Đánh giá nguồn gen cây đậu tương cúc bóng tại huyện võ nhai tỉnh thái nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn phân loại định danh cây đậu tương Cúc bóng là hết sức cần thiết cho công tác nghiên cứu bảo tồn và lưu g

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -

NGUYỄN THANH HOÀN

ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN CÂY ĐẬU TƯƠNG CÚC BÓNG

TẠI HUYỆN VÕ NHAI TỈNH THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2019

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -

NGUYỄN THANH HOÀN

ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN CÂY ĐẬU TƯƠNG CÚC BÓNG

TẠI HUYỆN VÕ NHAI TỈNH THÁI NGUYÊN

Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số ngành : 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Dương Văn Cường

2 TS Trần Minh Quân

Thái Nguyên - 2019

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng quy tắc Kết quả trình bày trong luận văn được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng được ai công bố trước đây

Thái Nguyên, tháng 8 năm 2019

Tác giả

Nguyễn Thanh Hoàn

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được thực hiện tại bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen, Viện khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông lâm - Đại học Thái Nguyên Để hoàn thành được luận văn này tôi đã nhận được sự động viên, giúp đỡ tận tình của rất nhiều cá nhân và tập thể

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Dương Văn Cường và TS Trần Minh Quân, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi rất tận tình trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị Ma Thị Trang, Vũ Hoài Nam, Hoàng Huyền Trang cán bộ tại bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen, và chị Vũ Thị Ánh cán bộ phòng phân tích hóa học Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy Trần Văn Phùng - Viện trưởng Viện Khoa học

Sự sống cùng các cán bộ nghiên cứu của viện đã tạo điều kiện cho tôi được thực tập

và hoàn thành đề tài này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, các cán bộ trong Trường ĐH Nông Lâm - ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ, trang

bị kiến thức và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám đốc, lãnh đạo khoa Xét TDCN và các anh chị đồng nghiệp thuộc Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

nghiệm-CĐHA-Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã giúp đỡ động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Xin chân thành cảm ơn!

Trang 5

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về cây đậu tương 3

1.1.1 Phân loại học 3

1.1.2 Sơ lược đặc điểm hình thái phân bố một số loài thuộc chi Glycine 4

1.1.3 Giá trị của cây đậu tương 5

1.2 Tổng quan về phân loại phân tử 6

1.2.1 Giới thiệu về phân loại phân tử 6

1.2.2 Các gen chỉ thị sử dụng trong phân loại phân tử 8

1.2.3 Một số gen chỉ thị trong phân loại thực vật 8

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 10

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 13

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Vật liệu nghiên cứu 17

2.3.1 Mồi phản ứng PCR 17

Trang 6

2.3.2 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Phương pháp phân loại hình thái thực vật và phân tích sinh hóa hạt 18

2.4.2 Phương pháp xác định mối quan hệ di truyền 21

2.4.3 Đăng kí trình tự gen chỉ thị đậu tương nghiên cứu trên ngân hàng gen quốc tế 24

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Kết quả đánh giá đặc điểm hình thái của đậu tương Cúc bóng tại huyện Võ Nhai tỉnh Thái Nguyên 25

3.2 Kết quả xác định mối quan hệ di truyền của đậu tương Cúc bóng 30

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA 30

3.2.2 Kết quả khuếch đại các gen chỉ thị rbcL và ITS2 32

3.2.3 Kết quả phân tích các gen chỉ thị 33

3.3 Đăng ký trình tự gen chỉ thị lên ngân hàng gen quốc tế 41

KẾT LUẬN 42

1 Kết luận 42

2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

Trang 7

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BP: Base pair – Cặp bazơ nitơ

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các mẫu đậu tương nghiên cứu 16

Bảng 2.2 Trình tự mồi phản ứng PCR 17

Bảng 2.3 Danh mục thiết bị được sử dụng 17

Bảng 2.4 Danh mục hóa chất sử dụng 18

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 23

Bảng 3.1 So sánh hình thái đậu tương Cúc bóng 28

Bảng 3.2 Hàm lượng một số chất dinh dưỡng của đậu tương Cúc bóng 29

Bảng 3.3 Thành phần axit amin trong protein của đậu tương Cúc bóng 29

Bảng 3.4 Kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ DNA 31

Bảng 3.5: Hệ số tương đồng trình tự gen rbcL của mẫu đậu tương Cúc bóng với trình tự trên ngân hàng mã vạch DNA 35

Bảng 3.6: Hệ số tương đồng trình tự gen ITS2 của mẫu đậu tương Cúc bóng với trình tự trên ngân hàng mã vạch DNA 39

Trang 9

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Sơ đồ chu trình nhiệt PCR 23

Hình 3.1: Hình thái cây đậu tương Cúc bóng 26

Hình 3.2: Rễ và nốt sần đậu tương Cúc bóng 26

Hình 3.5: Quả đậu tương Cúc bóng 27

Hình 3.6: Hạt đậu tương Cúc bóng 27

Hình 3.7: So sánh kích thước hạt đậu tương Cúc bóng và DT 84 28

Hình 3.8 Kết quả tách chiết DNA tổng số đậu tương 31

Hình 3.9 Kết quả khuếch đại chỉ thị rbcL 32

Hình 3.10 Kết quả khuếchđại chỉ thị ITS2 32

Hình 3.11: Kết quả kiểm tra chất lượng tín hiệu giải trình tự gen rbcL 34

Hình 3.12 Kết quả so sánh trình tự nucleotide chỉ thị rbcL 35

Hình 3.13: Kết quả kiểm tra chất lượng tín hiệu giải trình tự gen ITS2 36

Hình 3.14 Kết quả so sánh trình tự nucleotide chỉ thị ITS2 38

Hình 3.15 Kết quả so sánh trình tự nucleotide chỉ thị ITS2 của mẫu đậu tương Cúc bóng và các loài chi Glycine 39

