Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở việt nam

Hướng dẫn áp dụng với các loại vi sinh vật đối kháng, các chất sinh học diệt khuẩn vào các vùng sinh thái khác nhau của cây trồng.. Đề tài tập trung nghiên cứu các chủng xạ khuẩn có hoạ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

BÙI THỊ VIỆT HÀ

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG

NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Hà Nội-2006

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS.TS Từ Minh Koóng

2 GS.TS Phạm Văn Ty

Hà Nội-2006

Lời cảm ơn

Tôi xin chân thành cảm ơn Đại học Quốc gia Hà nội, Tr-ờng ĐH Khoa học Tự nhiên đã ủng hộ và tạo mọi điều kiện về các thủ tục, kinh phí để tôi hoàn thành nhiệm vụ của một nghiên cứu sinh

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS Từ Minh Koóng, GS.TS Phạm Văn Ty những ng-ời thầy đã tận tình h-ớng dẫn và giúp đỡ tôi

để hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin cám ơn PGS.TS Kiều Hữu ảnh, Chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh vật học, ng-ời đã luôn ủng hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi làm việc và làm luận án tại Bộ môn Vi sinh vật học, Tr-ờng ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà nội

Hoàn thành bản luận án này, tôi cũng đã nhận đ-ợc nhiều sự giúp đỡ khác: các thầy các cô Bộ môn Vi sinh, Khoa Sinh học, Tr-ờng ĐH Khoa hoc

Tự nhiên đã giúp đỡ về thời gian, hoá chất, thiết bị máy móc cho các thí nghiệm của luận án, cảm ơn TS Đỗ Quyên, Tr-ờng ĐH D-ợc Hà nội đã rất nhiệt tình giúp tôi trong việc xác định cấu trúc hoá học của chất kháng sinh bằng ph-ơng pháp phân tích khối phổ và cộng h-ởng từ hạt nhân Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tất cả sự giúp đỡ quí báu đó

Luận án này sẽ không thể hoàn thành nếu tôi không nhận đ-ợc sự giúp

đỡ và ủng hộ lớn lao từ gia đình, ng-ời thân và những ng-ời đã luôn ở bên cạnh tôi trong cả những lúc thuận lợi và khó khăn nhất để lắng nghe, động viên và chia sẻ

Hà nội, ngày 21 tháng 2 năm 2006 Bùi Thị Việt Hà

Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất cứ công trình nào khác

Hà nội, ngày 21 tháng 2 năm 2006

Tác giả

Bùi Thị Việt Hà

MỞ ĐẦU 14

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 14

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 15

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 16

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH 16

1.1.1 Chất kháng sinh (Antibiotic) 16

1.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh 16

1.2 CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH 18

1.2 1.Ức chế tổng hợp thành tế bào 19

Liên kết với protein thụ thể 20

1.2.2 Ức chế sự tổng hợp protein 20

1.2.3 Chất kháng sinh phá huỷ màng sinh chất của tế bào 21

1.2.4 Ức chế các con đường trao đổi chất 22

1.2.5 Ức chế sự tổng hợp axit nucleic 23

1.3 XẠ KHUẨN VÀ SỰ HÌNH THÀNH KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 24

1.3.1 Xạ khuẩn và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 24

1.3.2 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên 24

1.3.3 Những khái niệm cơ bản về xạ khuẩn 26

1.3.4 Streptomyces và xạ khuẩn hiếm 27

1.3.5 P HƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN 32

1.3.6 Phân loại chi Streptomyces 36

1.4 SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 37

1.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 37

1.4.2 Công nghệ lên men CKS – Quá trình sau lên men (Downstream Processing) 40

1.4.3 Sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp CKS 40

1.5 TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ CHẤT KHÁNG SINH 41

1.5.1 Tách chiết CKS từ hệ khuẩn ty 42

1.5.2 Tách chiết CKS từ dịch lọc 42

1.5.3 Tinh chế CKS 43

1.5.4 Đơn vị chất kháng sinh 43

1.5.5 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học bằng quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân 43

1.6 CÁC BỆNH THỰC VẬT DO NẤM GÂY RA VÀ CÁC CHẤT KHÁNG SINH ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP 44

1.6.1 Sự lan truyền và chu kỳ phát triển của nấm gây bệnh thực vật 45

1.6.2 Các loại nấm gây bệnh thực vật thường gặp 47

1.6.4 Sơ lược về tình hình nghiên cứu và ứng dụng chất kháng sinh trong phòng chống các

bệnh do vi sinh vật gây ra ở thực vật trên thế giới và ở Việt Nam 52

1.6.5 Các chất kháng sinh được sử dụng phòng trừ nấm gây hại thực vật 54

1.6.6 Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật 59

1.6.7 Ứng dụng xạ khuẩn và các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật 59

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 62

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HOÁ CHẤT 62

2.1.1 Nguyên liệu 62

2.1.2 Hoá chất 62

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 63

2.1.4 Các công thức môi trường 63

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 66

2.2.1 Phương pháp thu mẫu bệnh thực vật, phân lập nấm và định tên 66

2.2.2 Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 67

2.2.3 Bảo quản giống 68

2.2.4 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 68

2.2.5 Các phương pháp sinh học phân tử 71

2.2.6 Lên men tạo kháng sinh 76

2.2.7 Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh 78

2.2.8 Xác định một số tính chất của chất kháng sinh 79

2.2.9 Sản xuất chế phẩm bào tử xạ khuẩn 81

2.2.10 Tìm hiểu khả năng ứng dụng 82

2.2.11 Thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng [10] 83

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 86

3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN 86

3.1.1 Sự phân bố và hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn 86

3.1.2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS chống nấm có hoạt tính cao 88

3.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN 89

3.2.1 Đặc điểm hình thái 89

3.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 90

M ÀU KTCC 91

3.2.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hoá 92

3.2.4 Hoạt tính kháng sinh 94

3.2.5 Giải trình tự ADNr 16S của 3 chủng xạ khuẩn nghiên cứu 96

3.3 KHẢ NĂNG TỔNG HỢP CKS CỦA 3 CHỦNG XẠ KHUẨN ĐÃ LỰA CHỌN 105

3.3.1 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp 105

3.3.2 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng hình thành CKS của 3 chủng T-41, D-42 và TC-54 107

3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH ban đầu và nhiệt độ 107

3.3.3 Động học của quá trình lên men của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 111

3.3.4 Tối ưu hoá môi trường lên men chủng TC-54 – Phương pháp Box- Willson 113

3.3.5 Lên men xốp chủng T-41 116

3.4 TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ CKS TC-54 117

3.4.1 Tách chiết CKS bằng dung môi hữu cơ 117

3.4.2 Xác định khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh 119

3.4.3 Xác định Rf của chất kháng sinh 120

CHẤT KHÁNG SINH 121

HỆ DUNG MÔI 121

RF 121

3.4.4 Tách chiết CKS TC-54 bằng chất hấp phụ 121

3.4.5 Tách chiết CKS TC-54 bằng nhựa trao đổi ion 122

3.4.6 Nhận dạng CKS TC-54 124

3.4.7 Mối tương quan giữa nồng độ CKS và đường kính vòng vô khuẩn 125

3.4.8 Nồng độ ức chế tối thiểu ( MIC) 125

3.5 TÌM HIỂU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CÁC CKS THÔ T-41, D-42 VÀ TC-54 126

3.5.1 Ảnh hưởng của CKS trong dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn T-41 và TC-54 tới khả năng nảy mầm của hạt 126

3.5.2 Ảnh hưởng của CKS T-4l và TC-54 đến khả năng sinh trưởng của cây 127

3.6 SẢN XUẤT CHẾ PHẨM 129

3.6.1 Quy trình sản xuất chế phẩm T-41 và D-42 129

3.6.2 Xác định một số tính chất của chế phẩm T-41 và D-42 131

3.6.3 Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng 132

KẾT LUẬN 141

KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 142

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 143

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

CFU (colony forming unit) Đơn vị hình thành khuẩn lạc

CMC (carboxymethyl cellulose) carboxymethyl xenluloza

CZ (Czapek–Dox–Agar) Môi trường Czapeck Dox

DAP (diamino acid pymelic) Axit diamino pimelic

(DHF), dihidrofolic axit đihidrofolic

dNTP (deoxyribonucleotide

triphosphate)Deoxyribo

Các loại nucleotit gồm:dATP, dCTP, dGTP and dTTP dùng trong phản ứng PCR

(PABA) para-aminobenzoic acid Axit para-aminobenzoic

EDTA (Ethylene diamine tetra acetic acid) Axit etylen diamin tetra axetic

FDA (Food and Drug Administration) Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ

