KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH NGHIÊN CỨU SINH HỌC

VI KHU N Edwardsiella ictaluri 1.1.1... ictaluri là EIM Edwardsiella ictaluri medium.. ictaluri nh : ho t tính catalase +, ho t tính oxydase -, kh n ng sinh Indole -, sinh H2S -, sinh ax

ao nuôi T l cá ch t có th lên t i 90% cá tra gi ng, 50% cá tra th ng ph m [4].

Hi n nay, vi khu n E ictaluri đã đ kháng v i nhi u lo i kháng sinh, m t khác ch a có vaccine phòng b nh gan th n m m t cách hi u qu nên vi c xác đ nh

s m tác nhân gây b nh đóng vai trò quan tr ng trong vi c phòng ch ng, ki m soát

và đi u tr b nh cho cá Thông th ng, đ phát hi n m t tác nhân gây b nh b ng

ph ng pháp vi sinh v t trong phòng thí nghi m m t kho ng 7 ngày v i đ tin c y không cao Ph ng pháp PCR c n 5-6 ti ng v i k thu t ph c t p, đòi h i máy gia nhi t t đ ng, đi n di, thu c nhu m hu nh quang đ c h i, đòi h i ngu n nhân l c

có tay ngh và v n c n ph i làm giàu m u Do v y, m t yêu c u c p thi t là phát tri n m t ph ng pháp phát hi n tác nhân gây b nh chi phí th p, hi u qu , d s

d ng, không đ c h i, có th ph bi n trong nhi u l nh v c LAMP- Loop mediated isothermal amplification là m t ph ng pháp khu ch đ i DNA đ t đ c nh ng đi u

ki n này Tuy nhiên, do kh i l ng các s n ph m khu ch đ i t o ra r t l n nên vi c gây ô nhi m không gian phòng thí nghi m v i các s n ph m khu ch đ i c a ph n

ng là m t v n đ nghiêm tr ng, ch có th kh c ph c b ng cách không m ng sau

khi ph n ng k t thúc Vì v y chúng tôi ti n hành đ tài “Nghiên c u s d ng Calcein là ch th màu phát hi n s khu ch đ i gen eip18 c a vi khu n Edwardsiella ictaluri b ng ph ng pháp LAMP” nh m xác đ nh nhanh, chính xác,

an toàn tác nhân gây b nh gan th n m trên cá tra đ t đó có nh ng bi n pháp ki m soát và đi u tr d ch b nh k p th i

CH NG 1: T NG QUAN TẨI LI U 1.1 VI KHU N Edwardsiella ictaluri

1.1.1 c đi m sinh h c vƠ đ c đi m h gen

Edwardsiella m t trong nh ng chi m i c a h Enterobacteriaceae đ c đ t tên theo tên nhà bác h c ng i M P.R Edwards (1901–1966) ng i đ u tiên đã phân l p và phân lo i đ c vi khu n này Chi Edwardsiella g m 3 loài: Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella hoshinae trong đó E.tarda

và E ictaluri đ c xem là nh ng đ i t ng gây b nh ch y u trên cá da tr n Khác

v i E tarda có kh n ng gây b nh c trên đ ng v t và ng i thì vi khu n E ictaluri

ch tìm th y trên các loài đ ng v t máu l nh đ c bi t là trong môi tr ng n c ng t Các đ c đi m sinh hóa c a vi khu n E ictaluri sai khác v i E tarda m t s đ c tính nh không sinh H2S, không sinh indole, di đ ng 25ºC và không di đ ng

37ºC

Vi khu n thu c chi Edwardsiella mang các đ c đi m đi n hình c a h Enterobacteriaceae: vi khu n Gram âm, hình que th ng, nh , kích th c 1×2-3 µm, không hình thành bào t và di đ ng b ng tiên mao, hô h p k khí tùy ti n Kích

th c khu n l c trên môi tr ng c s sau 24 gi nuôi c y r t nh (0,5-1 mm) [8]

ch bi n nhi t Trong khi đó E tarda và E hoshinae sinh tr ng và phát tri n nhi t đ cao h n, kho ng 37ºC M t khác bi t n a so v i hai ch ng còn l i, E ictaluri sinh tr ng r t ch m trên môi tr ng th ch đ a, thông th ng sau 2-3 ngày

nuôi c y 30ºC m i t o thành khu n l c kích th c 1 mm V m t sinh hóa, E ictaluri c ng ít ho t tính h n so v i các loài Edwardsiella khác [8]

Genome c a E ictaluri là m t nhi m s c th đ n d ng vòng, có kích th c kho ng 2,15 Mb Nghiên c u DNA ch ra r ng E ictaluri liên quan ch t ch nh t