Hình 3.16: Cây phát sinh chủng loại các loài thuộc chi Glycine xây dựng dựa trên trình tự ITS2 41

Trang 10

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây đậu tương là một loại cây thân thảo thuộc họ đậu (Fabaceae), có hàm lượng dinh dưỡng cao, là cây thực phẩm quan trọng cho người và gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt [1]

Cây đậu tương dễ trồng và thích nghi tương đối rộng ở nhiều vùng khí hậu khác nhau Tại Việt Nam, hình thành 6 vùng sản xuất đậu tương, vùng Đông Nam Bộ, miền núi Bắc Bộ, Đồng bằng sông Hồng, Đồng bằng sông Cửu Long Tổng diện tích 4 vùng này chiếm 66,6% trong tổng diện tích cả nước, còn lại là các vùng Đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên [2] Các giống đậu tương rất đa dạng phong phú cả về kiểu hình và kiểu gen, đây là nguồn nguyên liệu để chọn tạo giống đậu tương mới cho năng suất và chất lượng phù hợp với mục tiêu chọn giống Tuy nhiên, do tập quán canh tác phân tán, chưa có khoanh vùng định hướng phát triển, cùng với sự phát triển của các giống đậu tương mới đang làm mất dần nhiều giống đậu tương bản địa có chất lượng Mặt khác, một giống có thể có nhiều tên gọi khác nhau hoặc cùng một tên gọi nhưng là các giống đậu tương khác nhau, điều này đã tạo ra nhưng khó khăn trong công tác phân loại và bảo tồn các nguồn gen bản địa

Một số nghiên cứu của Trung tâm Tài nguyên thực vật cho thấy phần lớn các giống đậu tương địa phương đều tập trung ở vùng trung du miền núi phía Bắc Một

số giống đậu tương ở vùng này có nhiều đặc tính nông, sinh học tốt, tuy nhiên đang mất dần giống Biện pháp tốt nhất để lưu giữ phát triển nguồn gen quý này là phải làm tốt công tác bảo tồn và phục tráng để phát triển ra sản xuất

Đậu tương Cúc bóng là một giống đặc hữu của tỉnh Thái Nguyên Đã từ lâu Cúc bóng được gieo trồng tại các xã Bình Long, Phương Giao…thuộc huyện Võ Nhai Giống cho chất lượng thơm ngon, tạo nên thương hiệu đậu phụ An Long nổi tiếng trong vùng Nhiều năm gần đây diện tích trồng giống đậu tương này đang bị thu hẹp, thay thế bởi các giống mới cho năng suất cao hơn Đậu tương Cúc bóng Võ Nhai đang phải đối mặt với nguy cơ thoái hóa và mất dần giống Chính vì vậy, việc

Trang 11

phân loại định danh cây đậu tương Cúc bóng là hết sức cần thiết cho công tác nghiên cứu bảo tồn và lưu giữ nguồn gen bản địa

Hiện nay, phương pháp phân loại phân tử DNA barcode (mã vạch DNA), là công cụ hữu hiệu trong việc phân loại định danh loài Bằng cách so sánh các trình

tự nucleotide của chỉ thị mã vạch DNA từ mẫu nghiên cứu với cơ sở dữ liệu trên thế giới, sự khác nhau giữa các trình tự nucleotide trên đoạn DNA này là cơ sở để phân biệt các loài với nhau Phương pháp cho kết quả nhanh, chính xác, bổ sung cho phương pháp phân loại học truyền thống [12]

Xuất phát từ những lí do trên, tôi lựa chọn đề tài “Đánh giá nguồn gen cây

đậu tương Cúc bóng tại huyện Võ Nhai tỉnh Thái Nguyên”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được hình thái giống đậu tương Cúc bóng

- Xác định được mối quan hệ di truyền giống đậu tương Cúc bóng với các giống đậu tương khác trên thế giới và Việt Nam

- Đăng kí được trình tự gen chỉ thị giống đậu tương Cúc bóng lên ngân hàng gen quốc tế

3 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu đậu tương Cúc bóng thu thập tại huyện Võ Nhai tỉnh Thái Nguyên

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Đánh giá được mối quan hệ di truyền của cây đậu tượng trên hai gen chỉ thị

rbcL, ITS2 Kết quả của đề tài góp phần bổ sung vào nguồn dữ liệu gen cây đậu

tương, là cơ sở khoa học để lựa chọn vùng gen chỉ thị hữu ích trong định danh loài bằng phương pháp DNA mã vạch (DNA barcode)

Trang 12

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây đậu tương

- Phân chi: Glycine, Soya

Chi Glycine từng được Carl Linnaeus đưa ra năm 1737 trong ấn bản đầu tiên của quyển Genera Plantarum Từ Glycine có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp - glykys (ngọt) và có thể đề cập đến chất ngọt của củ ăn được sản xuất ở Bắc Mỹ có

dạng cây đậu thân leo, Glycine apios, nay là Apios americana Đậu tương được

trồng được xuất hiện đầu tiên trong quyển Species Plantarum của Linnaeus, với tên

gọi Phaseolus max L Việc kết hợp Glycine max (L.) Merr., theo đề nghị của Merrill

năm 1917, đã trở thành tên gọi chính thức được công nhận của loài này

Chi Glycine được chia thành 2 phân chi Glycine và Soja Phân chi Glycine bao gồm 23 loài hoang dã lâu năm Phân chi Soja bao gồm cây đậu tương được

trồng trọt là loài Glycine max và cây đậu dại thuộc loài Glycine soja sieb và zucc

Cả hai loài đều là các loài cây hàng năm Glycine soja là tổ tiên hoang dại của Glycine max, và chúng mọc hoang ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài

Loan, và Nga Phân chi Glycine bao gồm nhiều loài cây dại lâu năm, ví dụ

như Glycine canescensvà Glycine tomentella, Glycine clandestina, Glycine

falcata [2], [15]

Trang 13

1.1.2 Sơ lược đặc điểm hình thái và phân bố một số loài thuộc chi Glycine

* Glycine falcata

Glycine falcata được Mies và Hmowitz phân loại năm 1973 Loài này có

nguồn gốc từ Úc, thân có thể bò sát mặt đất hoặc thẳng với lông cứng Bản lá hơi rộng hình thuôn Chùm hoa dài, mập với màu sắc trắng tới màu hoa cà nhạt Quả cong hình lưỡi liềm, rộng bản, có nhiều lông cứng, với hạt hình thuôn hoặc ô van

Glycine falcata khác với các loài khác ở tập tính sinh trưởng, sự phân bố của dải

protein ở hạt và không có lớp màng ở vỏ hạt [2]

* Glycine latifolia

Glycine latifolia có nguồn gốc từ Úc, thân khỏe bò sát hoặc đôi khi leo Phiến

lá rộng có răng cưa, chùm hoa dài, mảnh, màu tím, quả ngắn, nhiều lông tơ hoặc cứng, được Newell và Hymowitz phân loại năm 1980 [2]

* Glycine tatrobeana

Glycine tatrobeana được bentham phân loại năm 1864 Loài này phân bố ở

Úc, cây nhỏ thân cứng, bò sát đất hoặc đôi khi leo, phiến lá hình bán cầu Hoa to

hơn Glycine clandestina nhưng quả tương tự [2]

* Glycine canescens

Glycine canescens chỉ phân bố ở Úc, loài thân leo, phiến lá nhỏ dài, gân lá có

gai, thân có lông hơi cứng, màu trắng xám Hoa màu hồng, có mùi thơm, quả thẳng Hạt hình chữ nhật đôi khi bẹt [2]

* Glycine tabacina

Glycine tabacina tìm thấy ở Úc, Trung Quốc, đảo Nam Thái Bình Dương của

New Caladonia, Vanuati, Fifi, Toga và Newe, vùng trung Tây Thái Bình dương, Ruykyu, đảo Mariana

Thân của loài này có thể bò hoặc leo, phiến lá có răng cưa Những lá ở đốt phía trên có hình ô van bản hẹp, những lá ở đốt phía dưới thường rộng bản hơn

Chùm hoa thường dài hơn chùm hoa của Glycine clandestina, màu tím đậm, có mùi

thơm Quả cứng, dài, với hạt màu nâu hoặc đen [2]

* Glycine tomentella

Glycine tomentella phân bố ở Úc, Trung Quốc, Tân Ghine, Philippines và Đài

Loan Thân cỏ bò hoặc leo có nhiều lông tơ Lá thường có hình ô van, có gai nhỏ

Trang 14

Cuống hoa ngắn, hoa thường tập trung nhiều ở phía ngọn hơn các loài khác Hoa màu tím đậm đến tím nhạt Quả thẳng, cứng và có vết lõm giữa các hạt Hạt có màu nâu hoặc đen [2]

* Glycine soja Sieb và Zucc

Glycine soja phân bố ở Trung Quốc, Liên Bang Nga, Triều Tiên, Nhật Bản và

Đài Loan Nó có thể mọc ở ruộng, bờ rào, dọc đường, bờ sông Là cây hàng năm, thân bò hoặc leo, lá chét có lông cứng, màu nâu, với hình ô van dài Hoa có màu tím hoặc đôi khi có màu trắng Cuống hoa mảnh và ngắn Quả ngắn, có nhiều lông cứng, hạt hình ô van dài Những kết quả nghiên cứu về tế bào học, hình thái học,

chứng tỏ rằng Glycine soja là tổ tiên hoang dại của đậu tương trồng [2]

* Glycine max

Glycine max là loài đậu tương trồng hàng năm, không phát hiện thấy ở loài

hoang dại Dựa trên những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công

nhận rằng đậu tương có nguyên sản ở châu Á và được thuần hoá ở Trung Quốc qua nhiều triều đại tiền phong kiến và được đưa vào trồng trọt và khảo sát có thể trong triềuđại Shang (năm 1700-1100 B.C) trước công nguyên [1], [2]

Thân cây thẳng, ít phân cành, dạng bụi, xẻ lá chét lông chim Phiến lá hình ô van hoặc ô van - elip Chùm hoa có cuống ngắn, hoa màu tím hoặc trắng Quả thẳng hoặc cong thường có nhiều lông Mỗi quả thường có 1 tới 3 hạt, hình tròn hoặc cầu

Vỏ hạt có màu biến đổi từ vàng sáng đến nâu, đen, xanh Trọng lượng 100 hạt từ 10-20 g [1]

1.1.3 Giá trị của cây đậu tương

Từ lâu, nhiều loài thuộc chi Glycine đã được con người biết đến sử dụng trong cuộc sống hàng ngày, như làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi hay trong các bài

thuốc dân gian Tuy nhiên, hiện nay loài Glycine max là loài đậu tương được trồng

phổ biến và cho giá trị kinh tế cao nhất

Thành phần dinh dưỡng trong hạt đậu tương Glycine max chứa 18% dầu, 38%

protein, 12-25% lipit, 10-15% gluxit; có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose Chứa các axit amin cơ bản: isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin

Trang 15

Ngoài ra, còn chứa các axit amin không thay thế cần thiết cho cơ thể và là một trong những loài thực vật cung cấp protein hoàn chỉnh có chất lượng tương đương với protein động vật [2], [19]

