SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN CÁC BỆNH NHÂN UNG THƢ TẠI VIỆT NAM

Việc xác định đột biến gen RB1 gây bệnh trên bệnh nhân UNBVM và gia đình là cơ sở để thực hiện điều trị cho bệnh nhân hiệu quả và tư vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân.. Một số bệnh n

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Họ và tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Thanh Hoa

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN:

SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN CÁC

BỆNH NHÂN UNG THƢ TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội- 2019

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Họ và tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Thanh Hoa

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN

SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN CÁC

BỆNH NHÂN UNG THƯ TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS.Nguyễn Hải Hà

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Sàng lọc đột biến gen RB1 thể

di truyền trên các bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam” là công trình nghiên cứu của

cá nhân tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong các công trình khác Nếu không đúng nhƣ đã nêu trên, tôi xin hoàn

toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình

Hà Nội, tháng năm 2019

Học viên Nguyễn Thị Thanh Hoa

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Hải Hà – Phó Trưởng Phòng phân tích hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen, người thầy - người chị không chỉ hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình làm việc và hoàn thành luận văn mà còn trong cuộc sống hàng ngày Thái độ làm việc chuyên nghiệp của chị đã truyền cảm hứng cho tôi và giúp tôi cải thiện bản thân mình rất nhiều sau thời gian thực tập này

Tôi cũng xin gửi lòng cảm ơn đặc biệt đến TS.Nguyễn Đăng Tôn –Trưởng Phòng phân tích hệ gen, Ths.Nguyễn Phương Nhung, Ths.Ma Thị Huyền Thương và Ths Trần Thị Bích Ngọc đã luôn theo sát giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn Qua đây tôi cũng xin cảm ơn tất cả các

cô, các anh, chị trong Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tôi thực tập tại đây Để có được những hiểu biết về kiến thức chuyên ngành, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo ở khoa Công nghệ sinh học - Học viện Khoa học và Công nghệ đã truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm học qua

Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, những người thân trong gia đình

và bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và động viên tinh thần tôi trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ của mình

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng năm 2019

Học viên Nguyễn Thị Thanh Hoa

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

UNBVM U nguyên bào võng mạc

RB1 Retinoblastoma 1

DNA Deoxyribonucleic acid

RNA Ribonucleic acid

cDNA Complement deoxyribonucleic acid

mRNA Messenger ribonucleic acid -RNA thông tin

dNTPS Deoxyribonucleotide Triphosphate

PCR Polymerase chain reaction

MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification

TAE Tris-axit axetic-EDTA

qPCR Quantitative polymerase chain reaction

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

DMSO Dimethyl sulfoxide

Danh mục các bảng biểu và hình ảnh BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại Reese Ellsworth cho phân loại u nguyên bào võng

mạc 8

Bảng 1.2 Hệ thống phân loại quốc tế cho u nguyên bào võng mạc nội nhãn …….10

Bảng 1.3 Đánh giá nguy cơ mang đột biến RB1 của các thành viên trong gia đình có trẻ bị UNBVM 14

Bảng 2.1 Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR……….……26

Bảng 3.1 Đặc điểm lâm sàng của các đối tượng nghiên cứu 36

Bảng 3.2 Nồng độ DNA tổng số của các mẫu bệnh nhi UNBVM 40

Bảng 3.3 Đột biến RB1 được xác định ở bệnh nhân UNBVM bằng phương pháp giải trình tự Sanger ………44

Bảng 3.4 Mối liên hệ giữa giá trị DQ và số bản sao .47

Bảng 3.5 Các đột biến mất đoạn lớn trên gen RB1 được xác định bằng phương pháp MLPA……… 49

HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình ảnh siêu âm của UNBVM 7

Hình 1.2 Hình ảnh cắt lớp vi tính của UNBVM 7

Hình 1.3 Soi đáy mắt trước điều trị hóa chất giảm tế bào 12

Hình 1.4 Soi đáy mắt trước điều trị hóa chất giảm tế bào 12

Hình 1.5 Giải th ch về mặt di truyền đột biến mất chức năng gen RB1 16

Hình 1.6 Tái tổ hợp trong nguyên phân 17

Hình 1.7 Hoạt động bất thường của DNA polymerase trong sao ch p DNA 18

Hình 1.9 Vị trí gen RB1 trên nhiễm sắc thể số 13 19

Hình 1.10 Cấu trúc gen và protein RB1 20Hình 3.1 Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết t mẫu máu bệnh nhân và gia đình 39Hình 3.2 Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR t mẫu UNBVM 42

Hình 3.3 Sơ đồ biểu diễn các đột biến trên gen RB1 đƣợc phát hiện ở 23 bệnh

nhân 44Hình 3.4 Kết quả dạng biểu đồ sóng (electrophotogram) sau khi phân tích MLPA…49Hình 4.1 Hình ảnh minh họa trình tự các đột biến mới đƣợc phát hiện ở bệnh

nhân UNBVM 52Hình 4.2 Sơ đồ phả hệ của các gia đình mắc UNBVM 53

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC 4

1.1.1 Tình hình u nguyên bào võng mạc trên thế giới và ở Việt Nam 4

1.1.2 Biểu hiện lâm sàng của UNBVM 6

1.1.3 Chẩn đoán UNBVM 6

1.1.4 Phân loại UNBVM 8

1.1.5 Điều trị UNBVM 10

1.1.6 Tư vấn di truyền cho bệnh nhân u nguyên bào võng mạc 13

1.1.7 Cơ chế gây bệnh u nguyên bào võng mạc 15

1.1.7.1 t p tron n u n p n 17

1.1.7.2 Hoạt độn t t n N po m r s tron t n p N 17

1.1.7.3 p n t t n n m s t 18

1.2 GIỚI THIỆU VỀ GEN RB1 19

1.3 CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT SỬ DỤNG NHẰM XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN RB1 TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 21

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LİỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU 23

2.1 VẬT LİỆU NGHİÊN CỨU 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.3 Hóa chất 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU 24

