Nghiên cứu ảnh hưởng địa lý đến sự phân bố các hợp chất terpenoid, flavonoid và steroid trong cây ké đầu ngựa mọc ở hòa bình

DANH MỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG, VÀ CÁC SƠ ĐỒ Hình 1.1: Ké đầu ngựa Xanthium strumarium L., Asteraceae Hình 1.2: Ké hoa đào, Ké hoa vàng, và Ké đầu ngựa Bảng 4.1: Hiệu suất thu nhận các phầ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS Phan Minh Giang

Hà Nội – 2013

LỜI CẢM ƠN

Luận văn thạc sĩ này được hoàn thành tại Phòng thí nghiệm Hóa học các hợp chất

thiên nhiên, Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn chân thành đến:

PGS TS Phan Minh Giang đã tin tưởng giao đề tài và tạo điều kiện thí nghiệm thuận lợi giúp tôi hoàn luận văn này

Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn đồng nghiệp trong Phòng thí nghiệm Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã tư vấn

và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 12 năm 2013

Học viên

Ninh Thế Sơn

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 KHÁI QUÁT VỀ HỌ CÚC (ASTERACEAE) VÀ CHI XANTHIUM 3

1.1.1 Họ Cúc (Asteraceae) 3

1.1.2 Chi Xanthium 4

1.2 ĐẶC ĐIỂM CÂY KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) 4

1.2.1 Đặc điểm thực vật 4

1.2.2 Đặc điểm sinh thái 6

1.2.3 Công dụng trong y học cổ truyền 7

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY XANTHIUM STRUMARIUM 10

CHƯƠNG 2: NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu 24

2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp

chất 25

2.2.2.1 Phương pháp chiết hai pha lỏng 25

2.2.2.2 Các phương pháp sắc ký 25

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc 28

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 29

3.2 NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 29

3.3 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY KÉ ĐẦU NGỰA 29

3.4 PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 30

3.5 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ ĐIỀU CHẾ 31

3.5.1 Phân tách sắc ký phần chiết lá n-hexan (HBLH) 31

3.5.2 Phân tách sắc ký phần chiết lá nước (HBLW) 32

3.5.3 Phân tách sắc ký phần chiết cành n-hexan (HBCH) .33

3.5.4 Phân tách sắc ký phần chiết cành điclometan (HBCD) 33

3.5.5 Phân tách sắc ký phần chiết lá và cành etyl axetat (HBE) 34

3.6 HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP 35

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

4.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39

4.2 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY KÉ ĐẦU NGỰA 39

4.3 PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 42

4.3.1 Phân tích phần chiết lá n-hexan (HBLH) 42

4.3.2 Phân tích phần chiết lá điclometan (HBLD) 43

4.3.3 Phân tích phần chiết cành n-hexan (HBCH) 43

4.3.4 Phân tích phần chiết cành điclometan (HBCD) 44

4.3.5 Phân tích phần chiết lá và cành etyl axetat (HBE) 45

4.4.1 Phân tách phần chiết lá n-hexan (HBLH) 46

4.4.2 Phân tách phần chiết lá nước (HBLW) 48

4.4.3 Phân tách phần chiết cành n-hexan (HBCH) 50

4.4.4 Phân tách phần chiết cành điclometan (HBCD) 52

4.4.5 Phân tách phần chiết lá và cành etyl axetat (HBE) 54

4.5 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC PHÂN LẬP ĐƯỢC 56

KẾT LUẬN 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 69

CÁC CHỮ VIẾT TẮT THƯỜNG DÙNG TRONG LUẬN VĂN

TLC (Thin layer Chromatography): Sắc ký lớp mỏng

CC (Column Chromatography): Sắc ký cột thường

FC (Flash Chromatography): Sắc ký cột nhanh

Mini-C (Mini Column Chromatography): Sắc ký cột tinh chế

IR (InfraRed spectroscopy): Phổ hồng ngoại

NMR (Nculear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1H-NMR (Proton-Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13C-NMR (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13

DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer): Phổ DEPT

GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry): Sắc ký-Khí khối phổ

ESI-MS (Electron Spray Ionization-Mass Spectrometry): Phổ khối lượng ion hoá phun bụi electron

DANH MỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG, VÀ CÁC SƠ ĐỒ

Hình 1.1: Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L., Asteraceae)

Hình 1.2: Ké hoa đào, Ké hoa vàng, và Ké đầu ngựa

Bảng 4.1: Hiệu suất thu nhận các phần chiết từ cây Ké đầu ngựa

Bảng 4.2: Phân tích TLC phần chiết lá n-hexan (HBLH)

Bảng 4.3: Phần tích TLC phần chiết lá điclometan (HBLD)

Bảng 4.4: Phân tích TLC phần chiết cành n-hexan (HBCH)

Bảng 4.5: Phân tích TLC phần chiết cành điclometan (HBCD)

Bảng 4.6: Phân tích TLC phần chiết lá và cành etyl axetat (HBE)

Sơ đồ 4.1: Quy trình điều chế các phần chiết từ cây Ké đầu ngựa

Sơ đồ 4.2: Phân tách phần chiết lá n-hexan (HBLH)

Sơ đồ 4.3: Phân tách phần chiết lá nước (HBLW)

Sơ đồ 4.4: Phân tách phần chiết cành n-hexan (HBCH)

Sơ đồ 4.5: Phân tách phần chiết cành điclometan (HBCD)

Sơ đồ 4.6: Phân tách phần chiết lá và cành etyl axetat (HBE)

Đánh giá vai trò của các hợp chất được tách chiết trong thực vật được ứng dụng trong y tế thì theo số liệu khảo sát gần đây thì hơn 50% dược phẩm đã và đang được sử dụng để chữa bệnh hay thử nghiệm lâm sàng Mặc dù đã có các ghi chép về tác dụng điều trị của một số cây thuốc nhưng nhìn tổng thể số lượng các cây được nghiên cứu hóa thực vật một cách chi tiết còn rất khiêm tốn, số lượng các hoạt chất liên quan trực tiếp đến các tác dụng điều trị của các cây thuốc được phát hiện còn ít hơn nữa Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa là điều kiện thuận lợi tạo nên sự đa dạng cho giới thực vật Theo số liệu thống kế mới nhất thảm thực vật của Việt Nam

có trên 12.000 loài và hơn 3.200 loài được ứng dụng làm thuốc Một trong những vấn đề lớn được đặt ra cho các nhà nghiên cứu hóa sinh hữu cơ và hóa học các hợp chất thiên nhiên là cần phải phát triển nhiều phương pháp nghiên cứu mới, hiện đại,