Hạt của loài này được sử dụng trong nhiều món ăn châu Á bao gồm súp, salad

và được chế biến thành các sản phẩm thực phẩm đa dạng, bao gồm sữa đậu nành, bánh đậu nành lên men (đậu phụ và tempeh), nước tương, tương miso [19] Bột làm

từ đậu tương được sử dụng trong nhiều loại thực phẩm chế biến, như một chất ổn định và tăng hàm lượng protein Dầu chiết xuất từ hạt (dầu đậu nành) được sử dụng rộng rãi trong nấu ăn (margarine, shortening, salad) cũng như trong ngành dược, mỹ phẩm và các sản phẩm phục vụ cho ngành công nghiệp (sơn, mực in, xà phòng, chất khử trùng và linoleum) Dầu đậu tương còn được sử dụng trong sản xuất nhiên liệu sạch như xăng sinh học Ngoài ra, bột đậu tương sau khi chiết xuất dầu được sử dụng để làm xơ, chất kết dính, hoặc làm thức ăn chăn nuôi Đậu tương còn là một loại cây trồng phủ đất, phân xanh [2]

1.2 Tổng quan về phân loại phân tử

1.2.1 Giới thiệu về phân loại phân tử

Phân loại học là ngành khoa học về mô tả và sắp xếp quan hệ phát sinh loài và các quan hệ giữa các loài, chi và họ tuân theo những quy định của các hệ thống phân loại nhân tạo và tự nhiên và những Luật quốc tế về danh pháp

Ðể phân loại sinh vật, phương pháp cổ điển được sử dụng phổ biến nhất là phân loại hình thái, dựa vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan sinh sản và sinh dưỡng, phương pháp này đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ và toàn diện

Ngoài ra còn có các phương pháp khác như: Giải phẫu so sánh, cổ thực vật học, sinh hoá học, phương pháp miễn dịch Hoặc có sự kết hợp giữa các phương pháp để đưa ra kết quả chính xác, các mẫu sẽ được nhận diện bằng các đặc tính hình thái bên ngoài và các đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn Tuy nhiên trong nhiều trường hợp rất khó để nhận biết như mẫu vật chưa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái bên ngoài, hoặc chúng bị dập nát,

hư hỏng các bộ phận, hoặc mẫu vật bị chết, thậm chí là không thể hoặc khó nhận

Trang 16

biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài Trong những trường hợp này phân loại phân tử bằng mã vạch DNA sẽ là phương pháp giúp giải quyết vấn đề trên, vì trình tự DNA dễ dàng thu nhận từ một mẫu mô nhỏ Ngoài ra nó còn được ứng dụng để kiểm tra thành phần thảo dược trong thực phẩm chức năng hay độ tinh khiết của các sản phẩm sinh học Hơn nữa, mã vạch DNA còn đóng góp thêm một ý nghĩa khác ngoài ý nghĩa giúp định danh mẫu vật, nó còn giúp quá trình phân tích tiến hóa sinh học của loài vật đó trong tự nhiên

Khái niệm mã vạch DNA được Paul Heber, nhà nghiên cứu tại đại học Guelph, Ontario đưa ra lần đầu tiên vào năm 2003 [14], nhằm giúp nhận diện các mẫu vật Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn (400 - 800 bp) nằm trong

bộ gen của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau, nó tương tự như máy quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngoài chúng rất giống nhau nhưng thực sự là khác nhau Bài báo nghiên cứu của Hebert được coi là ví dụ đầu tiên về phân loại phân tử động vật,

dùng đoạn DNA ty thể cytochrome oxidase tiểu đơn vị 1 (CO1) Nghiên cứu thành

công này sớm được ứng dụng để xác định loài của các nhóm động vật khác như chim, cá, động vật có vú, động vật lưỡng cư và loài bò sát, mã vạch DNA không chỉ giúp xác định các động vật, thực vật hay các sinh vật sống khác mà nó còn được sử dụng trong kiểm nghiệm thành phần các loại thuốc thảo dược được thương mại hóa trên thị trường, mở ra 1 hướng ứng dụng mới của sinh học phân tử [9] Một mã vạch DNA cần phải đáp ứng được các yêu cầu sau :

1 Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật

2 Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao

3 Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [9]

Xác định loài bằng trình tự đoạn mã vạch DNA gồm năm bước chính Đầu tiên, mẫu được thu gom và xác định bởi các nhà phân loại Sau đó, mẫu được tách chiết thu DNA tổng số, trình tự DNA đích sẽ được khuếch đại bằng phản ứng PCR và giải trình tự để tạo ra mã vạch Sau đó các mã vạch được nhập vào hệ thống ngân hàng dữ liệu Barcode (BOLD) Đây là một hệ thống trực tuyến lưu giữ thông tin mã vạch DNA chứa các thông tin như tên phân loại, hình ảnh của loài, GPS tọa độ nơi mà loài

Trang 17

đó đã được tìm thấy, trình tự mã vạch, và các ứng dụng khác như giám sát môi trường, an toàn thực phẩm và y học Thông tin chuỗi DNA của tất cả các loài đã được nghiên cứu trong nghiên cứu này có thể được truy cập miễn phí cho tất cả mọi người Tính đến năm 2017, BOLD bao gồm hơn 5,9 triệu chuỗi mã vạch DNA từ hơn 542.000 loài [9]

1.2.2 Các gen chỉ thị sử dụng trong phân loại phân tử

Từ các kết quả nghiên cứu DNA barcode trên thế giới cho thấy, có nhiều đoạn gen được sử dụng làm DNA mã vạch, có thể là những đoạn gen nằm ở trong nhân