đ n E tarda Trong h gen c a E ictaluri thì h gen eip là đ c tr ng ch có loài

E ictaluri H gen này bao g m 11 gen trong đó 8 gen xác đ nh mã hóa cho protein Trong s này có 3 gen l n l t là eip18, eip19, eip20 mã hóa cho các s n ph m protein v i tr ng l ng kho ng 18, 19 và 20 kDa Theo Moore và c ng s (2002) thì gen eip18 đ c bi u hi n trong quá trình nhi m b nh và đóng vai trò là kháng nguyên gây đáp ng mi n d ch [17] Do h gen này mang tính đ c tr ng cho loài nên có th s d ng m t trong s 3 gen này đ phân l p đ n loài b ng ph ng pháp sinh h c phân t Hi n nay, gen eip18 là gen đ c dùng nhi u trong các nghiên c u

đ phát hi n, đ nh danh vi khu n E ictaluri, tác nhân gây b nh nhi m trùng huy t trên cá da tr n M [31]

và ki m soát d ch không t t d n đ n vi c d ch b nh di n ra quanh n m

Vi t Nam, nh ng n m g n đây cá tra là loài cá n c ng t đ c nuôi và

xu t kh u nhi u nh t so v i các đ i t ng th y s n khác N m 2011 xu t kh u cá tra đ t 1,806 t USD, kh i l ng xu t kh u trên 600 nghìn t n [3] i t ng này

đ c nuôi v i quy mô công nghi p m t s t nh đ ng b ng Sông C u Long nh :

An Giang, ng Tháp, C n Th , B n Tre, Ti n Giang… Nuôi tr ng cá tra là m t trong nh ng ngành có t c đ phát tri n r t nhanh và đem l i l i nhu n cao cho

ng i dân B nh gan th n m xu t hi n đ u tiên n c ta vào cu i n m 1998 [4]

M c dù đ c phát hi n mu n h n so v i m t s các b nh khác nh ng b nh gan th n

m đ c đánh giá là b nh gây thi t h i nghiêm tr ng Theo báo cáo n m 2011, t ng

di n tích th nuôi c a các đ a ph ng thu c đ ng b ng Sông C u Long vào kho ng 6.800 ha, b nh gây thi t h i kho ng 500 ha [3, 35] T l cá ch t do nhi m b nh cao, t 50 - 60% và nguy hi m nh t là giai đo n cá gi ng, t l cá ch t có th lên t i 90% [6]

Khi cá b b nh ng i nuôi th ng dùng ch t hoá h c và thu c kháng sinh đ

ch a tr , tuy nhiên do s d ng b a bãi, vi khu n E ictaluri trên cá tra đã kháng v i

m t s lo i thu c kháng sinh nh : Oxytetracylin, Oxolinic acid, Sulphonamid [1]; Amoxicilin và Ampicilin [5] Vi c s d ng kháng sinh còn làm cho các s n ph m

th y s n sau đó th ng không đ c a chu ng do s tích l y thu c, hoá ch t trong

th t

Nh v y b nh gan th n m đ c đánh giá là m t trong nh ng b nh gây t n

th t l n cho ngành nuôi tr ng th y s n, đ c bi t là cá tra và cá basa c a n c ta

Vi c phân l p đ xác đ nh chính xác tác nhân gây b nh là r t c n thi t đ ng i nuôi

hi n vi khu n M u b nh ph m sau khi thu nh n đ c nuôi c y trên môi tr ng

ch n l c riêng dành cho vi khu n E ictaluri là EIM (Edwardsiella ictaluri medium) Vi khu n phát tri n trên EIM đ c phân bi t v i E ictaluri d a trên hình thái c a khu n l c EIM c ch vi khu n Gr (+) ngo i tr c u khu n (Enterococci) Ngoài ra, fungizone c ng đ c thêm vào EIM nh m ng n ch n s phát tri n c a

h u h t các lo i n m EIM cho phép đánh giá ngu n môi tr ng, m c đ nhi m và ngu n mang E ictaluri Sau khi c y tr i vi khu n trên môi tr ng EIM, nuôi c y nhi t đ 28oC sau 24 – 48 gi thu đ c khu n l c đ n có hình tròn nh màu xanh và kích th c t 0,5 – 1 mm [27]

1.2.1.2. Xác đ nh ho t tính sinh hóa đi n hình

Bên c nh ph ng pháp vi sinh, đ phát hi n chính xác vi khu n E ictaluri, ta

ti n hành các ph n ng sinh hóa đ c tr ng c a E ictaluri nh : ho t tính catalase (+), ho t tính oxydase (-), kh n ng sinh Indole (-), sinh H2S (-), sinh axit trên các môi tr ng sucrose, monitol, arabinose E ictaluri có ho t tính protease r t h n ch , không phân h y casein, gelatin, collagen nh ng l i phân h y chrondroitin sulfate và

có ho t tính tan huy t [8]

Vi c phân lo i d a vào ph ng pháp truy n th ng t n th i gian mà đ chính xác ch a cao nên r t h n ch trong ch n đoán d ch b nh