HPLC ( High performance liquid chromatography) Sắc ký lỏng cao áp

IR (Infrared) spectroscopy Phổ hồng ngoại

ISP ( International Streptomyces Project) Chương trình xạ khuẩn quốc tế

LD50 (lethal dose) Liều gây chết 50 %

MIC (Minimum inhibition concentration) Nồng độ ức chế tối thiểu

MS ( mass spectrophotometry) Khối phổ

MW (Molecular Weight) Trọng lượng phân tử

NAG (N-acetylglucozamine) N-acetylglucozamin

NAM (N-acetylmuramic) N-acetylmuramic

NMR ( nuclear magnetic resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân PCR (Polymerase chain reaction) Phản ứng chuỗi polime

PDA (Potato Dextrose Agar) Môi trường thạch khoai tây

PG (peptidoglycan) Thành tế bào vi khuẩn

RA (Retinaculiaperti) Cuống sinh bào tử hình móc câu

RF (Rectiflexibiles) Cuống sinh bào tử hơi lượn sóng

SDS ( sodium docecyl sulfate) Natri docecyl sulphat

TLC (thin layer chromatography) Sắc ký bản mỏng

TLm ( Median Tolerance limit) Giới hạn chịu đựng trung bình THF (tetrahydrofolic) axit tetrahydrofolic

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Các loại typ thành tế bào khác nhau ở Actinomycetes

Bảng 3.1 Số lượng và sự phân bố xạ khuẩn trong đất ở một số vùng

Bảng3.2 Đặc điểm nuôi cây của 3 chủng

Bảng 3.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng T-41, D-42 và TC-54

Bảng 3.4 Khả năng đồng hoá đường của các chủng T-41, D-42 và TC-54

Bảng 3.5 Hoạt phổ kháng khuẩn của 3 chủng xạ khuẩn

Bảng 3.6 So sánh đặc điểm phân loại của chủng T-41 với loài chuẩn S

antimycoticus và chủng D-42 với loài chuẩn S.viridogenes

Bảng 3.7 So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn TC-54 với chủng

chuẩn S hygroscopicus ISP – 5578

Bảng 3.8 Hoạt tính kháng F oxysporum của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu

trên các môi trường lên men khác nhau

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của pH ban đầu tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp

CKS của các chủng T-41, D-42 và TC-54

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành chất kháng

sinh của 3 chủng xạ khuẩn

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và sinh

tổng hợp CKS của các chủng T-41, D-42 và TC- 54

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của

các chủng T-41, D-42 và TC-54

Bảng 3.13 Tối ưu hoá môi trường theo phương pháp Box- Willson

Bảng 3.14 Môi trường tối ưu “lên dốc” của chủng TC-54

Bảng 3.15 Các thông số lên men của chủng TC-54 trong nồi lên men 80 lít

Bảng 1.16 Hoạt tính kháng sinh được chiết bằng các loại dung môi khác nhau

Bảng 3.17 Hệ số Rf của CKS T-41, D-42, TC-54 trên các hệ dung môi khác nhau

Bảng 3.18 Kết quả thử nghiệm trên cà chua

Bảng 3.19 Kết quả thử nghiệm trên bắp cải

Bảng 3.20 Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh trước khi phun thuốc

Bảng 3.21 Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh 5 ngày sau phun thuốc

Bảng 3.22 Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh 10, 15 và 20 ngày sau phun thuốc

Bảng 3.23 Tổng hợp số liệu khảo nghiệm sau 20 ngày

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Mốc thời gian tìm ra các chất kháng sinh khác nhau

Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của tetracylin và aminoglycosit

Hình 1.3 Cơ chế tác dụng của macrolit và chloramphenicol

Hình 1.4 Cơ chế tác dụng của amphotericin B

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của sunfonamit trong quá trình sinh tổng hợp

axit folic

Hình1.6 Đồ thị về tỷ lệ các vi sinh vật sinh chất kháng sinh

Hình 1 7 Mục tiêu tuyển chọn các chất có hoạt tính sinh học

Hình 3.1 Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn thuộc Chi Streptomyces theo nhóm màu

Hình 3.2 Tỷ lệ phần trăm các chủng có hoạt tính kháng sinh

Hình 3.3 Hoạt tính kháng sinh của 47 chủng xạ khuẩn

Hình 3 4 Bề mặt bào tử chủng T-41

Hình 3.5 Bề mặt bào tử chủng D-42

Hình 3.6 Bề mặt bào tử chủng TC-54

Hình 3.7 Cuống sinh bào tử chủng TC-54

Hình 3.8 Hoạt tính kháng F.oxysporum của 3 chủng T-41, D-42, TC-54

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR

Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 16S, thể hiện mối quan hệ giữa 3 chủng xạ khuẩn T-41, D-42, TC-54 và các

đại diện có quan hệ gần gũi thuộc chi Streptomyces

Hình 3.11 Động thái lên men CKS của 3 chủng T-41, D-42, TC-54

Hình 3.12 Hoạt tính kháng sinh của chủng T-41 trên môi trường lên men xốp

Hình 3.13 Hoạt tính kháng sinh của 3 chủng nghiên cứu chiết ở các pH khác nhau

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng sinh của 3 chủng xạ khuẩn

Hình 3.15 Tách chiết CKS bằng than hoạt tính và giải hấp phụ bằng axeton

Hình 3.16 Sơ đồ phân lập chất kháng sinh TC-54-1

Hình 3 17 Công thức cấu tạo của validamyxin

Hình 3.18 Mối tương quan giữa đường kính vòng vô khuẩn và nồng độ

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh thực vật như đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sương…đẫ gây tổn thất nặng nề cho mùa màng, chúng chiếm 83% trong số các bệnh ở cây trồng [173,174, 175] Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương Liên hiệp Quốc (FAO), thiệt hại trong nông nghiệp do các bệnh vi nấm lên tới 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế giới [49,152, 187,189] Việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật nhằm tăng sản lượng nông nghiệp từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam với các chủng loại thuốc bảo vệ thực vật rất đa dạng Mỗi năm Việt Nam

sử dụng khoảng 25.000 tấn thuốc hóa học diệt sâu bệnh Theo thống kê năm 2004, ở Việt Nam có tới 436 loại hoá chất với 1231 tên thương phẩm [61] Song việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thường rất độc và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản

sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm mất cân bằng sinh thái Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực Châu Á Thái Bình Dương của FAO năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (quản lý dịch hại tổng hợp) với 3 chiến lược cơ bản chính [49, 138]:

1 Sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể ký sinh Hướng dẫn áp dụng với các loại vi sinh vật đối kháng, các chất sinh học diệt khuẩn vào các vùng sinh thái khác nhau của cây trồng

2 Làm tăng các loại vi sinh vật có ích, đấu tranh chống các vi sinh vật ký sinh cho cây ở trong đất

3 Thúc đẩy khả năng sinh trưởng của cây trồng, làm tăng sức chống chịu của cây

Việt Nam là nước nông nghiệp, diện tích đất canh tác 10,126 triệu ha với sản phẩm nông nghiệp chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, mưa nhiều là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển gây tổn thất nặng nề đến năng suất cây trồng Năm 2003, Việt Nam phải nhập tới 166 triệu USD thuốc bảo vệ thực vật, trong đó các chất chống nấm chiếm tỷ lệ 28,0% [61]

Những năm vừa qua, nông dân Việt Nam cũng đã ứng dụng một số chế phẩm kháng sinh chống nấm gây bệnh cho cây trồng như: validamyxin, jingangmixin, polioxin, blastixidin S, kasugamyxin…nhưng đây đều là các chế phẩm nhập ngoại

Xuất phát từ những yêu cầu đó, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay, cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của nước ta

Chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: ” Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng

sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam” Đề tài tập trung nghiên cứu các

chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm mạnh, tiến hành lên men, chiÕt xuÊt, tinh chế và xác định cấu trúc hóa học của chất kháng sinh có tiềm năng nhất; đưa ra quy trỡnh sản xuất và ứng dụng trong nông nghiệp Việc tiến hành đề tài này là cần thiết

và có ý nghĩa thực tiễn, đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng chống các bệnh thực vật từ các chất có hoạt tính sinh học, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp sạch, an toàn và bền vững ở Việt Nam

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Việt Nam

Các vi nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam

 Nội dung nghiên cứu

1 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn của Việt Nam có khả năng sinh chất kháng sinh dùng làm nguyên liệu nghiên cứu đồng thời đóng góp vào

sự tìm hiểu tính đa dạng sinh học cũng như phát hiện nguồn gen quý hiếm từ

xạ khuẩn của Việt Nam

2 Phân loại một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh chống nấm mạnh nhất theo phương pháp sinh học phân tử

3 Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh

4 Xác định cấu trúc hoá học của chất kháng sinh

5 Thăm dò khả năng ứng dụng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH

1.1.1 Chất kháng sinh (Antibiotic)

Chất kháng sinh, theo khái niệm cũ là bất kỳ sản phẩm vi sinh nào mà ngay ở nồng độ thấp (g/ml) cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác (vi khuẩn, nấm nem, nấm mốc…) một cách chọn lọc [124] Thuật ngữ antibiotic bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: “anti” là kháng lại, còn “bios” là sự sống Thuật ngữ này được Waksman sử dụng vào những năm 1940 để phân biệt penixillin với sulfonamit

đã được phát hiện từ những năm 1930 Thuật ngữ này đã được thay đổi sau khi penixillin và các chất kháng khuẩn khác đã được cải tiến và tổng hợp mới trong phòng thí nghiệm Ngày nay, thuật ngữ này được sử dụng rộng rãi hơn để chỉ các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, bán tổng hợp, hoặc tổng hợp hoàn toàn có hiệu quả diệt khuẩn ở nồng độ thấp Nhiều chất kháng sinh được sử dụng như là một chất hoá trị liệu có khả năng kháng virut, động vật nguyên sinh, tế bào ung thư…Tất cả các CKS đều có tính độc chọn lọc Mỗi chất kháng sinh thường chỉ tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định Một số CKS sử dụng ngoài mục địch y học có tầm quan trọng trong sinh thái như agroxin, bacterioxin, yếu tố gây chết (killer factor), microxin…

1.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh

Alexander Fleming, người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS – nhà sinh vật học người Anh làm việc tại viện St Mary, London, đã phát hiện

ra penixillin vào tháng 10 năm 1928 Trong khi tiến hành thí nghiệm, ông đã quan

sát thấy một hiện tượng lạ: trên đĩa thạch đã cấy vi khuẩn Staphylococcus aureus bị

nhiễm một loại nấm mốc xanh và xung quanh vùng nấm mọc thì vi khuẩn không thể phát triển được Điều đó chứng tỏ rằng loại nấm này đã sinh ra một chất ức chế sự

phát triển và tiêu diệt S.aureus Fleming đã phân lập và định tên loại vi nấm này là Penicillium notatum và đặt tên cho chất kháng khuẩn Êy là penixillin

Một thập kỷ sau, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh vật häc vµ sinh ho¸ häc Anh, Mỹ, penixillin đã được nghiên cứu, sản xuất với số lượng lớn và trở thành một “loại thuốc thần kỳ” Năm 1945, A.Fleming, E.Chain và H.W Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã sự khám phá ra giá trị to lớn của penixillin mở ra một

kỷ nguyên mới trong y học – kỷ nguyên kháng sinh

Năm 1939, Rene’ Jules Dubos nuôi cấy Bacillus brevis phân lập từ vùng New

Jersey và tách được một hỗn hợp gồm hai chất khác nhau là gramixidin và tiroxidin Sau đó ít lâu Abraham, Waksman, Schatz và Bugie [82, 135, 172] đã phát hiện ra streptomixin, chất này có tác dụng chủ yếu trên vi khuẩn G(-), đặc biệt là trực khuẩn lao Tốc độ tìm kiếm chất kháng sinh ngày càng được đẩy mạnh Những năm 1940-1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS Hàng loạt chất kháng sinh được phát hiện trong gia đoạn này có ứng dụng trong y học như: actinomixin (Waksman,1940), chloramphenicol (Erhlich,1947), chlotetraxyclin (Dugar, 1948), [172] Trong suốt những năm 1960 và 1970, ngành công nghiệp về kháng sinh đã bùng nổ khắp thế giới Vào đầu năm 1970, hơn 270 CKS đã được sản xuất Vào những năm 1990, nhiều công ty dược phẩm đã đầu tư để nghiên cứu và phát triển, tìm ra các chất kháng sinh mới do tình trạng kháng thuốc lan tràn của các

vi sinh vật gây bệnh [126] Vào khoảng những năm 1993 đến 2002, số lượng các tác nhân kháng khuẩn đã tăng lên từ 90 đến 120 (Công bố tại Hội nghị Khoa học về tác nhân kháng khuẩn và hoá trị liệu) Tại hội nghị này 21 công ty dược phẩm lớn

đã trình bày các phương pháp để khám phá ra các CKS mới [45,129] Như vậy, sau hơn 70 năm kể từ khi khám phá ra CKS, đến nay, số lượng CKS được phát hiện lên tới trên 17.000 chất [46] Tuy nhiên chỉ có 1-2 % CKS đủ tiêu chuẩn để sử dụng rộng rãi trong thực tiễn y học Thị trường CKS trên thế giới, theo thống kê năm

2002 đã đạt doanh số 26 tỷ đôla [174], và sẽ vẫn còn tăng khoảng 0,6% từ năm 2002-2008 Con số này cho thấy tiềm năng to lớn của ngành công nghệ kháng sinh trong nền kinh tế quốc dân Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới, làm cho chúng ta đang phải đối mặt với “thời kỳ hậu kháng sinh” (post antibiotic era) [89,90] Chính vì thế nhiệm vụ

đặt ra của ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh là: một mặt cải biến các CKS cũ

để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển (R&D) để tìm ra các chất kháng sinh mới với các cơ chế tác động mới hoàn toàn.[113]

Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới Có thể nói ngành công nghiệp sản xuất CKS vẫn đang là một trong những hướng phát triển mạnh mẽ nhất trong công nghệ sinh học Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành Vi sinh vật học, Hoá sinh học, Di truyền học phân tử và đặc biệt là sự ra đời của công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho lĩnh vực nghiên cứu CKS đạt được những thành tựu lớn lao Dưới đây là các mốc thời gian phát hiện ra các CKS trong những năm vừa qua [45,101,108,153]

Hình 1.1 Mốc thời gian tìm ra các chất kháng sinh khác nhau

1.2 CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH

Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên những vị trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật Cơ chế này phụ thuộc vào bản chất hoá học, nồng độ chất kháng sinh và cấu trúc hiển vi của tế bào Các CKS có bản chất hóa học khác nhau thì thường có cơ chế tác dụng khác nhau, còn các chất có bản chất hoá học gần giống nhau thì có hoạt phổ tương tự như nhau Đồng thời nó còn phụ thuộc vào nồng độ Một số chất

kháng sinh khi ở nồng độ thấp không những không tác dụng ức chế sinh trưởng của

vi sinh vật mà còn kích thích vi sinh vật phát triển Ngoài ra, cùng một chất kháng sinh như nhau nhưng trong các điều kiện khác nhau thì cơ chế tác động cũng có thể không hoàn toàn giống nhau Nhìn chung, cơ chế tác dụng của CKS được thể hiện theo năm phương thức sau

vị PG mới và vận chuyển nó tới đúng vị trí sinh trưởng của thành tế bào [135] Phần lớn các tác nhân kháng khuẩn thông thường đều hoạt động dựa trên sự ức chế quá trình hình thành liên kết chéo giữa các tetrapeptit của tiểu phần NAM Nổi bật nhất giữa các chất này là các kháng sinh -lactam mà đại diện là penixillin và cephalosporin Đây là các chất kháng khuẩn có vùng chức năng là các vòng -lactam Các kháng sinh -lactam ức chế sự hình thành PG mới bằng cách gắn với transpeptidaza là enzym cần thiết cho sự hình thành liên kết chéo giữa các chuỗi