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 25

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA genomic 25

2.2.3 Phương pháp khuếch đại gen (PCR) 26

2.2.4 Phương pháp giải trình tự gen 30

2.2.5 Phương pháp Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) 31

2.2.6 Phương pháp phân t ch kết quả 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 KẾT QUẢ 36

3.1.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 36

3.1.2 Tách chiết DNA tổng số 39

3.1.3 PCR khuếch đại các đoạn gen RB1 41

3.1.4 Phát hiện đột biến bằng giải trình tự gen RB1 43

3.1.5 Phát hiện thay đổi cấu trúc gen bằng MLPA 46

3.2 THẢO LUẬN 50

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

4.1 KẾT LUẬN 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

MỞ ĐẦU

U nguyên bào võng mạc (retinoblastoma, UNBVM) là bệnh u ác tính

mắt thường gặp ở trẻ em dưới 5 tuổi, gây ra bởi đột biến trên gen RB1

(retinoblastoma 1) UNBVM xuất hiện với tỷ lệ khoảng 1/15000 đến 1/20000 trẻ tương ứng với khoảng 9000 trường hợp mới mỗi năm, bệnh xảy ra ở cả hai giới tính nam và nữ, không phụ thuộc vào nguồn gốc chủng tộc [5-8] Trên thế giới, ước tính có khoảng 3001 đến 3376 trẻ em chết do UNBVM hàng năm Tỷ lệ tử vong ở châu Á (39%) cao hơn nhiều so với châu Âu, Canada và Mỹ (3–5%) do khoảng cách về tiếp cận y tế [9] Hầu hết các trường hợp UNBVM đều liên quan

đến sự mất chức năng của cả hai alen của gen áp chế khối u RB1 nằm trên nhiễm

sắc thể số 13 [7] Khoảng 40% trẻ UNBVM là thể di truyền trong khi 60%

trường hợp còn lại là thể không di truyền [10] RB1 là gen áp chế khối u đầu tiên

được tìm thấy, nằm tại vị tr 13q14.2, có k ch thước DNA là 183 kb Cho đến

nay, hơn 1750 đột biến gen RB1 khác nhau phát hiện được ở bệnh nhân UNBVM

và đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu đột biến gen RB1 (RB1 Gene Mutation Database) [11], và các đột biến gen RB1 gây bệnh UNBVM không

đồng nhất và xuất hiện rải rác trên vùng promoter và 27 exon Việc xác định đột

biến gen RB1 gây bệnh trên bệnh nhân UNBVM và gia đình là cơ sở để thực

hiện điều trị cho bệnh nhân hiệu quả và tư vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân

Việc chẩn đoán sớm và phương pháp điều trị th ch hợp có vai trò quan trọng trong việc tiên lượng và khả năng sống sót của bệnh nhân UNBVM [12] Ở các nước phát triển, mục tiêu của điều trị là bảo tồn thị lực và việc kiểm tra gen

RB1 đã được áp dụng như là một kiểm tra định kì ở nhóm bệnh nhân UNBVM

[13-16] Ở Việt Nam, phần lớn bệnh nhân nhập viện ở giai đoạn muộn nên bị lỡ

cơ hội điều trị bảo tồn mắt Mặc dù rất nhiều kinh ph đã được đầu tư cho việc

phát triển các kỹ thuật điều trị lâm sàng nhưng phát triển các kĩ thuật sinh học phân tử phục vụ chẩn đoán sớm của bệnh UNBVM gần đây mới thực sự phát triển Một số bệnh nhân được sinh ra trong gia đình có tiền sử bệnh UNBVM đã cho thấy vai trò của yếu tố di truyền với khả năng sinh bệnh, do đó việc phát

hiện sớm đột biến trên gen RB1 đóng vai trò quan trọng trong quản lý lâm sàng

cũng như dự đoán nguy cơ mắc bệnh của các thành viên trong gia đình người bệnh Cho đến nay, việc điều trị cho bệnh nhân UNBVM ở giai đoạn sớm đã được thực hiện khá hiệu quả ở Việt Nam, tuy nhiên hiểu biết về cơ chế phân tử

và nguyên nhân di truyền đối với bệnh này còn rất hạn chế Các công tác tư vấn

di truyền hầu như chưa được thực hiện nhằm đem lại sự hiểu biết cần thiết cho gia đình bệnh nhân, đặc biệt trong các gia đình đã có người mắc bệnh như cha/mẹ hay anh/chị em ruột

Do nhu cầu thực tiễn của bệnh nhân UNBVM, luận văn: “Sàng lọc đột

biến gen RB1 thể di truyền trên các bệnh nhân ung thư tại Việt Nam” được tiến hành với muc tiêu: Sàng lọc đột biến gen RB1 thể di truyền gây bệnh ở trẻ em

mắc u nguyên bào võng mạc Nội dung nghiên cứu như sau:

 Thu thập mẫu máu của những bệnh nhi UNBVM ở Bệnh viện Mắt Trung ương, và người thân trong gia đình như mẫu bố/mẹ, anh chị em ruột (nếu có)

 Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân các đoạn gen RB1, giải trình tự chuỗi DNA tại

vùng điều khiển, vùng nối exon-intron và toàn bộ vùng mang mã của gen

RB1

 Sử dụng kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification)

nhằm phát hiện các đột biến thêm/mất đoạn lớn trên gen RB1

 Phân t ch kết quả nhằm phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân UNBVM tại Việt Nam

 nghĩa của đề tài: Nghiên cứu này bước đầu tao ra cơ sở dữ liệu đột biến gen của bênh nhân UNBVM ở Việt Nam Kết quả thu được có thể làm sáng

tỏ nguyên nhân gây bệnh ở mức độ phân tử và làm cơ sở cho công tác chẩn đoán, chữa trị và tư vấn di truyền cho các bệnh nhân và gia đình người bệnh UNBVM

