XÁC ĐỊNH CHẤT BẢO QUẢN ACID SORBIC VÀ ACID BENZOIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

ACID SORBIC ACID BENZOIC PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ACID BENZOIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

Tp.HCM, năm 2016-2017

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 3

I.TỔNG QUAN 4

1 Chất bảo quản 4

2 Acid sorbic 6

3 Acid benzoic 9

4 Phương pháp HPLC 11

II XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BENZOIC VÀ AXIT SORBIC 19

1 Phạm vi áp dụng 19

2 Nguyên tắc 19

3 Thuốc thử 19

4 Thiết bị, dụng cụ 21

5 Lấy m u 21

6 Chu n bị m u thử 21

7 Cách tiến hành 22

8 Tính toán và biểu thị kết quả 23

9 Độ chụm 24

10 Báo cáo thử nghiệm 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội đòi hỏi các mặt hàng thực phẩm ngày càng dồi dào và phong phú về số lượng, chất lượng, cũng như chủng loại và thời gian sử dụng

Để đáp ứng nhu cầu đó, trong quá trình chế biến thực phẩm các nhà sản xuất thường

thêm các chất phụ gia vào thực phẩm nhằm cải thiện chúng Phụ gia thực phẩm là những

chất không được coi là thực phẩm hoặc một thành phần của thực phẩm, chúng có ít hoặc không có giá trị dinh dưỡng, được chủ động cho vào với mục đích đáp ứng nhu cầu công nghệ trong quá trình sản xuất, chế biến, xử lí, bao gói, vận chuyển, bảo quản

Trong đó khâu bảo quản thực phẩm không kém phần quan trọng Có nhiều cách để bảo quản thực phẩm như phơi, sấy khô, làm lạnh, đóng gói, muối, ngâm tẩm hóa chất Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng, trong đó việc sử dụng hóa chất bảo quản là một biện pháp hiện đại, làm chậm hư thối, giữ được phẩm chất và vả hấp dẫn của thực phẩm Trong nhóm hóa chất bảo quản có axit benzoic và axit sorbic được sử dụng nhiều nhằm mục đích ức chế sự phát triển của nấm men, nấm mốc gây hư hỏng thực phẩm

Vì lượng nhỏ axit benzoic và axit sorbic trên nền hữu cơ là khó xác định Do đó phải lựa chọn phương pháp phân tích hữu hiệu nhất Có thể phân tích hai axit này bằng nhiều phương pháp như quang phổ UV – VIS, sắc kí phối phổ, sắc kí lỏng hiệu nâng cao,…các phương pháp này đo độ nhạy, độ chính xác cao Tuy nhiên, cho đến nay việc xác định đồng thời hai axit này trong cùng một đối tượng mẫu chưa được nghiên cứu

Để góp phần phục vụ công tác kiểm tra an toàn thực phẩm, đồng thời tiết kiệm chi phí,

rút ngắn thời gian phân tích, chúng tôi chọn đề tài: “Xác định đồng thời axit benzoic và

axit sorbic trong các loại thực ph m đóng gói bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu nâng cao” với hai mục tiêu:

- Xây dựng được qui trình phân tích đồng thới axit benzoic và axit sorbic trong một số thực phẩm đóng gói

- Áp dụng qui trình phân tích vào thực tế kiểm tra một số thực phẩm đóng gói đang được sử dụng rộng rãi

I TỔNG QUAN

1 Chất bảo quản

Bảo quản thực phẩm là làm cho thực phẩm có thể giữ nguyên được trạng thái như

lúc tươi mới mà không bị thối hỏng trong một thời gian dài Đây là một nhu cầu tất yếu cũng như một biện pháp bắt buộc để lưu thông chuyên chở, phân phối, buôn bán cũng như dự trữ thực phẩm