(nuclear DNA - nDNA), như vùng ITS; Cytb nằm ở ty thể (Mitochondrial DNA - mtDNA), vùng kiểm soát (control region); hay matK, rcbL, atpβ, ndnF, 16S nằm ở lục lạp (Chloroplast DNA - cpDNA) [9], [16] Các gen thuộc cpDNA được chia thành 3 nhóm: Nhóm 1 là các gen mã hóa cho các rRNA (rrn16,

rrn5 ), trnA (trnH, trnK ), RNA polymerase (rpoA, rpoB ), các gen tiểu phần

ribosome (rps2, rps3 ); Nhóm 2 là các gen mã hóa cho những yếu tố thuộc quang hợp như psaA, psaB, psbA, psbB (phytosystem), petA, petB (cytochrome b6f), atpA,

atpB (ATP synthase), rbcL, ndhA, ndhB ; Nhóm 3 gồm các khung đọc mở ORF

(ycfs) và các gen mã hóa protein như matK, cemA

Có rất nhiều gen cpDNA tham gia trong phân tích phân loại thực vật như:

16S, rbcL, atpβ, ndhF, intron trnL và matK Mỗi đoạn mã vạch DNA có những đặc

trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau Ví dụ, các đoạn gen như: 18S, 16S, 5,6S có khả năng phân biệt sinh vật ở mức họ và chi; các

đoạn gen, như: 26S, rbcL, ndnF, atpβ có khả năng phân biệt ở mức chi và loài; các đoạn gen, như: ITS, matK, cytb, 5S spacer có khả năng phân biệt ở mức loài và dưới

loài Tuy nhiên, các nhà khoa học cũng đã khuyến cáo, chưa có đoạn gen nào được

sử dụng làm mã vạch chung cho tất cả các loài sinh vật Vì vậy, việc lựa chọn những đoạn gen đặc trưng để làm mã vạch và việc phối hợp giữa các đoạn mã vạch DNA là rất cần thiết và đem lại hiệu quả cao [20], [24], [26]

1.2.3 Một số gen chỉ thị trong phân loại thực vật

Ở động vật, các gen ti thể như CO1 và Cytb được sử dụng rộng rãi trong các

nghiên cứu phân loại, nhưng khi áp dụng cho các loài thực vật lại biểu hiện tính bảo

Trang 18

thủ cao nên không phù hợp làm DNA mã vạch Hệ thực vật vô cùng phong phú và

đa dạng Chúng bao gồm thực vật có hạt (hạt trần và hạt kín) cùng với rêu, dương xỉ

và các loài có quan hệ gần với dương xỉ,ước tính gần đây đã cho thấy rằng hiện có khoảng 380.000 loài thực vật trên cạn, gồm khoảng 352.000 loài thực vật hạt kín, 1.300 loài thực vật hạt trần, 13.000 loài rêu và dương xỉ.

Bởi mức độ tiến hóa của gen mã hóa CO1 ở thực vật chậm hơn động vật rất nhiều, tốc độ tiến hóa của các gen trên ty thể không nhanh như ở động vật, do vậy không đủ sai khác để phân biệt được các loài Vì vậy, các vùng trong hệ gen lục lạp

đã được dùng trong các nghiên cứu phát sinh loài (như các vùng exon của các gen

rbcL, atpB, ndhF và matK và vùng intron của các gen trnL và trnL-F) Một vùng

trình tự thông thường khác cho nghiên cứu phát sinh loài thực vật trên cạn là

ribosome ITS nhân (vùng đệm của tiểu đơn vị lớn DNA ribosome) Tính đến năm

2009, đã có khoảng 8 locus gen được sử dụng làm mã vạch DNA ở các loài thực vật, bao gồm cả hệ gen nhân và hệ gen lục lạp [7], [18]

Vùng gen mã hóa ribosome: rDNA là hệ thống đa gen mã hóa RNA của ribosome Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã

hóa ITS1, ITS2 Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS

Các đơn vị rDNA được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể, từng đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức

ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau Như vậy, rDNA mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi [4]

nrITS vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những trình tự hữu ích

nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó phổ biến trong tự

nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng ITS2 một trong

những marker phát sinh loài phổ biến nhất cho sinh vật nhân chuẩn, để xác định các

loài thực vật và như một locus bổ sung cho CO1 để xác định các loài động vật Đối với thực vật, độ dài của chuỗi ITS2 từ thực vật hai lá mầm và rêu được phân bố từ

Trang 19

100 đến 700 bp, và độ dài của chuỗi ITS2 từ thực vật một lá mầm, thực vật hạt trần

và dương xỉ được phân bố từ 100 đến 480 bp Độ dài trung bình của chuỗi ITS2 đối

với cây hai lá mầm, một lá mầm, cây hạt trần, dương xỉ và rêu tương ứng là 221,

236, 240, 224 và 260 bp Đối với động vật, độ dài chuỗi ITS2 dao động từ 100 đến

1,209 bp (chủ yếu nằm trong khoảng 195 và 510 bp) [24], [26]

Trình tự gen rbcL: Mã hóa các tiểu đơn vị lớn của rubilose -1,5- bisphosphate cacboxylase/ oxygenase Gen lục lạp rbcL được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật Việc phân tích hơn 10.000 chuỗi rbcL từ GenBank chứng minh rằng gen rbcL có hiệu quả phân biệt giữa các loài thực vật tới

85% Do rbcL dễ dàng khuếch đại PCR ở một số loài thực vật, nên được công nhận

là một trong những trình tự gen có tiềm năng cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực vật Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài thấp hơn, nên sử dụng kết

hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, như ITS2, matK là mã vạch được đề

xuất để xác định cho cây trồng [20], [23]

Trình tự gen matK: Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen

tiến hoá nhanh nhất, có kích thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA

Do matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như

một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật

CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực

vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự với một cặp mồi đơn và đề nghị sử

dụng matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [4], [24]

Sau nhiều lần nghiên cứu mở rộng sàng lọc các vùng gen trong hệ gen thực vật

các vùng gen ITS, Maturase K (matK), trnH-psbA, tiểu đơn vị lớn của bisphosphate carboxylase - rbcL đã trở thành mã vạch tiêu chuẩn được lựa chọn

ribulose-nhiều nhất ứng dụng trong phân loại thực vật [16], [24]