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC

1.1.1 Tình hình u nguyên bào võng mạc trên thế giới và ở Việt Nam

U nguyên bào võng mạc là bệnh ác tính nội nhãn phổ biến ở trẻ em phát sinh t các tế bào võng mạc nguyên thủy, bệnh thường gặp ở trẻ em dưới 5 tuổi,

gây ra bởi đột biến trên gen RB1 (retinoblastoma 1) Có khoảng 9000 trường hợp

UNBVM mới được phát hiện mỗi năm, tỷ lệ xuất hiện khoảng 1/15000 đến 1/20000 trẻ tương ứng với, bệnh xảy ra ở cả hai giới tính nam và nữ, không phụ thuộc vào nguồn gốc chủng tộc [5-7] Trên thế giới, ước tính có khoảng 3001 đến 3376 trẻ em chết do UNBVM hàng năm Mỗi năm có 175.000 ca UNBVM mắc mới được phát hiện ở các nước đang phát triển, với tỷ lệ tử vong cao dưới 15% Tỷ lệ tử vong ở châu Á (39%) cao hơn nhiều so với châu Âu, cao thứ hai thế giới (sau châu Phi 70%), Canada và Mỹ (3–5%) do khoảng cách về tiếp cận y

tế [9] Trong 100 năm qua, có sự tiến bộ đáng kể trong việc chẩn đoán và quản lý UNBVM theo nguyên tắc ưu tiên: Sống sót, Toàn cầu & Thị lực (Life, Globe & Vision) [9, 17]

Ở Việt Nam, chưa có số liệu đầy đủ về tỷ lệ mắc UNBVM hàng năm Tại Bệnh viện Mắt trung ương, số bệnh nhân mắc u nguyên bào võng mạc hàng năm tăng t 29 người (2004) lên 68 người (2016), chủ yếu tập trung ở trẻ em lứa tuổi

t 2-3 tuổi (theo hội thảo quốc tế chuyên đề về UNBVM ở Bệnh viện Mắt Trung ương năm 2017) Tuy số lượng không nhiều so với các bệnh lý khác nhưng đây

là căn bệnh hiểm nghèo, nếu không được điều trị đúng, xử lý sớm sẽ ảnh hưởng tới thị lực thậm tr t nh mạng người bệnh Phần lớn bệnh nhân nhập viện ở giai đoạn muộn nên bị lỡ cơ hội điều trị bảo tồn mắt Một số bệnh nhân được sinh ra trong gia đình có tiền sử bệnh UNBVM đã cho thấy vai trò của yếu tố di truyền

với khả năng sinh bệnh Hiện nay, ở Việt Nam, chẩn đoán phân tử bệnh UNBVM đã bắt đầu phát triển và đã đạt được một số thành tựu Năm 2005, Nguyễn Công Kiệt và Nguyễn Tr Dũng đã sử dụng kỹ thuật di truyền tế bào nghiên cứu 30 ca võng mạc ở Việt Nam và xác định được một bệnh nhân bị đột biến mất đoạn ở vị tr nhiễm sắc thể 13q14 [1] T năm 2013 nhóm nghiên cứu của chúng tôi, đứng đầu là tiến sỹ Nguyễn Hải Hà, đã bắt đầu xây dựng quy trình sàng lọc biến đổi di truyền cho bệnh nhân UNBVM Việt Nam sử dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp Năm 2014, nhóm đã công bố hai đột biến gen thể di phát

hiện được t mẫu máu của bệnh nhân UNBVM [2] Năm 2016, nhóm đã xây dựng

thành công phương pháp sàng lọc đột biến gen RB1 thông qua phân t ch bản

phiên mã của gen này [3] Kết hợp hai phương pháp x t nghiệm trên DNA và

cDNA trong sàng lọc đột biến gen RB1 ở một gia đình có hai con mắc bệnh ung

thư võng mạc đã phát hiện được người cha và hai con đều mang đột biến gây ảnh

hưởng tới sự tổ hợp lại mRNA của RB1 Năm 2017, chúng tôi đã sử dụng

phương pháp MLPA nhằm phát hiện những đột biến mất đoạn/lặp đoạn lớn trên

gen RB1 ở những bệnh nhân UNBVM [4] Kết quả nghiên cứu cho thấy phương

pháp này hoàn toàn đáng tin cậy để áp dụng nhằm tăng độ nhạy trong chẩn đoán

di truyền của bệnh UNBVM Năm 2018, nhóm nghiên cứu đã công bố một số

kết quả bước đầu của nghiên cứu đặc điểm di truyền của gen RB1 của 34 bệnh

nhân UNBVM trên tạp ch Molecular Vision (Mỹ), [18] Cũng trên tạp ch này gần đây nhất, nhóm nghiên cứu ph a Nam của giáo sư Nguyễn Công Kiệt đã công bố kết quả kiểm tra di truyền trên mẫu máu và mẫu u của 50 bệnh nhân UNBVM điều trị tại Bệnh viện mắt thành phố Hồ Ch Minh Với nghiên cứu

này, các tác giả đã xác định dược phổ đột biến gen RB1 bao gồm cả đột biến sinh

dưỡng và đột biến dòng mầm trên nhóm bệnh nhân này [19]

1.1.2 Biểu hiện lâm sàng của UNBVM

Biểu hiện UNBVM rất đa dạng bao gồm đồng tử có màu trắng, lác mắt, giảm thị lực và rung giật nhãn cầu, ngoài ra ở giai đoạn muộn có thể thấy các triệu chứng khác như: mắt đỏ, đau nhức do tăng nhãn áp thứ phát, nhìn mờ, lồi mắt, viêm tổ chức quanh hốc mắt, đồng tử giãn, mủ tiền phòng, mống mắt dị sắc, trẻ chậm phát triển [20] Đồng tử trắng là dấu hiệu phổ biến nhất ở trẻ bị UNBVM chiếm 60%, khi nhìn vào mắt bé, cha mẹ thấy có ánh trắng (nhất là vào ban đêm hoặc trong phòng tối vì khi đó đồng tử giãn), cũng có thể thấy 1 hoặc 2 đồng tử màu trắng hay vàng khi chụp ảnh buổi tối có dùng đèn flash Dấu hiệu nhận biết chính thứ hai là trẻ bị lác/lé, chiếm 20% Đặc biệt, nếu bé bị lác trong vòng 6 tháng tuổi thì nên nghi ngờ có UNBVM [21]

1.1.3 Chẩn đoán UNBVM

Chẩn đoán UNBVM có thể tiến hành theo các phương pháp sau:

* Chẩn đoán lâm sàng: Soi đáy mắt là khám nghiệm quan trọng để chẩn đoán bệnh Tổn thương ở võng mạc có biểu hiện khác nhau tùy theo hướng phát triển của u Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh giúp xác định chẩn đoán Khám siêu âm và chụp cắt lớp có thể thấy rõ k ch thước và vị tr khối u hoặc thấy hình ảnh canxi hóa trong khối u-dấu hiệu đặc trưng của UNBVM Ngoài ra còn có thể xác định sự phát triển của khối u ra ngoài nhãn cầu hay vào nội sọ Chụp MRI cho ph p khảo sát hình ảnh nhãn cầu, hốc mắt và não [22] Quét xương toàn thân bằng Technetium-99m và chụp cắt lớp phát xạ positron Fluorine-18 pos ourodeoxyglucose (PET CT) cũng rất hữu ch để phát hiện sớm

di căn [23] Hầu hết trẻ em bị UNBVM không cần phải tiến hành chụp xương Phương pháp này thường chỉ sử dụng khi UNBVM bị nghi ngờ rằng có thể đã lan rộng ra khỏi mắt [11]

Hình 1.1 Hình ảnh siêu âm của

UNBVM

Hình 1.2Hình ảnh chụp cắt lớp vi

t nh của UNBVM

N uồn: vong-mac-1236.html

https://bacsinoitru.vn/content/chan-doan-va-dieu-tri-u-nguyen-bao-* Kiểm tra mô bệnh học và phân t ch nhiễm sắc thể Chẩn đoán UNBVM

có thể được xác định bằng kiểm tra mô bệnh học Kiểm tra cẩn thận các dây thần kinh thị giác là cần thiết để xác định khả năng xâm nhập của các tế bào khối u Phân t ch di truyền học tế bào lympho máu ngoại vi được sử dụng để phát hiện mất đoạn hay sự sắp xếp lại liên quan đến 13q14.1-14q2, tìm thấy trên khoảng 5% các trường hợp bị UNBVM một bên mắt và khoảng 7.5% các trường hợp bị

cả hai bên mắt [20]

* Kiểm tra di truyền phân tử:

Phát hiện sớm trẻ em có nguy cơ phát triển UNBVM là rất quan trọng để

bảo tồn cuộc sống và thị lực X t nghiệm di truyền đã trở thành một phần quan

trọng trong việc chăm sóc cho những bệnh nhân bị UNBVM Gen RB1 là gen ức chế khối u đầu tiên được xác định, phần lớn các đột biến RB1 là riêng cho t ng gia đình, và được phân bố trên khắp gen RB1 bao gồm vùng promoter, vùng mã

hóa exon, và khu vực nối của intron [24] Việc chẩn đoán UNBVM thể di truyền được tiến hành ở các bệnh nhân mang bệnh hoặc có tiền sử gia đình, trong đó

một biến thể gây bệnh dòng mầm dạng dị hợp tử trên gen RB1 trong x t nghiệm

di truyền phân tử là cần thiết để xác định xem UNBVM có phải là dạng di truyền hay không và cho ph p chẩn đoán, sàng lọc sớm nguy cơ cho các thành viên trong gia đình [20]

1.1.4 Phân loại UNBVM

Chẩn đoán UNBVM được tiến hành trên cơ sở các phát hiện lâm sàng và

x t nghiệm hình ảnh Xác định giai đoạn khối u tại thời điểm chẩn đoán là rất quan trọng để quản lý th ch hợp, do đó kiến thức về hệ thống phân loại u nguyên bào võng mạc là rất quan trọng Phân loại Reese Ellsworth (Bảng 1.1) được phát triển vào những năm 1960 bởi Tiến sĩ Algernon Reese và Tiến sĩ Robert Ellsworth là hệ thống phân loại được sử dụng rộng rãi nhất đối với các khối u nội nhãn và dựa trên vị tr , số khối u và k ch thước của khối u [25]

Bảng 1.1: Hệ thống phân loại Reese Ellsworth cho phân loại u nguyên bào võng

IV Không thuận lợi trong bảo

b, Gieo mầm vào pha lê thể

Hệ thống phân loại Reese Ellsworth về cơ bản được thiết kế để dự đoán kết quả điều trị bằng xạ trị chùm tia ngoài (EBRT), được sử dụng phổ biến như

là phương pháp điều trị bảo tồn mắt ch nh cho đến khi điều trị bằng hóa trị liệu được sử dụng vào những năm 1990 Một số nhược điểm của hệ thống phân loại này như sau: các khối u ngoại biên, nhiều khối u và khối u lớn được cho là nguy hiểm hơn trong giai đoạn điều trị bằng xạ trị chùm tia ngoài và có tiên lượng xấu hơn ở mắt Hệ thống phân loại Reese Ellsworth không giải quyết được vấn đề gieo hạt dưới võng mạc và không phân biệt giữa gieo hạt vào thủy tinh khu trú

và khuếch tán [26] Do đó, cần phải đề xuất một hệ thống phân loại mới có thể

dự đoán kết quả điều trị bằng hóa trị liệu ch nh xác hơn Nhiều trung tâm đã tham gia và thống nhất một hệ thống phân loại duy nhất được thiết kế bởi Murphree và các cộng sự (Bảng 1.2) [27]

Bảng 1.2: Hệ thống phân loại quốc tế cho u nguyên bào võng mạc nội nhãn [27]

B

Nguy cơ thấp

Các khối u võng mạc có bất kỳ k ch thước hoặc vị tr nào không thuộc nhóm A Không gieo hạt vào thủy tinh thể Một lượng nhỏ dịch k o dài không quá 5 mm t nh t khối u được cho ph p

1.1.5 Điều trị UNBVM

Mục tiêu đầu tiên của điều trị là đảm bảo t nh mạng của người bệnh và sau đó là thị lực Bên cạnh việc phân loại mắt và giai đoạn khối u thì cần lựa chọn phương pháp điều trị dựa trên nhiều yếu tố bao gồm: số lượng các ổ khối u (bị một bên và chỉ có một khối u; bị một bên và có nhiều khối u; bị cả hai bên mắt), vị tr và k ch thước khối u trong mắt, có gieo mầm vào pha lê thể và dưới võng mạc hay không, khả năng bảo tồn thị lực và tuổi bệnh nhân Các phương pháp được sử dụng trong điều trị UNBVM bao gồm:

* Phẫu thuật khoét bỏ nhãn cầu: Thường chỉ định khi khối u lớn (hơn 60%

thể t ch nhãn cầu) không còn thị lực, mù, mắt đau hoặc khối u xâm lấn vào thần

kinh thị Người ta hay kho t bỏ nhãn cầu hơn cho những mắt đã thất bại với các phương pháp điều trị bảo tồn trước đó Ngoài ra, kho t bỏ nhãn cầu được chỉ định cho trường hợp tăng nhãn áp thứ phát, gieo mầm vào thủy tinh, hoặc xâm lấn ra tiền phòng

* Lạn đôn : Chỉ định cho khối u nhỏ cho những u nhỏ (< 6 mm đường

k nh và < 3 mm độ dày) và ở ph a trước Trong quá trình lạnh đông, một chất rất lạnh như nitơ lỏng, được đặt trong hoặc gần các tế bào ung thư.Một khi các tế bào đóng băng, chất lạnh được loại bỏ và các tế bào tan băng Quá trình đóng băng và tan băng này, lặp đi lặp lại một vài lần trong mỗi đợt trị liệu, khiến các

tế bào ung thư bị chết Biến chứng của phương pháp này gồm bong võng mạc tơ huyết thoáng qua, che khuất mạch máu võng mạc, kéo dãn võng mạc và xơ hóa tiền võng mạc

* Liệu pháp laser: Hồ quang xenon hoặc laser (argon và krypton): chỉ định

cho u nhỏ và ở ph a sau Quang đông (photocoagnlation) là dùng sức nóng của

laser Argon để phá hủy mạch máu nuôi dưỡng tế bào khối u

* Tia xạ: Tia xạ với nguồn tia t ngoài vào (External beam radiotherapy viết

tắt EBRT) là phương pháp điều trị bảo tồn nhãn cầu đầu tiên trong UNBVM Tia

xạ có thể chỉ định với những khối u lớn hai bên, gieo mầm vào thủy tinh, các khối u gần dây thần kinh thị trong mắt có khả năng còn thị lực hoặc nhiều khối u

mà các khối u lại quá lớn không thể điều trị bằng phương pháp lạnh hoặc quang đông

* Điều trị bằng các tấm có hoạt t nh phóng xạ: Liệu pháp tia phóng xạ để gần (I – 125) là dùng các tấm mỏng có hoạt t nh phóng xạ áp vào thành mắt ở góc của khối u, có thể áp dụng như là phương pháp điều trị ban đầu hoặc hỗ trợ cho phẫu

thuật Tuy nhiên, không phải là tất cả các bệnh nhân đều được điều trị bằng phương

pháp này [22] [28]

* Liệu pháp hóa học: UNBVM là một bệnh ác t nh nhạy cảm với hóa chất

Hóa chất có hoạt t nh nhất như carboplatin, vincristin, có hoặc không có

etoposide

Hó t ảm tế ào: Do hầu hết bệnh nhân có khối u lớn tại thời điểm

chẩn đoán nên người ta sử dụng hóa chất giảm tế bào để giảm k ch thước khối u, giúp tăng hiệu quả của các phương pháp điều trị tại chỗ Hóa chất giảm tế bào trở thành một phần quan trọng trong điều trị ban đầu UNBVM và làm tăng khả năng bảo tồn nhãn cầu Hóa chất giảm tế bào còn nhằm chống lại sự phát triển của UNBVM ba bên [29]

Hình 1.3: Soi đáy mắt trước điều trị

hóa chất giảm tế bào

Hình 1.4: Soi đáy mắt sau điều trị hóa

chất giảm tế bào Nguồn: http://bacsinoitru.vn/content/chan-doan-va-dieu-tri-u-nguyen-bao-vong-mac-1.Trước đây, việc loại bỏ nhãn cầu đã được sử dụng để điều trị cho những bệnh nhân mắc UNBVM nặng Hiện nay có bằng chứng cho thấy cách tiếp cận phối hợp nhiều phương pháp bao gồm hóa trị thu nhỏ khối u, phẫu thuật loại bỏ nhân, EBRT và hóa trị ngăn ng a có hiệu quả trong các trường hợp khối u lan ra

ổ mắt và thần kinh thị giác, do đó không cần phải kho t bỏ nhãn cầu và khả năng sống sót tốt hơn [30] Cách tiếp cận này bao gồm 3-6 chu kỳ hóa trị liệu hệ thống liều cao, gây ra sự thu nhỏ khối u và làm cho mắt có thể điều chỉnh được Kiểm soát khối u hiệu quả hơn và an toàn hơn đã được quan sát với phương pháp VEC khi so sánh một phác đồ 5 thuốc bao gồm carboplatin và etoposide, xen kẽ với cyclophosphamide, idarubicin và vincristine Hóa trị liệu liều cao được tiếp tục trong 12 chu kỳ và theo dõi chặt chẽ với mục đ ch loại bỏ hoàn toàn khối u bằng cách soi đáy mắt và ngăn ng a di căn [31] Chawla và cộng sự phân t ch một nhóm nhỏ trẻ em mắc UNBVM đã phát hiện ra rằng 39,2% trẻ em còn sống không bị tái phát/di căn, 9% trẻ bị di căn và 51,8% trẻ tử vong Di căn đến hệ thần kinh trung ương được ghi nhận ở 15,7% trẻ và mang tiên lượng xấu Các khối u ác t nh thứ phát đáng quan tâm trong đó có u xương là phổ biến nhất [32]

1.1.6 Tư vấn di truyền cho bệnh nhân u nguyên bào võng mạc

Nguy cơ mắc UNBVM có thể được xác định t mối quan hệ của trẻ sơ sinh với thành viên trong gia đình đã được chẩn đoán bị bệnh (Bảng 1.3) [33] Trong trường hợp chưa thực hiện hoặc không thể thực hiện được xét nghiệm di truyền, nguy cơ mắc bệnh ước tính có thể xác định được bằng cường độ kiểm tra Tuy nhiên, nguy cơ mắc bệnh của một đứa trẻ có thể được xác định chính xác hơn bằng phân tích di truyền của gia đình, thường bắt đầu với việc thực hiện xét

nghiệm di truyền toàn bộ gen RB1 của một thành viên trong gia đình bị UNBVM

để xác định khả năng di truyền; nếu di truyền, đột biến gây bệnh sẽ được kiểm tra một cách kĩ lưỡng ở những người có nguy cơ cao