Sự bảo quản thực phẩm còn nhằm lưu giữ những giá trị thành phần dinh dưỡng Thực phẩm không được bảo quản thì những thành phần dinh dưỡng trong chúng dễ dàng

bị biến tính Đáp ứng nhu cầu, chất bảo quản ra đời

Chất bảo quản là những chất có khả năng ức chế, trì hoãn cũng như là đình chỉ quá

trình lên men, hóa chua và biến chất của thực phẩm, ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật, làm chậm quá trình thối rữa Chúng có thể sử dụng như là một hóa chất duy nhất

mà cũng có thể trong tổ hợp với nhiều loại hóa chất có các tác dụng khác

 Các loại chất bảo quản thường dùng:

- Các chất chống oxy hóa: Acd ascorbic, acid citric, acid tactric, dẫn xuất tocopherol, có tác dụng làm chậm sự biến chất, ôi khét, biến màu trong quá trình bảo quản thực phẩm tươi

- Các chất kháng sinh: Steptomixin, các loại penixilin,…

- Chất sát khuẩn: acid acetic, acid sorbic, acid benzoic, natri nitrat, có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn

 Tác động bất lợi về việc sử dụng chất bảo quản:

- Gây ung thư

Theo tiến sĩ Lê Quang Hưng, Trưởng Bộ môn Cây công nghiệp Đại học Nông Lâm TPHCM, chất 2,4D nếu sử dụng liều lượng cao sẽ có công dụng diệt cỏ Sử dụng nồng độ thấp sẽ trở thành chất kích thích cực mạnh làm cho củ quả tăng kích thước nhanh bất thường Ngoài ra, còn có công dụng làm chậm quá trình lão hóa, tươi lâu cũng như giữ được màu sắc củ quả khá tốt Nó còn diệt cả côn trùng, vi khuẩn…

- Gây quái thai:

o Gây ra các biểu hiện của nhiễm độc thực phẩm, những chất này còn gây ra thiếu máu do thiếu hemoglobin, giảm hàm lượng phosphat và magie máu, tăng hàm lượng canxi huyết

o Ở hệ thống da, niêm mạc, chúng gây tăng tiết và làm tăng kích thích như tăng tiết dịch phế quản Trên phụ nữ có thai, chúng là tác nhân gây ra quái thai Do đó mà liều cho phép với chất này là dưới 50mg/l nước

- Tác hại của một số hóa chất bảo quản thực phẩm:

o Clorin là một chất bảo quản thịt hay được dùng Chất này có khả năng gây kích thích mạnh hệ hô hấp Mặc dù không có những bằng chứng rõ ràng về ung thư và quái thai nhưng đây là một chất oxi hoá mạnh và có thể gây ra các phản ứng viêm trong phổi

Ở một nồng độ cao có thể gây ra phá huỷ phổi

o Cacbon monoxit (CO) được sử dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm và rau quả tươi, thực phẩm tươi sống nhìn có màu sắc đỏ tươi và bắt mắt hơn , nồng độ cao của chất CO sẽ gây những phản ứng phụ ảnh hưởng trên hệ thần kinh, nhức đầu, chóng mặt…

o Khác với các hợp chất nitrit và nitrat, formaldehyt (thường gọi là foc-môn) là một chất cực độc và có thể gây tử vong Đây là một hợp chất vẫn dùng để ướp xác Nếu

sử dụng hoá chất này trong xử lý thực phẩm, thực phẩm có thể lưu giữ được thời gian vô cùng lâu Nhưng tác hại mà nó gây ra thì cũng vô cùng lớn.Cố tình dùng quá nhiều trong công nghệ xử lý thì nó có thể gây tử vong do ngộ độc

o Đây là một chất hoá học gây quái thai mạnh, ngay từ liều nhỏ, chưa đến 200µg/kg Về tác hại trên các mô bề mặt như da, niêm mạc, đây là một chất kích thích mạnh Hơi của chúng hoặc mùi của chúng dễ dàng làm chảy nước mắt, nước mũi, dịch phế quản Các tác hại khác có thể gặp đó là kích ứng da, viêm da, giảm tế bào lympho ngoại vi Một số báo cáo cho thấy nó có thể làm biến đổi DNA

Các chất bảo quản và hàm lượng cho phép

xử lý bột, tạo phức kim loại

Tên sản ph m: Acid Sorbic_Chất bảo quản_Chống nấm mốc.