PG, kìm hãm hoạt tính của enzym này và làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn [135] Tuy nhiên, cần chú ý rằng các chất kháng sinh này chỉ hoạt động ở giai đoạn tế bào đang sinh trưởng vì các tế bào già hay ở trạng thái nghỉ không sinh tổng hợp PG Các penixillin không thấm qua được màng ngoài của vi khuẩn Gram (-) nên hiệu quả chống các vi khuẩn này rất thấp, tuy nhiên các penixillin và cephalosporin phổ rộng hoặc bán tổng hợp có thể vượt qua màng ngoài

vi khuẩn Gram (-) Tế bào của người không có PG nên các kháng sinh -lactam rất

ít độc đối với tế bào người [135, 172]

Các chất kháng sinh khác như vancomyxin do Streptomyces orientalis sinh

ra và CKS bán tổng hợp xycloserin ức chế sự hình thành thành tế bào theo một cách

khác Chúng cản trở trực tiếp đến sự hình thành cầu D-alanin-D-alanin liên kết các

tiểu phần NAM của các vi khuẩn Gram (+) Tuy nhiên, các vi khuẩn không có cầu

D-alanin-D-alanin có khả năng đề kháng tự nhiên đối với những chất kháng sinh

này Một chất kháng sinh ức chế tổng hợp thành tế bào khác là bacitracin ngăn cản

sự vận chuyển các đơn vị PG mới từ tế bào chất đến vị trí tổng hợp của thành tế

bào Cũng như các CKS -lactam, vancomyxin, xycloserin và bacitraxin làm gián

đoạn sự tổng hợp thành tế bào và làm tế bào bị phá vỡ do áp suất thẩm thấu [135]

Liên kết với protein thụ thể

Người ta cho rằng, một số protein liên kết với penixillin–(Peniciline Binding

Protein (PBP) nằm trên màng tế bào vi khuẩn) là các đích cho các penixillin và các

cephalosporin liên kết Tất cả các vi khuẩn đều có loại protein này, ví dụ

Staphylococcus aureus có 4 PBP còn E.coli thì có ít nhất là 7 PBP Các PBP này

hoạt động như các enzym và biểu hiện hoạt tính của cacbocylpeptidaza,

transpeptidaza, enđopeptidaza và transglycozylaza Song vai trò chính xác của các

PBP, bất kể thuộc hoạt tính enzym nào, trong sự sinh trưởng và phân chia tế bào,

vẫn chưa được biết rõ, và vì vậy cơ chế phân tử của hoạt động gây chết của các chất

kháng sinh nhóm β-lactam vẫn chưa được giải thích

1.2.2 Ức chế sự tổng hợp protein

Các tác nhân kháng khuẩn có đích tấn công là tiểu phần 30S của riboxom gồm

các aminoglycozit và các tetraxyclin Aminoglycozit bao gồm streptomyxin,

gentamyxin, neomyxin, kanamyxin, amykaxin, tobramyxin…Chúng gắn vào tiểu

phần 30S của riboxom, làm biến dạng tiểu phần này và gây ra sự bắt cặp không

chính xác giữa các codon của ARNt và các anticodon của ARNvc tương ứng Kết

quả làm mã di truyền trên phân tử ARNt bị đọc sai Ví dụ dưới tác động của

streptomyxin, codon UUU mã hoá cho phenylalanin bị đọc sai thành codon AUU

mã cho isolexin Tetracyclin phong bế vị trí gắn của phân tử ARNvc với ARNtt ở

tiểu phần 30S, ngăn cản sự gắn bổ sung các axit amin vào chuỗi polypeptit đang được kéo dài [135]

Hình 1.2 Cơ chế tác động của tetracylin và aminoglycosit

Các tác nhân kháng khuẩn khác có đích tấn công là tiểu phần 50S của riboxom Chloramphenicol và một số chất tương tự phong bế vị trí hoạt động của enzym xúc tác cho sự tạo thành liên kết peptit giữa các axit amin trong chuỗi polypeptit đang kéo dài, ngăn cản sự tạo thành phân tử protein hoàn chỉnh

Clindamyxin và các tác nhân kháng khuẩn thuộc nhóm macrolit bao gồm

erythromyxin gắn vào tiểu phần 50S ngăn cản sự dịch chuyển của riboxom từ codon này đến codon kế tiếp Kết quả là quá trình dịch mã bị cản trở và sự tổng hợp phân

tử protein bị dừng lại

Hình 1.3 Cơ chế tác dụng của Macrolit và Chloramphenicol

1.2.3 Chất kháng sinh phá huỷ màng sinh chất của tế bào

Một số CKS phá vỡ màng sinh chất của các tế bào đích bằng cách tương tác với màng sinh chất và làm tổn thương tính nguyên vẹn của nó Đây là cơ chế

hoạt động của một nhóm chất gọi là polyen Amphoterixin B là một polyen có khả

năng kháng nấm vì nó gắn với ergosterol-thành phần cấu tạo nên màng sinh chất

của nấm và tạo ra các lỗ rò trên màng, làm nội chất của tế bào thất thoát ra môi

trường bên ngoài Màng sinh chất của tế bào người và động vật có thể bị tổn thương

bởi amphoterixin B vì chúng chứa cholesterol là các phân tử có cấu trúc tương tự

như ergosterol, mặc dù cách gắn của amphoterixin B với cholesterol hơi khác so với

ergosterol

Hình 1.4 Cơ chế tác dụng của Amphotericin B

Màng sinh chất của hầu hết vi khuẩn không có sterol nên chúng có khả năng

đề kháng với amphoterixin B Tuy nhiên, chúng vẫn có thể bị phá vỡ bởi các polyen khác Ví dụ: polymyxin một polyen do Bacillus polymyxa sinh ra có khả năng

kháng đặc hiệu đối với vi khuẩn Gram (-) Polymyxin phá vỡ màng sinh chất của vi

khuẩn bằng cách gắn vào photpholipit của màng, làm biến dạng bề mặt tế bào và thay đổi cấu trúc của màng dẫn đến sự rò rỉ một số chất của tế bào ra môi trường bên ngoài, gây chết tế bào [135,137]

1.2.4 Ức chế các con đường trao đổi chất

Phần lớn các CKS kháng vi sinh vật theo cơ chế này đều có cấu trúc gần giống với các chất trao đổi bình thường của tế bào như axit amin, coenzym, nên được coi

là các chất kháng chất trao đổi (antimetabolite), tác dụng theo kiểu ức chế cạnh tranh Ở nhiều vi sinh vật axit para-aminobenzoic (PABA) là cơ chất cho phản ứng enzym dẫn đến sự tổng hợp axit tetrahydrofolic (THF), một dạng của axit folic đóng vai trò như một coenzym cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp các purin và pyrimidin của axit nucleic Để tổng hợp THF, PABA phải được chuyển thành axit đihidrofolic (DHF), rồi từ DHF tổng hợp nên THF nhờ sự có mặt của các enzym

xúc tác Sunfonamit là chất hoạt động như một chất kháng chất trao đổi vì nó có cấu trúc hoá học gần giống với PABA Khi có mặt sunfonamit, nó sẽ cạnh tranh với PABA vị trí hoạt động của enzym xúc tác chuyển PABA thành DHF Kết quả là sự thiếu hụt DHF đã làm cản trở quá trình tổng hợp THF, ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của sunfonamit trong quá trình sinh tổng hợp axit folic

Một tác nhân kháng chất trao đổi khác là trimethoprim cũng can thiệp vào quá trình tổng hợp axit nucleic Tuy nhiên thay vì gắn vào enzym chuyển hoá PABA thành DHF, trimethoprim lại gắn vào enzym chuyển DHF thành THF Các chất kháng chất trao đổi rất có giá trị trong y học vì chúng ức chế các tế bào vi khuẩn và động vật nguyên sinh mà không tác dụng lên tế bào người và động vật Nguyên do

vì người không tổng hợp THF từ PABA như vi khuẩn mà thay vào đó người thu nhận các axit folic đơn giản từ chất dinh dưỡng trong chế độ ăn uống rồi chuyển chúng thành THF [135,137]