Bảng 1.3: Đánh giá nguy cơ mang đột biến RB1 của các thành viên trong gia

Xét nghiệm phân tử xác định đột biến RB1 giúp làm rõ nguy cơ mắc

UNBVM của các thành viên trong gia đình, do đó có thể giảm cường độ kiểm tra mắt chuyên khoa ở một số trẻ em, cho phép trẻ trải qua tầm soát t hơn X t nghiệm và tư vấn di truyền cho UNBVM là một vấn đề phức tạp và cần sự phối hợp chặt chẽ giữa bác sĩ với các chuyên gia di truyền (cố vấn di truyền hoặc các nhà di truyền y học) có kinh nghiệm Ví dụ, mặc dù bố mẹ của một đứa trẻ bị

UNBVM cả hai bên mắt có thể xét nghiệm âm tính với đột biến RB1, nhưng vẫn

có 5% nguy cơ sinh ra những đứa trẻ tiếp theo bị bệnh vì khả năng có thể bố mẹ

bị đột biến RB1 dạng khảm dòng mầm Việc sàng lọc trước sinh là rất quan trọng

đối với những gia đình có tiền sử mắc UNBVM Nếu có tiền sử gia đình mắc

UNBVM mang đột biến gen RB1 thì trẻ sinh ra cũng có nguy cơ cao mang khối

u võng mạc Khi cha mẹ có mong muốn kiểm tra trong thai kỳ để phát hiện đột

biến gen RB1 của bào thai, các kĩ thuật sinh thiết gai nhau (t tuần thai 11-14) và

chọc ối (t tuần thai 16 trở đi) sẽ được thực hiện Sau khi sinh, việc kiểm tra khối

u mắt (thực hiện khi gây mê trẻ) càng sớm càng tốt sẽ đảm bảo kiểm soát sự xâm lấn của khối u nếu có Trong trường hợp thai nhi được xác định là mang đột biến

gen RB1 thì sẽ được chỉ định sinh sớm hơn thời gian dự kiến (t tuần 36-38 của

thai kỳ), t đó có thể phát hiện và kiểm soát tốt hơn sự tiến triển của khối u kể t khi khối u vẫn còn nhỏ, đồng thời giúp bảo tồn thị lực của trẻ [33, 34]

1.1.7 Cơ chế gây bệnh u nguyên bào võng mạc

Dựa vào những biểu hiện lâm sàng của UNBVM, người ta đưa ra các giả thuyết về cơ chế phân tử của bệnh: chịu trách nhiệm cho sự hình thành khối u là

gen RB1, protein RB (pRB) tác động vào chu kỳ tế bào Khi gắn với yếu tố phiên

mã E2F, pRB ức chế sự sinh sản tế bào Khi không có pRB, các phôi bào sinh sản bất tận dẫn đến bệnh ung thư Hoạt động tương tác giữa pRB và E2F được điều hòa bởi các yếu tố như cyclin D1, cdk4 và p16 [35] Một alen hoạt động của

gen RB1 cũng có khả năng ngăn chặn sinh ung thư, do đó, sự chuyển dạng ác tính của các tế bào võng mạc xảy ra khi cả 2 alen của gen RB1 bị đột biến mất

chức năng Phát hiện này củng cố giả thuyết “two hit” của Knudson, cho rằng UNBVM hình thành cần có hai cú hích gây tổn thương di truyền: lần 1 (đột biến

dòng mầm tế bào sinh dục) đột biến xảy ra trên các exon của gen RB1, lần 2 (đột

biến thể soma) làm sai lệch sinh sản tế bào dẫn đến sự hình thành khối u [36]

[37] Cơ chế bệnh sinh này được giải thích tốt nhất bằng việc khảo sát sự di truyền của UNBVM

Với bệnh nhân mà gia đình không có tiền sử bệnh: ngay tại hợp tử không

mang gen RB1 đột biến, tế bào cần trải qua hai sự kiện đột biến tế bào soma trên

bệnh, ngay tại giai đoạn hợp tử bệnh nhân đã mang một gen RB1 đột biến, chỉ

cần trải qua một sự kiện đột biến trên tế bào soma là có khả năng gây nên kiểu hình ung thư Bất kể các đột biến ban đầu là do di truyền hay do phát sinh trên tế bào soma, các tế bào võng mạc chỉ trở thành ác tính khi bị mất bản sao bình

thường còn lại của RB1 Mất alen RB1 chức năng thứ hai có thể là do một đột

biến soma riêng biệt (~30% các khối u), sự methyl hóa quá mức (tỷ lệ nhỏ các khối u), hoặc mất trạng thái dị hợp tử (~70% các khối u) Mất trạng thái dị hợp xảy ra do tái tổ hợp trong nguyên phân bào, phân ly bất thường của nhiễm sắc thể, hoặc mất đoạn lớn [39]

Hình 1.5: Giải th ch về mặt di truyền đột biến mất chức năng gen RB1[40]

T đó, người ta đưa ra một số giả thuyết gây nên hiện tượng đột biến

trên gen Rb1 gồm: Tái tổ hợp trong nguyên phân, hoạt động bất thường của

DNA polymerase trong tổng hợp DNA và sự phân chia bất thường của nhiễm sắc thể [40]

1.1.7.1 t p tron n u n p n

Hai nhiễm sắc thể tương đồng mang 2 alen dị hợp, tại giai đoạn pha S,

bộ gen nhân đôi, đồng thời nhiễm sắc thể mang gen đột biến mất chức năng Rb cũng được nhân đôi; tại pha G2 và M xảy ra hiện tượng tái tổ hợp trong nguyên phân một phần của hai nhiễm sắc thể tương đồng Khi các nhiễm sắc thể sắp xếp trên mặt phẳng x ch đạo của thoi vô sắc, quá trình phân chia nhiễm sắc thể một cách ngẫu nhiên diễn ra và có thể tạo thành dạng tế bào mang đồng thời

hai đoạn gen chứa hai alen đột biến của gen RB1 [40]

Hình 1.6: Tái tổ hợp trong nguyên phân [40]

