Nghiên cứu chiết suất hoạt chất từ cây gai xanh (boehmeria nivea l gaud) và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HỒNG NGỌC NGHIÊN CỨU CHIẾT SUẤT HOẠT CHẤT TỪ CÂY GAI XANH Boehmeria nivea L.Gaud VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HỒNG NGỌC

NGHIÊN CỨU CHIẾT SUẤT HOẠT CHẤT

TỪ CÂY GAI XANH (Boehmeria nivea L.Gaud)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HỒNG NGỌC

NGHIÊN CỨU CHIẾT SUẤT HOẠT CHẤT

TỪ CÂY GAI XANH (Boehmeria nivea L.Gaud)

VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM

BẢO VỆ SỨC KHỎE

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Văn Chí

Thái Nguyên - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN htt p : / / l r c tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được

sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS.Trần Văn Chí đã

luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thànhluận văn này

Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến ThS Lưu Hồng Sơn cùng các cán bộ, các bạn

sinh viên Khoa Công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm trường Đại học NôngLâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứunày

Em xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Sinh Huỳnh, chủ nhiệm đề tài

“Nghiên cứu công nghệ chế biến một số sản phẩm từ cây gai xanh tại tỉnh CaoBằng”, của sở Khoa học và công nghệ tỉnh Cao Bằng năm 2018, giám đốc công ty

cổ phẩn giống và chăn nuôi Cao Bằng đã giúp đỡ em trong quá trình thực tập vànghiên cứu, cũng như hỗ trợ kinh phí để thực hiện luận văn

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thựchiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2019

Học Viên

Nguyễn Thị Hồng Ngọc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN htt p : / / l r c tnu.edu.vn

ii

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết 1

1.1 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.1.1 Mục tiêu chung 2

1.1.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.2.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.2.2 Ý nghĩa thực tiễn .2

Chương 1 .3

CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 3

1.1 Cơ sở khoa học 3

1.1.1 Tổng quan về cây gai xanh 3

1.1.2 Các hoạt chất sinh học trong cây gai xanh và tính chất của chúng 5

1.1.3 Tổng quan về gốc tự do và các chất chống oxi hóa 6

1.1.4 Định nghĩa thực phẩm chức năng 7

1.1.5 Đặc điểm và tác dụng của thực phẩm chức năng 8

1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng cây gai xanh 8

1.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng cây gai xanh tại Việt Nam 8

1.2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng cây gai xanh trên thế giới 9

Chương 2 .12

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 12

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN htt p : / / l r c tnu.edu.vn

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 12

2.1.2.1 Phạm vi nội dung 12

2.1.2.2 Phạm vi không gian nghiên cứu: 12

2.1.2.3 Vật liệu, hoá chất và thiết bị sử dụng 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Phân tích, thử nghiệm hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong cây gai xanh 13

2.3.1.1 Xác định hàm lượng flavonoid tổng số bằng phương pháp cân 13

2.3.1.2 Phương pháp xác định hoạt động chống oxy hóa tế bào 14

2.3.2 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình chiết suất cao củ gai 15

2.3.3 Phương pháp thử khả năng kháng khuẩn 19

2.3.4 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc và cao củ gai 19

2.3.4.1 Nghiên cứu, xây dựng quy trình công nghệ sản xuất trà túi lọc từ lá Gai 19

2.3.4.2 Nghiên cứu, xây dựng quy trình công nghệ sản xuất cao từ rễ (củ) Gai: 26

2.3.4.3 Phương pháp phân tích chỉ tiêu chất lượng các sản phẩm thu được 27

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 28

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Kết quả nghiên cứu một số hoạt chất sinh học trong dịch chiết lá và củ gai 29

3.1.1 Kết quả phân tích hoạt chất sinh học trong một số bộ phận cây gai xanh 29

3.1.2 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá gai 30

3.2 Kết quả tối ưu hóa quá trình chiết suất cao củ gai 32

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết suất 33

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết suất 33

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết suất 34

3.2.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 35

3.2.5 Kết quả tối ưu các điều kiện chiết suất dịch củ gai 36

3.2.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến chất lượng sản phẩm. 39

3.2.7 Kết quả phân tích hàm lượng flavonoid trong cao củ gai 39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN htt p : / / l r c tnu.edu.vn

3.3 Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của một số hoạt chất sinh học của

cây gai xanh; 40

3.4 Kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc và cao củ gai 42

3.4.1 Kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc 42

3.4.1.1.Kết quả xác định thành phần hóa học của nguyên liệu 42

3.4.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố trong quá trình sản xuất43 3.4.1.3 Quy trình sản xuất 46

3.4.1.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm trà túi lọc từ lá gai 47

3.4.2 Kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất cao củ gai 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

I Tài liệu tiếng Việt: 51

II Tài liệu tiếng Anh: 51

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN htt p : / / l r c tnu.edu.vn

HPLC : High Performance Liquid Chromatography - Sắc ký

lỏng hiệu năng cao

LB : Luria Bertani

ROS : Reactive oxygen species - Gốc tự do oxy hóa

SSR : Simple sequence repeat - Chuỗi lặp lại đơn giản

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN htt p : / / l r c tnu.edu.vn

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu 18

Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố và hàm lượng hoạt chất sinh học của cao củ gai 18

Bảng 3.1 Bảng kết quả phân tích các hoạt chất sinh học trong một số bộ phận của cây gai xanh 29

Bảng 3.2 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết được thể hiện qua giá trị IC50 32

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng flavonoid 33

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số 34

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số 34

Bảng 3.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hàm lượng flavonoid tổng số 35

Bảng 3.7: Ma trận thực nghiệm Box-Behken ba yếu tố chiết củ Gai 36

Bảng 3.8: Phân tích phương sai ANOVA của mô hình chiết suất từ củ Gai 37

Bảng 3.9 Kết quả của ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến chất lượng sản phẩm 39

Bảng 3.10 Kết quả phân tích hàm lượng flavonoid trong cao củ gai 40

Bảng 3.11 Đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết lá gai kháng E coli, B subtilis và S aureus 41

Bảng 3.12 Bảng kết quả phân tích một số chỉ tiêu từ lá và rễ của cây gai xanh 42

Bảng 3.13 Kết quả đánh giá cảm quan nhiệt độ đến quá trình sấy 43

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của thời gian sấy 44

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu 45

Bảng 3.16 Tỷ lệ nguyên liệu phụ bổ sung vào trong sản phẩm 45

Bảng 3.17 Kết quả đánh giá chất lượng sản phẩm 47

Bảng 3.18 Kết quả đánh giá chỉ tiêu vi sinh vật 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN htt p : / / l r c tnu.edu.vn

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cây gai xanh và củ của cây gai xanh 3

