = 0.083x - 0.009 R² = 0.997

-0.1

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9