1.1.7.2 Hoạt độn t t n N po m r s tron t n p

DNA

Trong quá trình này, enzyme tham gia quá trình tự sao là DNA polymerase nhảy khỏi mạch khuôn ban đầu của nó, chuyển sang mạch khuôn của gen tương đồng và tổng hợp một đoạn Khi tổng hợp xong, DNA polymerase lại nhảy trở lại mạch khuôn ban đầu và tiếp tục tổng hợp kéo dài mạch bổ sung của

nó Kết quả là sau khi được sao ch p, mạch mới sẽ mang một phần vật liệu di

truyền của cặp tương đồng Nếu gen ức chế khối u bị đột biến mất chức năng nằm trên đoạn gen này, bộ nhiễm sắc thể sau sao ch p sẽ mang ba alen đột biến

và trong quá trình phân ly nhiễm sắc thể về hai cực của tế bào, có khả năng hình thành tế bào mang 2 alen đột biến mất chức năng và sinh ung thư [40]

Hình 1.7: Hoạt động bất thường của DNA polymerase trong sao ch p DNA [40]

1.1.7.3 p n t t n n m s t

Trong quá trình này, nhiễm sắc thể của cặp tương đồng vẫn nhân đôi bình thường để chuẩn bị cho quá trình nguyên phân phân chia nhiễm sắc thể về hai tế bào con Tuy nhiên, quá trình phân chia này diễn ra không chính xác, một

tế bào con giữ ba nhiễm sắc thể (triploid – tam bội) của cặp tương đồng, còn một

tế bào con chỉ chứa một nhiễm sắc thể Tế bào chứa ba nhiễm sắc thể tương đồng

sẽ có xu hướng loại bỏ bớt một nhiễm sắc thể không cần thiết và nếu nhiễm sắc thể đó mang gen có chức năng, hai nhiễm sắc thể được giữ lại đều mang hai alen đột biến, hiện tượng mất trạng thái dị hợp đã diễn ra, có thể dẫn đến ung thư [40]

Hình 1.8: Sự phân chia bất thường của nhiễm sắc thể trong nguyên phân [40]

1.2 GIỚI THIỆU VỀ GEN RB1

Theo thống kê, khoảng 40% ca UNBVM là thể di truyền trong khi 60% số

ca còn lại là thể không di truyền Khi quan sát các trường hợp UNBVM có yếu

tố gia đình hoặc không có yếu tố gia đình, người ta cho rằng tất cả các trường

hợp UNBVM là hậu quả của đột biến mất chức năng gen RB1 nằm trên NST13q14 [7] Gen RB1 có 27 exon và 26 introns với khối lượng phân tử là

180kb được tạo thành t 31-1889 cặp base Sản phẩm gen là phosphoprotein p110 (có trọng lượng phân tử là 110 kDa) có 928 acid amin

Hình 1.9: Vị tr gen RB1 trên nhiễm sắc thể số 13

Hình 1.10: Cấu trúc gen và protein RB1

RB1 mã hóa cho protein RB, protein này hoạt động như một chất kiềm

chế khối u, có nghĩa là nó điều chỉnh sự tăng trưởng tế bào và giữ cho tế bào không phân chia quá nhanh hoặc theo một cách không kiểm soát được

Cơ chế gây bệnh: RB1 bị ức chế khi bị phosphoryl hóa bởi các enzyme

kinase phụ thuộc cyclin (cyclin dependent kinase) nhưng sẽ ở trạng thái hoạt động khi không bị phosphoryl hóa một cách tương đối Ở trạng thái hoạt động, pRB gắn với các thành phần trong phức hệ phiên mã E2F và bất hoạt chúng, phức hệ này có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy tế bào bước vào giai đoạn

S, giai đoạn tổng hợp DNA trong chu kỳ tế bào cho nên khi pRb hoạt động sẽ làm đình chỉ quá trình tăng sinh tế bào Với t nh năng như vậy bình thường pRb hoạt động như một cái “hãm” cho hoạt động sinh sản tế bào và khi pRb bị bất hoạt do bị phosphoryl hóa thì hoạt động sinh sản tế bào mới bắt đầu trở lại Khi

xảy ra các đột biến làm mất chức năng của gen RB1 hoặc trong những trường

hợp gia tăng sự methyl hóa vùng 5’ của gen này có thể dẫn tới tình trạng bất hoạt thường xuyên của gen, khi đó cơ chế kìm hãm hoạt động sinh sản của tế bào không còn nữa, tế bào sẽ tăng sinh không kiểm soát gây ung thư [41]

Knudson đã đưa ra giả thuyết lần một đột biến xảy ra trên các exon của

gen RB1, lần hai đột biến soma làm sai lệch tế bào sinh sản dẫn đến sự hình

thành khối u Các đột biến trong gene RB1 mang t nh chất không đồng nhất và

phân bố trên cả vùng promoter cũng như 27 exon Hơn hai phần ba các đột biến

trong gen RB1 được dự đoán là tạo nên kết thúc dịch mã sớm-dẫn tới hình thành

protein RB không hoàn chỉnh [42] Một báo cáo năm 2005 đã thống kê được 16

điểm nóng đột biến của gen RB1 bao gồm các dạng đột biến vô nghĩa, đột biến

ảnh hưởng tới phân cắt mRNA và đột biến sai nghĩa Phần lớn các đột biến tái phát xảy ra do sự thay đổi C>T trong 11 bộ ba CGA tại các exon 8, 10, 11, 14,

15, 17, 18 và 23 [43] Cho đến nay, hơn 1700 đột biến đã được đưa vào cơ sở dữ

liệu đột biến gen RB1 (RB1 Gene Mutation Database)

1.3 CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT

SỬ DỤNG NHẰM XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN RB1 TRÊN THẾ GIỚI