1.2.2 Ph ng pháp PCR vƠ sequensing

1.2.2.1. Phân lo i d a vào 16S rDNA

Vi c s d ng các trình t gen mã hóa 16S rRNA đ nghiên c u phát sinh loài

vi khu n và phân lo i đã đ c s d ng r t ph bi n Gen mã hóa 16S rRNA t n t i

nh m t h đa gen ho c operon; ch c n ng c a gen mã hóa 16S rRNA không thay

đ i theo th i gian cho th y s thay đ i th t ng u nhiên là m t th c đo chính xác trong quá trình ti n hóa và gen 16S rRNA có kích th c kho ng 1500 bp là đ l n cho các m c đích thông th ng dùng trong phân lo i c p đ phân t [21]

i v i hai loài E ictaluri và E tarda, sau khi s d ng PCR nhân trình t 16S rDNA, đ c trình t cho th y đ t ng đ ng rDNA c a hai loài lên t i 99,6% [5] và c ng ch có th k t lu n tác nhân gây b nh thu c chi Edwardsiella

Nh v y k t h p ph ng pháp truy n th ng và ph ng pháp phân lo i d a vào 16S rDNA có th phát hi n đ c E ictaluri song t ng th i gian nghiên c u

c ng khá dài, lên đ n 7 ngày

1.2.2.2. Phân lo i d a vào gen đ c tr ng

Gen eip18 là m t trong ba gen đ c tr ng ch có E ictaluri mà không có

E tarda, cho nên nó đ c xem là m t trong nh ng ch th phân t đ xác đ nh chính xác đ n c p đ loài Vì v y đ ki m tra xem ch ng vi khu n nào có ch a đo n gen

đó có th s d ng ph ng pháp PCR v i c p m i là eip18 nh m nhân s l ng l n gen eip18 đ i v i nh ng ch ng có đo n gen này Sau khi khu ch đ i, s n ph m

đ c đi n di và nhu m Ethidium bromide Toàn b qui trình đ đ c đ c k t qu

m t kho ng 6 ti ng [7] v i k thu t ph c t p, máy móc đ t ti n, thu c nhu m DNA

đ c h i

1.2.3 Ph ng pháp LAMP

N m 2000, Notomi và c ng s đã phát tri n k thu t LAMP (Loop-mediated isothermal amplifications), m t ph ng pháp phát hi n d a trên vi c khu ch đ i

m t trình t DNA có s n đi u ki n đ ng nhi t [20] T đó đ n nay k thu t này

đ c th gi i ng d ng đ phát hi n r t nhi u tác nhân sinh h c bao g m virut, vi khu n, n m, kí sinh trùng…, trong đó có E ictaluri [26]

LAMP có kh n ng t ng h p m t l ng l n DNA, RNA mà không c n máy gia nhi t t đ ng Ph ng pháp LAMP d a vào quá trình t ng h p DNA đ c th c

hi n b i m t DNA polymerase có ho t tính t tách chu i cao và hai c p m i đ c

hi u B c đ u tiên c a quá trình b n m i đ c s d ng, sau đó hai m i đ c s

d ng cho m i chu k Toàn b quá trình khu ch đ i đo n DNA đích c n th i gian

kho ng 60 phút S n ph m cu i cùng nh n đ c là các đo n DNA d ng g p khúc có kích th c g p nhi u l n kích th c c a đo n gen đích DNA polymerase th ng

đ c s d ng trong các ph n ng LAMP là Bst DNA polymerase ho c Bsm polymerase Ph ng pháp LAMP r t nh y, có th thu đ c k t qu t t ngay n ng

đ DNA th p [31] Tuy nhiên, m i dùng cho ph n ng LAMP l i ph c t p h n m i cho ph n ng PCR thông th ng Ph n ng LAMP c n ph i s d ng ít nh t hai c p

m i, m t c p có chi u dài 40 nucleotide và đ c thi t k đ c bi t, c p còn l i có chi u dài kho ng 20 nucleotide Do đó, đ đ c hi u c a ph n ng cao h n nhi u so

v i ph ng pháp PCR

- Không đòi h i máy bi n nhi t đ t ti n nh PCR b i vì t t c ph n ng di n

ra t i 1 nhi t đ c đ nh Do v y ch c n m t máy n nhi t đ n gi n c a phòng thí nghi m bình th ng

- K t qu có th đ c đ c ngay sau khi ph n ng k t thúc mà không c n

đi n di trên gel agarose d a vào s t o thành Mg2P2O7 k t t a là s n ph m ph c a

ph n ng khu ch đ i gen có th đ c xác đ nh b ng ly tâm ho c đo đ đ c Ho c

d a vào s chuy n màu c a ch th kim lo i ví d Calcein, FDR (Fluorescent detected reagent), HNB (Hydroxyl naphthol blue) hay SYBR Green I

- Th i gian th c hi n ph n ng r t ng n, v i gi i h n phát hi n cao g p h n

k thu t PCR t 10 – 1000 l n

- đ c hi u cao vì s d ng 2 c p m i nh n bi t 6 trình t khác bi t trên DNA đích trong b c đ u tiên và 4 trình t trong các b c sau đó

Ph n ng LAMP c n ít nh t 4 m i: c p m i ngoài F3, B3 có vai trò trong

vi c chuy n m ch nên ch tham gia vào giai đo n đ u c a ph n ng; c p m i trong

FIP, BIP là m i lai ch a c trình t khuôn và đ i khuôn giúp cho vi c hình thành vòng loop