Hình 2.1 Phản ứng khử gốc DPPH 14

Hình 3.1 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá gai 31

Hình 3.2 Hoạt tính chống oxy hóa của Acid ascorbic 31

Hình 3.3 Bề mặt đáp ứng hàm lượng flavonoid 38

Hình 3.4 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu hàm lượng flavonoid trong dịch chiết 38 Hình 3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lá gai với vi khuẩn lần lượt A: Escherichia coli, B: Bacillus subtilis, C: Staphylococcus aureus và D: Đối chứng dương Ampicillin, đối chứng âm nước cất .40

Hình 3.6 Khả năng kháng khuẩn của cao củ gai đối với Bacillus subtilis và Escherichia coli 42

Hình 3.7 Sơ đồ quy trình sản xuất trà túi lọc lá gai 46

Hình 3.8 Quy trình sản xuất cao củ gai 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN htt p : / / l r c tnu.edu.vn

1

1 Tính cấp thiết

MỞ ĐẦU

Cây gai xanh - Boehmeria nivea (L.) Gaud đã được sử dụng từ 5.000 - 3.300

trước công nguyên trong các loại vải xác ướp ở Ai Cập Nó được trồng như một loạicây lấy sợi ở nhiều quốc gia bao gồm Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Philippines,

Ấn Độ và Hàn Quốc Phần vỏ ngoài của thân cây gai xanh chứa hàm lượng chất xơcao, khi thu hoạch chủ yếu đã và đang được sử đụng để sản suất vải sợi Ngoài ratrong thành phần chất xơ này có hoạt chất với khả năng chống vi khuẩn, côn trùngtấn công và nấm mốc [12]

Ở Hàn Quốc đã có rất nhiều nghiên cứu về việc sử dụng cây gai xanh trongthực phẩm, chẳng hạn như nhiều loại bánh gạo truyền thống của Hàn Quốc [12].Đặc biệt, phần lá của cây gai xanh rất giàu các yếu tố dinh dưỡng như khoáng chất,protein, vitamin, và nhiều chất hoạt tính sinh học khác nhau [18]

Trong thuốc thảo dược truyền thống của Trung Quốc đã sử dụng rễ của câygai xanh để điều trị cảm lạnh thông thường, phù nề, sốt, nhiễm trùng đường tiếtniệu, viêm thận và an thai rất tốt [12]

Những nghiên cứu trước đây đã tìm thấy các hợp chất quý có trong cây gaixanh như alkaloids, lignans, flavon, terpenoids và glycosides và axit behenic, axitursolic, β- sitosterol, cholesterol, kiwiionoside, rutin, uracil, quercetin, α-amyrin,nonacosanol, emodin, emodin-8-O-β-glucoside, physcion, polydatin, catechin,epicatechin và epicatechin gallate [12]

Theo dược lý hiện đại, lá gai có chlorogenic acid, flavonoid rhoifolin,apogenin Trong đó chlorogenic acid có tác dụng diệt nấm, vi khuẩn và chống oxyhóa mạnh gấp 10 lần vitamin E Nó phong tỏa nhóm “tự do”, ngăn chặn sự oxy hóalipoprotein LDL, là khởi điểm của xơ động mạch để dẫn tới cao huyết áp và nhồimáu cơ tim

Các báo cáo đã chỉ ra rằng các chất chiết xuất từ rễ cây gai xanh đã biểu hiệncác hoạt động bảo vệ gan chống lại các tổn thương gan do CCl4 gây ra và các tácdụng chống oxy hóa trên FeCl2-ascorbate gây ra lipid peroxid hóa trong ganhomogenate [12] Trong nghiên cứu Xiaoning Wang và cs đã chỉ ra rằng chiết xuất

Boehmeria nivea (L.) Gaud có thể ngăn ngừa thoái hóa thần kinh dẫn đến bệnh

Alzheimer [23]

Mặc dù cây gai xanh có rất nhiều công dụng đối với sức khỏe con người đặcbiệt là từ phần lá và củ của cây, nhưng hiện nay vẫn chưa có một quy trình cụ thểtrong sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng từ lá gai và củ gai Do đó, tôi tiến

hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết suất hoạt chất từ cây gai xanh

(Boehmeria nivea L Gaud) và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung

Nghiên cứu chiết suất hoạt chất từ cây gai xanh (Boehmeria nivea L Gaud)

và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Nghiên cứu thành phần hoạt chất sinh học có trong nguyên liệu lá và củ gai;

- Tối ưu hóa quy trình chiết suất một số hoạt chất có hoạt tính sinh học cao từ

lá và củ gai;

- Đánh giá khả năng kháng khuẩn của lá và củ cây gai xanh;

- Quy trình nghiên cứu sản xuất sản phẩm trà túi lọc lá gai, cao củ gai vàđánh giá chất lượng sản phẩm

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Chương 1

CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Cơ sở khoa học

1.1.1 Tổng quan về cây gai xanh [1],[2],[7],[11]

Hình 1.1 Cây gai xanh và củ của cây gai xanh[2]

Mô tả thực vật

Tên khoa học: Boehmeria nivea (L.) Gaud

Tên đồng nghĩa : Urtica nivea L.

Tên khác: Gai tuyết, gai làm bánh (Kinh), trữ ma, bâu pán (Tày), co pán(Thái), chiểu đủ (Dao)

Tên nước ngoài: Ramie grass, China grass, chinese silk – plant (Anh); ramie,ramie blanche, ramie de Chine, ortle de Chine argentee, ortie à feuilles blanches(Pháp)

Họ : Gai (Urticaceae)

Cây nhỏ, cao 1 – 2m Thân cứng hóa gỗ ở gốc Cành màu đỏ nhạt, phủ nhiềulông sát Lá mọc so le, hình trái xoan hoặc hình trứng, gốc tròn hay hình tim, đầuthuôn nhọn, dài 7 – 15 cm, rộng 4 – 8 cm, lúc non phủ nhiều lông mềm ở cả hai

mặt, lúc già thì mặt trên nhẵn màu lục sẫm, mặt dưới lông trở thành trắng bạc, mép

có răng hình tam giác, gân gốc 3, cuống lá mảnh, màu đỏ, có lông mềm, lá kèmhình dải nhọn, dễ rụng

Cụm hoa cùng gốc hay khác gốc, ngắn hơn lá, mọc ở kẽ lá, xếp thành chùyđơn ở hoa cái hay hợp lại với nhau ở hoa cái và hoa đực, có khi tạo thành nhữngtúm dày đặc; cụm hoa đực nhiều hoa, nụ hình cầu có lông lởm chởm, lá dài 4, nhị 4,nhụy lép có dạng quả lê; cụm hoa cái hình cầu, mang nhiều hoa, bao hoa màu lụcnhạt, hình trứng có lông, bầu giẹp, hình trái xoan, hơi có cánh