để nhanh chóng đánh giá được nguồn tài nguyên thực vật của Việt Nam, bước đầu

có những đóng góp quan trọng vào các nghiên cứu hóa hữu cơ, hóa sinh, và y dược của thế giới

Trong sự đa dạng của thế giới thực vật thì họ Cúc (Asteraceae) có một vai trò quan trọng Nhiều loài cây trong họ này được biết đến với vai trò các dược thảo có tác dụng tốt đối với con người hoặc các cây có giá trị thực phẩm Nhiều cây của họ này cho nhiều hợp chất có giá trị hoặc có các cấu trúc mới vô cùng lý thú Chi

Xanthium thuộc họ này khá phổ biến trong tự nhiên và được tìm thấy trên nhiều quốc

Ninh Thế Sơn 2

gia Chi này ở Việt Nam được đặc trưng bởi hai loài Ké đầu ngựa (Xanthium

strumarium L.) và Ké (Xanthium inaequilaterum DC.)

Xanthium strumarium L được biết đến là tổng hợp nhiều các chất xanthanolit

(các seco-guaianoid) và thiazin, một nhóm nhỏ các chất có cấu trúc rất đặc biệt Phổ

mạch hoạt tính của các chất này có thể quyết định cho nhiều tác dụng điều trị của

Xanthium strumarium một loài cây được dùng làm thuốc ở nhiều nước Ở Việt Nam,

cây Ké đầu ngựa được trồng lấy quả làm thuốc ở một số địa phương như Hà Nội và Hòa Bình, tuy nhiên chưa có các đánh giá khoa học về hiệu quả sử dụng của loài cây này Nghiên cứu sự phụ thuộc của các thành phần hóa học của cây trồng vào các điều kiện sinh trưởng và địa lý của cây đã được xác định là một nội dung nghiên cứu của Hóa nông nghiệp trong thời gian gần đây và các phương pháp nghiên cứu hóa học đã được áp dụng để đánh giá sự ảnh hưởng này Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn

về đánh giá khoa học cho các cây thuốc Việt Nam, trong luận văn này, chúng tôi đã lựa chọn cây Ké đầu ngựa mọc ở Hòa Bình làm đối tượng nghiên cứu với mục tiêu bước đầu đánh giá các thành phần hóa học (các terpenoid, flavonoid, và steroid) có trong loài cây này qua phân lập để có thể có một số cơ sở ban đầu cho việc tiếp tục nghiên cứu phát triển cây thuốc này một cách hiệu quả ở Việt Nam

Ninh Thế Sơn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 KHÁI QUÁT VỀ HỌ CÚC (ASTERACEAE) VÀ CHI XANTHIUM

1.1.1 Họ Cúc (Asteraceae) [7]

Họ Cúc (danh pháp khoa học: Asteraceae hay Compositae), còn gọi là họ

Hướng dương, họ Cúc tây, là một họ thực vật có hoa hai lá mầm Tên gọi khoa học

của họ này có từ chi Aster (Cúc tây) Asteraceae là họ lớn nhất trong Magnoliophyta

Họ Asteraceae có 1.100 chi và 20.000 loài phân bố rộng khắp trên thế giới nhưng phổ biến nhất tại khu vực ôn đới và miền núi nhiệt đới

Các loài thuộc về họ Cúc có các đặc trưng thực vật sau:

 Cụm hoa: Cụm hoa dạng đầu

 Bao phấn hữu tính, tức là với các nhị hoa kết hợp lại với nhau tại các gờ của chúng bởi các bao phấn, tạo thành ống

 Bầu nhụy với sự phân bổ cơ bản của các noãn hoa

 Các noãn hoa trên một bầu nhụy

 Mào lông (chùm lông trên quả)

 Quả là loại quả bế (tạo thành từ một lá noãn và không nẻ ra khi chín)

 Các sesquiterpen có mặt trong tinh dầu, nhưng không có các iridoid

Họ Asteraceae bao gồm chủ yếu các cây thân cỏ, cây bụi và một số rất ít cây thân gỗ Lá của họ này có thể mọc đối, so le hoặc ít phổ biến hơn là kiểu mọc vòng

Lá có thể là lá đơn có hình lông chim hoặc lá kép hình chân vịt và không có lá kèm Hoa được chia làm hai kiểu cơ bản: hình ống đối xứng tỏa tia hay loại được tạo hình dây đối xứng hai bên Hoa có thể là đơn tính hay lưỡng tính tùy loại

Họ Asteraceae chia làm ba bộ lớn:

- Heliantheceae;

là Actiso, Bạch truật, Cỏ nhọ nồi, Cỏ ngọt, Cúc hoa, Cúc tần, Hồng hoa, Hy thiêm,

Ké đầu ngựa, Khoản đông hoa, Mần tưới, Mộc hương, Ngải cứu, Ngưu bàng, Sài đất, Thương truật, Thanh hao hoa vàng, Tử uyển

1.1.2 Chi Xanthium

Xanthium là một chi của loại cây có hoa trong họ Cúc (Asteraceae) và là các

loài cây phổ biến ở châu Mỹ và châu Á Chúng thuộc loại cây thảo nhất niên cao khoảng 50-120 cm, lá mọc so le, có mép răng cưa Không giống như các chi khác

thuộc họ Cúc với quả phủ lông ở đầu, quả Xanthium cứng, có nhiều gai nhọn, hình

cầu hoặc oval dễ bám vào quần áo hoặc da động vật

Theo tài liệu [1] chi Xanthium hiện có 25 loài trên thế giới, ở Việt Nam có hai loài là Xanthium strumarium L và Xanthium inaequilaterum L

Các loài của chi Xanthium được sử dụng như một loại thuốc thảo mộc cổ

truyền trong một thời gian dài ở các nước phương Đông

1.2 ĐẶC ĐIỂM CÂY KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.)