M i ngoài ng c B3 b sung v i B3c c a DNA, m i ngoài xuôi F3 b sung

v i F3c c a DNA M i trong xuôi FIP g m F1c đ u 5’ gi ng trình t F1c trên DNA đích và F2 đ u 3’ b sung v i F2c DNA đích, t ng t m i trong ng c BIP g m B1c đ u 5’ có trình t gi ng B1c DNA đích và B2 đ u 3’ có trình t

b sung v i vùng B2c DNA đích

Hình 2: M i cho ph n ng LAMP

6 vùng khác bi t trên s i DNA khuôn đ c kí hi u là F3, F2, F1, B1c, B2c và B3

t đ u 5’ Kí t c có ngh a là vùng trình t này n m trên s i b sung, trình t F1c là trình

t b sung v i trình t F1, B1c là trình t b sung v i trình t B1, B2c là trình t b sung

v i trình t B2 Hai m i trong là BIP và FIP và hai m i ngoài là F3 và B3 đ c s d ng trong ph n ng LAMP FIP (BIP) là m i lai có ch a trình t F1c (B1c) và F2 (B2)

Thi t k m i thích h p là m t chìa khóa quan tr ng trong khu ch đ i gen s

d ng ph ng pháp LAMP Có th thi t k m i th công ho c s d ng ph n m m

Các đi m chính đ thi t k m t m i t i u [20,29]:

- Các đi m k t thúc c a m i không đ c giàu AT đ tránh s t o thành c u trúc b c 2 c a m i và s b t c p v i m i khác

- Nhi t đ nóng ch y Tm c a m i vùng kho ng 55-65ºC, t ng đ ng v i nhi t đ t i u c a Bst polymerase

- Tm c a F1c và B1c h i cao h n F2 và B2 đ c u trúc loop đ c hình thành ngay sau khi s i đ n DNA đ c gi i phóng t m ch g c

- Tm c a m i ngoài (B3, F3) nh h n F2, B2 đ đ m b o r ng s t ng h p

nh c p m i trong x y ra tr c c p m i ngoài Thêm vào đó n ng đ c p m i ngoài

b ng 1/4 đ n 1/10 c p m i trong

- Kho ng cách gi a các đo n trình t t đ u 5’ c a F2 và B2 kho ng 120-180

bp, kho ng cách gi a 2 đo n trong F2-F3 và B2-B3 t 0 đ n 20 bp Kho ng cách trong vùng t o loop (t đ u 5’ c a F2 t i 3’ F1 và 5’ B2 đ n 3’ B1) kho ng 40-60bp

- Chi u dài c a trình t DNA khu ch đ i (t F2 đ n B2) không nên l n h n 200bp

- tinh khi t c a m i là r t quan tr ng đ kh n ng tái khu ch đ i nhanh chóng

- N u trên gen đích ho c trên vùng ch a primer có v trí c t c a enzyme gi i

h n thì có th đ c s d ng đ xác đ nh chính xác s n ph m khu ch đ i

1.2.3.3. Nguyên lý c a ph ng pháp LAMP

LAMP là m t quá trình t ng h p DNA t đ ng đ c th c hi n m t nhi t

đ không đ i t 60-65ºC trong kho ng th i gian 45-60 phút v i s có m t c a Bst DNA polymerase, dNTP, v i ít nh t 4 m i đ c thi t k b sung v i 6 trình t riêng

bi t trên gen đích Có hai b c khu ch đ i LAMP là b c không theo chu k và

b c theo chu k [22]

- B c không theo chu k : m c tiêu là t o ra s i DNA có hai vòng loop hai

đ u, là c u trúc kh i đ u cho b c LAMP theo chu k V i ph ng pháp LAMP, không gi ng nh PCR, không c n có s bi n tính DNA s i đôi b i nhi t đ Thông qua ho t đ ng c a DNA polymerase có ho t tính t tách chu i cao, m i đ c g n vào DNA đích, b t đ u t khu v c F2 đ u 3’ c a FIP, t ng h p DNA m i theo nguyên t c b sung Sau đó, m i F3 liên k t v i khu v c F3c bên ngoài m i FIP,

t ng h p s i DNA b sung v i DNA đích thay th s i DNA mà FIP đã t ng h p, do

đó m t s i DNA đôi đ c hình thành t s i DNA đ c t ng h p t m i F3 và DNA đích, gi i phóng m t s i DNA đ n có đ u là FIP S i đ n này hình thành c u trúc loop đ u 5’ do s b sung gi a F1c và F1 S i DNA đ n này đ c dùng làm khuôn kh i đ u quá trình t ng h p DNA b ng m i BIP và B3, quá trình t ng h p

t ng t nh trên b t đ u t v trí 3’ c a BIP Sau đó, m i B3 t ng h p ra m t s i

m i b sung v i khuôn nên gi i phóng s i đ n đ c t ng h p b i m i BIP S i DNA đ n này hình thành c u trúc loop hai đ u nhìn gi ng qu t DNA c u trúc

gi ng qu t nhanh chóng t ng h p DNA do s t m i C u trúc này là c u trúc

kh i đ u cho s khu ch đ i hàm m theo chu k k ti p (Hình 3)

Hình 3: B c t o c u trúc kh i đ u (không theo chu k )

Quá trình đ c kh i đ u là m i FIP, vùng F2 b t c p v i vùng F2c trên s i DNA khuôn và kh i đ u cho s kéo dài chu i v phía đ u 5’ c a s i khuôn Ti p t c đ n m i BIP, vùng B2 c ng g n v i vùng B2c c a s i DNA và kéo dài chu i M i F3 ti p t c đ n

và g n vào v trí F3c trên DNA khuôn, m t s i m i đ c t ng h p t m i F3 và thay th cho s i t ng h p b i m i FIP S i đ n t ng h p b ng m i FIP s b đ y ra và hình thành nên m t c u trúc loop đ u 3’ c a nó (c u trúc 3) Quá trình s đ c ti p di n v i m i BIP

và m i B3 Cu i cùng m t s i đ n có c u trúc loop c hai đ u 3’ và 5’ đ c hình thành (c u trúc 5)

- Khu ch đ i theo chu k : trong chu k LAMP, m i trong liên k t b sung

v i đo n loop trong s n ph m và b t đ u t ng h p s i DNA thay th , t o ra s i DNA loop m i v i chi u dài g p đôi Trong th i gian ng n, m i FIP liên k t v i

đo n loop c a s i đ n g c, t ng h p s i DNA thay th , phát hành s i t ng h p

tr c đó t o ra s i đ n có c u trúc loop đ u 3’ vì liên k t b sung gi a B1c và B1 Sau đó, b t đ u t đ u 3’ c a B1, s t ng h p DNA b t đ u b ng cách s d ng c u trúc c a b n thân nh là khuôn và gi i phóng s i b sung liên k t v i FIP, s i đ n này có c u trúc gi ng qu t v i loop hai đ u do b sung gi a F1-F1c, B1-B1c

H n n a, BIP liên k t v i B2c t ng h p s i thay th , gi i phóng s i DNA m i b i B1 K t qu là t o ra các c u trúc có kích th c khác nhau, g m các trình t l p l i luân phiên đ o ng c c a trình t đích trên các s i m i đ c t o thành Ph n ng theo chu k ti p t c v i s tích l y c a 109 b n sao c a DNA đích trong vòng ch a

đ y 1 gi

c u trúc 7 s đ c hình thành là c u trúc b sung v i c u trúc 5 C u trúc 5 đ c hình thành t c u trúc 8 trong ph n ng theo ki u hình thành c u trúc 5-7 C u trúc 9 và c u trúc 10 đ c hình thành t c u trúc 6 và c u trúc 8, và các c u trúc kéo dài h n ti p t c

đ c t o thành

1.2.3.4. DNA đích

Hi u qu c a ph n ng LAMP ph thu c vào kích th c c a DNA đích K t

qu t t nh t là DNA đích có kích th c 130-200 bp N u DNA đích dài h n 500bp

nh ng l i thi u ho t tính 3’-5’ exonuclease Bst DNA polymerase có đ ho t đ ng

r t cao, ho t đ ng nhi t đ t i u 60ºC- 65ºC B b t ho t nhi t đ l n h n 70ºC Nó v a có kh n ng tách chu i, v a có kh n ng t ng h p chu i m i Do đó

trong quá trình khu ch đ i DNA không c n thêm b c bi n tính DNA nhi t đ cao [16]

1.2.3.6. Betaine ( N,N,N- trimethylglycerine)

Trong các h th ng sinh h c, betaine ho t đ ng nh m t ch t đ c t bào t

t ng h p ho c l y t môi tr ng bên ngoài đ ch ng l i áp l c th m th u, h n hán,

đ m n cao ho c nhi t đ cao Khi betaine tích t trong c th , nó giúp n đ nh c u trúc b c 4 c a protein, n đ nh ch c n ng c a enzyme, n đ nh tính toàn v n c a màng, cho phép gi n c trong t bào, do đó b o v t bào kh i nh ng nh h ng

c a s m t n c [32]

Glyceryl betaine (N,N,N- trimethylglycerine) là betaine đ c phát hi n đ u tiên trong c c i đ ng th k 19 Tuy nhiên, đ i v i DNA thì betaine là ch t hóa

h c gây m t n đ nh xo n c a DNA (có th làm gi m s hình thành c u trúc th

c p trong trình t giàu GC), giúp DNA có th ch p nh n DNA polymerase bám vào,

đ c phát hi n đ nâng cao hi u qu khu ch đ i c a DNA trong ph n ng LAMP

S có m t c a 0,5- 1,5 M betaine giúp gi m s ch ng chéo c a các baz , nh h ng không ch đ n đ nh y c a ph n ng mà còn t ng m c tiêu ch n l c v i vi c gi m đáng k trình t không liên quan [20,31]

Hình 5: C u trúc hóa h c c a trimethylglycerine 1.3 CÁC PH NG PHÁP PHÁT HI N S N PH M C A PH N NG

Tuy nhiên, do kh i l ng s n ph m khu ch đ i c a ph n ng LAMP là r t

l n, khi m n p th c hi n các thao tác đi n di có th làm DNA bung ra ngoài khu ch tán vào không khí ng n ch n ô nhi m chéo, ph ng pháp phát hi n s n

ph m khu ch đ i ngay trong ng mà không c n m n p đ c phát tri n Nói chung,

quá trình khu ch đ i DNA nh DNA polymerase đi cùng v i vi c t o ra magie pyrophosphate (Mg2P2O7), đ c t o ra do k t qu c a s k t h p gi a ion pyrophosphate t o ra t nguyên li u dNTP và Mg2+ trong dung d ch ph n ng M t

l ng l n DNA cao đ c t ng h p t ph n ng LAMP d n đ n đ ng th i s n xu t

m t l ng l n ion pyrophosphate Ion pyrophosphate liên k t c c m nh v i các ion kim lo i khác t o mu i không tan và có th quan sát đ c b ng m t th ng Tuy nhiên, các tín hi u này khá y u nên m t th ng khó phát hi n đ t hi u qu cao

h n, s n ph m khu ch đ i trong ng còn đ c phát hi n b ng cách nhu m tr c ti p DNA s i đôi nh các thu c nhu m nh SYBR Green, PicoGreen…[18], trong đó

đ n gi n và d s d ng nh t là SYBR Green ho c phát hi n hu nh quang gián ti p

s n ph m LAMP trong ng nh vào s n ph m ph pyrophosphate b ng vi c s

d ng Calcein

1.3.2 S d ng SYBR Green I

SYBR Green I k t h p v i DNA s i đôi thì phát quang, vì v y khi s n ph m càng tích l y thì tín hi u hu nh quang càng t ng lên Nh ng l i th c a SYBR Green I là d s d ng và nh y c m i m b t l i là SYBR Green I s ph n ng liên

k t v i b t kì DNA s i đôi nào, bao g m c dimer do m i sinh ra và các s n ph m

ph n ng không đ c hi u khác

Hình 6: S ho t đ ng phát quang c a SYRB Green

M t khác, n u thêm SYBR Green I tr c ph n ng, do đ c tính liên k t ch t

v i DNA đôi, nó có th gây c ch ph n ng, nh ng n u m n p đ thêm SYBR Green I vào sau khi ph n ng k t thúc l i gây ra nguy c ô nhi m chéo Và cu i cùng, SYBR Green I là hóa ch t đ t ti n khó đ c ng d ng m t cách r ng rãi nh EtBr

kh c ph c nh ng nh c đi m trên, h th ng phát hi n s n ph m khu ch

đ i c a ph n ng LAMP nh Calcein đ c phát tri n ây là m t h th ng phát

hi n không ch đ n gi n, giá thành r , h u ích trong nghiên c u c b n v y h c,

d c ph m, v sinh môi tr ng, các th nghi m trong nông nghi p…mà còn gi m

nguy c ô nhi m không gian làm vi c, không c n thi t b chuyên d ng và gi m thi u ngu n nhân l c

1.3.3 S d ng Calcein

1.3.3.1. Công th c hóa h c và tính ch t c a Calcein

Calcein có công th c hóa h c C30H26N2O13 kh i l ng phân t 622,55 g/mol

v i tên qu c t là 8- [N, N- Bis (carboxymethyl) aminomethyl]- methylunbelliferone, có màu tr ng ho c màu vàng cam d ng b t

4-Hình 7: C u trúc hóa h c c a Calcein

Calcein là m t ch th kim lo i hu nh quang đ c s d ng đ phát hi n m t

s kim lo i nh Ca2+, Mg2+ Nó hòa tan trong dung d ch ki m, nh ng ít tan trong

n c H ng s phân ly proton c a nó đ c báo cáo là pKa1 = 2,45; pKa2 = 7,24 và pKa3 = 11,3 Calcein phát x quang h c b c sóng ánh sáng t 495 đ n 515 nm

và c c đ i b c sóng 509 nm t i pH 7.4 S thay đ i màu s c c a ch th kim lo i này có th đ c quan sát b ng m t th ng ho c d i tia UV S phát quang c a Calcein đ c d p t t b i các ion kim lo i nh Co2+, Ni2+ và Cu 2 +, Fe3+ và Mn2+ Tuy nhiên, Calcein t o thành m t h p ch t phát hu nh quang m nh v i các kim lo i

ki m th [34]

Hi n nay s n ph m th ng m i ch a Calcein đang đ c s d ng ph bi n là FDR (Flourescent dectection reagent) do công ty Eiken c a Nh t cung c p

1.3.3.2. S phát quang c a Calcein

G n đây, Tomita và c ng s n m 2008 đã báo cáo m t ph n ng LAMP

đ c phát hi n b ng cách thêm Calcein và ion Mn2+ vào ph n ng Calcein không

đ c h i nh nh ng thu c th hu nh quang khác nh SYBR Green, EtBr (do liên k t

v i DNA gây đ t bi n) Trong khi đó, k t qu quan sát tr c quan s thay đ i màu

s c mà không c n m n p ho c b t k thi t b phát hi n chuyên d ng nào

H n h p Calcein và Mn2+đ c thêm vào tr c ph n ng Do s có m t c a ion Mn2+, Calcein liên k t v i Mn2+nên ph n ng phát hu nh quang c a Calcein b

d p t t (không phát quang), dung d ch có màu cam N ng đ ion Mg2+ trong môi

tr ng dung d ch ban đ u không đ đ đ y đ c Mn2+ ra kh i Calcein khi không có ion P2O74- Khi ph n ng khu ch đ i DNA x y ra v i s có m t c a DNA đích:

Hình 8: Nguyên t c c a vi c s d ng ion kim lo i phát quang (Calcein)

Trong quá trình khu ch đ i DNA nh DNA polymerase, ion pyrophosphate đ c tao ra t dNTPs là s n ph m ph c a ph n ng Calcein trong h n h p ph n ng ban đ u

k t h p v i Mn2+ làm cho s phát quang không di n ra Khi s n ph m ph n ng đ c khu ch đ i, pyrophosphate t c Mn2+ c a Calcein nh đó ion Mg2+ thay th vào v trí

Mn2+ d n đ n phát hu nh quang

Hình 9: Phát hi n s n ph m LAMP b ng ch th kim lo i phát hu nh quang

Calcein d i ánh sáng th ng và d i UV [22]

Ph n ng d ng (bên trái) cho màu vàng chanh d i ánh sáng th ng và phát

quang m nh d i đi u ki n UV

Ph n ng âm (bên ph i) cho màu da cam d i ánh sáng th ng và không phát

quang d i đi u ki n UV

CH NG 2: V T LI U VẨ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 V T LI U

2.1.1 M u DNA

DNA đã đ c tinh s ch c a các ch ng vi khu n:

Edwardsiella ictaluri E7, E5, E40 đ c phân l p t i Vi t Nam, E ictaluri ATCC 33202 (Ei), Edwardsiella tarda ATCC 15469 đ c cung c p b i Phòng K thu t di truy n, Vi n Công ngh sinh h c, Vi n Khoa h c và công ngh Vi t Nam

Các ch ng vi sinh v t ki m đ nh: Vibrio sp., Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Salmonella enteretidis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Aeromonas hydrophila, Enterococcus sp đ c cung c p b i Phòng K thu t di truy n, Vi n Công ngh sinh h c, Vi n Khoa h c

và công ngh Vi t Nam

2.1.2 Hóa ch t, enzyme, máy móc

Các hóa ch t dùng trong nghiên c u

+ m Tris HCl pH 8,8, acetic acid, EDTA, DMSO, KCl, MgSO4, (NH4)2SO4, MnCl2 (MERK), Calcein, Triton 100X, Betaine, Agarose, dNTPs

(Fermentas), thang DNA chu n 100bp và 1kb (500µg/ml) (Fermentas), Ethidium

bromide (Sigma)

+ Các enzyme: Bst DNA polymerase (8000U/ml) (New England BioLabs), enzyme gi i h n FastDigest Mnl I (Fermentas)

+ Các m i đ khu ch đ i gen eip18: hai c p m i dùng đ nhân gen eip18 đã

đ c thi t k và đ c đ t t ng h p t i hãng Invitrogen, Anh (B ng 1)

Các thi t b dùng trong nghiên c u

ng Eppendorf 1,5 ml, 0,5 ml và 0,2 ml, máy ly tâm nh , máy spin, máy n nhi t dùng n c ( c), máy PCR 9700 (M ), máy đi n di, máy soi gel, l c vô khu n 2 µm, b pipet, máy đo quang ph (Nh t)…

B ng 1: Danh sách các m i nhơn gen eip18 c a vi khu n E ictaluri b ng

F1c TTTT F2

44 (F1c: 22, F2: 18) CAGGAAACCATTGATTTCGCC

TTTT CCGCCTTACCGCTCTGAT BIP M i trong ng c

- Dung d ch nhu m gel Ethidium bromide 0,5 µg/ml

- Dung d ch TAE 50x: 24,2 g Tris base; 5,71 ml acid acetic; 10 ml EDTA 0,5 M; ch nh pH = 8

b o qu n -20ºC

- Buffer dùng cho ph n ng LAMP:

B ng 3: ThƠnh ph n 10x LAMP buffer ch y cho ph n ng LAMP v i

Ph n ng LAMP đ c th c hi n th tích 25µl trong các ng eppendorf 0,2

ml, đ c b sung thêm thu c th Calcein đã liên k t v i Mn2+ vào h n h p ph n

ng LAMP Thành ph n cho ph n ng LAMP đ c th hi n trong b ng 4

- H n h p thành ph n ph n ng (tr Bst DNA polymerase và DNA khuôn)

đ c tr n đ u

- Chia 23 µl h n h p trên vào các ng eppendorf 0,2ml

- B sung 1 µl DNA khuôn, đ i ch ng âm DNA đ c thay th b ng n c

- Thêm 1µl Bst DNA polymerase r i ch y chu trình nhi t nh sau: 60 phút

65oC, 10 phút 80ºC và k t thúc 22oC

C s lý thuy t: Ph ng pháp này d a trên m t đ c tính c a axit nucleic là

pH trung tính mang đi n tích âm nh các nhóm phosphat n m trên khung photphodieste c a các s i axit nucleic i u đó có ngh a là các phân t s ch y v

c c d ng khi đ c đ t trong đi n tr ng K thu t này đ c ti n hành trong m t

đ m gel agarose có tác d ng phân tách các axit nucleic theo kích th c Th c hi n

nh sau:

- Chu n b khuôn và l p l c có kích th c và s l ng gi ng theo yêu c u

- un tan 2,0 gam agarose trong 100 ml dung d ch đ m TAE 1X, đ vào khuôn đã l p l c

- gel ngu i và n đ nh trong 30 phút Sau đó rút l c và đ t t m gel vào trong máy đi n di, ng p trong dung d ch TAE 1X

- Tr n đ u dung d ch loading buffer 6x v i m u theo t l 1:6 Tra m u vào

gi ng

- Ch y đi n di b ng dòng đi n m t chi u v i đi n th 100 V, c ng đ dòng

đi n 80 mA trong 50 phút

- Nhu m b n gel trong dung d ch EtBr (n ng đ 0,5 l/ml) 10-15 phút

- Quan sát v ch DNA trên máy soi gel

Chú ý: Khi đi n di c n ph i m n p ng, do đó kh n ng ô nhi m cao

h n ch vi c nhi m vào m u khác, luôn luôn spin xu ng tr c khi m n p, và m

n p nh nhàng trong th i gian ng n nh t có th

2.2.3 C t DNA b ng enzyme gi i h n

Enzyme gi i h n là các nuclease n i bào có kh n ng nh n bi t các đo n DNA v i các trình t nucleotide nh t đ nh, bám vào đo n DNA đó và c t c hai s i

c a phân t DNA Các enzyme gi i h n th ng đ c s d ng đ c t DNA:

T o đ u b ng: Sma I, HinC II, EcoR V c t hai s i DNA t i cùng m t đi m

2.2.4 Xác đ nh s có m t c a Mg 2 P 2 O 7

Nguyên lý: S có m t c a Mg2P2O7 trong dung d ch ph n ng là k t qu c a

s k t h p gi a ion pyrophosphate t o ra t nguyên li u dNTP khi DNA đ c khu ch đ i trong ph n ng LAMP và Mg2+ trong dung d ch ph n ng Giá tr quang

h p th c a Mg2P2O7 b c sóng 400 nm là đ i l ng bi u th cho s có m t c a Mg2P2O7, nói cách khác nó là giá tr bi u th s khu ch đ i DNA

Ti n hành: xác đ nh ph n ng có di n ra hay không, chúng tôi ti n hành

xác đ nh gián ti p s t o thành mu i Mg2P2O7 b ng ph ng pháp đo đ đ c: 25µl

c a ph n ng LAMP đ c pha loãng 5 l n chuy n 50µl h n h p sau ph n ng vào cuvet M u chu n là dung d ch h n h p tr c ph n ng Sau đó đo OD400 L p l i

ba l n và l y k t qu trung bình.Giá tr OD400 thay đ i so v i đ i ch ng đ c xác

đ nh là có s t o thành k t t a làm t ng đ đ c c a dung d ch ph n ng đ ng ngh a

v i vi c DNA đã đ c khu ch đ i trong ph n ng

2.2.5 nh h ng c a n ng đ dNTP đ n ph n ng LAMP

Ph n ng LAMP th c hi n v i n ng đ dNTP cu i cùng trong m i ph n ng thay đ i: 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 mM i v i m i n ng đ dNTP, th c

hi n song song m t ph n ng không có DNA khuôn làm đ i ch ng

2.2.6 nh h ng c a n ng đ betaine đ n ph n ng LAMP

S d ng n ng đ dNTP t i u đã xác đ nh đ c Ph n ng LAMP đ c th c

hi n v i n ng đ betainecu i cùng trong t ng ph n ng thay đ i: 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 M i v i m i n ng đ betaine, th c hi n song song m t ph n

ng không có DNA khuôn làm đ i ch ng

2.2.7 nh h ng c a t l m i ngoƠi vƠ m i trong đ n ph n ng LAMP

S d ng n ng đ dNTP, betaine t i u đã xác đ nh đ c Ph n ng LAMP

ti p t c đ c th c hi n v i các m i có t l (m i ngoài:m i trong) là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7 1:8 đ c s d ng cho các ph n ng LAMP khu ch đ i đ c hi u gen eip18 N ng đ m i ngoài có trong m i ph n ng là 0,16 µM i v i m i t l

m i, th c hi n song song m t ph n ng không có DNA khuôn làm đ i ch ng