Quả bế, hình quả lê, có nhiều lông, hạt có dấu

Mùa hoa quả: tháng 11 – 1

Phân bố khắp cả nước, tuy nhiên phát hiện nhiều tại các vùng đồng bằng,

miền núi của miền Bắc Việt Nam như: Cao Bằng, Lào Cai, Quảng Ninh, TháiNguyên, Lạng Sơn, Hà Tây, Hà Nội

Chi Boehmeria Jacq gồm 75 loài, phân bố rải rác khắp các vùng miền nhiệt

đới và cận nhiệt đới bắc bán cầu Ở châu Á có 15 loài, trong đó Việt Nam cókhoảng 10 loài Gai là cây trồng tương đối phổ biến trong nhân dân để lấy lá làmbánh và rễ củ làm thuốc Gai còn phân bố ở nhiều nước khác như Ấn Độ, Thái Lan,Lào, Trung Quốc, Campuchia và Nhật Bản

Gai thuộc loại cây ưa ẩm và có thể hơi chịu bóng, sinh trưởng phát triển nhanhtrong mùa mưa ẩm, đến mùa đông có hiện tượng rụng lá, hơi tàn lụi Cây ra hoahàng năm Chưa quan sát được cây con mọc từ hạt Song, gai lại có khả năng táisinh vô tính khỏe bằng cách tái sinh cây chồi sau khi chặt và từ các đoạn thân, cànhđem giâm xuống đất

Bộ phận dùng

Rễ củ gai thường gọi là trử ma căn Rễ thu hái quanh năm, tốt nhất là vào mùa

hạ hay mùa thu Đào rễ rửa sạch đất cát, cắt bỏ rễ con, để nguyên hay thái phiến,dùng tươi hay phơi, sấy khô, Rễ hình trụ, thường cong queo dài 5 – 10 cm, đườngkính 0,5 – 1,5 cm, mặt ngoài nâu sẫm, có những nếp nhăn dọc và sẹo của dễ con, dễ

nẻ, vết bẻ màu vàng có xơ, không mùi, vị nhạt

Lá gai dùng làm bánh hoặc nấu nước uống thanh nhiệt, giải cảm, ngoài ra hàmlượng protein trong lá rất cao được ứng dụng trực tiếp làm thức ăn gia súc để cungcấp hàm lượng đạm thực vật cho vật nuôi…

Thân gai: Hàng năm, các nhà máy dệt của Việt Nam phải nhập khẩu hàng vạntấn sợi gai để sản xuất vải Ngoài ứng dụng thân cây gai xanh để sản xuất vải maymặc, nó còn được ứng dụng tạo sợi đan lưới đánh cá và là cơ chất lý tưởng để nuôitrồng và sản xuất nấm ăn

Năng suất thân gai tươi thường 40 - 60 tấn/ha, cho 1.000 - 1.600 kg sợi khô và

500 - 1.200 kg sợi đã loại chất keo Ở Philippin thu được 2.000 kg sợi khô/ha trongnăm đầu và 3.500 kg sợi khô trong các năm tiếp theo Các diện tích gai ở nhiều nướcthường sau 7 - 20 năm mới phải phá đi để trồng lại Gai trồng để làm thức ăn gia súc,năng suất lá có thể đến 300 tấn tươi hay 42 tấn khô với 14 lần cắt trong 1 năm Năngsuất phụ thuộc nhiều vào tính chất thổ nhưỡng, cách chăm sóc và trồng giống

1.1.2 Các hoạt chất sinh học trong cây gai xanh và tính chất của chúng

Lá cây gai xanh cũng thường được sử dụng trong các biện pháp dân gian nhưmột thuốc lợi tiểu và chống sốt, và đã được cho là có tính chất hepatoprotective,chống oxy hóa, và chống viêm [12] Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng lá gaichứa kiwiionoside, rutin, uracil, axit 3-hydroxy-4-methoxy-benzoic, cholesterol, α-amyrin, nonacosanol, emodin, emodin-8-O-β-glucoside, physcion, polydatin,catechin , kali nitrat, β-sitosterol, epicatechin và epicatechin gallate

Hơn nữa, lá của B nivea chứa một lượng lớn các hợp chất phenolic, có khả năng ức chế men chuyển đổi angiotensin I Trong rễ của loài B tricuspis có một số

epicatechin dimers như (-) - epiafzelechin - (-) - epicatechin-4,8 (hoặc 6) -dimer, và(-) - epicatechin - (-) epicatechin- 4,8- (hoặc 6) –dimer, trong số đó epicatechin,

epicatechin gallate, và rutin là các hợp chất polyphenolic được gọi là flavonoid,

được biết đến với đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống khối u, chống vikhuẩn, chống virus và chống dị ứng [12]

Rễ gai chứa acid chlorogenic, acid protocatechuic, acid cafeic, acid quinic,rhoifolin 0,7%, apigenin, rhoifolin khi thủy phân cho apigenin, glucose, rhamnose.Ngoài ra, còn chứa β- sitosterol, daucosterol và acid 19α hydroxyl ursolic (CA, 126,

1997, 291739) Các polysaccharide thành phần chủ yếu gồm D- galctose , L –

rhamnose, D –arabinose, D – mannose, và D – galacturonic Me – ester Bên cạnhpolysaccharid, còn có một số oligosaccharid và monosaccharide Cácmonosaccharide trong rễ cây là erythrose, heptose và một lượng nhỏ D – galactose,

L – arabinose, acid D- galacturonic, melibiose, glucose và fructose, cácpolysaccharide, một số oligo saccharid và monosaccharide Các pectin với thànhphẩn chủ yếu là acid D – galacuronic và dẫn chất mentyl ester của chúng, cùng vớiđường L – rhamnose, D – galactose, L – arabinose, L – fructose, D – glucose, D –manose và D – Xylose, các hemicelluloses với thành phần chính là glucomannan[11]

1.1.3 Tổng quan về gốc tự do và các chất chống oxi hóa

1.1.3.1 Giới thiệu về gốc tự do

Gốc tự do là những nguyên tử hay phân tử mất đi một điện tử ở lớp vỏ ngoàicùng Do thiếu một điện tử nên các phân tử hay nguyên tử này trở nên không ổnđịnh và dễ dàng phản ứng với các phân tử/nguyên tử lân cận khác để trở nên bềnvững, kết quả tạo ra một loạt gốc tự do mới [15]

Phân loại: gốc tự do được tạo ra từ nguyên tử oxy (reactive oxygen species – ROS)như superoxide (O2-•) hydroxyl (OH•), peroxyl (ROO•), lipid peroxyl (LOO•); và từnguyên tử nitơ (Reactive nitrogen species) như nitric oxide (NO•) và nitrogendioxide (NO2•) Ngoài ra các phân tử không phải là gốc tự do như hydroperoxide(H2O2), ozon (O3), oxy phân tử (O2), axit hypochoric (HOCl), axit nitric (HNO2),chúng được gọi những chất oxi hóa do dễ dàng tạo ra các phản ứng sinh gốc tự dotrong tế bào [15]