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Ké đầu ngựa (Tên khoa học: Xanthium strumarium L.) (Tên tiếng Pháp

Lambourde; Herbe aux écsrouelles, tên Hán Việt: Thương Nhĩ, Phắt Ma) thuộc họ Cúc (Compositae hay Asteraceae) Là loại cây thuộc thân thảo (thân mềm yếu, vòng đời ngắn, không chứa lignin) Quả có răng móc, được dùng làm thuốc gọi là Thương Nhĩ Tử chữa phong thấp hay mụn nhọt [3]

Ninh Thế Sơn 5

Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) thuộc cây thân thảo, là cây nhất niên,

ít có nhánh, cao từ 50 đến 80 cm Thân có khía dọc, có lông nhám, màu lục, đôi khi

có chấm tím Lá hình tim hoặc bầu dục có xẻ 5 múi, có răng cưa không đều, hai mặt

lá có lông cứng, bề dài 4-10 cm, ngang 4-12 cm Cụm hoa ở đầu cành hoặc kẽ lá, màu lục nhạt, gồm 2 loại đầu cùng gốc Đầu trên nhỏ, mang hoa lưỡng tính, những đầu khác mang hoa cái Quả dạng chập đôi, hình bầu dục, có gai, mỗi trái dài từ 12-

15 mm, ngang 7 mm Nếu là quả đơn thì dài 12 mm, ngang 6 mm, hơi dẹp, một mặt bằng, một mặt lồi Bên trong có hai hột

Trên thế giới Ké đầu ngựa được tìm thấy ở nhiều quốc gia như Mỹ, Canada, Trung Quốc, Ấn Độ, Lào, Campuchia Ở Việt Nam, cây Ké đầu ngựa mọc hoang ở nhiều nơi, những vùng núi ở độ cao dưới 1.500 m đến những vùng đồng bằng ven

Hình 1: Ké đầu ngựa

Hình 1: Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L., Asteraceae)

Ninh Thế Sơn 6

biển Cây Ké đầu ngựa mọc ven đường hay trên các nương rẫy, bờ ruộng Ngày nay,

do nhu cầu, nhiều nơi đã trồng cây Ké đầu ngựa làm thuốc [8]

1.2.2 Đặc điểm sinh thái [8]

Tùy vào điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng từng vùng mà các loài Xanthium mọc phổ biến cũng khác nhau Ở Việt Nam và Trung Quốc phổ biến loài Xanthium

strumarum L Nhưng với một số quốc gia Nam Mỹ với điều kiện khí hậu ôn đới như

Chile thì Xanthium spinosum L lại là phổ biến

Cây Ké đầu ngựa có thể sống trên nhiều loại đất khác nhau, cây bắt đầu mọc vào mùa Xuân sinh trưởng và phát triển nhanh trong mùa mưa ẩm, sang mùa Hạ cây

ra hoa, kết trái, cuối mùa Hạ sang mùa Thu quả chín Cây ưa ánh sáng và có thể chịu hạn, thường mọc thành đám ở ven đường, vùng đồi, bãi hoang, bờ sông

Ngày nay do nhu cầu, Ké đầu ngựa được nhân dân ta đem vào gieo trồng Nó được trồng vào mùa Xuân Đào đất thành những hốc sâu 10-15 cm, mỗi hốc cách nhau 50-60 cm Cho tro hay đất song, đất phốt phát vào rồi cho mỗi hốc 3-4 hột Phủ một ít đất lên, tưới ẩm vừa phải hằng ngày Sau độ 10 ngày cây mọc Khi cây cao

độ 6-7 cm có thể đem trồng ở chỗ khác Vào cuối mùa hè hay đầu mùa thu là có thể thu hoạch cả quả lẫn cây (đem sấy khô hoặc phơi khi thu hoạch) [8]

Cần phân biệt cây Ké đầu ngựa với cây Ké hoa đào (Urena lobata L.) và cây

Ké hoa vàng (Sida rhombifolia L.) Hai cây này nhỏ và thấp hơn, có trái nhỏ, không

có hình thoi như trái Ké đầu ngựa

1.2.3 Công dụng trong y học cổ truyền

Cây Ké đầu ngựa có vị ngọt, tính ôn, hơi độc, có tác dụng làm đổ mồ hôi, tán phong, trị các chứng phong hàn, đau nhức, phong tê thấp, tê dại, mờ mắt, chân tay

co giật, uống lâu ích khí [8]

Lá Ké đầu ngựa đắng và chát Ở Việt Nam, lá được dùng làm thuốc hoạt nhuận Với rễ cây, chắt lấy nước đem đắp vào chỗ ung nhọt [8]

Hoa có tính bồi bổ sức khỏe, an thần, giúp ra mồ hôi Người Malaysia dùng làm nước sát trùng [8]

Hiện nay Ké đầu ngựa là một vị thuốc thường dùng trong y học dân gian Việt nam, Trung quốc để chữa mụn nhọt, lở loét, bướu cổ, ung thư phát bối (đằng sau

lưng), mụn nhọt không đầu, đau răng, đau cổ họng, viêm mũi [3]

Ké đầu ngựa (Thương Nhĩ Tử) thường được nhân dân Trung Quốc thường chế thành cao Thương Nhĩ còn gọi là Vạn ứng cao chữa lở loét, mụn nhọt Cách làm như sau: từ tháng 5-9, hái toàn cây về phơi khô, cắt nhỏ nấu với nước, lọc và cô thành cao mềm Khi uống hoà với nước âm ấm, mỗi ngày dùng 6-8 g cao Uống luôn

từ 1/2 tháng đến 2 tháng [3]

Ké hoa đào Ké hoa vàng Ké đầu ngựa

Hình 2: Ké hoa đào, Ké hoa vàng, và Ké đầu ngựa

Ninh Thế Sơn 8

Có thể chế thành thuốc viên Thương Nhĩ Hoàn như sau: Bỏ rễ, rửa sạch, cắt ngắn cho vào nồi nấu với nước sôi trong 1 giờ, lọc lấy nước, bã còn lại thêm nước, nấu sôi một giờ nữa, lọc và ép lấy hết nước Hợp cả hai nước lại, cô thành cao mềm Khi lấy que nhúng vào cao, nhỏ lên giấy, giọt cao không loang ra nữa là được Sau

đó thêm vừa đủ bột vào (chừng 1/3 lượng cao) trộn đều chế thành viên [3]

Nhân dân Liên Xô cũ dùng Ké đầu ngựa để chữa bướu cổ, các bệnh mụn nhọt, nấm tóc, hắc lào, lỵ và đau răng

Ở Ấn Độ, người ta dùng Ké đầu ngựa trị sốt rét, làm toát mồ hôi, trị bệnh tràng nhạc, ung thư, quả làm dịu kích thích, trị bệnh đậu mùa