1.2.5 Ức chế sự tổng hợp axit nucleic

Axit nucleic gồm ADN và ARN là các đại phân tử sinh học không thể thiếu được đối với sự sống của tế bào Một số CKS cản trở quá trình sao chép ADN và phiên mã ở vi sinh vật Các CKS này ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp axit nucleic

bằng cách ức chế sự tổng hợp các nucleotit, ức chế sao chép hoặc làm dừng phiên

mã Vì sự khác biệt giữa ADN của tế bào prokaryot và eukaryot là rất nhỏ nên những CKS ức chế sinh tổng hợp axit nucleic không những tiêu diệt vi sinh vật mà còn độc với cả con người Ví dụ actinomyxin gắn với ADN ức chế sự tổng hợp ADN và phiên mã không chỉ ở các tế bào vi khuẩn gây bệnh mà còn đối với cả con người Các kháng sinh tổng hợp như các quinolon và fluoroquinolon có khả năng ức chế đặc hiệu ADN của tế bào prokaryot mà ít ảnh hưởng đến các tế bào eukaryot Những kháng sinh này ức chế sự hoạt động của enzym tháo xoắn sợi ADN mạch kép trong quá trình sao chép ADN của tế bào là ADN gyraza Các kháng sinh khác

ức chế hoạt động của ARN polymeraza trong quá trình sinh tổng hợp ARN từ ADN mạch khuôn Một số kháng sinh bao gồm rifampin kết hợp mạnh mẽ với ARN polymeraza của prokaryot nhưng ít ảnh hưởng đến ARN polymeraza của eukaryot nên rifampin độc với vi khuẩn gây bệnh hơn so với con người [135, 137,153]

1.3 XẠ KHUẨN VÀ SỰ HÌNH THÀNH KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 1.3.1 Xạ khuẩn và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đơn bào, phân bố rộng rói và đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên [139] Chúng tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá hợp chất trong đất, trong nước Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật Theo Waksman thì trong 1 gam đất có khoảng 29.000-2.400.000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9-45 % tổng số vi sinh vật [181] Đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS, 60-70%

xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh

1.3.2 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên

Tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh bao gồm các bước sau: [7,8, 62,99, 134,178]

Thu thập các mẫu đất, bùn, nước, lá… từ các loại môi trường khác nhau

Thử khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật kiểm định của các chủng

đã thuần khiết

Chọn lựa các chủng thuần khiết có hoạt tính sinh học: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng u, dùng trong y học, trong nông nghiệp và trong thú y để nghiên cứu tiếp Lên men khối lượng lớn hơn để tách chiết CKS và xác định hoạt tính kháng khuẩn của CKS

Phần lớn CKS lµ do xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh ra, song khả năng

sinh CKS của các chi thuộc “ xạ khuẩn hiếm” ngày càng được đặc biệt chú ý Dưới đây là đồ thị biểu diễn tỷ lệ các vi sinh vật sinh các chất kháng sinh theo khảo sát năm 1982-1999 ở Nhật Bản và mục đích tuyển chọn các chất kháng sinh được ứng dụng trong thực tiễn [107]

Những năm vừa qua, số lượng các chất kháng sinh do nấm sinh ra tăng lên nhiều từ 10%-40% và tỷ lệ các chất kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra giảm đi đáng kể

Các chất được sử dụng trong nông nghiệp và chăn nuôi

Hình 1.7 Mục tiêu tuyển chọn các chất có hoạt tính sinh học

( Japanese patent 1982-1999) Nhìn vào đồ thị, chúng ta có thể thấy việc sử dụng chất kháng sinh trong nông nghiệp và thú y không có sự biến động lớn lắm Tuy nhiên, vài năm gần đây

xu thế này có vẻ giảm đi đôi chút

1.3.3 Những khái niệm cơ bản về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn G(+), đặc biệt khác với vi sinh vật nhân

sơ là có tỷ lệ G +X cao (>70 %) , trong khi đó ở vi khuẩn là 25- 45 %, đựơc phân biệt với các vi sinh vật khác bởi 2 đặc điểm cơ bản [108,140,166]

Có khoảng 17.000 chất kháng sinh được phát hiện từ vi sinh vật trong đó 2/3

là do xạ khuẩn sinh ra và chủ yếu là thuộc chi Streptomyces [46]

Theo quan điểm sinh thái học thì xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng trong chu trình phân hủy các chất và có thể sử dụng chất hữu cơ khó phân giải là axit humic Gần đây, xạ khuẩn (Actinomycetes) được xác định thuộc bộ Actinomycetales dựa vào trình tự ADNr 16S Taxon này có khoảng 100 chi với 1.000 loài Một nửa trong số các chi này thuộc vi khuẩn điển hình như dạng cầu, dạng que, không tạo thành khuẩn ty dạng sợi và bào tử

Xạ khuẩn điển hình thuộc bộ Actinomycetales gồm Streptomyces, Actinomadura, Actinoplanes, Dactylosporangium, Microbispora, Micromonospora, Streptosporangium Chúng sinh ra rất nhiều chất kháng sinh, kích thước genom

dạng thẳng 8-9 Mbp

Xạ khuẩn không điển hình thuộc bộ Actinomycetales gồm: Micrococcus, Arthrobacter, Mycobacterium, Propionibacterium không sinh ra chất kháng sinh,

genom dạng vòng, kích thước 3-4 Mbp

1.3.4 Streptomyces và xạ khuẩn hiếm

Xạ khuẩn điển hình được phân chia thành 2 nhóm Streptomyces và xạ khuẩn hiếm Streptomyces là nhóm xạ khuẩn chiếm ưu thế trong đất, chi này có khoảng

500 loài Xạ khuẩn hiếm lại được chia thành hơn 50 chi khác nhau và gồm nhiều loài chưa công bố, chúng thường sinh trưởng chậm, tạo thành khuẩn lạc nhỏ, thường khó bảo quản và nuôi cấy trong môi trường dịch thể Trong khi đó,

Streptomyces lại rất thuận tiện cho việc tìm kiếm và sàng lọc chất kháng

Glyxin Arabinoza Galactoza Chi đại diện

DAP, diaminopimelic acid, Alanin và glutamic đều có mặt ở +

* Glyxin là amino axit duy nhất không chứa carbon đối xứng trong phân tử của chúng Do đó, glycin không có cấu hình dạng D hay L

** Trong họ Micromonospora thì L-alanin tại vị trí số 1 của phần peptit đổi thành glyxin ( tức là loại mất nhóm –CH3)

*** Trong nhóm xạ khuẩn có chứa axit mycolic như Norcadia và Mycobacterium, thì thành tế bào có chứa arabinogalactan (cấu tạo bởi arabinoza

và galactoza)

Theo Lechevalier và Lechevalier, 1967, dựa vào 5000 chủng phân lập từ 16

mẫu đất, đã chia ra khu hệ xạ khuẩn trong đất như sau: Chi Streptomyces chiếm

95,43%, chi Norcadia chiếm 1,98%, Micromonospora chiếm 1,4%, Thermomonospora 0,22%, Actinoplanes 0,2%, Microbispora 0,18%,

Streptosporangium 0,1%, Actinomadura 0,1%

Năm 1970, Lechevalier và Lechevalier đã đưa ra tiêu chuẩn phân chia thành

tế bào của xạ khuẩn điển hình ra làm 4 typ [91,92] Vào những năm 1980, cấu trúc hóa học của peptydoglycan đã được làm sáng tỏ và typ thành tế bào lại được xác nhận lại lần nữa

hóa về hình dạng rất phức tạp, nhưng trong đất, chúng thường tồn tại dưới dạng bào

1.3.4.3 Thành tế bào typ III

Chứa meso-DAP Loại này gồm rất nhiều họ như Streptosporangiaceae, Thermomonosporaceae (thuộc nhóm Actinomadura), Nocadiopsaceae và Pseudonocardiaceae Xạ khuẩn có dạng meso-DAP và tạo thành khuẩn ty khí sinh thường không dễ dàng xá định được Họ này được phân biệt với các họ khác nhờ thành phần đường trong toàn bộ tế bào

1.3.4.4.Thành tế bào typ IV

Chứa meso-DAP, arabinoza và galactoza Những vi khuẩn thuộc nhóm này

gồm: Mycobacterium, Nocardia, Gordonia và Rhodococcus Chúng đều có axit

mycolic, arabinogalactan và axit N-glycolyl muramic trong thành tế bào Một số

loài gây bệnh phổi, ho gà về hình dạng thì thường hình que hoặc đa hình, có dạng sợi đơn giản hoặc có xu thế tạo thành các mảnh nhỏ hình que [108, 148]