Gốc tự do nội sinh được tạo ra từ các phản ứng enzyme trong tế bào liênquan đến hoạt động hô hấp, thực bào, tổng hợp prostaglandin và hoạt động chuyểnhóa của hệ enzyme cytochrome P450 Các trường hợp sinh ra gốc tự do nội sinhnhư hoạt động của tế bào miễn dịch, viêm, căng thẳng, tập thể dục quá sức, thiếumáu cục bộ, nhiễm trùng, ung thư và lão hóa Ngược lại gốc tự do sinh ra khôngliên quan đến hoạt động của các enzyme mà do phản ứng của oxy với các hợp chấthữu cơ hoặc do các phản ứng phophoryl hóa xảy ra ở ty thể gọi là gốc tự do ngoạisinh Nguồn gốc của các gốc tự do ngoại sinh từ không khí, nước bị ô nhiễm, khóithuốc, rượu, kim loại nặng (Cd, Hg, Pb, Fe, As), thuốc kháng sinh (gentamycin,

bleomycine), thuốc ức chế miễn dịch (cyclosporine, tacrolimus), thịt hun khói, dầu

mỡ cháy, phóng xạ [15]

Vai trò của gốc tự do: Ở mức thấp và vừa, gốc tự do là nguồn cung cấp nănglượng cho cơ thể, tạo ra các chất màu melamine cần cho thị giác, góp phần sản xuấtaxit béo không bão hòa có tác dụng ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng cường miễn dịch.Tuy nhiên ở nồng độ cao nó sẽ gây ra sự phá hủy cấu trúc tế bào và là nguyên nhâncủa các bệnh mạn tính và thoái hóa như ung thư, hen, lão hóa, rối loạn miễn dịch,tim mạch và thoái hóa tế bào thần kinh (Alzheimer, Parkinson), trầm cảm, thoái hóakhớp [15]

1.1.3.2 Các chất chống oxi hóa

Khi gốc tự do bị dư thừa cơ thể có cơ chế bảo vệ bằng cách sản sinh ra cácchất để trung hòa các gốc tự do gọi là các chất chống oxi hóa Chất chống oxi hóagồm enzyme chống oxi hóa tương ứng với các gốc tự do như superoxide dismutase(SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) và glutathione reductase(GRx); các chất chống oxi hóa không có hoạt tính enzyme gồm chất chống oxi hóachuyển hóa (còn được gọi là chất chống oxi hóa nội sinh được sinh ra bởi quá trìnhchuyển hóa trong cơ thể như axit lipoid, glutathione, L-ariginine, coenzyme Q10,melatonin, acid uric, bilirubin, …) và chất chống oxi hóa dinh dưỡng (là chất chốngoxi hóa ngoại sinh không được sản xuất trong cơ thể phải cung cấp từ thực phẩm

hay bổ sung như vitamin E, vitamin C, carotenoids, flavonoid, omega-3, omega-6,

các nguyên tố: manganm kẽm, selen) [16]

1.1.4 Định nghĩa thực phẩm chức năng

Tại Mỹ: Thực phẩm chức năng (thực phẩm bảo vệ sức khỏe): là thực phẩm mang đến nhiều lợi ích cho sức khỏe, là bất cứ thực phẩm nào được thay đổi thành

phần qua chế biến hoặc có các thành phần của thực phẩm có lợi cho sức khỏe ngoài thành phần dinh dưỡng truyền thống của nó

 Hiệp hội thông tin thực phẩm quốc tế (IFIC):

Thực phẩm chức năng là thực phẩm mang đến những lợi ích cho sức khỏevượt xa hơn cơ bản

 Tại Úc: Thực phẩm chức năng là thực phẩm:

- Có tác dụng đối với sức khỏe hơn là các chất dinh dưỡng thông thường

- Gần giống như các TP truyền thống nhưng nó được chế biến để cho mụcđích ăn kiêng hoặc tăng cường các chất dinh dưỡng để nâng cao vai trò sinh lí củachúng khi bị giảm dự trữ.

- Được chế biến, sản xuất theo công thức chứ không phải các thực phẩm cósẵn trong tự nhiên

 Bộ Y tế Việt Nam: thông tư số 08/TT-BYT ngày 23/08/2004 về việc

“Hướng dẫn việc quản lí các sản phẩm thực phẩm chức năng” đã đưa ra định nghĩa:Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phậntrong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể sự thoải mái, tăng sức đềkháng và giảm nguy cơ gây bệnh [8]

1.1.5 Đặc điểm và tác dụng của thực phẩm chức năng

 Đặc điểm:

- Là thực phẩm - không phải thuốc

- Là thực phẩm không giàu calo

- Đầy đủ, cân đối các chất dinh dưỡng (được thiết kế theo nhu cầu dinh dưỡng

của cơ thể).

- Là dinh dưỡng tế bào (có khả năng cung cấp dinh dưỡng trực tiếp cho tế bào

và giúp tế bào giải độc, kháng gốc tự do, hỗ trợ chu trình chuyển hóa tế bào)

1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng cây gai xanh

1.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng cây gai xanh tại Việt Nam

Ở Việt Nam từ xưa tới nay, cây gai xanh được khai thác theo 2 hướng chủ yếu

là cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất sợi và làm dược liệu theo y học

cổ truyền Bên cạnh đó nhiều địa phương sử dụng lá Gai để làm bánh, nhiều nơi tạothành thương hiệu của vùng, miền mang lại giá trị kinh tế cao cho người dân nhưHải Dương, Hàm Yên (Tuyên Quang), Cao Bằng

Các công trình nghiên cứu liên quan đến cây gai xanh phải kể đến: Năm 2008,tác giả Tạ Kim Chính và cộng sự thuộc trung tâm nghiên cứu sản xuất các chế phẩmsinh học đã có đề tài nghiên cứu phát triển cây gai xanh (Boehmeria nivea L.Gaud)trên đất dốc rừng đầu nguồn sông Đà, góp phần bảo vệ môi trường và xoá đói giảmnghèo cho vùng di dân lòng hồ ở Sơn La đã đem đến những ý nghĩa lớn trong pháttriển kinh tế [9]

Năm 2016, ThS Trần Đức Hảo, Viện nghiên cứu bông và phát triển nôngnghiệp Nha Hố đã chủ trì thực hiện nhiệm vụ quỹ gen “Khai thác và phát triểnnguồn gen các giống gai xanh (Boehmeria nivea L Gaudich) Phú Yên và ThanhHóa”, nhằm phát triển 2 giống gai xanh có nguồn gốc từ những nơi này, chất lượngtốt, cùng với các quy trình kỹ thuật trồng và chăm sóc để phục vụ sản xuất [10].