Gần đây theo Đỗ Tất Lợi Và Phạm Kim Loan, với cây Ké đầu ngựa thu hái

ở các tỉnh miền núi như Lạng Sơn, Cao Bằng, Hòa Bình thì tất cả các bộ phận của cây (trái, thân, lá) đều chứa hàm lượng iot lớn, trung bình vào khoảng 150 µg iot trong một gam thân, lá hay trái Do đó, cây Ké đầu ngựa được dùng để phòng ngừa

và chữa bệnh bướu cổ Nhu cầu hàng ngày của cơ thể về iot là 200-300 µg; mỗi ngày, một người chỉ cần uống 1-2 gam cây hay trái Ké đầu ngựa phơi khô Trong 2 năm 1969-70, Tổng cục Lâm nghiệp Việt nam đã dùng cao Ké đầu ngựa chế thành viên chữa bướu cổ tại một số lâm trường miền núi Kết quả đạt trên 80% người khỏi bệnh [8]

Ngoài ra, Ké đầu ngựa còn có tác dụng làm giảm cường độ co bóp của tim, giảm thân nhiệt và lợi tiểu Hoạt chất xanthumin có tác dụng ức chế thần kinh trung ương Đặc biệt, Ké đầu ngựa còn có tác dụng kháng các vi khuẩn Gram và kháng

nấm [9]

Ké đầu ngựa chữa thấp khớp, viêm khớp: Ké đầu ngựa 12 g, cỏ Xước 40 g,

Hy thiêm 28 g, Thổ phục linh 20 g, cỏ Nhọ nồi 16 g, Ngải cứu 12 g Tất cả sao vàng, sắc nấu uống thường xuyên trong ngày [9]

Chữa mụn nhọt, chữa lở: Ké đầu ngựa 10 g, Kim ngân hoa 20 g, làm dạng chè thuốc, đóng 30 g/ gói, mỗi ngày uống 1 gói, hãm nước sôi uống cả ngày Hoặc Ké

Ninh Thế Sơn 9

đầu ngựa 10 g, Bồ công anh 15 g, Sài đất 10 g, Kim ngân hoa 5 g, Cam thảo đất 2 g Tất cả bào chế thành dạng chè thuốc, trọng lượng của 1 gói là 42 g, mỗi ngày dùng

1 gói, cho hãm nước sôi uống trong ngày [9]

Chữa đau răng: Sắc nước quả Ké đầu ngựa ngựa ngậm nhiều lần rồi nhổ ra [9]

Chữa viêm mũi dị ứng, tăng tiết dịch: Quả Ké đầu ngựa sao vàng, tán bột,

Nổi mề đay: Loại mề đay từng đám lặn chỗ này, mọc chỗ khác Thương Nhĩ

Tử 10 g, Kinh giới 15 g, Bạc hà 15 g Tất cả rửa sạch nấu lấy nước (bỏ bã) nấu cháo [8]

Loại mề đay đỏ, nóng, ngứa nhiều Hạt Thương Nhĩ Tử 15 g, Sinh địa 30 g, Bạc hà 12 g Nấu lấy nước uống [8]

Thuốc mỡ trái Ké: Cao lỏng trái Ké 100 ml, lanolin 100 g, vaselin 200 g, glycerin 10 ml Bôi ngoài da chứa rôm sẩy, mẩn ngứa [8]

Viêm xoang mũi dùng bài Thương Nhĩ Tử của Nghiêm Dung Hòa đời Tống trong Tê Sinh Phương: Thương Nhĩ Tử 8g, Tân Di Hoa 15 g, Bạc hà 3 g, Bạch chỉ

Ninh Thế Sơn 10

30 g Trà lượng vừa đủ, Hành lượng vừa đủ Tán bột mịn 4 vị trên, uống sau bữa cơm mỗi lần 6 g với nước Trà và Hành nấu chung Nếu viêm Xoang thời kỳ đầu thuộc biểu chứng thì tang lượng Bạc hà Có thể them Cúc hoa, Liên kiều, Cát căn, Kim ngân hoa

Thấp khớp: Rược Thương Nhĩ (Phổ Tế Phương): Thương Nhĩ Tử 30 g, Phòng phong 30 g, Bàng tử (sao) 30 g, Đại sinh địa 30 g, Độc hoạt 30 g, Ý dĩ nhân 20 g, Nhân sâm 15 g, Nhục quế 12 g Tất cả giã nát cho vào túi vải ngâm vào rược 2 lít, buộc kín miệng bình Sau một tuần uống được, mỗi lần một ly Ngày uống 2-3 lần Các bệnh ngoài da do dị ứng, chàm: Ké đầu ngựa 9 kg, Thổ phục linh 9 kg, cồn benzoic 10% 300 ml Nước vừa đủ 23 lít Nếu không dùng đường thì nấu nước,

cô cao, tán bột làm viên Đã điều trị 124 trường hợp cho kết quả tốt [3]

Viêm da mủ và nhiễm trùng thứ phát (chốc, nhọt, loét sâu quảng, bối thư, do liên tụ cầu) Dùng Ké đầu ngựa, Kim ngân hoa, Bồ công anh, Thổ phục linh, Sài đất mỗi vị 30 g (công thức điều trị của bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng-Khoa truyền nhiễm) Kết quả khỏi 73,8 %, đỡ 18,8 %, không khỏi 7,4 %

Chữa ung thư não: Thương Nhĩ Tử 15 g, Thất diệp nhất chi hoa (cây 7 lá 1 hoa) 16 g, Viễn chi 10 g, Xương bồ 6 g, sắc uống ngày 1 thang [3]

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA

CÂY XANTHIUM STRUMARIUM

Xanthium strumarium L đã được các nhà khoa học Ấn Độ thử nghiệm lâm

sàng trong việc điều trị bệnh động kinh Phân đoạn chiết ete được tiêm vào tĩnh mạch chuột bạch tạng Wistar (250 mg/kg và 500 mg/kg), sau đó áp dụng biện pháp sốc điện tối đa và uống thuốc động kinh pentylenetrazole (PTZ) Kết quả chỉ ra khả năng kháng chấn động sốc điện là 5,14±0,154 (250 mg/kg) và 2,64±0,16 (500 mg/kg) giây, PTZ là 523,64±1,21 và 571,36±1,62 giây [19]

Dịch chiết etanol cây Xanthium strumarium đã được Yogananda R và Sridharamurthy N B thử với hai chủng vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilus

Ninh Thế Sơn 11

NCIM 2718 và Staphylococcus aureus ATCC25923) và ba chủng vi khuẩn Gram

âm (Pseudomonas aeruginosa ATCC 27.853, Klebsiella pneumoniea ATCC 70.063,

và Eschrichia coli ATCC 25922) Kết quả dương tính với các chủng vi khuẩn được

cho là do sự xuất hiện các hợp chất tannin, flavonoit, tritecpenoit và axit phenolic trong dịch chiết [37]