1.3 Tình hình nghiên cứu DNA barcode trong và ngoài nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, có rất nhiều đề tài sử dụng phương pháp DNA barcode để phân loại và giám định loài Phương pháp cho kết quả nhanh chính xác tên loài, xác định

Trang 20

mối quan hệ di truyền giữa các loài, góp phần trong công tác bảo tồn, lưu giữ những nguồn gen

Năm 2009, Daniel H Janzen và nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Pennsylvania, Philadelphia công bố kết quả nghiên cứu “Mã vạch DNA cho thực vật”, với mục đích xác định mã vạch DNA tiêu chuẩn cho từng loài thực vật trên cạn Nhóm tác giả nghiên cứu trên 907 đối tượngthuộc 445 loài thực vật hạt kín, 38 loài thực vật hạt trần và 67 loài chưa được phân loại Bảy vùng gen được lựa chọn : gen

atpF-atpH, matK, rbcL, rpoB, rpoC1, psbK-psbI và trnH-psbA Kết quả thu được,

trong số 397 mẫu được giải trình tự thành công trên 7 chỉ thị, sự phân biệt loài đối với

từng chỉ thị riêng lẻ dao động từ 43% (rpoC1 ) đến 68% - 69 % ( psbK, psbI và trnH,

psbA ), với rbcL và matKlà61% Nhóm nghiên cứu đã đưa ra khuyến nghị nên kết hợp

hai gen chỉ thị rbcL và matK sẽ cho kết quả phân biệt loài cao [13]

Năm 2012, Kuzmina M.L và cộng sự sử dụng phương pháp mã vạch DNA để phân loại 900 mẫu vật đại diện cho 312 trong số 354 loài thực vật có mạch ở Bắc Cực gần thị trấn Churchill, Manitoba Nhiều loài thực vật ở đây có khả năng mất đa dạng

di truyền do khả năng phân tán hạn chế do đó giảm phạm vi phân bố, và đặc biệt chịu tác động lớn bởi biến đổi khí hậu Phương pháp này được nhóm tác giả đánh giá

là rất hữu ích, xác định nhanh, chính xác Kết quả nghiên cứu thu được: vùng gen rbcL

cho chất lượng kết quả giải trình tự đạt cao nhất là 95% với mẫu vật tươi và 85% đối

với mẫu khô (Herbarium) Vùng gen ITS2 cho hiệu quả như nhau đối với mẫu tươi và khô (89% và 88%) Thành công giải trình tự thấp nhất là vùng gen matK (76% mẫu tươi, 45% mẫu khô) Việc phân loại loài dựa trên kết hợp thông tin hai vùng gen rbcL

và matK phân biệt được 54% của 286 loài, trong khi rbcL và ITS2 phân biệt 63% của

285 loài Mức phân loại loài cao nhất (69%) khi kết hợp thông tin trình tự từ cả ba

vùng gen Chỉ thị ITS2 cho kết quả cao trong phân loại các loài có mối quan hệ gần

gũi nhau như cây họ cải (Brassicaceae), họ hoa hồng (Rosaceae), họ hòa thảo (Poaceae), họ cói (Cyperaceae), tuy nhiên ở một số trường hợp lại cho hiệu quả phân loại thấp như ở họ Phong lan (Orchidaceae) [22]

Năm 2012, Madesis và cộng sự đã sử dụng phương pháp DNA barcode để phân loại các loài cây họ đậu thuộc vùng Địa Trung Hải, đây là vùng được đánh giá

Trang 21

là rất quan trong việc nghiên cứu về nguồn gốc của cây họ đậu, và nó cũng là một nguồn thực phẩm chính nuôi sống người dân trong vùng Nhóm nghiên cứu đã đánh

giá mức hiệu quả việc sử dụng hai vùng lục lạp, trnL và rpoC1, và một vùng gen nhân ITS2 trong việc tạo mã vạch barcode cho cây họ đậu.Hai mươi lăm loài cây họ

đậu đã được nghiên cứu DNA được chiết xuất với bộ kit mini của Qiagen Dneasy, khuếch đại PCR được thực hiện bằng DNA polymerase Kapa Taq và các đoạn mồi

khuếch đại các vùng trnL và rpoC1 của lục lạp hay vùng gen nhân ITS2 Nhóm nghiên cứu đưa ra kết luận: vùng gen trnL và ITS2 cho kết quả phân biệt thành công được giữa các loài là 100%, hơn nữa, việc sử dụng vùng trnL cho phép phân biệt được các loài rất gần gũi, như Phaseolus lunatus và P coccineus hoặc Vicia faba

subsp Major với V faba subsp,trong khi vùng rpoC1 chỉ xác định được 72% trong

số chúng [21]

Việc ứng dụng mã vạchDNA trong phân loại học ngày càng được sử dụng rộng rãi Phương pháp góp phần rút ngắn thời gian trong công tác phân loại cũng như định danh loài mới của sinh vật,không chỉ dừng lại ở đó mã vạch DNA còn giúp phân tích

sự đa hình di truyền giữa các loài có cùng nguồn gốc Ngoài ra, phương pháp đang được sử dụng trong lĩnh vực kiểm nghiệm thành phần các loại thuốc thảo dược trong điều trị bệnh,khi thực trạng hiện nay vì nhiều lý do như lợi nhuận, khan hiếm, nhiềuloại dược liệu có thể bị pha trộn hoặc thay thế bằng các loại tương tự nhưng hoạt chất thấp hơn hoặc không có, hay thành phần không đúng như trong thông tin công bố, làm giảm hiệu quả của quá trình điều trị