Tuy nhiên các nghiên cứu chuyên sâu về tác dụng dược lý của cây gai xanhchủ yếu được công bố bởi các báo cáo khoa học nước ngoài Trong nước, cây gaixanh chủ yếu được ghi chép trong các bản ghi chép của y học cổ truyền và sử dụngtheo kinh nghiệm dân gian Cây được khai thác lấy lá và củ, có vị ngọt, tính hàn,không độc, có tác dụng tả nhiệt, tán ứ, chữa đơn độc, thông tiểu, chữa sang lở.Trong tác phẩm “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của Giáo sư Đỗ Tất Lợi

do Nhà xuất bản Y học phát hành, được Hội đồng chứng chỉ (khoa học) tối cao Liên

Xô công nhận, cây gai xanh được giới thiệu như một vị thuốc an thai, lợi tiểu Thực

tế, từ xa xưa nhân dân ta đã biết sử dụng và truyền bá kinh nghiệm trong dân gianviệc dùng cây gai xanh để làm thuốc an thai và chữa sa dạ con Vị thuốc cây gaixanh hiện được bán nhiều nơi tại các hiệu thuốc đông y trên toàn quốc ở dạng phơikhô, có thể đã sơ chế hoặc ở dạng thô [2] Trên thị trường cũng xuất hiện những sảnphẩm đóng gói nhỏ, lẻ có chứa thành phần là lá hoặc củ gai kết hợp với nhiều loạidược liệu khác, dễ dàng trong quá trình sử dụng, bảo quản và vận chuyển Giá thành

lá Gai khô hiện nay khoảng 20.000 VNĐ/Kg, thay đổi tùy địa phương và thị trường

1.2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng cây gai xanh trên thế giới

Cây gai xanh – Boehmeria nivea (L.) Gaud là loại thực vật tự nhiên rất phổ

biến tại nhiều nước Châu Á Người Trung Quốc, Nhật Bản đã biết sử dụng cây gaixanh làm sợi từ rất lâu đời Từ khoảng 3000-5000 năm trước Công nguyên tại AiCập, cây gai xanh đã được biết tới như một mặt hàng xuất khẩu và các nước nhưGuatemala, Brazil và Nam Mỹ đã nghiên cứu khả năng tận dụng nguồn lá gai giàuprotein làm thức ăn chăn nuôi Việc sử dụng lá gai cho chăn nuôi trâu bò, cừu, lợn

là hoàn toàn khả thi cho dù là hình thức lá tươi hay dạng bột

Việc sử dụng các sản phẩm phụ của ngành công nghiệp dệt may có nguồngốc từ lá gai làm thức ăn cho gia súc đã gợi ý cho nhiều nhóm nghiên cứu tìm cáchkhai thác và tăng số lượng sinh khối của cây gai xanh Các bộ phận cây như lá, hạt,

ngọn, thân cây sau khi chiết suất để tạo sợi, đều được sử dụng làm thức ăn cho độngvật với mức độ dinh dưỡng có thể chấp nhận được Phụ phẩm từ lá cho thấy lượngprotein hay vật chất khô lên tới 20%.

Năm 2010, G Contò và cộng sự đã đánh giá về mức độ dinh dưỡng và thànhphần hóa học của lá và ngọn cây lá Gai, là những phần không được sử dụng cho quátrình sản xuất sợi, phát hiện trong khối lượng khô của mẫu lá Gai có chứa proteinthô với hàm lượng 17,00 ± 1,52% ở lá, 15,25 ± 0,77% ở ngọn và 11,79 ± 3,32%tính trên toàn bộ cây Phát hiện này góp phần mở ra những hướng phát triển mới,tránh lãng phí những sản phẩm truyền thống của cây gai xanh [13]

Năm 2011, Xi a o Yin g Tian và cộng sự sử dụng dịch chiết lá Gai xanh và thửnghiệm trên 05 nhóm chuột mang thai qua đường uống với nồng độ thay đổi từ 2g-32g/kg/ngày, nhóm đối chứng âm sử dụng nước cất và đối chứng dương sử dụngvitamin A, đồng thời cho tiếp xúc với 2 dòng tế bào là dòng tế bào phôi và dòng tếbào 3T3 (nguyên bào sợi) Kết quả cho thấy các tiêu chí về khối lượng cơ thể bàothai, mức tăng trọng lượng cơ thể chuột mẹ, khối lượng tim, gan, thận, kiểm tra môhọc trong các nhóm thí nghiệm không có sự khác biệt Giá trị IC50 (ức chế 50%)giữa dòng tế bào phôi và dòng tế bào 3T3 là tương đương, tuy nhiên khả năng sốngsót của phôi sẽ có thể bị ảnh hưởng khi nồng độ dịch chiết Gai xanh tăng cao Pháthiện này bổ sung những thông tin thực nghiệm khoa học cho quá trình đánh giá độ

an toàn của cây gai xanh khi sử dụng cho cơ thể động vật bậc cao, đặc biệt trongnhững trường hợp sử dụng để điều trị xảy thai [21]

Tại Hàn Quốc, lá hoặc rễ cây gai xanh được sử dụng kết hợp với những thànhphần dược liệu khác làm đồ uống cho người và tạo thành sản phẩm được lưu thôngtrên thị trường Tuy rằng công thức phối trộn không được công bố do vấn đề thươnghiệu và bản quyền nhưng trong thành phần phối trộn có chứa lá Gai hoặc dịch chiết

lá Gai và có thể được bổ sung nhiều canxi Những sản phẩm này được biết là có íchtrong quá trình trao đổi lipid và kiểm soát chức năng tiêu hóa Năm 2012, Heej e o n g Lee

và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa công thức bánh mỳ có sử dụng bột lá Gai

và thời gian bảo quản của bánh mỳ với sự phơi nhiễm với tia gamma Sự khác nhau

về lượng bột lá Gai tạo ra sự khác biệt về mùi vị, hình thức, màu sắc, độ ẩm và chấtlượng nói chung của sản phẩm bánh mỳ Trong quá trình bảo quản, những mẫu

bánh mỳ có bột lá Gai sau khi chiếu tia gamma cho thấy sự phát triển của tế bào visinh vật thấp hơn Những thông tin mới phát hiện về mặt thực phẩm và dược phẩmcho thấy cây gai xanh có nhiều tiềm năng hơn so với việc khai thác lấy sợi truyềnthống [14],[25],[26].