Các axit béo chứa trong dầu của cây Xanthium strumarium đã được xác định

là axit palmitic 5,32 %, axit linoleic 3,68 %, axit stearic 64,2 %, và axit oleic 26,8

% [8]

Theo Whehmer (1931) trong quả Xanthium strumarium có chứa 1,27% một

chất glucozit gọi là xanthostrumarin, 3,3% nhựa và vitamin C

Theo Xocolov (1952) Xanthium strumarium ở Liên Xô có chứa ancaloit nhưng theo sự phân tích của Viện Y học Bắc Kinh (1958) thì trong quả Xanthium

strumarium có chất saponin (glucozit) (1), không có ancaloit [3]

1

Ninh Thế Sơn 12

Năm 1970, Paschenko và Pivnenko đã tìm thấy trong cây Xanthium strumarium

ở thời kỳ ra hoa chứa axit caffeic (2) và axit 1,4-dicaffeoylquinic (3) [8]

2 R = COOH

3 R = C17H17O10

Axit trans-caffeic từ phần chiết axeton quả cây Ké đầu ngựa được tiêm vào

tĩnh mạch chuột được gây tiểu đường bằng streptozotocin (chuột STZ) và chuột mắc bệnh tiểu đường không phụ thuộc vào insulin (chuột NIDDM) nhằm nghiên cứu khả năng kháng bệnh tiểu đường với liều lượng 0,5-3 mg/kg Kết quả chỉ ra khả năng chống lại sự tăng đường huyết trong máu của axit caffeic được đưa vào ở liều lượng

3 mg/kg thể trọng đạt giá trị 23,8±8,8% đối với chuột STZ và 33,4±5,7% đối với chuột NIDDM Khi sử dụng metformin (thuốc chống đái tháo đường) khả năng chống tăng lượng đường trong máu của chuột STZ là 18,4±3,1% và chuột NIDDM

là 28,2±4,5% (100 mg/kg) Tiêm axit caffeic giúp chuột duy trì được trạng thái ổn định tốt từ 30-40 phút, tối đa là 90 phút Axit caffeic không làm giảm lượng đường

mà chỉ làm ổn định lượng đường trong máu cho chuột thí nghiệm [36]

Quả ké chứa carboxyatractylozit ở dạng muối có tác dụng hạ đường huyết rất mạnh, có độc tính và xanthelin và xanthamin là những chất có tác dụng kháng khuẩn

Năm 1976, Craig J và cộng sự đã phân lập và xác định được từ Xanthium

strumarium một ditecpen glycosit là carboxyatractylosid (4) Carboxyatractylosid

và muối của nó thể hiện mức độ ức chế cao và chọn lọc với các translocator nucleotide adenine (ANT) [8]

Ninh Thế Sơn 13

4

Han T và cộng sự đã phân lập được 7 hợp chất từ cây Xanthium strumarium

bao gồm các thiazin là

7-hydroxymethyl-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzo[1,4]thiazin-3,5-dion 11-O-β-D-glucopyranoside (5), hydroxymethyl-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzol[1,4]thiazin-3,5-dion-11-O-β-D-

2-hydroxy-7-glucopyranosid (6), xanthiazon (7); và các hợp chất phenolic là axit chlorogenic (8), axit ferulic (9), formonometin (10), và ononin (11) [30]

Ninh Thế Sơn 15

13 R = R1 = R2 = H

14 R = H, R1, R2 = Δ21,22

15 R1 = R2 = H, R = β-D-Glc Năm 1974, Khafagy đã lần đầu tiên tách từ quả Xanthium strumarium một

sesquitecpen-lacton không no dãy xanthanolit (16) [3]

16

Sau đó rất nhiều hợp chất có bộ khung sesquitecpen lacton dãy xanthanolid

đã được phân lập từ Xanthium strumarium, Xanthium canadense, Xanthium

orientale, Xanthium indicum, Xanthium spinosum, Xanthium pungens, Xanthium

catharticum [20] như xanthatin (17), xanthanol (18), 2-epi-xanthanol (19),

epi-xanthatin (20), 2-hydroxytomentosin (21), xanthumin (22), 2-epi-xanthumin (23),

8-epi-xanthatin-lβ,5β-epoxid (24), tomentosin (25), lβ,5β-epoxy-1,5-dihydroxanthatin

(26), 1α,5α-epoxy-1,5-dihydroxanthatin (27),

2-hydroxy-4-O-acetyl-desacetylxanthanol (28), 2-oxo-4-O-acetyl-2-hydroxy-4-O-acetyl-desacetylxanthanol (29),

4-O-β-Ninh Thế Sơn 16

D-glucopyranosyl-11α,13-dihydro-8-epi-desacetylxanthiuminol (30),

2-O-β-D-glucopyranosyl-8-epi-desacetylxanthiuminol (31), 8-epi-xanthatin (32), 11α,13-dihydro-tomentosin (33), 1β,5β-epoxy-1,5,11α,13-

11α,13-dihydro-tetrahydro-8-epi-xanthatin (34), xanthatin (35), hydroxytomentosin (36), 11αH,13-dihydroxanthumin (37), và bis-

Ba sesquitecpen được phân lập từ Xanthium strumarium là xanthatin,

xanthinosin, và axit 4-oxo-bedfordia đã được chứng tỏ là các chất ức chế sự tổng hợp NxOy của tế bào thần kinh đệm (IC50 đạt các giá trị lần lượt là 0,47, 11,2, và 136,5 µM)

Lim H J và cộng sự đã phân lập được hợp axit 4-oxo-bedfordia (39) từ cây

Xanthium strumarium [14]

39

Ninh Thế Sơn 18

Xanthinosin được nghiên cứu ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật Kết quả chỉ ra rằng ở nồng độ chất này nhỏ hơn 32 µM chất này không gây ảnh hưởng tới sự phát triển của cây trồng Khi nồng độ đạt 160 µM khả năng ức chế cây trồng bắt đầu thay đổi Với nồng độ 800 µM thì cây hai lá mầm như cây mào gà, rau diếp nhạy cảm hơn loài một lá mầm như cây lúa mì và lúa nước Khả năng ức chế bộ rễ cây mào gà và cây rau diếp là 78% và 89% trong khi đó cây lúa mì là 69% và cây lúa nước là 66% [32]