1.3.4.5.Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

 Khuẩn lạc

Khác với các vi sinh vật khác, khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì,

có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc có ba lớp: lớp

vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường lên men Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh [7,8,176,181] Các loài xạ khuẩn có thể tạo các loại sắc hoà tố tan trong môi trường nuôi cấy Hướng sinh trưởng của khuẩn ty vào phía trong hoặc ra ngoài mặt môi trường tạo thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh của khuẩn lạc xạ khuẩn Khuẩn ty khí sinh phát triển ra ngoài không khí, thường phần cuối các khuẩn ty này biến thành cuống sinh bào tử [114,134,154]

 Khuẩn ty

Khuẩn ty của xạ khuẩn trông giống hệ sợi của vi nấm, phân nhánh và không có vách ngăn Xạ khuẩn phát triển theo kiểu mọc chồi, phân nhánh, khoảng 30µm một nhánh Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đoạn phát triển là 11µm [181], “nhân” tế bào xạ khuẩn phát triển đều đặn theo chiều dài của khuẩn ty Do vậy, mỗi đoạn khuẩn ty hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên sau 1-2giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ADN, nhân các gen cần thiết từ genom

và tiến hành tổng hợp protein Cứ như vậy khuẩn ty hình thành và phát triển

Xạ khuẩn thuộc nhóm cơ thể dị dưỡng, thường sử dụng nguồn cacbon như đường, tinh bột, rượu, axit hữu cơ, polysacarit Nguồn nitơ vô cơ thường là nitrat, muối amon, nguồn nitơ hữu cơ là: pepton, protein, cao ngô, cao nấm

men…Khả năng đồng hóa các chất ở các loài xạ khuẩn khác nhau là khác nhau Phần lớn chúng ưa khí, ưa ẩm, phát triển tốt ở môi trường trung tính hoặc hơi kiềm

 Cấu trúc tế bào

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn G(+) Thành tế bào xạ khuẩn gồm 3 lớp: lớp ngoài dày khoảng 60-120A°, khi già có thể là 150A°; lớp giữa rắn và chắc hơn, dày khoảng 50A°, lớp trong dày 50A° được cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptit gồm các gốc N-axetylglucozamin (NAG) liên kết với các axit N-axetylmuramic (NAM) bởi các liên kết  1,4- glycozit Khi xử lý bằng lizozym các liên kết này bị phá vỡ, thành tế bào bị phá hủy để lại màng nguyên sinh chất bao bọc phần còn lại của tế bào gọi là thể sinh chất (protoplast) Màng tế bào xạ khuẩn chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển chất qua màng [42, 77,

108, 134, 150, 171, 182]

Màng sinh chất của xạ khuẩn chủ yếu bao gồm hai thành phần là photpholipit và protein Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự tái sắp xếp lại các phần

tử ADN Điều này gây ra một số hiện tượng lạ như: tạo ra tính đa hình thái, tính kháng thuốc Hơn nữa, sự tự nhân lên của các đoạn ADN còn làm phức tạp thêm việc nghiên cứu di truyền của xạ khuẩn

 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF), dạng xoắn lò so (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản,

có hình móc câu (RA) Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo hai cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [114] Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh trưởng của khuẩn ty khí sinh Nếu môi trường giầu dinh dưỡng quá thì quá trình sinh bào

tử thường bị kìm hãm [99] Trong nhiều trường hợp khi kích thích sự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi

1.3.5 Phương pháp phân loại xạ khuẩn

1.3.5.1 Thành tế bào (Peptidoglycan)

Vi khuẩn có một thành tế bào riêng biệt, tại đó biểu hiện nhiều biến đổi thuận lợi cho các tiêu chuẩn phân loại Peptiđoglycan được tìm thấy ở tất cả các vi khuẩn

thật trừ Mycoplasma Trong khi vi khuẩn Gram (-) có lớp peptiđoglycan mỏng với

cấu trúc thông thường thì vi khuẩn Gram (+) lại có lớp này dầy với cấu trúc biến đổi mang tính phân loại Có hai typ cấu trúc peptiđoglycan, typ A và typ B Mặc dù rất khó xác định trực tiếp những biến đổi về mặt cấu trúc nhưng các dạng này thường được xác định thông qua thành phần axit amin của peptiđoglycan tinh sạch [108] Ngoài sự khác biệt phức tạp này thì sự biến đổi trong liên kết chéo giữa điamino axit cũng hữu ích cho việc phân loại và xác định đặc điểm vi khuẩn Vì thế việc phân tích peptiđoglycan được coi là một trong những tiêu chuẩn hoá phân loại thiết yếu nhất cho vi khuẩn Gram(+), trong đó có xạ khuẩn Các đồng phân axit điaminopimelic (DAP) của peptiđoglycan, là một trong các amino axit chìa khoá phổ biến nhất, có thể được xác định bằng một phương pháp đơn giản: thuỷ phân toàn bộ tế bào - tiếp đó dùng phép sắc ký bản mỏng [20, 25, 67,83,127,128] Nhiều

vi khuẩn lactic và vi khuẩn coryneform chứa lysin hoặc ornithin dưới dạng các axit amin chìa khoá, chúng cũng được tìm thấy trong protein Khi người ta không phát hiện được bất cứ đồng phân DAP nào thì thành phần axit amin phải được xác định bằng cách thuỷ phân peptiđoglycan đã tinh sạch nhờ máy phân tích axit amin tự động hoặc phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Ngoài ra trong thành tế bào, thành phần đường và typ thành tế bào là những chỉ số hữu ích nữa cho hoá phân loại nói chung , đặc biệt đối với một số nhóm xạ khuẩn nói riêng [144,146, 161]

1.3.5.2.Axit béo tế bào

Các axit béo thường nằm ở màng tế bào chất của vi khuẩn và được tạo ra nhờ

lớn để xác định các đặc điểm phân loại Chuẩn bị mẫu cho các metyl este và phân tích sắc ký khí không đặc biệt dành cho mục đích phân loại này Người ta phân các axit béo tế bào thành ba dạng chính [83]:

- Dạng mạch thẳng chứa các axit C15 và C18 cùng với các axit đơn không no tương ứng,

- Dạng mạch nhánh chủ yếu chứa các axit iso và anteiso chiếm ưu thế nhưng thiếu các axit không no Tuy nhiên các axit mạch nhánh iso chứa các axit không

no tương ứng lại chiếm ưu thế ở dạng mạch nhánh của một số xạ khuẩn và vi khuẩn Gram (-)

- Dạng phức, dạng này chứa thành phần của cả hai dạng trên và được tìm thấy ở một số vi khuẩn Gram (+), chủ yếu ở xạ khuẩn

Có một số sự biến đổi đặc biệt ở axit béo không nằm ở màng tế bào chất

Vi khuẩn Gram (-) có vỏ tế bào đặc trưng, màng ngoài chứa axit béo 3-hyđroxy tiện lợi làm vai trò đánh dấu ( marker) khi phân loại Axit mycolic là axit béo 2-alkyl 3-hyđroxy phân tử lượng cao

1.3.5.3.Các isoprenoit quinon

Các isoprenoit quinon là chất tương tự coenzym Q của chuỗi hô hấp và được tìm thấy nhiều trong các vi khuẩn hiếu khí Phần lớn các vi kuẩn có thành phần các isoprenoit quinon đơn giản, trong khí đó hầu hết các xạ khuẩn lại có thành phần này phức tạp và đôi khi lại có các đồng phân cấu trúc

Menaquinon là quinon ưu thế ở vi khuẩn Gram (+) chứa các isoprenoit quinon

Vi khuẩn sống trong các môi trường khắc nghiệt thường có những quinon bất thường Các phân tích định tính isopren quinon cần dùng phép sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và đôi khi còn cần cả khối phổ ký để xác định đặc điểm loài ở cấp độ phân

tử Phép sắc ký bản mỏng là một kỹ thuật cực kỳ đơn giản và hữu dụng để mô tả định tính tính chất của một số lượng mẫu lớn