Năm 2013, Touming Liu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về marker SSR(simple sequence repeat) nhằm làm sáng tỏ thêm những hiểu biết về di truyền ở cây

lá Gai Tổng số 24 giống Gai xanh với 100 marker SSR đã được nghiên cứu Trong

đó 98 marker được khuếch đại thành công và xác định được 81 marker ở dạng đahình, có từ 2- 6 alleles trong 24 giống Gai này Những hiểu biết về SSR có thể được

sử dụng để phát triển bản đồ di truyền và bản đồ vật lý, bản đồ các locus của tínhtrạng, nghiên cứu về đa dạng di truyền, lập bản đồ liên kết và xác nhận giống câytrồng, từ đó có thể nghiên cứu về các gene có liên quan tới tính trạng có ích trongquá trình tạo sợi ở cây lá Gai [21]

Năm 2016, Sana Ullah và cộng sự nghiên cứu về ảnh hưởng của các loại phânbón tới sự sinh trưởng, năng suất và chất lượng sợi phục vụ cho công nghiệp sợi.Cùng thời điểm Tan XF và cộng sự đã nghiên cứu hợp chất mới MgAl-layereddouble hydroxides composite từ gốc của cây gai xanh, có khả năng loại bỏ các chấttinh thể tím trong dung dịch lỏng Ngoài ra cây lá Gai còn được biết tới với khảnăng kích thích Receptor Gamma trong tế bào C2C12 từ đó làm tăng khả năng hấpthụ glucose [17]

Những nghiên cứu này cho thấy cây gai xanh có tiềm năm phát triển theonhiều hướng, là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp dệt may, công nghệ thức ănchăn nuôi, phục vụ nghiên cứu cơ bản và phát triển dược liệu, thực phẩm và thựcphẩm chức năng

Thị trường và giá các sản phẩm từ cây gai xanh trên thế giới

Các sản phẩm cây gai xanh trên thị trường thế giới rất đa dạng và phong phú.Theo Alibaba một trang web thương mại điện tử, đấu giá trực tuyến uy tín trên thếgiới Thì có nhiều sản phẩm từ cây gai xanh được rao bán trên đây Hầu hết các sảnphẩm từ cây gai xanh được bán với giá trên 10 USD/ kg (220.000 đồng/ kg) Như

củ rễ cây do công ty Shaanxi Fuheng Biotechnology (Trung Quốc) 12,3 – 18,8USD/ kg (270.000 – 414.000 đồng/ kg), lá cây do Xian Sciyu Biotech (Trung quốc)giá 9 – 50 USD/ Kg Hay công ty Xian Lucky Clover Biotech (Trung Quốc) 10 – 20USD/ Kg [27]

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Lá và rễ (củ) cây gai xanh được thu mua tại xã Cao Bình, Huyện Hòa An,Tỉnh Cao Bằng

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

2.1.2.1 Phạm vi nội dung

Đề tài nghiên cứu về thành phần các hoạt chất sinh học, khả năng khángkhuẩn của dịch chiết từ lá và rễ cây gai xanh từ đó nghiên cứu xây dựng hoàn thiệnquy trình sản xuất thực phẩm chức năng từ cao củ gai

2.1.2.2 Phạm vi không gian nghiên cứu:

Nghiên cứu chiết suất hoạt chất sinh học từ cây gai xanh Boehmeria nivea

(L.) Gaud và ứng dụng sản xuất một số thực phẩm bảo vệ sức khỏe ở quy mô phòngthí nghiệm

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 08/2018 đến tháng 8/2019

2.1.2.3 Vật liệu, hoá chất và thiết bị sử dụng

Vật liệu:

Cây gai xanh tươi (Boehmeria nivea (L.) Gaud) được thu mua tại xã Hưng

Đạo, Huyện Hòa An, Tỉnh Cao Bằng

Nguyên liệu được rửa sạch, sau đó đem đi sấy ở nhiệt độ 60oC đến độ ẩmdưới 10% Tiến hành bảo quản quản trong túi PE đặt trong hộp nhựa kín, lưu trữ ởnhiệt độ phòng, tránh ánh sáng và ẩm

Hóa chất, thiết bị:

Các hóa chất và môi trường được sử dụng trong thí nghiệm: picrylhydrazyl (DPPH); ethanol (EtOH) của Merck – Đức (dạng tinh khiết),methanol (MeOH) và môi trường Luria Bertani (trypton: 10 g/L (Đức); NaCl: 10g/L (Trung Quốc); yeast extract: 5 g/L (Ấn Độ) và agar: 15 g/L (Việt Nam)

1,1-Diphenyl-2-(Sambrook, 2001) được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn Escherichia coli (E coli) và

Bacillus subtilis (B subtilis) Vi sinh vật được sử dụng để khảo sát hoạt tính kháng

khuẩn gồm 2 dòng vi khuẩn đại diện gram âm - E coli và vi khuẩn gram dương - B.

subtilis được cung cấp bởi phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ vi sinh – Viện

Khoa học sự sống Hai dòng vi khuẩn này được nuôi cấy trên môi trường LuriaBertani (LB) ở 37oC trong 24 giờ

Thiết bị: Máy đo quang phổ, tủ sấy, cân điện tử, máy soxlet, tủ cấy, tủ ấm

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu thành phần các chất có hoạt tính sinh học trong nguyên liệu lá gai và củ gai;

- Nội dung 2: Tối ưu hóa quy trình chiết suất một số hoạt chất có hoạt tính sinh học cao từ lá và củ gai;

- Nội dung 3: Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của một số hoạt chất sinh học của cây gai xanh;

- Nội dung 4: Hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc và cao củ gai

 Xây dựng và hoàn thiện quy trình sản xuất cao củ gai;

 Xây dựng và hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gai;

 Phân tích các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm thu được

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân tích, thử nghiệm hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong cây gai xanh

- Các hoạt chất flavonoid, Chlorogenic acid, Apogenin được xác định bằngphương pháp sắc ký trên thiết bị HPLC Các hoạt động chống oxy hóa được thựchiện thông qua phương pháp khử gốc tự do DPPH Cụ thể như sau:

2.3.1.1 Xác định hàm lượng flavonoid tổng số bằng phương pháp cân

Cân chính xác 2g bột cây gai xanh chiết trong bình Soxhlet bằng este dầuhỏa để loại clorophyl (trong 2 giờ) Sau đó lấy túi chứa bột cây gai xanh ra để ởnhiệt độ phòng cho bay hết dung môi rồi chiết kiệt flavonoid bằng ethanol 70%, cấtthu hồi ethanol, còn dịch chiết nước để nguội loại bỏ tanin bằng thuộc da hoặcgelatin 3% cho tới khi không còn xuất hiện kết tủa Chiết lấy kiệt flavonoid bằngethylacetat, bốc hơi dung môi rồi sấy cặn tới khối lượng không đổi, đem cân Hàmlượng flavonoid tổng số trong mẫu thử được tính theo công thức [5]

X (%)  a b 100

Trong đó:

X: % khối lượng flavonoid tổng số

b: Là khối lượng cặn thu được (g)

a: Là khối lượng mẫu đem phân tích khô tuyệt đối (g)