Hợp chất 1β-hydroxy-5α-chloro-8-epi-xanthatin từ Xanthium sibiricum có

khả năng ức chế tế bào ung thư gan SNU 378 với giá trị IC50 = 5,1 µM [20]

Phần chiết clorofom từ lá Xanthium italicum cho các chất xanthatin, xanthanol, 4-epi-isoxanthanol, và 2-hydroxyxanthinosin đã được thử nghiệm độc

4-epi-tính tế bào với các dòng tế bào HeLa, MCF-7, và A431 Kết quả cho thấy xanthatin cho các giá trị IC50 tương ứng là 8,00 µM (HeLa), 3,44 µM (MCF-7), và 5,19 µM (MCF-7) 2-Hydroxyxanthinosin cho các giá trị IC50 7,78±1,21 µM (HeLa) 4-epi-

Xanthanol và 4-epi-isoxanthanol cho IC50 15,53-37,62 µM đối với cả ba dòng tế bào

Đặc tính cấu trúc vòng α-methylen-γ-lacton là yếu tố chính quyết định gây độc tế bào của cả 4 hợp chất xanthanolit Xanthatin còn có thêm nhóm α,β-cabonyl không

bão hòa là nguyên nhân làm tăng giá trị IC50

Các xanthanolit cũng tồn tại ở dạng dime như các chất xanthipungolid (40),

pungiolid A (41), và pungiolid B (42) từ cây Xanthium sibiricum [10]

Ninh Thế Sơn 19

40 41 1β-OH, 5α-H

42 1,5-epoxid

Ngoài các sesquitecpenoit và xanthanoit thì hai chất mới có khung terpenoid

dãy eremophilan là sibiriolid C (43) và sibiriolid D (44) cũng đã được tìm thấy trong

cây Xanthium sibiricum [31]

43 R1 = OH, R2 = α-CH3

44 R1 = OH, R2 = β-CH3

Hai đồng phân quang học (các đồng phân epime tại vị trí C-11) mới được tìm

ra là sibiriolid C (cấu hình R) và sibiriolid D (cấu hình S) và một số hợp chất sesquitecpen lacton được phân lập từ Xanthium sibiricumđã được thử nghiệm gây

độc in vitro với dòng tế bào ung thư gan Huh-7, ung thư họng KB, và ung thư dạ

dày BGC-823 và KE-97, cho các giá trị IC50 từ 1,1 đến 18,0 μM [31]

Li J L và cộng sự cũng đã chỉ ra sự tồn tại của các hợp chất xanthodien (45), isolantolacton (46), eudesmanolid (47), eudesmanolid 8-epimer (48), và xanthinin

(49) trong cây Xanthium indicum [20]

Ninh Thế Sơn 20

45 46 47 8β-H1 49

48 8α-H

Nghiên cứu các hợp chất có trong chi Xanthium, Li J L và cộng sự đã chỉ ra

sự xuất hiện của nhóm các kauren glycosit như axit 2-O-β-D

Ninh Thế Sơn 21

55

Theo công trình nghiên cứu gần đây nhất (10/10/2013) của Liu C., và cộng sự

về cây Xanthium sibiricum một số chất có liên kết glycozit cũng đã được phát hiện

[11]

56 57

58

Ninh Thế Sơn 22

Các hợp chất monotecpen đã được biết đến trong tinh dầu cây Xanthium như d-limonen (59), cymen (60), β-caryophyllen (61), terpinolen (62), 1-α-ionon (63), carvol (64), và α-pinen (65) [20]

59 60 61 62

63 64 65

Các hợp chất có trong Xanthium indicum Koen có đặc tính chống oxi hóa và

có IC50 ~ 141,25 µg/mL tương đương với axit ascorbic, IC50 ~ 14,12 µg/mL [21] Các hoạt tính này có thể liên quan nhiều đến các hợp chất chứa vòng phenol Ngoài cacd hợp chất đã được nêu ở trên, 5 hợp chất phenolic được tìm thấy trong quả khô

Xanthium sibiricum là axit caffeic, axit chlorogenic, cynarin, axit neochlorogenic

(66), và axit crypto-chlorogenic (67) [16]

Ninh Thế Sơn 23

66 67

Phần chiết methanol từ cây Xanthium brasilicum đã được nghiên cứu khả năng chống sốt rét (in vitro) với 3 chủng Plasmodium falciparum IC50 của dịch chiết

methanol đối với P falciparum Nf54 là 3,1, 1,2, và 5,7 mg/ml IC50 đối với P

falciparum FCM17 là 7,4, 3,9, và 21 mg/ml và IC50 đối với P falciparum QDN12

là 3,9, 2,3, và 10,3 mg/ml

Tổng kết lại các nghiên cứu trên mặt đất các bộ phận trên mặt đất của các loài

Xanthium (Asteraceae) đã phân lập được các terpenoid, chủ yếu là các sesquitecpen

dãy seco-guainolid, eremophilan, và eudesmanolid, thiazin, steroid, và các hợp chất

phenolic Các hợp chất này được xác định là tham gia vào các tác dụng sinh học và

dược lý của cây Xanhthium strumarium

Ninh Thế Sơn 24

CHƯƠNG 2 NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

Các thành phần sesquitecpenoit, thiazin, steroid, và các hợp chất phenolic có

mặt trong nhiều loài Xanthium strumarium của nhiều nước và có chức năng sinh học

nhất định trong cây thuốc này Tuy vậy cho đến nay vẫn chưa có các nghiên cứu hệ thống cho thấy rõ sự phân bố của các thành phần này trong cây Ké đầu ngựa trồng

ở Việt Nam Với mục đích đánh giá các thành phần terpenoid, flavonoid, và steroid trong cây thuốc Ké đầu ngựa của Việt Nam Luận văn này nghiên cứu thành phần

hoá học của cây Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) được thu thập ở Hòa Bình

Nhiệm vụ được đề ra cho nghiên cứu trong Luận văn bao gồm:

1 Xây dựng quy trình chiết các hợp chất hữu cơ thiên nhiên từ cành và lá cây Ké đầu ngựa Hòa Bình

2 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết để định tính các phần chiết và xác định các hệ dung môi thích hợp cho phân tách sắc ký cột

3 Phân tách sắc ký các phần chiết và phân lập các hợp chất thành phần chính bằng các phương pháp sắc ký điều chế

4 Xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập bằng các phương pháp phổ hiện đại

5 Đánh giá sự khác biệt các thành phần terpenoid, flavonoid, và steroid của cây Ké