Cây thuốc Hoàng Cầm (với danh pháp quốc tế là Scutellaria baicalensis

GEORGI) đây là một trong 50 loài thảo dược cơ bản của y học cổ truyền nổi tiếng

Trung Quốc, thường sử dụng trong các bài thuốc chữa viêm gan, vàng da, tăng lipit máu, chống huyết khối Do sự khai thác quá mức đã gây ra sự suy giảm các nguồn tự

nhiên, rễ khô của các loài tương tự như S amoena, S Rehderiana và S viscidula, đã

được sử dụng để pha trộn và thay thế Việc làmnày có thể gây ra một loạt các tác dụng điều trị không mong muốn và khókiểm soát chất lượng trong ngành công nghiệp dược thảo Do đó, Xiaorong và cộng sự đã giải trình tự và phân tích ba chỉ thị mã vạch DNA,

gen RNA maturase của ribosome (matK), gen tiểu đơn vị lớn ribulose-1,4-bisphosphate

Trang 22

carboxylase (rbcL) và gen psbA-trnH phân biệt loại dược liệu này và các loài cây thay

thế chúng Các vùng gen chỉ thị được khuếch đại từ các mẫu lá thu thập từ các tỉnh có nguồn dược liệu lớn của Trung Quốc Dựa trên phân tích kết quả giải trình tự cho thấy,

vùng gen rbcL của loài Scutellaria baicalensis tương đồng cao với các loài S amoena, S

rehderiana và S viscidula, có thể kết luận chúng cùng họ và chi, và vùng gen rbcL có tính

bảo thủ cao, không biệt được đến cấp độ loài Trong khi đó, gen matK hoặc psbA-trnH có

thể phân biệt chính xác đến cấp độ loài, sai khác giữa các loài từ 1,46 đến 6,16%.Nhóm

nghiên cứu đề xuất sử dụng kết hợp 2 vùng genrbcL vàpsbA-trnH để xác định loài cho cây thuốc Hoàng Cầm (S Baicalensis) và các cây thay thế cùng một chi [25]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, có nhiều đề tài nghiên cứu sử dụng kỹ thuật DNA Barcode để phân loại định danh loài như:

Nguyễn Thị Thanh Nga (2012), bằng kỹ thuật mã vạch DNA đã đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis

sp) Tác giả đã nghiên cứu khuếch đại vùng gen ITS và matK, và phân tích đa hình trên mỗi vùng gen Kết quả thu được vùng gen ITS kích thước từ 638-650 bp xuất

hiện 113 điểm đa hình, chiếm 17,4% trên toàn bộ trình tự vùng gen, có độ đa hình

cao hơn so với gen matK kích thước 871 bp với 61 điểm đa hình xuất hiện, chiếm 7% trên toàn bộ trình tự Với sự tương đồng 100% trong trình tự, vùng gen ITS là rất bảo thủ ở loài C javanica và C tangshen, rất có ý nghĩa trong kiểm định dược liệu Sau

khi phân tích trình tự DNA và cây phát sinh chủng loại tác giả đưa ra kết luận vùng

gen matK có khả năng phân biệt tốt hơn vùng gen ITS, vùng gen matK có thể được sử

dụng để phân biệt các dưới loài của chi Codonopsis [7]

Phan Kế Long cùng công sự (2014), trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide

vùng matK và ITS-rDNA đã nghiên cứu mối quan hệ di truyền của các mẫu sâm thu ở

Lai Châu giữa một số loài trong chi Panax ở Việt Nam Đã giải mã được 1485

nucleotide vùng gen matK và 588 nucleotide vùng gen ITS-rDNA cho tổng số 17 cá

thể của 2 loại Sâm ở Lai Châu bao gồm sâm Lai Châu và Tam thất trắng và đăng ký

các trình tự này trên GenBank Kết quả phân tích trình tự nucleotide vùng gen matK

và ITS-rDNA chỉ ra các loài Sâm trong chi Panax có cùng nguồn gốc tiến hóa Hai

Trang 23

thứ sâm Lai Châu và sâm Ngọc Linh của loài sâm Việt (P vietnamensis Ha &

Grushv.) có quan hệ chị em Sâm Lai Châu có chiều dài vùng matK là 1485

nucleotide và khác với sâm Ngọc Linh 02 nucleotide Chiều dài vùng ITS-rDNA của

sâm Lai Châu 588 nucleotide và khác với sâm Ngọc Linh ( từ 4 nucleotide đến 5 nucleotide) [6]

Bùi Văn Thắng, cùng cộng sự (2014), “Giám định một số loài nưa tại Thanh

Hóa bằng các dẫn liệu hình thái và phân tử” Nhóm tác giả đã sử dụng đoạn gen matK

và trnL phân tích 16 mẫu nưa Thanh Hóa, đối chiếu với Genbank Kết quả cho thấy

13 mẫu (từ 1-13) là loài nưa Chuông, có chiều dài trình tự đoạn gen matK là 905 nucleotide giống tới 100%, đoạn gen trnL là 552 nucleotide giống tới 99%, có một

nucleotide sai khác ở vị trí 415 (có thêm 1A) Mẫu 14, 15, 16 là loài nưa Krausei, có

chiều đoạn gen matK là 951 nucleotide giống tới 100%, đoạn gen trnL là 444

nucleotide giống tới 99% có một nucleotide sai khác ở vị trí 318 (có thêm 1A), loài nưa Krausei có phân bố hẹp, chỉ thấy xuất hiện ở xã Trí Nang của huyện Lang Chánh; trong khi đó loài nưa Chuông tìm thấy phổ biến ở các huyện còn lại của tỉnh

Kết quả cũng cho thấy việc sử dụng mã vạch DNA của 2 đoạn gen matK và trnL

trong việc giám định các mẫu nưa ở Thanh Hóa là hiệu quả và là cơ sở khoa học phục

vụ cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen cây nưa có giá trị cho tỉnh [8]