1.3.5.4.Thành phần bazơ của ADN

Thành phần của ADN được trình bày dưới dạng tỷ lệ G+C là một trong những thành phần thiết yếu của genom một vi sinh vật vì người ta đã biết tỉ số A/T bằng G/C Tỷ lệ này ở vi khuẩn và nấm men biến đổi rất nhiều từ ít hơn 30mol% đến hơn 70mol %.[63,64,74,159] Đây chính là những chỉ số rất giá trị dùng trong phân loại

xạ khuẩn Phương pháp biến tính bằng nhiệt được dùng phổ biến nhằm xác định thành phần bazơ này.[147] Gần đây một phương pháp phân tích mới, dùng HPLC tiếp sau việc phân hủy nhờ enzym, thành phần ADN ngày càng trở nên một chỉ số phổ biến và thường xuyên dùng để xác định đặc điểm xạ khuẩn Phương pháp HPLC có một ưu điểm nữa là dung dịch ADN chứa ARN có thể được đưa vào phân tích HPLC bằng cách tách hoàn toàn ARN trên sắc đồ Càng nhiều số liệu được thu thập thì độ tin cậy của tiêu chuẩn càng tăng.[81]

1.3.5.5 Lai ADN-ADN

Kỹ thuật lai ADN-ADN có thể kiểm tra được các đoạn tương đồng giữa hai vi sinh vật bằng cách so sánh tỉ lệ tái tổ hợp khác nguồn gốc của các ADN mạch đơn

Vì kích cỡ genom của vi khuẩn và nấm men là không quá lớn nên kỹ thuật này được

áp dụng dễ dàng ở cấp độ ADN nhiễm sắc thể Mặc dầu có nhiều phương pháp thông dụng để xác định mối quan hệ họ hàng của ADN, nhưng theo nhận định chung về vi khuẩn thì ranh giới giữa các loài, sự tương đồng về ADN là khoảng 70% Gần đây Ezaki và cộng sự đưa ra kỹ thuật sử dụng chất nền huỳnh quang thay cho đồng vị phóng xạ Kỹ thuật này làm cho việc sử dụng phép lai ADN-ADN để xác định đặc điểm vi sinh vật một cách nhanh chóng [59,108]

Phép lai ADN-ADN là phương pháp tốt nhất đưa ra một cặp kết quả cuối cùng khi xác định đặc điểm Cần nhớ rằng tính tương đồng ADN-ADN không phải là một giá trị tuyệt đối như thành phần bazơ của ADN mà nó chỉ là chỉ số tương đôí giữa các bên tham gia nên nó không phù hợp cho việc mô tả một taxon (đơn vị phân loại) [20,22,23,80]

1.3.5.6 Trình tự ARN ribosom

Hiện nay phần lớn các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ tương đồng về trình tự ARNr phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể vi sinh vật [74, 97, 170] Tất cả các loài vi sinh vật đều có cùng một cách tổng hợp protein nhờ các riboxom Vì vậy người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã hóa ARNr ở các vi sinh vật khác nhau để xác định mối quan hệ tiến hoá giữa chúng ARNr là phân tử lý tưởng cho các nghiên cứu về tiến hoá của vi sinh vật và mối quan hệ giữa chúng bởi vì chúng là thành phần cơ bản có trong mọi tế bào vi sinh vật [24,102] Vai trò và chức năng của chúng là giống nhau ở tất cả các riboxom Người ta nhận thấy cấu trúc không gian của phân tử ARNr rất giống nhau giữa các loài vi sinh vật khác nhau Các gen mã hóa cho chúng được bảo tồn rất tốt trong quá trình tiến hoá Trong quá trình tiến hoá, các vùng gen đó có thể bị những đột biến nhất định, nhưng chọn lọc tự nhiên chỉ giữ lại những đột biến trung tính, ít làm thay đổi cấu trúc không gian của ARNr, ít ảnh hưởng đến sự tổng hợp protein của sinh vật [158,159]

Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho phân tử ARNr, các nhà khoa học đã thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại các vùng biến đổi

So sánh sự khác biệt giữa các vùng này, người ta có thể chỉ ra được những sự khác biệt giữa các loài gần gũi [85] Theo Robert W Bauman, nếu hai loài vi khuẩn có sự khác biệt về trình tự gen ARNr 16S lớn hơn 3% thì có thể xem là hai loài khác nhau [135]

Theo các nhà khoa học thì dung lượng phát sinh loài của phân tử ARNr 23S là lớn hơn so với phân tử ARNr 16S Tuy nhiên trình tự đã được xác định hoàn chỉnh của gen ARNr 23S là rất ít trong khi đó trình tự của gen ARNr 16S là khá phong phú và được công bố rộng rãi trên ngân hàng gen quốc tế Chính vì vậy phương pháp giải trình tự gen mã hoá ARNr 16S để làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh chủng loại của vi sinh vật vẫn là lý tưởng nhất Lần xuất bản thứ tư của cả

“Bergey’s Manual of Systemmatic Bacteriology” và “The Prokaryote” đều dựa vào tiêu chuẩn ARNr 16S làm tiêu chuẩn phát sinh loài tương ứng của vi sinh vật

Chính vì vậy có thể nói phương pháp xác định trình tự gen ARNr 16S là phương pháp phân tử phổ biến nhất được dùng để định loại vi khuẩn [62,135]

Cây phát sinh chủng loại (cây phả hệ) được xây dựng dựa trên các khoảng cách đã tính toán Nó đang trở thành một công cụ đắc lực cho nghiên cứu phân loại

ở các cấp độ cao hơn chi Sự tương đồng giữa phép phân loại dựa trên các đặc điểm kiểu hình (phenotypic) và cây phát sinh đã và đang được nghiên cứu một cách rộng rãi Nhìn chung các đặc điểm hoá phân loại đã đề cập ở trên cho thấy mối tương quan tốt với cây phát sinh chủng loại [30,145,164,165,166]

1.3.6 Phân loại chi Streptomyces

Streptomyces là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất Khuẩn ty sinh

dưỡng (0,5-2,0 µm) được sinh ra từ sợi khuẩn ty và phát triển theo kiểu phân nhánh, sau đó tạo thành hệ khuẩn ty sinh dưỡng Từ khuẩn ty sinh dưỡng phát triển thành khuẩn ty khí sinh Ở hầu hết các loại khuẩn ty khí sinh hình thành cuống sinh bào

tử có từ 3 đến nhiều bào tử Bề mặt bào tử có kết cấu khác nhau , có thể nhẵn, xù xì, phủ gai hoặc lông Ở những loại khác, khuẩn ty khí sinh là những sợi nhỏ dài, thẳng hoặc mang các nhánh ngắt quãng, sắp xếp thành chùm Mỗi nhánh có 2 hoặc nhiều bào tử hình cầu hoặc elip có dạng gai hoặc dạng tóc… Bề mặt khuẩn lạc có dạng lông mịn, dạng bông, dạng da, dạng bột, hoặc dạng nhung [20,52,56, 154,170,176]

Mầu sắc khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất rất khác nhau Chúng có

thể hình thành sắc tố tan và tiết vào môi trường Các loài thuộc chi Streptomyces có

cấu tạo giống vi khuẩn Gram (+), hiếu khí, dị dưỡng Nhiệt độ tối ưu là 25-28°C và

pH tối ưu thường là 6,5-8

Các đặc điểm về hóa phân loại của chi này được đặc trưng bởi [159,183, 186]:

+ Thành tế bào thuộc Typ I chứa LL- DAP ( axit L-diaminopimelic) + Peptidoglican (PG) ở Streptomyces có đặc điểm: liên kết chéo trong

PG được hình thành giữa D-alanin tận cùng của tetrapeptit này với nhóm axit diaminopimelic (DAP) ở vị trí thứ ba của tetrapeptit khác Đặc điểm này lại giống

với cấu trúc của hầu hết các vi khuẩn G(-) Đây là một trong các đặc điểm rất khác biệt của xạ khuẩn với hầu hết các nhóm vi khuẩn G(+) khác

+Axit béo bão hòa, đồng phân nhánh 15-17C với lượng ít và không bão hòa với mạch phân nhánh 16C izo và 15-17C canteiso được metyl hóa ở nguyên tử cácbon thứ 10

+ Dạng menaquinon 9 [33,142,143]

+ Photpholipit dạng II: photpholipit chứa nitơ là photphotidylenatolamin + Mol % (G+C) của ADN là 69-78