đầu ngựa trồng ở Hòa Bình với các loài Xanthium strumarium đã được nghiên cứu

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu

Mẫu thực vật sau khi được thu hái được phơi khô trong bóng râm, sấy ở nhiệt

độ 40 oC và xay thành bột mịn Bột nguyên liệu được ngâm với metanol ở nhiệt độ

Ninh Thế Sơn 25

phòng 4 lần mỗi lần trong 3 ngày Sau đó dung phương pháp chiết hai pha lỏng với

các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, điclometan, và etyl axetat

2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Phân tích, phân tách các phần chiết và phân lập các hợp chất đã sử dụng các

phương pháp chiết, các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng (TLC), các phương pháp sắc ký điều chế như sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột loại trừ theo kích thước (SEC), sắc ký cột nhanh (FC), sắc ký cột tinh chế (Mini-C), chiết pha rắn trên pha đảo (RP-SPE), và phương pháp kết tinh chọn lọc

2.2.2.1 Phương pháp chiết hai pha lỏng

Phương pháp chiết hai pha lỏng là dung một dung môi thích hợp hòa tan chất cần tách khỏi pha nước chứa các chất ít tan trong pha hữu cơ Sau khi tách lấy dịch chiết, cất loại dung môi cho các chất hữu cơ cần quan tâm

2.2.2.2 Các phương pháp sắc ký

Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Chuẩn bị mẫu phân tích: Hòa tan mẫu thử trong dung môi thích hợp (1

mg/ml), sau đó dùng capilla hút dịch mẫu bằng lực mao quản chuyển dung dịch mẫu lên trên lớp chất hấp phụ ở vị trí của tuyến xuất phát

Dung môi triển khai: Các dung môi dùng trong TLC đều được làm khan và

chưng cất lại khi sử dụng Các hệ dung môi được pha theo tỉ lệ phù hợp Sau khi pha phải lắc kỹ cho các dung môi trong hệ trộn đều rồi cho vào bình triển khai sắc ký đáy có nút nhám kín Để yên đến khi bình được bão hòa dung môi mới tiến hành triển khai bản mỏng

Triển khai bản mỏng: Bản mỏng được cắt kích thước phù hợp, có hai tuyến

dung môi là tuyến trên và tuyến dưới Dùng kẹp sắt đưa nhanh bản mỏng đã được tẩm mẫu vào bình chạy sắc ký, đậy nắp kín, để yên quan sát Khi quan sát thấy dung

oC

Đánh dấu vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị Rf và ghi màu sắc của các vệt chất Dựa vào sắc ký đồ TLC có thể đánh giá sơ bộ số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp, khả năng phân giải của hệ dung môi và định hướng cho phân tách sắc ký điều chế

Sắc ký cột thường (CC)

Sắc ký cột được thực hiện trên chất hấp phụ silica gel theo cơ chế sắc ký hấp

phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất thiên nhiên

Phân tách hỗn hợp các chất được thực hiện dựa trên sự khác biệt về tốc độ di

chuyển của các chất khi pha động đi qua pha tĩnh Pha tĩnh thường là silica gel được nhồi trong một cột sắc ký và pha động là hệ dung môi chạy cột

Sắc ký cột thường (CC) được thường được thực hiện dưới trọng lực của dung môi

Sắc ký cột nhanh (FC)

Phân tách sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp suất nén Chất hấp

phụ cho FC thường là silica gel

Các cột sắc ký thủy tinh (Sigma-Aldrich) có đường kính khác nhau được sử

dụng tùy theo khối lượng mẫu cần phân tách

Sắc ký cột tinh chế (Mini-C)

Ninh Thế Sơn 27

Phân tách sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được sử dụng để tinh chế các hợp chất

hữu cơ Cột Pasteur pippet (0,7 cm i d × 10 cm) được nhồi silica gel Merck (cỡ hạt

15-40 μm) (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) được sử dụng cho Mini-C

Kỹ thuật nhồi cột ướt và đưa mẫu lên cột tẩm trên silica gel hoặc đưa mẫu trực

tiếp đã được sử dụng cho các phương pháp sắc ký CC, FC và Mini-C

Sắc ký cột loại trừ theo kích thước (SEC)

Sắc ký cột loại trừ theo kích thước được thực hiện theo chế độ CC dưới trọng

lực của dung môi Chất hấp phụ cho sắc ký là Sephadex LH-20 (cỡ hạt 25-100 µm) (Pharmacia Fine Chemicals, Thụy Điển)

Chiết pha rắn trên pha đảo (RP-SPE)

Chiết pha rắn trên pha đảo là quá trình chuyển chất tan (chất cần phân tích) từ

pha lỏng sang pha rắn Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu, làm giàu và làm sạch mẫu phân tích Pha rắn là loại chất hấp phụ kỵ nước kiểu silica gel biến cải (C-18) có kích thước 40 µm với đường kính lỗ xấp xỉ 60 Ao liên kết với nhóm octodecylsilan, pha động là dung môi phân cực thường là MeOH-H2O

Cột RP-SPE được sử dụng là C18 Sep-Pak Vac catridge (Waters, Hoa Kỳ) Quá trình chiết pha rắn thường được tiến hành qua 3 giai đoạn

Giai đoạn 1: Hoạt hóa pha tĩnh Cho dung môi chảy qua cột chiết để thấm ướt

các pha tĩnh, hoạt hóa các nhóm chức, đuổi bọt khí, lấp đầy dung môi vào khoảng trống Sau khi hoạt hóa, pha tĩnh cần được ngâm trong dung môi

Giai đoạn 2: Đưa mẫu phân tích vào cột chiết Các chất phân tích bị hấp phụ

thành dải ở phần đầu của cột chiết nhờ lực tương tác phân tử, hoặc liên kết hydro, lưỡng cực-lưỡng cực, hoặc theo cơ chế trao đổi ion

Giai đoạn 3: Làm sạch mẫu phân tích Tiến hành rửa giải cột chiết bằng dung

môi để rửa giải chất phân tích và loại bỏ các tạp chất

Phương pháp kết tinh lại

Ninh Thế Sơn 28

Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để phân lập và tinh chế chất rắn Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của chất ở các nhiệt

độ khác nhau

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp

phổ:

Phổ hồng ngoại (IR);

Phổ khối lượng ion hóa phun bụi electron (ESI-MS);

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR);

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (13C-NMR) với chương trình DEPT