VÀ VIỆT NAM

Phương pháp x t nghiệm phân tử để xác định các bệnh nhân UNBVM có phải thuộc dạng di truyền hay không bao gồm các xét nghiệm đơn gen, đối với các bệnh nhân bị UNBVM một bên mắt, 2 bên mắt hoặc bị một bên mắt nhưng

có nhiều khối u Phân tích trình tự và phân tích mất/lặp đoạn lớn gen RB1 được

thực hiện trên DNA máu ngoại vi Đối với các bệnh nhân bị UNBVM một bên mắt nhưng có nhiều khối u và không có tiền sử gia đình, nếu không có mẫu mô

khối u, phân tích trình tự và phân tích mất/lặp đoạn lớn gen RB1 được thực hiện

trên DNA máu ngoại vi Nếu có mẫu mô khối u, phân tích trình tự và phân tích

mất/lặp đoạn lớn gen RB1 được thực hiện trên DNA mẫu mô trước sau đó tiến

hành trên DNA t máu để kiểm tra sự có mặt của biến thể này Phân tích trình tự nhằm phát hiện các đột biến điểm có khả năng gây bệnh hoặc gây bệnh điểm trên

vùng promoter, trên các exon và cả vùng nối intron-exon của gen RB1 Biến thể

nghĩa và các điểm cắt nối tạo mRNA; tuy nhiên phương pháp này không phát hiện được các đột biến mất/lặp đoạn lớn Các phương pháp phân t ch mất/ lặp đoạn được sử dụng bao gồm PCR định lượng (qPCR), long-range PCR, multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) và microarray [20] Bên cạnh đó, một nghiên cứu năm 2016 tại Mỹ đã sử dụng công nghệ giải trình

tự thế hệ mới cho ph p xác định được các đột biến điểm, các indels nhỏ và mất

đoạn/lặp đoạn lớn trên toàn bộ gen RB1 Phương pháp này cũng cho ph p xác

định được những đột biến dạng khảm trong mẫu máu [8] Hiện nay, quy trình

thông thường cho xét nghiệm đột biến gen RB1 là kết hợp sàng lọc các vùng mã

hóa bằng giải trình tự với các phân tích mất đoạn/lặp đoạn lớn bằng MLPA Một

số kết quả nghiên cứu cho thấy khi kết hợp hai kĩ thuật giải trình tự và MLPA đã làm tăng độ nhạy trong chẩn đoán Cụ thể, nghiên cứu của nhóm Trung Quốc cho thấy tỉ lệ phát hiện đột biến tăng t 78.6% (sử dụng kĩ thuật giải trình tự) lên 92.3% (kết hợp giải trình tự với MLPA) [44] Nghiên cứu trên các bệnh nhân người Malaysia cũng báo cáo tỉ lệ phát hiện đột biến là 52.6% (kết hợp giải trình

tự với MLPA)-cao hơn 36.8% (sử dụng kĩ thuật giải trình tự) và 15.8% (sử dụng

kĩ thuật MLPA) [45] Ngoài ra, kĩ thuật MLPA kết hợp với giải trình tự gen

cũng đã được sử dụng trong sàng lọc đột biến gen RB1 trên các bệnh nhân u

nguyên bào võng mạc ở Iran, Brazil, Argentina và Singapore [30] [46] [47] [48]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LİỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU

2.1 VẬT LİỆU NGHİÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là ba mươi bệnh nhi đã được chẩn đoán UNBVM trên lâm sàng và cận lâm sàng t năm 2013 đến 2018 tại Bệnh viện Mắt trung ương Chẩn đoán UNBVM được thiết lập theo tiêu chuẩn nhãn khoa và mô học

Độ tuổi chẩn đoán là t 3 đến 36 tháng tuổi Cha mẹ các bệnh nhi đồng ý tham gia nghiên cứu tự nguyện Mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân và người thân trong gia đình được thu thập và được bảo quản ở - 20°C cho đến khi tách chiết DNA Khi một bệnh nhân được xác định là có đột biến dòng mầm, cha mẹ và anh chị

em của bệnh nhân sẽ được tư vấn di truyền để kiểm tra đột biến ở cùng vị trí

nucleotide trên gen RB1 Nghiên cứu này đã được chấp thuận của Hội đồng Đạo

Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Phương pháp nghiên cứu phù hợp với các quy định của Tuyên bố Helsinki và Hiệp hội nghiên cứu về thị lực và nhãn khoa (Research in Vision and Ophthalmology-ARVO) trên các đối tượng con người

2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị

Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu này thuộc Viện nghiên cứu hệ gen, Viện hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam Các thiết bị sử dụng chính bao gồm: Máy ly tâm Eppendorf (Đức) và máy ly tâm lạnh đa năng 5810R* (Đức); Máy PCR Mastercycler pro S (Đức); Máy soi gel và chụp ảnh tự động DigiDoc-It® Imaging System của Ultra-violet production (Mỹ); Máy đo

quang phổ (UV- Vis BioSpectrometer Basic, Đức); Máy đọc trình tự gen ABI

3500 Genetic Analyzer của Applied Biosciences (Mỹ)…

2.1.3 Hóa chất

*Hó t đ t ết N : Sử dụng kit E.Z.N.A.® Blood

DNA Minicủa OMEGA bio-tek, Mỹ

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU

Quá trình nghiên cứu đươc thực hiện theo sơ đồ sau:

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Bệnh nhân được lấy 2 mL máu tĩnh mạch, cho vào ống chứa chất chống đông EDTA với hàm lượng 1,5 mg/mL Quy trình lấy máu đảm bảo vô trùng tuyệt đối và bảo quản ở -20°C cho đến khi tách chiết DNA

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA genomic

Mẫu máu của các đối tượng nghiên cứu được tách chiết DNA tổng số bằng cách sử dụng kit E.Z.N.A Blood DNA mini (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được xác định nồng độ bằng kit Qubit Fluorometer BR (Broad-range) DNA Nguyên lý của phương pháp này là khi hòa hỗn hợp có Qubit dye với DNA tổng số, dye sẽ gắn kết với DNA sợi đôi

và đạt trạng thái bão hòa trong 2 phút Tín hiệu huỳnh quang của dye sẽ tỉ lệ

thuận với nồng độ DNA mà dye gắn kết vào T đó, Qubit Fluorometer thu nhận tín hiệu huỳnh quang và tính nồng độ DNA sợi đôi dựa trên đường chuẩn nồng

độ DNA được xây dựng t hai mẫu chuẩn (được cung cấp theo bộ kit)

2.2.3 Phương pháp khuếch đại gen (PCR)

2.2.3.1 ết kế mồ o PCR và s qu n n

Cặp mồi nhân vùng điều khiển gen được thiết kế dựa trên trình tự nhân

chuẩn của RB1 mang accession number NM.000321.2 trong ngân hàng

GenBank Các cặp mồi này đều cho ph p nhân được toàn bộ exon đ ch và 100bp thuộc hai intron liền kề

50-Bảng 2.1 Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR