Nghiên cứu tạo dung dịch keo bạc nano để phòng trừ bệnh rụng lá corynespora trên cây cao su do nấm corynespora cassiicola

[2] Lê Thị An Nhiên, Trần Đức Trọng, Lê Thị Thủy Tiên, Nguyễn Đức Lượng, Lê Quang Luân, “Nghiên cứu sinh tổng hợp bạc nano từ dịch nội bào vi khuẩn Bacillus subtillis ứng dụng trong nông

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

[1] L T A Nhien, L T T Tien, N D Luong, L Q Luan, “Radiation synthesis of silver nano particles/chitosan for controlling leaf fall disease on

rubber trees causing by Corynespora cassiicola” Journal of Nanomaterials, vol

2018, pp 1-9, 2018 https://doi.org/10.1155/2018/7121549

[2] Lê Thị An Nhiên, Trần Đức Trọng, Lê Thị Thủy Tiên, Nguyễn Đức Lượng,

Lê Quang Luân, “Nghiên cứu sinh tổng hợp bạc nano từ dịch nội bào vi khuẩn

Bacillus subtillis ứng dụng trong nông nghiệp” Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, vol 2(87), pp 109-116, 2018

[3] L T A Nhien, L N T Tam, D H Xo, L Q Luan, N D Luong,

“Radiation synthesis of silver nano particles/chitosan against Corynespora cassiicola causing leaf fall disease on rubber trees,” Journal of Science and Technology, vol 55(1B), pp 29-40, 2017 https://doi.org/10.15625/2525-

MỞ ĐẦU

Cây cao su (Hevea brasiliensis) là cây công nghiệp dài ngày có giá trị kinh t

cao, cung c p mủ và gỗ cho nhiều ngành công nghiệp Đ p ứng nhu cầu kinh

t , c c dòng cao su ược l a chọn theo hướng sinh trư ng mạnh Cùng với s sinh trư ng mạnh của cây cao su thì những thiệt hại do bệnh gây ra cũng gia

tăng Đ ng k nh t là bệnh rụng lá Corynespora do n m Corynespora cassiicola gây ra, bệnh xu t hiện năm 1999 v ang có chiều hướng lan rộng

gây hại cho các dòng vô tính cao su Với hiện trạng dịch bệnh bùng phát thì thu c hoá học trước mắt vẫn giữ vai trò chủ l c trong công tác trị bệnh Cũng

như nhiều loại hoá ch t khác, thu c trừ n m C cassiicola gây bệnh rụng lá Corynespora có th gián ti p làm hại sức khỏe con ngư i, là m i e dọa cho

các hệ sinh th i, ồng th i làm giảm ch t lượng sản phẩm

Gần ây, c ng nghệ nano ngày càng phát tri n và ược ịnh hướng trong việc nâng cao ch t lượng v năng su t cây trồng, trong ó nano bạc ược tổng hợp

b ng phư ng ph p sinh học và phư ng ph p chi u xạ, ược coi là một sản phẩn

an toàn góp phần trong công tác phòng và trị bệnh trên cây trồng Cây cao su là loại cây xu t khẩu có giá trị hiện nay nhưng lại ang gặp phải khó khăn về v n

ề bệnh rụng lá Corynespora do n m C cassiicola gây ra thì việc phòng và trị

bệnh b ng biện ph p an to n ược ặc biệt quan tâm Từ v n ề th c tiễn nêu trên, ề tài: “Nghiên cứu tạo dung dịch keo bạc nano phòng trừ bệnh rụng lá

Corynespora trên cây cao su do n m Corynespora cassiicola” ược th c hiện

Đối tượng nghiên cứu

N m C cassiicola ược phân l p từ lá của cây cao su bị bệnh Corynespora

trồng tại Đồng Nai

Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Tìm hi u bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su do n m C cassiicola gây ra

v tìm phư ng ph p tạo ch phẩm phòng trừ bệnh rụng lá Corynespora có hiệu

quả trong phòng thí nghiệm v trên cây cao su trong vư n ư m

Ý nghĩa khoa học

Lu n n c ịnh ược c c iều kiện th ch hợp cho qu trình tạo ra 4 ch phẩm

gồm huyền ph vi khuẩn B subtilis, B thuringiensis, dung dịch keo bạc nano từ dịch nội b o vi khuẩn B subtilis v dung dịch keo bạc nano - chitosan b ng

n m C cassiicola gây ra trên cây cao su Bước ầu thành công trên cây cao su 9

tháng tuổi trong vư n ư m

Việc ứng dụng nano bạc phòng v trị bệnh rụng l Corynespora của cây cao

su là một phư ng ph p mới, có hiệu quả, p ứng một s v n ề sau:

- Áp dụng công nghệ cao phục vụ sản xu t nông nghiệp

- iệc giảm sử dụng các loại thu c bảo vệ th c v t hóa học sẽ góp phần bảo

vệ sức khỏe của nông dân

Tính mới của luận án

1 c ịnh ược ảnh hư ng của kh i lượng phân tử v ộ deacetyl hóa chitosan lên k ch thước hạt bạc nano

2 Bước ầu c ịnh ược ảnh hư ng của bạc nano lên hệ sợi n m C

cassiicola b ng ảnh SEM

3 Xây d ng ược quy trình và ch tạo ược dung dịch keo bạc nano có kích thước hạt khác nhau sử dụng chitosan làm ch t ổn ịnh b ng phư ng ph p chi u xạ

4 Chứng minh ược hiệu quả của dung dịch keo bạc nano - chitosan ch tạo ược i với bệnh rụng l Corynespora trên cây cao su trong vư n ư m

Nội dung nghi n ứu

1 Phân l p và khảo sát một s y u t ảnh hư ng lên s sinh trư ng của n m

C cassiicola gây bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su, từ ó ặt k

hoạch tạo ch phẩm phòng ch ng chúng

2 hảo s t khả năng i kh ng n m C cassiicola của B subtilis và

B thuringiensis

3 hảo s t khả năng tổng hợp bạc nano từ dịch nội b o của vi khuẩn

B subtilis có khả năng kh ng n m C cassiicola

4 Ch tạo dung dịch keo bạc nano - chitosan có khả năng ức ch n m

C cassiicola b ng phư ng ph p chi u xạ

5 Khảo sát khả năng ức ch n m C cassiicola của dung dịch keo bạc nano trong iều kiện in vitro

6 Khảo sát khả năng phòng và trị bệnh rụng lá Corynespora do n m

C cassiicola gây ra trên cây cao su 9 tháng tuổi trong vư n ư m của dung

dịch keo bạc nano - chitosan có k ch thước hạt bạc 10 nm

Bệnh rụng lá Corynespora do n m Corynespora cassiicola (Berk & Curt.)

Wei gây ra gây thiệt hại r t nghiêm trọng i với ngành cao su không chỉ

Việt Nam mà còn nhiều qu c gia trên th giới N m C cassiicola có th gây

ra thiệt hại trên nhiều bộ ph n của cây cao su vào mọi giai oạn sinh trư ng và

có th xảy ra quanh năm Các dạng v t bệnh phổ bi n trên lá gồm có dạng

ư ng c , dạng m trên phi n lá, trên gân lá phụ, trên gân lá chính

1.2 ượ v nano

Nano bạc là những hạt bạc có k ch thước từ 0,1 n 100 nm Nano bạc thư ng dưới dạng dung dịch keo với ch t bảo vệ là các polymer giúp cho các hạt bạc không bị k t tụ Nano bạc là ứng dụng khoa học và công nghệ nano i với bạc tăng t nh năng diệt khuẩn, sát trùng và khử m i, ược ứng dụng trong sản

xu t rau sạch

1.3 T nh h t kh ng khu n ủa nano

Bạc nano ược em như một tác nhân kháng vi sinh v t có tác dụng ức ch mạnh mẽ với phổ hoạt ộng khá rộng i với vi khuẩn, n m và virus

ình 1.1 C ch diệt vi khuẩn của

bạc nano th ng qua c c tư ng t c

với protein v nucleic acid

ình 1.2 C ch diệt n m của bạc nano

th ng qua t c ộng của c c g c o y hóa

t do (ROS) n ty th v DNA

ình 1.3 C c c ch t c ộng của bạc nano n vi sinh v t

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật iệu

- Lá cây cao su thuộc dòng vô tính RRI 4 ược thu hái tại N ng trư ng cao

su Cẩm Đư ng - tỉnh Đồng Nai, có các bi u hiện ặc trưng của bệnh rụng lá

Corynespora

- Cây cao su 9 tháng tuổi DVT RRIV 4, không bị bệnh do Công ty TNHH Một Thành viên Gi ng cây trồng s một cung c p

- Chủng vi khuẩn B subtilis (ATCC6633) và B thuringiensis (ATCC10792)

do Bộ môn Công nghệ sinh học - Khoa Kỹ thu t Hóa học - Đại học Bách khoa thành ph Hồ Chí Minh cung c p

2.2 Nội ung và phư ng ph p nghi n ứu

2.2.1 Phân lập và khảo sát một số ố ả n sự

của nấm C cassiicola gây bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su

Thu mẫu lá cây cao su bị bệnh rụng l Corynespora, phân l p n m C cassiicola

c ịnh các y u t ảnh hư ng lên s sinh trư ng của n m C cassiicola như

Khảo sát khả năng tổng hợp bạc nano của dịch nội bào và xác t bào vi khuẩn

B subtilis; ảnh hư ng của nhiệt ộ, p n quá trình tổng hợp bạc nano từ dịch nội bào vi khuẩn B subtilis Đồng th i khảo sát th i gian ổn ịnh của dung dịch

keo bạc nano ược tạo thành

2.2.4 Ch tạo dung dịch keo bạc nano - chitosan bằ ơ u

xạ

c ịnh các y u t ảnh hư ng n k ch thước hạt bạc nano ược tạo thành như: liều xạ bão hòa; nồng ộ AgNO3; nồng ộ, kh i lượng phân tử v ộ deacetyl hóa của chitosan Đồng th i khảo s t ộ ổn ịnh của ch phẩm

2.2.5 Khảo sát hiệu lực ức ch nấm C cassiicola của dung dịch keo bạc

ều kiện in vitro

Khảo sát khả năng ức ch n m C cassiicola của dung dịch keo bạc nano ược tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B subtilis

Khảo sát khả năng ức ch n m C cassiicola của dung dịch keo bạc nano

- chitosan ược ch tạo b ng phư ng ph p chi u ạ với c c k ch thước hạt bạc nano nồng ộ bạc nano kh c nhau; So sánh hiệu quả ức ch n m với dung dịch

keo bạc nano ược tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B subtilis

hảo s t ảnh hư ng của nồng ộ v k ch thước hạt bạc nano của dung dịch keo

bạc nano - chitosan n hình th i sợi n m C cassiicola

2.2.6 Khảo sát khả ă ị ệnh rụng lá Corynespora của cây

ơm ủa dung dịch keo bạc nano - chitosan

hảo s t khả năng phòng v trị bệnh rụng l Corynespora do n m C cassiicola

gây ra trên cây cao su 9 tháng tuổi (có 3 tầng lá ổn ịnh thuộc dòng vô tính RRIV 4 không bị bệnh, sinh trư ng ồng ều v ược trồng trong vư n ư m 1

th ng trước khi ti n hành thí nghiệm) trong vư n ư m b ng dung dịch keo bạc nano - chitosan có k ch thước hạt 10 nm

 đồ tổng quát các nội dung nghiên cứu:

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập và khảo sát một số ếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

của n m C cassiicola gây bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su 3.1.1 m ị ệ ụ ập nấm

C cassiicola

Chủng n m C cassiicola phân l p từ lá cao su bị bệnh K t quả ịnh danh b ng

phư ng ph p giải trình t gen ITS ược th hiện trong k t quả tra cứu trên

BLAST SEARCH

3.1.2 Ả ng củ mô ng ô ấ

Sau 10 ng y nu i c y trên m i trư ng thạch l cao su, n m C cassiicola sinh

trư ng t t nh t ạt ư ng k nh t i a 90,00 mm v có chiều dài bào tử cao nh t (86,39 μm) (Bảng 3.1)

Bảng 3.1 Đư ng k nh tản n m v chiều dài trung bình của bào tử n m

C cassiicola sau 10 ng y nu i c y trên c c m i trư ng kh c nhau

Môi trường PDA Th ch malt Th ch lá cao su Đường k nh tản n 59,70 61,80 90,00

Chi u dài trung bình của bào t (μ ) 44,12 54,03 86,39

3.1.3 Ả ng của nhiệ ộ

Sau 10 ng y nu i c y trên m i trư ng thạch l cao su, n m C cassiicola sinh

trư ng t t nh t nhiệt ộ 29C ( ư ng k nh tản n m ạt 90 mm) (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Đư ng k nh tản n m sau 10 ng y nu i c y c c nhiệt ộ kh c nhau

Nhiệt độ (C) 10C 22C 29C 35C Đường k nh tản n 18,13 85,63 90,00 22,75

hả năng ức ch n m C cassiicola của vi khuẩn B subtilis (45,67 %) cao h n

so với vi khuẩn B thuringiensis (33,04 %) (Bảng 3.4)

Bảng 3.4 So s nh hiệu quả ức ch n m C cassiicola của vi khuẩn

B subtilis và B thuringiensis sau 10 ng y nu i c y

Nghiệm thức Đường kính tản n m (mm) Hiệu lực ức chế (%)

3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp nano từ dịch nội

bào vi khu n B subtilis

3.3.1 Q ạ ị ộ ẩ

Ở c c nghiệm thức sử dụng dịch nội bào và phần xác t bào vi khuẩn B subtilis

ều xu t hiện bước sóng h p thụ c c ại ặc trưng của bạc nano tại 415 nm

Tuy nhiên m t ộ quang của nghiệm thức sử dụng dịch nội bào vi khuẩn ạt 0,65 cao h n 2,5 lần so với nghiệm thức sử dụng phần xác t bào (Hình 3.1) Như v y, dung dịch keo bạc nano ược tạo ra chủ y u từ dịch nội bào vi khuẩn

Hình 3.1 Quang phổ h p thụ của dịch nội b o v c t b o vi khuẩn B.subtilis

sau qu trình sinh tổng hợp bạc nano

3.3.2 Ả ng của pH

Dung dịch keo bạc nano ược tạo th nh p 10 có bước sóng h p thụ c c ại

412 nm (Hình 3.2) Tại bước sóng 420 nm, m t ộ quang ạt giá trị cao nh t (1,12) v k t quả ảnh TE cũng cho th y k ch thước hạt bạc nano hình th nh tại p 10 l nhỏ nh t, trung bình 7,14 nm Như v y p 10 l p t t nh t cho

quá trình tổng hợp bạc nano từ B subtilis

Hình 3.2Quang phổ h p thụ của dung dịch keo bạc nano hình th nh c c p

Ở nhiệt ộ 80C, dung dịch keo bạc nano ược tổng hợp từ dịch nội b o vi

khuẩn B subtilis có bước sóng h p thụ c c ại l 415 nm, m t ộ quang ạt giá

trị cao nh t (1,45) (Hình 3.3) v hạt bạc nano có k ch thước nhỏ nh t (7,78 nm)

Hình 3.3Quang phổ h p thụ của dung dịch sau phản ứng c c nhiệt ộ

3.3.4 Th i gian ịnh của dung dịch keo bạc nano

K t quả o quang phổ h p thụ của dung dịch keo bạc nano ược tổng hợp từ

dịch nội b o vi khuẩn B subtilis ( ình 3.4) cho th y m t ộ quang không thay

ổi nhiều trong th i gian 20 ng y, chỉ giảm từ 1,45 ng y ầu tiên xu ng còn 1,23 ng y thứ 20 Như v y dung dịch keo bạc nano ược tổng hợp từ dịch nội

b o vi khuẩn B subtilis có ộ ổn ịnh khoảng 20 ng y

ình 3.4 Quang phổ h p thụ của dung dịch keo bạc nano theo th i gian

3.4 Chế t o ung ị h k o b c nano - chitosan bằng phư ng ph p hiếu x

3.4.1 Liều xạ bão hòa của dung dịch bạc có nồ ộ bạc nitrate khác nhau

Nồng ộ bạc nitrate ược bổ sung trong dung dịch chi u ạ l 1,0; 2,5; 5,0 v 10,0 m có liều xạ chuy n hóa b o hòa tư ng ứng lần lượt l 8, 12, 16 v

28 kGy, với bước sóng h p thụ c c ại tăng dần từ 397,5 lên 405,5 nm ch thước trung bình của hạt nano bạc tăng dần theo nồng ộ bạc nitrate, lần lượt l 5,18; 7,13; 8,69 v 10,06 nm (Bảng 3.5)

Bảng 3.5 Đặc i m của dung dịch keo bạc nano - chitosan theo nồng ộ bạc

K h thước h t (nm)

3.4.2 Ả ng của nồ ộ chitosan lên í ớc hạt ạ nano

hi bổ sung chitosan với nồng ộ 1, 2, 3 v 5 v o dung dịch keo bạc nano,

k ch thước trung bình của hạt bạc nano tạo th nh giảm dần với s gia tăng nồng

Bảng 3.7 Ảnh hư ng của kh i lượng phân tử chitosan lên k ch thước

hi bổ sung chitosan 1 với ộ deacetyl hóa 7B, 8B, 9B v 10B v o dung dịch keo nano bạc, k ch thước trung bình của hạt nano bạc tạo th nh tăng dần theo ộ deacetyl hóa, lần lượt l 8,67; 10,06; 10,78 v 11,88 nm (Bảng 3.8) Bảng 3.8 Ảnh hư ng của ộ deacetyl hóa của chitosan lên k ch thước

3.5 Hiệu lực ức chế n m C cassiicola của dung dịch keo b c nano trong

đi u kiện in vitro

3.5.1 ệ ự ức ch ấm ủ ịch keo bạ c

t ng h p t dịch nội bào vi khuẩn B subtilis ồ ộ nhau

Dung dịch keo bạc nano ược tổng hợp từ dịch nội b o vi khuẩn B subtilis có

hiệu l c ức ch n m C cassiicola t t cả c c nồng ộ v hiệu l c kh ng n m

Bảng 3.9 hả năng ức ch n m C cassiicola của dung dịch keo bạc nano ược tổng hợp từ dịch nội b o vi khuẩn B subtilis c c nồng ộ kh c nhau sau 10

Dung dịch keo bạc nano - chitosan có k ch thước 5, 10, 15 nm nồng ộ

50 ppm ều có khả năng kh ng n m với hiệu l c ức ch lần lượt l 100,00; 62,22 v 52,08 % sau 8 ngày nuôi c y (Bảng 3.10 và Hình 3.7)

Bảng 3.10 Khả năng ức ch n m C cassiicola của dung dịch keo bạc nano

- chitosan c c k ch thước khác nhau sau 8 ngày nuôi c y

K h thước h t b c nano (nm) Hiệu lực ức chế (%)

Hình 3.7 Tản n m C cassiicola sau 8 ng y nu i c y trên m i trư ng thạch lá

cao su bổ sung dung dịch keo bạc nano - chitosan c c k ch thước khác nhau

3.5.3 ệ ự ức ch ấm ủ ị ạ -

ớ ớ ồ ộ ạ

Dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm) có hiệu l c ức ch n m C cassiicola t t cả c c nồng ộ v hiệu l c ức ch n m cao nh t ạt 100,00 nồng ộ 90 ppm trong iều kiện in vitro (Bảng 3.11 và Hình 3.8)

Bảng 3.11 Khả năng ức ch n m C cassiicola của dung dịch keo

bạc nano - chitosan (10 nm) các nồng ộ sau 9 ng y nu i c y

Nồng độ b c nano

(ppm)

Đường kính tản n m (mm)

Hiệu lực ức chế (%)

ình 3.8 Tản n m C cassiicola trong iều kiện m i trư ng có bổ sung

dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm) c c nồng ộ kh c nhau