Ninh Thế Sơn 29

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM

3.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với lớp silica gel dày 0,2 mm trên nền nhôm Chất hấp phụ cho sắc ký cột (CC và FC) là silica gel cỡ hạt 63-200 µm, 63-

100 µm, và 40-63 µm (Merck, Darmstadt, CHLB Đức)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) (500 MHz), phổ cộng hưởng

từ hạt nhân cacbon-13 (13C-NMR) và phổ DEPT (125 MHz) được ghi trên thiết bị Bruker Avance 500 với tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero cho phổ 1H-NMR và tín hiệu dung môi cho phổ 13C-NMR Độ chuyển dịch hoá học δ được biểu thị bằng ppm, J tính theo Hz Tính bội của các tín hiệu 13C được xác định trên cơ sở các phổ DEPT 90 và DEPT 135

Phổ khối lượng ion hóa phun bụi electron (ESI-MS) được ghi trên hệ thống LC-MS 6310 Agilen Ion Trap và LC/MS/MS-Xevo TQMS

Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên thiết bị Impact-410-Nicolet FT-IR

spectroscopy

3.2 NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

Nguyên liệu thực vật là lá và cành cây Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium

L.) được thu thập tại Hòa Bình vào tháng 9 năm 2012

Mẫu tiêu bản được lưu tại Phòng thí nghiệm Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

3.3 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY KÉ ĐẦU NGỰA

Nguyên liệu cành và lá (có một ít quả non) cây Ké đầu ngựa (20 kg) được

phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy ở nhiệt độ 40 oC trong vòng 2 ngày Mẫu lá

khô được đem xay thành bột mịn

Ninh Thế Sơn 30

Bột lá (3 kg) và bột cành (2 kg) được ngâm chiết trong MeOH ở nhiệt độ

phòng trong 3 ngày Dịch chiết được tách khỏi phần bã và quy trình ngâm chiết được lặp lại 4 lần Các dịch chiết MeOH tổng được gộp lại, cất loại kiệt dung môi ở 50 oC dưới áp suất giảm cho phần chiết MeOH từ lá và cành

Phần chiết MeOH được hòa thêm nước cất, sau đó dịch chiết nước này được

chiết lần lượt với n-hexan, điclometan, và etyl axetat Các dịch chiết được làm khan

bằng Na2SO4 và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho các phần chiết n-hexan

[(HBLH (lá) và HBCH (cành)], điclometan (HBLD và HBCD), và etyl axetat (HBLE và HBCE) Phần dịch nước còn lại được cất loại nước dưới áp suất giảm ở

100 oC cho một phần chiết nước (HBLW và HBCW)

Quy trình điều chế các phần chiết được trình bày trong Sơ đồ 1, Mục 4.2, Chương 4: Kết quả và Thảo Luận

Khối lượng và hiệu suất điều chế các phần chiết được nêu trong Bảng 1, Mục 4.2, Chương 3: Kết quả và Thảo luận

3.4 PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG

Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) các phần chiết sử dụng bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) và các hệ dung môi triển khai thích hợp với độ phân cực của các chất Phát hiện các vệt chất trên sắc ký đồ bằng các thuốc thử 1% vanilin/H2SO4 đặc, 5% FeCl3/EtOH, và 8% Ce2SO4/H2SO4 (15 %)

Sắc ký đồ TLC của phần chiết lá n-hexan HBLH được nêu ở Bảng 2, Mục

4.3.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận

Sắc ký đồ TLC của phần chiết lá điclometan HBLD được nêu ở Bảng 3, Mục

4.3.2, Chương 4: Kết quả và Thảo luận

Sắc ký đồ TLC của phần chiết cành n-hexan HBCH được nêu ở Bảng 4, Mục

4.3.3, Chương 4: Kết quả và Thảo luận

Sắc ký đồ TLC của phần chiết cành điclometan HBCD được nêu ở Bảng 5,

Mục 4.3.4, Chương 4: Kết quả và Thảo luận

Ninh Thế Sơn 31

Sắc ký đồ TLC của phần chiết lá và cành etyl axetat HBE được nêu ở Bảng

6, Mục 4.3.5, Chương 4: Kết quả và Thảo luận

3.5 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ ĐIỀU CHẾ

3.5.1 Phân tách sắc ký phần chiết lá n-hexan (HBLH)

Phần chiết lá n-hexan (HBLH) (55,9 g) được hòa trong một lượng vừa đủ

metanol, thêm vào 58 g silica gel (Merck, 63-200 µm) và khuấy đều cho bay hết dung môi, làm khô hỗn hợp cho đến khi thu được bột tơi mịn màu xanh đen

Cân 200 g silica gel (Merck, 63-200 µm) cho vào cốc, đổ dung môi n-hexan

vào, khuấy đều cho hết hẳn bọt khí rồi nhồi vào cột Dùng bơm nén cột nhiều lần để

ổn định cột

Phân tách phần chiết này được thực hiện trên cột CC (5 × 20 cm, silica gel

Merk, 63-200 µm), hệ dung môi rửa giải gradient n-hexan-axeton với các tỉ lệ 19:1,

9:1, 6:1, 3:1, và 2:1 Cuối cùng dội cột bằng axeton Tốc độ rửa giải 20 giọt/phút Kết quả thu được 38 phân đoạn (mỗi phân đoạn 100 ml) được gộp thành 11

nhóm phân đoạn từ HBLH1 đến HBLH11 trên cơ sở các phân tích TLC

Các nhóm phân đoạn HBLH4 và HBLH5 cho một lượng lớn tinh thể màu trắng chất HBLH4, đ.n.c 135-136 oC Hợp chất này được nhận dạng là β-sitosterol trên cơ sở phân tích và so sánh TLC và co-TLC với mẫu chuẩn β-sitosterol của chúng

tôi

Các nhóm phân đoạn HBLH1 - HBLH3 sau phân tích TLC được gộp lại với

nhau 5 g nhóm phân đoạn này được phân tách bằng sắc ký cột CC (2,5 × 30 cm,

silica gel Merck, 63-200 µm) với các hệ dung môi rửa giải gradient n-hexan-axeton

90:1, 49:1, 19:1, 9:1, 6:1, và 3:1 50 phân đoạn nhận được (mỗi phân đoạn 20 ml) được gộp thành 9 nhóm phân đoạn trên cơ sở phân tích TLC Kết tinh các nhóm phân đoạn 2 - 4 trong hệ dung môi chạy cột và rửa các tinh thể nhận được bằng

MeOH cho một hỗn hợp các axit béo (HBLH2) (18 mg)