Tên gọi khác: Chất bảo quản E200, axit sorbic

- Hòa tan trong nước, pH tối ưu cho hoạt động kháng khuẩn thấp hơn pH = 6,5

- Sorbates thường được sử dụng ở nồng độ 0,025% đến 0,10% Sorbates ảnh hưởng rất nhiều đến pH trong thực phẩm Cần phải điều chỉnh pH phù hợp để đảm bảo chất lượng thực phẩm

- Nó được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm khác, chẳng hạn như pho mát và bánh mì

Quy trình sản xuất acid sorbic: từ một polyester thu được bằng phản ứng của

crotonaldehyde với ketene và sử dụng muối kẽm acid hữu cơ như một chất xúc tác, trong

đó bao gồm quá trình hòa tan polyester trong dung môi hydrocarbon, hòa tan trong nước

từ 92°C đến 100°C Sau khi rửa lọc polyester với nước hoặc axít để loại bỏ chất kẽm và tiếp tục tiếp xúc với các dung dịch có axit mạnh, trao đổi ion, tạo acid sorbic

Công dụng và ứng dụng:

- Có tác dụng ức chế nấm men, nấm mốc, ít tác dụng đến vi khuẩn, nên được dùng để bảo quản: rau quả chua, sữa chua Các sản phẩm này được bảo quản bằng acid

sorbic vẫn đảm bảo vi khuẩn lactic phát triển và lên men được

- Không độc hại, không có mùi vị lạ, không làm mất mùi vị tự nhiên nên được sử

dụng khá phổ biến trong chế biến thực phẩm, đồ hộp, cá, thịt, bánh mì

- Việc sử dụng axit sorbic trong sản xuất đồ hộp có thể giảm được nhiệt thanh trùng

- Phối hợp axit sorbic hoặc sorbat với các chất bảo quản khác: Dùng axit sorbic với natri benzoat trong bảo quản nước quả Dùng axit sorbic cho sản phẩm ướp đường có thể giảm một nửa lượng đường để ướp

- Dùng nhiều trong chế biến rau quả, rượu vang, sản xuất đồ hộp, chế biến sữa, bảo quản và chế biến cá, thịt, sản phẩm bánh mì, bảo quản nước mắm, nước chấm, cá ngâm dấm

Liều lƣợng trong thực ph m:

- Các loại sản phẩm rau quả có Axit (kết hợp với xử lý nhiệt nhẹ) và các loại bánh: 0,05-0,1%

- Cá ngâm dấm, patê cá: a.sorbic 0,2% + K.sorbate 0,27%

- Thức ăn chế biến từ cua, tôm (không thanh trùng): a.sorbic 0,25% + K.sorbate 0,33%

- Mứt quả: phun lên bề mặt sản phẩm dd K.sorbate 7%, chống mốc được 4 tháng

- Thịt gà tươi nhúng vào dd Axit sorbic 7,5% (71℃) có thể giữ được 18 ngày

Thuộc tính và sử dụng:

Với pKa là 4,76, nó có tính axit như axit axetic

Các số E là:

- E200 Sorbic axit

- E201 Sodium sorbate

- E202 Kali sorbat

- E203 Canxi sorbat

LD50:

LD 50 giá trị của axit sorbic được ước tính từ 10-7,4 g/kg, là khá cao Hợp chất

này là tương đối không ổn định và nhanh chóng bị phân hủy trong đất, do đó nó thường được coi là thân thiện với môi trường

- Acid benzoic là một acid tương đối mạnh (pH=4,19) nên có tính kháng khuẩn cao

Quy trình sản xuất acid benzoic:

Điều chế theo con đường hoá học bằng cách: oxi hoá toluen bằng acid nitric hoặc acid cromic hoặc bằng oxi không khí (trong pha lỏng), decacboxyl hoá anhidrit phtalic trong pha khí ở 34oC với chất xúc tác ZnO

Một số loại cây chứa nhiều Acid benzoic:

Acid benzoic có nhiều trong vỏ cây anh đào, quất, mận, hồi và cây chè

Cơ chế tác dụng:

Acid benzoic tác dụng theo cơ chế trực tiếp: Khi các phân tử acid benzoic khuếch tán vào bên trong tế bào vi sinh vật nó sẽ tác động lên một số enzyme gây hạn chế sự trao

đổi chất, làm ức chế quá trình hô hấp của tế bào, ức chế quá trình oxy hóa glucose và pyruvate, đồng thời làm tăng nhu cầu oxy trong suốt quá trình oxy hóa glucose nên có tác dụng ngăn cản sự phân đôi của vi khuẩn, ức chế sự phát triển của nấm men và nấm mốc gây hư hỏng thực phẩm Khả năng chống nấm mốc của acid benzoic cao hơn nấm men và

vi khuẩn Acid benzoic còn có khả năng tác dụng lên màng tế bào để hạn chế sự hấp thu axit amin của tế bào vi sinh vật và các túi màng

Hoạt tính và sử dụng:

Hoạt tính kháng khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào pH, tác dụng bảo quản chỉ xảy ra

ở môi trường pH = 2,5 – 3,5, khi pH càng thấp hoạt tính kháng khuẩn càng cao

- pH = 2 – 2.5: cần hàm lượng acid benzoic 0,02 – 0,03%

- pH = 3.5 – 4: cần 0.08% tiêu diệt mốc, 0.1- 0.15% diệt nấm men, 0,15 – 0.2%

diệt vi khuẩn lactic

- pH trung tính: hiệu quả giảm 300 lần so với pH =3

Công dụng:

Acid benzoic để sử dụng trong thực phẩm: sữa lên men, quả ngâm giấm, hoa quả

ngâm đường,các loại sản phẩm nước trái cây, rau thanh trùng…

LD50:

- Liệu lượng cho phép tối đa là 0.1-0.12%, thường dùng 0.05-0.075% đối với

nước quả chua và 0.075-0.1% đối với nước quả ít chua

- Liều lượng gây độc ở người là 6mg/kg thể trọng Nên sử dụng liều lượng nhỏ

hơn 1g/kg thực phẩm

Lưu ý: Nhược điểm của acid benzoic là có thể gây thâm đen khi sử dụng để bảo

quản các sản phẩm có nguồn gốc từ rau quả

Bảng liều lượng sử dụng trong thực phẩm

1 Sữa lên men (nguyên kem), có xử lý nhiệt sau lên men 50

4 Rau, củ ngâm dấm, dầu, nước muối 2000

5 Rau thanh trùng pasteur đóng hộp, đóng chai hoặc đóng túi 1000

6 Necta quả thanh trùng pasteur đóng hộp hoặc đóng chai 2000

4 Phương pháp HPLC

HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

4.1 Khái niệm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này

ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng

định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

Sơ đồ máy phân tích HPLC

4.2 Phânloại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

 Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

 Sắc ký phâAn bố (partition chromatography)

 Sắc ký ion (ion chromatography)

 Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000) SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân

cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography) Trong

SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm

SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng

SKPĐ Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT

4.3 Pha t nh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

 Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography)

 Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography)

Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

 Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích

 Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này

4.4 Pha động trong sắc ký pha đảo

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

 Hòa tan mẫu phân tích

 Phù hợp với đầu dò

 Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh

 Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao

 Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade)

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết chúng ta

có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải

Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