2.3.1.2 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa tế bào

DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để kiểm tra khả năng loại bỏgốc tự do và các nhóm cho hydro, phương pháp này cũng được sử dụng để địnhlượng các chất oxy hóa trong hệ thống sinh học phức tạp ngày nay Những electron

lẻ có trong gốc tự do DPPH cho sự hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 517 nm và hợpchất này có màu tím Khi các electron lẻ này kết hợp với hydro của chất kháng oxyhóa để hình thành dạng DPPH-H, hợp chất sẽ chuyển từ màu tím sang vàng tươngứng với lượng electron kết hợp với DPPH Vì vậy, khả năng làm sạch gốc tự do củamột chất càng cao thì sự hấp thu quang phổ được đo ở bước sóng 517 nm của phảnứng DPPH có giá trị càng thấp và ngược lại

Khả năng khử gốc tự do

DPPH (%) = 100 × (ACT –ASP)/ACT

Trong đó,

ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dung dịch chiết;

ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dung dịch chiết

Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dung dịch chiết khử được 50% gốc

tự do DPPH ở điều kiện xác định Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự doDPPH càng cao [6]

2.3.2 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình chiết suất cao củ gai

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi tới hàm lượng flavonoid

Có nhiều dung môi được sử dụng cho quá trình chiết suất như ethanol, n –Hexan, ete dầu hỏa,… trong thí nghiệm này ta sử dụng dung môi là Ethanol vì đây

là dung môi có khả năng hòa tan được nhiều hoạt chất trong củ gainhư flavonoid,steroid, … Ethanol là dung môi an toàn, không độc, không ảnh hưởng xấu tới chấtlượng sản phẩm, không ăn mòn thiết bị, dễ bay hơi nên dễ tách ra khỏi thiết bị côđặc và là dung môi rất phổ biến, dễ kiếm

Chúng tôi tiến hành quá trình trích ly theo phương pháp ngâm kết hợp vớiphương pháp lôi cuốn hơi nước bằng thiết bị Soxlet Để đánh giá ảnh hưởng củanồng độ dung môi chiết đến hiệu suất trích ly Phương pháp tiến hành:

Cân 100g củ gai sau đó trích ly ở các nồng độ ethanol như sau:

Công thức Nồng độ ethanol (%) Hàm lượng flavonoid (mg/100g)

Trích ly ở cùng điều kiện:

 Thời gian chiết là 60 phút

 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu : 10/1

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết tới hàm lượng

flavonoid.

Để xác định nhiệt độ chiết chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các khoảng thờigian khác nhau lần lượt là 75, 90, 105 phút Các công thức thí nghiệm được bố trínhư sau:

Cân 100g củ GaiTrích ly ở các khoảng thời gian

75 phút 90 phút 105 phút

Dịch chiết

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 10/1.

Kết thúc quá trình trích ly, xác định chỉ tiêu:

- Thí nghiệm được tiến hành như sau:

Củ gai sau khi được xử lý, cắt thành miếng nhỏ đem cân 100g đem trích ly ở các nhiệt độ khác nhau như sau:

Công thức Nhiệt độ trích ly (ºC) flavonoid (mg/100g) Hàm lượng

- Để đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu suất trích

ly, ta tiến hành thí nghiệm với các công thức sau:

Cân 100g củ GaiTrích ly ở các tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

10/1 15/1 20/1

Dịch chiết

Các điều kiện trích ly:

Phân tích

 Nồng độ ethanol đã được tối ưu ở thí nghiệm 2

 Thời gian trích ly đã được tối ưu ở thí nghiệm 3

 Nhiệt độ trích ly là 70ºC

Kết thúc quá trình trích ly, xác định chỉ tiêu: Hàm lượng flavonoid

Dựa vào kết quả phân tích chỉ tiêu, lựa chọn được nồng độ dung môi tốt nhất.Kết quả của thí nghiệm 4 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu ảnh hưởng rất lớn đến khả năng trích ly các hợpchất hòa tan trong củ Gai Nếu chọn tỷ lệ này phù hợp thì sẽ chiết tách được tối đacác chất và hiệu quả trích ly cao

Trích ly ở cùng các điều kiện:

 Nồng độ ethanol trích ly đã được tối ưu ở thí nghiệm 2

 Thời gian trích ly đã được tối ưu ở thí nghiệm 3.

 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đã được tối ưu ở thí nghiệm 4

Kết thúc quá trình trích ly, xác định chỉ tiêu: Hàm lượng flavonoid

Dựa vào kết quả phân tích chỉ tiêu, lưa chọn được nhiệt độ trích ly tốt nhất.Kết quả của thí nghiệm 5 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo Flavonoidđược chiết từ cây gai xanh bằng dung môi ethanol 60; 70; 80% Nhiệt độ chiết là

65, 70, 75°C trong các khoảng thời gian 75, 90, 105 phút với tỷ lệ dung môi:Nguyên liệu lần lượt là 10:1; 15:1; 20:1 (v/w) Sau khi tiến hành khảo sát các đơnnhân tố, chúng tôi lựa chọn 03 yếu tố là các yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hàmlượng flavonoid tổng số trong cao củ gai để đánh giá khả năng ảnh hưởng củachúng, chúng tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm củaBox - Behnken với ba yếu tố, ba cấp độ [3]

Bảng 2.1 Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu Biến độc lập Ký tự mã hóa -1 Các cấp độ của biến0 1

Nhiệt độ chiết suất (ºC) A a1 a2 a3

Thời gian chiết tách (phút) C c1 c2 c3

Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố và hàm lượng hoạt

chất sinh học của cao củ gai

Biến phụ thuộc: Y (Hàm lượng hoạt chất sinh học trong dịch chiết)

Dựa vào kết quả thí nghiệm, lựa chọn được điều kiện tối ưu sao cho cao cóhàm lượng hoạt chất sinh học Flavonoid là cao nhất

2.3.3 Phương pháp thử khả năng kháng khuẩn

Khảo sát khả năng kháng một số loại vi khuẩn gây bệnh ở người như

Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis của dịch chiết từ lá Gai.