Hà Văn Huân, Phạm Minh Toại (2016) đã tiến hành thu mẫu, giám định và làm

tiêu bản cho loài Bách xanh (Calocedrus macrolepis kurz) Tách chiết DNA tổng số và nhân bản thành công các đoạn DNA mã vạch (matK, rbcL, trnH-psbA, ITS2, ITS) từ

DNA tổng số của loài Bách xanh bằng kỹ thuật PCR Sản phẩm PCR sau tinh sạch được xác định trình tự nucleotide Kết quả xác định và phân tích trình tự

nucleotide của các đoạn ADN được nhân bản, đã chỉ ra như sau: đoạn matK có chiều dài 887 nucleotide, đoạn rbcL có chiều dài 599 nucleotide, đoạn trnH-psbA

là 576 nucleotide, đoạn ITS2 là 379 nucleotide và đoạn ITS có chiều dài 971

nucleotide Khi so sánh trình tự nucleotide của các đoạn trên với các trình tự nucleotide

tương ứng trên ngân hàng gen quốc tế, đoạn gien matK và rbcL có độ tương đồng 100%, đoạn ITS2 tương đồng 99,37%, đoạn ITS tương đồng 99,16% và đoạn trnH-psbA tương đồng cao nhất 99,01% so với loài Calocedrus formosana (mã số AB831010) Tác giả

Trang 24

đưa ra kết luận các đoạn trnH -psbA, ITS và ITS2 có thể sử dụng làm đoạn DNA mã vạch cho loài Bách xanh, trong đó trnH-psbA có khả năng phân biệt tốt nhất [5]

Tuy nhiên, hiện chưa tìm thấy đề tài nào trên các trang tạp chí khoa học tại Việt Nam sử dụng phương pháp DNA Barcode trên đối tượng đậu tương, chỉ tìm thấy duy nhất một đề tài “Nghiên cứu nhận dạng phân tử một số nguồn gen đậu tương bằng chỉ thị SSR” với phương pháp lập tiêu bản DNA (DNA fingerprinting) với 19 mẫu đậu tương Việt Nam được lưu giữ tại Ngân hàng gen cây trồng quốc gia – Trung tâm Tài nguyên thực vật

Với tình hình nghiên cứu như trên cho thấy cần phải có nhiều đề tài nghiên cứu

về nguồn gen các loài cây bản địa tại Việt Nam

Trang 25

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Ðối tượng nghiên cứu: 12 mẫu đậu tương Cúc bóng thu thập từ huyện Võ Nhai tỉnh Thái Nguyên

- Quá trình nghiên cứu được thực hiện tại bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen Viện Khoa học Sự sống – Trường Ðại học Nông Lâm - Ðại học Thái Nguyên

Bảng 2.1 Các mẫu đậu tương nghiên cứu

2.2 Nội dung nghiên cứu

1 Đánh giá đặc điểm hình thái của đậu tương Cúc bóng tại huyện Võ Nhai tỉnh Thái Nguyên

2 Xác định mối quan hệ di truyền của đậu tương Cúc bóng

3 Đăng kí trình tự gen chỉ thị

Trang 26

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Mồi phản ứng PCR

Mồi thực hiện phản ứng khuếch đại đoạn gen rbcL và ITS2 được thiết kế dựa

trên nghiên cứu của tác giả Shilin Chen, Levin Kress & Erickson [18] Thông tin của các cặp mồi được liệt kê trong bảng sau:

ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT AAA GC

700 bp

(R*: A hoặc G)

2.3.2 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.3.2 1 Thiết bị

Bảng 2.3 Danh mục thiết bị được sử dụng

STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ

13 Tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu – 425 – 400E – Nuaire – USA

14 Tủ lạnh -200C, -800C Super freezer Eco 130 – Ficchetti – Italy

Trang 27

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp phân loại hình thái thực vật và phân tích sinh hóa hạt

2.4.1.1 Phương pháp phân loại hình thái thực vật

Các giống đậu tương Cúc bóng được thu thập tại các xã Bình Long, Phương Dân Tiến, Phương Giao huyện Võ Nhai, được trồng khảo nghiệm ở cùng một điều kiện canh tác Phương pháp thực hiện theo QCVN 01-58:2011/BNNPTNT “Về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng giống đậu tương” Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: Thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, số lượng hoa, quả, hạt trên cây, trọng lượng hạt

Trang 28

Mô tả hình thái cây đậu tương dựa trên phương pháp của Ngô Thế Dân[1], và Trần Văn Điền [2], các bộ phận mô tả bao gồm: thân, lá, rễ, hoa, quả và hạt

2.4.1.2 Phương pháp phân phân tích sinh hóa hạt

Phân tích các chỉ tiêu sinh hóa hạt đậu tương được thực hiện tại phòng Phân tích hóa học – Viện Khoa học Sự sống – Đại học thái Nguyên

* Xác định hàm lượng Protein

Phương pháp xác định: Theo TCVN 4328-1:2007

Mẫu thử nghiệm được vô cơ hóa bằng H2SO4 98% kết hợp với chất xúc tác để chuyển Nitơ hữu cơ ra dạng vô cơ (NH4)2SO4, rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối Amoni, NH3 sau khi được giải phóng ra sẽ được cuốn đi bằng dòng hơi nước nóng Sau khi được làm nguội sẽ được hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có mầu xanh trong

(NH4)2SO4 + 2NaOH = NH3 + Na2SO4 + H2O

NH3 + H3BO3 = (NH4)3BO3

Để xác định được lượng amoniac (NH3) giải phóng ra trong quá trình chưng cất được đem đi chuẩn độ bằng dung dich H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch chuyển sang mầu tím nhạt

* Hàm lượng lipit

Phương pháp xác định: Theo TCVN 4331:2001

Định dạng
Số trang	56
Dung lượng	2,19 MB