Đó là các đặc điểm mà Stackebrandt đã nghiên cứu và đưa ra để dùng

trong phân loại chi Streptomyces [159]

1.4 SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN

1.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh

Vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên sinh ra các sản phẩm trao đổi chất và các thành phần tế bào chỉ ở mức độ cần thiết cho sự sinh sản và sự duy trì loài [42] Những quá trình lên men công nghiệp phải chọn hoặc tìm ra được những cá thể có khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm mong muốn với năng suất cao Trong việc tối

ưu hóa các quá trình lên men công nghiệp, cần phải tìm ra trạng thái sinh lý để có năng suất cao nhất và duy trì trong một thời gian dài [42,43] Vấn đề kinh tế chủ yếu đối với một quá trình lên men là làm sao từ cơ chất ban đầu, trong một thể tích nồi lên men nhỏ tới mức cho phép, trong một thời gian ngắn có thể đạt tới mức thu hoạch cao đối với các sản phẩm mong muốn Để có được kết quả đó cần phải xác định các thông số cần thiết cho sự phát triển và hình thành tối ưu sản phẩm của quá trình sinh tổng hợp

1.4.1.1 Thành phần môi trường lên men

 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn cacbon thường là các đường đơn: glucoza, fructoza hay các loại đường đôi như: sacaroza, maltoza, lactoza hoặc cũng có thể là các loại tinh bột,

các chất có thành phần không xác định như rỉ đường [7,8,53] Trong tất cả các nguồn cacbon thì glucoza là nguồn cacbon dễ tiêu hoá, nhưng nó thường gây nên hiện tượng kiềm chế dị hoá trong tổng hợp CKS ở một ngưỡng nồng độ nào đó [99] Tuy nhiên ta có thể khắc phục đuợc hiện tượng này bằng cách bổ sung liên tục một lượng nhỏ glucoza theo định kỳ, mà không dẫn đến tích lũy các chất trao đổi ức chế, nhờ đó có thể tiến hành sản xuất CKS từ nguồn cacbon là glucoza.[40,68]

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ, tồn tại ở hai dạng vô cơ và hữu cơ Nguồn nitơ hữu cơ gồm: cao ngô, cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tương Nguồn nitơ vô cơ thường dùng

ở dạng muối amôn(NH4+) hoặc nitrat (NO3-), song thông thường quá trình sinh tổng hợp CKS đòi hỏi cả hai nguồn nitơ trong môi trường [88] Nguồn và nồng độ nitơ trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp CKS Sự dư thừa các amon hay các nitơ chuyển hóa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp của nhiều chất kháng sinh như erythromixin, leucomixin, novobioxin…[53,78,99] Tác dụng ngược của nguồn nitơ dễ tiêu (amon) có thể được loại trừ khi bổ sung Mg3(PO4)2

vào môi trường Sự hình thành CKS của mỗi chủng đòi hỏi tỷ lệ C/N nhất định

Ảnh hưởng của nguồn photpho vô cơ

Bên cạnh nguồn C và N thì photphat vô cơ được xem như là yếu tố tham gia điều chỉnh sinh tổng hợp CKS ở xạ khuẩn [182] Nồng độ photphat thích hợp cho tổng hợp CKS thường không vượt quá 10mg/ml [44] Nồng độ photphat cao sẽ làm tăng tổng hợp axit nucleic trong tế bào, do đó rút ngắn pha tổng hợp và kéo dài pha dinh dưỡng, hoặc lượng photphat dư thừa sẽ ức chế quá trình tổng hợp các enzym tham giam vào tổng hợp enzym [44,52] Tuy nhiên cũng có những ngoại lệ như sinh

tổng hợp nocaxidin bởi Nocardia uniformic lại cần một nồng độ photphat vô cơ cao

100-200 g/ml [7,16, 182]

1.4.1.2 Điều kiện nuôi cấy

 Độ thông khí

Xạ khuẩn là vi khuẩn hiếu khí, có nhu cầu thông khí cao hơn so với các vi sinh vật khác, nhất là trong giai đoạn nhân giống Do đó yếu tố thông khí có ảnh hưởng quyết định đến sinh tổng hợp CKS Đối với hàng loạt CKS thì độ thông khí để đạt hiệu suất cực đại là lưu lượng thổi khí 1v/v/phút

 Nhiệt độ

Hầu hết xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28  300C Nhiệt độ thích hợp cho

sự tổng hợp CKS còn phụ thuộc vào từng chủng sản Ví dụ chủng S.griseus nhiệt độ

tối ưu cho sản xuất CKS streptomyxin là 260C, nhiệt độ ức chế sản xuất là 30, còn

S.rifamices thì nhiệt độ tối ưu cho sản xuất lại là 190C, nhiệt độ ức chế là 270C [7]

 pH môi trường

Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc rất lớn vào pH môi trường pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường là pH trung tính pH axit hay kiềm đều ức chế quá trình tổng hợp CKS Bởi vậy mà trong hệ thống nồi lên men, thường thiết kế bộ phận điều chỉnh pH tự động bằng HCl và NaOH [44,182]

 Chất lượng bào tử và giống sinh dưỡng

Thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng, nghĩa là vào tuổi và khả năng đồng đều về mặt di truyền cùng hoạt tính trao đổi chất của chủng giống phản ánh điều kiện nuôi cấy.[41]

Tuổi của giống cho hiệu suất CKS cao nhất là 24 giờ tuổi, tuy nhiên thời gian nuôi còn phụ thuộc vào từng chủng và tuổi của bào tử giống Tỷ lệ giống vào môi trường lên men phụ thuộc vào chủng xạ khuẩn và thành phần môi trường nhân giống (thường là từ 2 - 10%)

Các phòng thí nghiệm hiện nay trên thế giới đã có rất nhiều phương pháp để lựa chọn các điều kiện lên men thích hợp cho quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của chủng sản Chẳng hạn nhóm nghiên cứu của Duetz đã dùng phương pháp

96 giếng , đây là phương pháp có nhiều ưu việt hơn, tuy nhiên không có một mô hình chuẩn nào cho việc lựa chọn các điều kiện tối ưu cho sự tạo thành các sản phẩm bậc 2 ở vi sinh vật [106]

1.4.2 Công nghệ lên men CKS – Quá trình sau lên men (Downstream Processing)

Đây là một thuật ngữ thường dùng để mô tả quá trình tinh sạch các sản phẩm đã được tạo thành trong thời gian lên men nhờ vi sinh vật Quá trình này gồm các bước: tinh sạch sản phẩm, phân tích kinh tế, tạo sản phẩm ở quy mô lớn Việc thu hồi và xác định các sản phẩm có phân tử nhỏ (300-800 MW), đặc biệt là các sản phẩm bậc hai, là bước nghiên cứu quan trọng [46]

Sản xuất CKS thường được tiến hành theo phương pháp lên men chìm trong nồi lên men có khuấy liên tục và sục khí Có hai hình thức lên men: lên men theo mẻ và lên men liên tục, được mô tả trong tài liệu [46] Cấu tạo nồi lên men phải đảm bảo tạo điều kiện lên men tối ưu: độ thông khí, nhiệt độ nuôi, pH…

Hai yếu tố quan trọng nhất trong quá trình sau lên men là: đặc tính sinh

lý của phân tử cần được tách chiết và tinh sạch (đó là trọng lượng phân tử (MW), sự phân cực của phân tử, sự tích điện của các ion) và nồng độ của chất cần tinh sạch có trong dịch nuôi cấy Nhìn chung, đặc tính lý hóa của phân tử có thể xác định nhờ một số phương pháp sắc ký như: trao đổi ion, lọc gel, tách phân lớp hay phương pháp hấp phụ Nồng độ của phân tử cần xác định có trong dịch lên men thường rất

ít, đối với một chủng hoang dại khi lên men thì nồng độ CKS thường từ

0,1-10g/ml Còn đối với một quá trình lên men chuẩn thì nồng độ là 300-600g/ml Tùy theo khả năng sinh kháng sinh của từng chủng sản, nhưng khoảng 5-10 L dịch lên men là có thể đủ cho việc xác định phổ hấp phụ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và các dữ liệu về cấu trúc phân tử trong database.[46,48]

1.4.3 Sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp CKS

1.4.3.1 Cá́c pha trao đổi chất