Chuẩn bị môi trường: Cân 38g môi trường (MPA) pha với 1000ml nước cất, đun sôi cho tan hết Agar, chia ra thành các bình tam giác 250ml, hấp khử trùng ở121ºC trong 15 phút Để thạch nguội xuống khoảng 40 - 45ºC, đổ 25ml môi trườngvào đĩa, dùng que cấy trang trải đều vi khuẩn lên bề mặt thạch Khi bề mặt thạchkhô thì sử dụng khoanh giấy thấm, đường kính khoảng 6mm Chuẩn bị các đĩa môitrường và đánh số thứ tự trên mỗi đĩa Chuẩn bị các ống vi khuẩn đã tiệt trùng Tiếnhành pha loãng vi khuẩn đạt nồng độ 106 tế bào/ml

Dùng tăm bông cấy các vi khuẩn từ ống dịch khuẩn pha loãng vào các đĩa môitrường đã đánh dấu Sau đó dùng micropipette hút 50 l dịch chiết lá gai lên giấythấm, trong đó có một giấy thấm chứa mẫu đối chứng là nước Nuôi vi khuẩn ở

37 C trong 12 – 24 giờ và quan sát vòng kháng khuẩn [4]

Tính kết quả:

Đo vòng kháng khuẩn và tính toán khả năng kháng khuẩn của dịch chiết

Giá trị trung bình đường kính vòng kháng khuẩn = D - d

- d: đường kính khoanh giấy

2.3.4 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc và cao củ gai

2.3.4.1 Nghiên cứu, xây dựng quy trình công nghệ sản xuất trà túi lọc từ lá Gai

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy nguyên liệu

Nhiệt độ sấy ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và nhiệt độ ảnh hưởng đến tỉ

lệ chất tan chiết được Do đó ta cần xác định nhiệt độ sấy lá gai tốt nhất để vừa giảm

thời gian từ đó giảm chi phí, vừa đáp ứng yêu cầu tạo sản phẩm có chất lượng tốt Dựa vào điều kiện thiết bị sấy và nguyên liệu ban đầu: Nhiệt độ sấy thử nghiệm 50,

0 Màu nâu đen hay màu lạ, có vị hoặc vị cháy khét, mùi lạ, khó chịuhoặc có mùi cháy khét.

1 Màu nâu hoặc vàng nhạt, ngọt gắt hoặc rất nhạt, mùi lạ hơi khó chịu,mùi hơi cháy khét.

2 Màu vàng rơm rất nhạy hay rất đậm, vị ngọt hơi gắt hoặc hơi nhạt, hậuvị nhẹ hoặc gắt, mùi lá còn tươi, mùi hơi gắt.

3 Màu vàng, vị hơi ngọt, hậu vị nhẹ hoặc hơi gắt, mùi thơm lá gaithoảng nhẹ.

4 Màu vàng rơm đặc trưng, vị ngọt vừa, vị hơi chát, hậu vị tốt, thơm mùilá gai nhẹ.

5 Màu vàng rơm đặc trưng, vị ngọt, vị hài hòa, hậu vị tốt, thơm mùi lágai đặc trưng.Tiến hành cho điểm các công thức bằng phương pháp đánh giá cảm quan

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến sản phẩm sau khi nghiền

Sau khi xác định được thời gian sấy thích hợp, sử dụng nguyên liệu đã được

xử lý ở thí nghiệm trên đem đi nghiền nhỏ với các kích thước khác nhau, sau đó sửdụng sàng để phân loại Đóng vào túi lọc chuyên dùng 2g/ túi và pha vào nước sôivới khoảng thời gian 5 phút sau đó tiến hành đánh giá cảm quan

Mục đích: Làm giảm kích thước nguyên liệu đến kích thước nhỏ nhất định, tạođiều kiện thuận lợi cho quá trình trích ly đồng thời không ảnh hưởng đến giá trị cảmquan của nước trà sau này (độ đục…) Nguyên liệu rửa sạch, sấy khô, sử dụng máyxay nghiền nhỏ nguyên liệu Chỉ tiêu theo dõi: giá trị cảm quan và tỉ lệ chất tanchiết được tốt nhất.

Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định kích thước nguyên liệu

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu tỉ lệ phối trộn nguyên liệu bổ sung

Mục đích: Thêm thành phần Lạc tiên, Cỏ ngọt, Hoa nhài với tỉ lệ thích hợp làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm

Thực hiện: Phối trộn các nguyên liệu theo các tỉ lệ thích hợp để chọn lấy một công thức tốt nhất giúp tăng giá trị của sản phẩm

Với nguyên liệu chính lá gai, bổ sung thêm Lạc tiên, Cỏ ngọt và hoa nhài

1,4g/0,2g/0,2g/0,2g; 1,5g/0,2g/0,2g/0,1g; 1,6g/0,1g/0,2g/0,1g; 1,6g/0,2g/0,2g/0g là

tương ứng với CT1, CT2, CT3, CT4 thực hiện với 3 lần lặp lại

Lá Gai

Xử lýPhối trộn

Chỉ tiêu đánh giá: Điểm đánh giá màu sắc, mùi, vị và trạng thái của trà

Bảng 2.6 Bảng cho điểm đánh giá cảm quan tỉ lệ phối trộn nguyên liệu bổ sung

Trong sáng, Trong sáng, Đạt tiêu Màu vàng Màumàu vàng nâu màu vàng nâu, chuẩn, kỹ nhạt, không nhạt

Màu sáng đặc đặc trưng sản thuật theo đặc trưng cho hoặc

sắc trưng cho sản phẩm yêu cầu sản phẩm nâu

Mùi

Thơm tự Thơm tự Đạt tiêu Kém thơm, Lộ rõnhiên, hài hòa nhiên,ấn tượng chuẩn yêu có mùi lạ mùi lạhấp dẫn, dễ hài hòa hấp cầu kỹ thuật, hoặc mùi do hoặcchịu đặc dẫn, đặc trưng có mùi thơm khuyết tật, mùi dotrưng Không sản phẩm không đặc khuyết

Trạng cặn lơ lửng dẫn, không có yêu cầu kỹ trưng cho sản nhiều

thái cặn thuật, không phẩm, có cặn cặn lơ

bị đục

Tiến hành cho điểm cảm quan các công thức bằng phương pháp đánh giá cảm quan

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ của nước pha trà và thời gian đến hiệu quả trích ly gói trà

Mục đích: Tìm được nhiệt độ và thời gian pha trà thích hợp cho chất lượngcảm quan tốt nhất

Thực hiện: Thí nghiệm với công thức phối trộn đã tìm được ở thí nghiệm 3 vớinhiệt độ nước gồm 70oC, 80oC, 90oC và 100oC tương ứng với CT1, CT2, CT3, CT4

Nguyên liệu

Trích ly

70ºC 80ºC 90ºC 100ºC

và thực hiện lặp lại 3 lần.

Phân tích đánhgiá cảm quan

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ trích ly trà

Cân 2g nguyên liệu gồm lá gai, lạc tiên, cỏ ngọt và hoa nhài với tỉ lệ nguyên liệu bổ sung như thí nghiệm 3 Tiến hành pha trà ở các nhiệt độ trên

Bảng 2.7 Công thức thí nghiệm khảo sát nhiệt độ nước trích ly trà

Công thức Nhiệt độ nước pha trà (ºC)

Chỉ tiêu đánh giá: Điểm đánh giá cảm quan màu, mùi, vị và trạng thái của trà

Bảng 2.8 Công thức thí nghiệm khảo sát thời gian trích ly gói trà

Công thức Thời gian pha trà (phút)