Nghiên cứu tăng cường tích lũy một số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây bá bệnh (eurycoma longifolia jack) nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- TRẦN THU TRANG NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ ALKALOID CÓ HOẠT TÍNH SINH H

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

TRẦN THU TRANG

NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ ALKALOID CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ SINH KHỐI

RỄ TƠ CÂY BÁ BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA

JACK) NUÔI CẤY TRÊN HỆ THỐNG BIOREACTOR 20

LÍT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội-2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Trần Thu Trang

NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ ALKALOID CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ SINH KHỐI

RỄ TƠ CÂY BÁ BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA

JACK) NUÔI CẤY TRÊN HỆ THỐNG BIOREACTOR 20

LÍT

Chuyên ngành: Hoá sinh học

Mã sỗ: 9 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Chu Nhật Huy

2 PGS.TS Phạm Bích Ngọc

Hà Nội, 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan

Luận án “Nghiên cứu tăng cường tích luỹ một số alkaloid có hoạt tính sinh

học từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy trên hệ

thống bioreactor 20 lít” là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được tác giả công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Tôi xin chịu trách nhiệm về tính chính xác và trung thực của luận án

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả

NCS Trần Thu Trang

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS Chu Hoàng Hà đã gợi ý, chỉ dẫn, giúp đỡ tôi trong những năm học vừa qua

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật, Phòng Công nghệ Lên men, Phòng Thử nghiệm sinh học, Phòng Dược liệu biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cơ sở đào tạo, Khoa Công nghệ sinh Học viện khoa học và công nghệ,Viện Công nghệ sinh học đã hướng dẫn và giúp

học-đỡ tôi trong suốt thời gian học tập này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cảm ơn GS T.Kishimoto, trường Đại học Osaka, Nhật Bản đã giúp đỡ tôi thực hiện một phần công trình nghiên cứu của luận án này

Đặc biêt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới các thành viên trong đại gia đình thân yêu của tôi Nhờ những động viên, khích lệ, đồng hành và chia sẻ khó khăn của những người thân trong gia đình mà tôi luôn có sự quyết tâm và nghị lực cao trong quá trình nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả

NCS Trần Thu Trang

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu chung về cây Bá bệnh 5

1.1.1 Đặc điểm sinh học và phân bố 5

1.1.2 Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học các alkaloid của cây Bá bệnh 6

1.1.3 Tác dụng dược lý của cây Bá bệnh 9

1.2 Ứng dụng của cây Bá bệnh trong Y học cổ truyền 13

1.3 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 14

1.3.1 Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối rễ tơ 14

1.3.2 Nuôi cấy rễ tơ trên quy mô Bioreactor để thu nhận hợp chất thứ cấp 18

1.3.3 Ảnh hưởng của elicitor đến tích luỹ các HCTC trong quá trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh 20

1.3.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về nuôi cấy sinh khối rễ tơ thu nhận các HCTC 23

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Vật liệu nghiên cứu 27

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.2 Thiết bị và hoá chất nghiên cứu 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng 30

2.2.2 Thực nghiệm chiết cao alkaloid và tách chất sạch 31

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học 33

2.2.4 Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các alkaloid phân lập được từ rễ tơ cây Bá

bệnh 33 2.2.5 Thực nghiệm và phương pháp định lượng các alkaloid thông qua phương

pháp HPLC-DAD 36 2.2.6 Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và tích luỹ các

alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh trên bình tam giác 500 ml 37 2.2.7 Xây dựng quy trình nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên hệ

thống Bioreactor 20 lít 41

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 42 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Xác định cấu trúc hoá học của các chất phân lập được từ cao chiết

alkaloid 43 3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của các chất phân lập được từ cao

chiết alkaloid cảu rễ tơ cây Bá bệnh 47

3.2.1 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chất thử (1), (2), (3)

47 3.2.2 Thử khả năng ức chế sự sản xuất của IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực

bào chuột và người kích thích bởi LPS của chất (1), (2), (3) 49 3.3 Xây dựng đường chuẩn định lượng các alkaloid trong các mẫu Bá bệnh

bằng phương pháp HPLC-DAD 54 3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và tích luỹ các chất (1), (2),

(3) của rễ tơ trên bình tam giác 500 ml 57 3.4.1 Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây

Bá bệnh 57 3.4.2 Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ Bá bệnh

58 3.4.3 Ảnh hưởng chiều dài rễ ban đầu đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây

Bá bệnh 59 3.4.4 Ảnh hưởng khối lượng rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển của rễ

tơ câyBá bệnh 61

3.4.5 Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng sinh trưởng và tích luỹ hợp

chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong

quá trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh 62

3.4.6 Ảnh hưởng của jasmonic acid (JA) lên sự tăng sinh và tích luỹ chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong quá trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh 69

3.4.7 Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sự tăng sinh và tích luỹ chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong quá trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh 72

3.4.8 Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men (YE) lên sự tăng sinh và tích luỹ chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong quá trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh 76

3.5 Xây dựng quy trình nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ Bá bệnh trên hệ thống bioreactor 20 lít 82

3.5.1 Thiết lập hệ thống nuôi cấy 82

3.5.2 Đánh giá sự tích luỹ các alkaloid (1), (2), (3) trong quá trình nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống bioreactor 20 lít so với rễ tự nhiên 87

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 90

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 92

TÀI LIỆU THAM KHẢO 93

MỤC LỤC 103

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

13C-NMR : Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon)

1H-1H-COSY : 1H-1H Correlated Spectroscopy (Phổ tương tác proton-proton)

1H-NMR : Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 7-MCPA : 7-methoxy-(9H-b-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid

ATCC Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ

CĐHST : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Chất (1) : 7-MCPA

Chất (2) : 9-methoxycanthin-6-one

Chất (3) : 9-hydroxycanthin-6-one

DEPT : Distortionless Enhancement By polarization Transfer (Phổ

DEPT) ĐK-Bb : Xây dựng phương pháp phân tích mẫu Bá bệnh bằng HPLC DMSO : Dimethyl sulfoxyde

dq : Dublet của quartet

dt : Dublet của triplet

HepG2 : Dòng tế bào ung thư gan

HPLC : High performance liquid chromatography

(sắc ký lỏng hiệu năng cao) HSQC : Heteronuclear Spectroscopy Quantum Coherence

KLK : Khối lượng khô

LPS : Escherichia coli 055:B5

LPS : Lipopolysaccharide

LU-1 : Dòng tế bào ung thư phổi

MCF-7 : Dòng tế bào ung thư vú

MS : Môi trường Murashige và Skoog – 1962

MS : Murashige & Skoog, 1962

MTT : (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium

bromide) NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

PBS : Huyết thanh bò (fetal bovine serum)

Rễ TN : Rễ tự nhiên

SH : Môi trường Schenk và Hildebrandt - 1972

SH : Schenk and Hidebrandt, 1972

TCA : Acid tricloacetic

TLC : Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng)

Trypsin EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

WPM : Môi trường McCown’s Woody Plant - 1981

WPM : McCown’s Woody Plant, 1981

YE : Yeast extract (dịch chiết nấm men)

δ (ppm) : Độ chuyển dịch hóa học tính bằng ppm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các thành phần hoá học được phân lập từ cây Bá bệnh và tác

dụng dược lý của chúng 10

Bảng 1.2 Sản xuất hợp chất thứ cấp bằng kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ từ một

số loài cây thuốc 25

Bảng 3.1 Kết quả thử hoạt tính độc tế bào ung thư của các chất thử (1),

Bảng 3.6 Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của JA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid

của rễ tơ cây Bá bệnh 70

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của SA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid

của rễ tơ cây Bá bệnh 73

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của YE lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid

của rễ tơ cây Bá bệnh 76

Bảng 3.15 Hiệu quả tác động của các elicitor lên tích luỹ các alkaloid 80

Bảng 3.16 Kết quả sau 30 ngày nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống bioreactor tự

tạo 20 lít 86 Bảng 3.17 Hàm lượng alkaloid có trong rễ tơ và rễ tự nhiên 87

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái cây Bá bệnh 5

Hình 1.2 Minh hoạ một số sản phẩm được sản xuất từ cây Bá bênh 14

Hình 1.3 Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu 18

Hình 1.4 Cơ chế tác động lên tế bào của elicitor 21

Hình 1.5 Sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh 90 g 28

Hình 2.1 Rễ tơ nuôi cấy trên môi trường WPM 27

Hình 2.2 Rễ tơ cây Bá bệnh nuôi cấy trên môi trường WPM 27

Hình 2.3 Quy trình chiết cao alkaloid từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh 31

Hình 2.4 Sơ đồ phân lập các chất từ cao chiết alkaloid 32

Hình 2.5 Mô phỏng các bộ phận của hệ thống bioreactor 20 lít sủi bọt dạng cầu tự tạo

42 Hình 3.1 Sắc ký cột và sắc ký bản mỏng một số phân đoạn cao chiết alkaloid

43 Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng của chất (1), (2), (3) phân lập được từ cao chiết methanol của rễ tơ cây Bá bệnh

47 Hình 3.4 Ảnh hưởng của chất 7-MCPA trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 49 Hình 3.5 Ảnh hưởng của chất 9-methoxycanthin-6-one trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7

49 Hình 3.5 Kết quả ảnh hưởng của chất (1), (2), (3) lên sự sống của tế bào đại thực bào chuột và người 50

Hình 3.6 Chất 7-MCPA ức chế sản xuất IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực vào chuột và người được kích hoạt bởi LPS 52

Hình 3.7 Chất 9-methoxycanthin-6-one ức chế sản xuất IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực vào chuột và người được kích hoạt bởi LPS 52 Hình 3.8 Chất 9-hydroxycanthin-6-one ức chế sản xuất IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực bào chuột và người được kích hoạt bởi LPS 53 Hình 3.9 Sắc ký đồ của các chất chuẩn (1), (2), (3), 54

Hình 3.10 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ chất chuẩn 56

Hình 3.11 Sự phát triển của rễ tơ trên môi trường lỏng và thạch 57

Hình 3.12 Sự phát triển của rễ tơ ở điều kiện tối và sáng 59

Hình 3.13 Quá trình mọc đầu sinh trưởng của các đoạn rễ tơ được cắt với kích thước khác nhau 60

Hình 3.14 Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ 60

Hình 3.15 Sự phát triển của rễ tơ trên 100 ml môi trường với lượng rễ ban đầu khác nhau 62

Hình 3.16 Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ 64

Hình 3.17 Sắc ký HPLC của rễ tơ được nuôi cấy trên môi trường WP 68

Hình 3.18 Ảnh hưởng của JA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ Bá bệnh 71

Hình 3.19 Sắc ký HPLC thể hiện hàm lượng alkaloid trong có trong rễ tơ nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 8 mg/l JA 72

Hình 3.20 Ảnh hưởng của SA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ Bá bệnh 75

Hình 3.21 Sắc ký HPLC thể hiện hàm lượng các alkaloid có trong rễ tơ nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 5 mg/l SA 75

Hình 3.22 Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh 77

Hình 3.23 Sắc ký HPLC thể hiện hàm lượng alkaloid của mẫu rễ tơ nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 40 mg/l YE 79

Hình 3.24 Nguồn mẫu ban đầu… 82

Hình 3.25 Chuẩn bị bình nuôi cấy bioreactor 20 lít 82

Hình 3.26 Bình thuỷ tinh 20 lít chứa 9,8 lít môi trường 83

Hình 3.27 Chuyển môi trường vào bình bioreactor 20 lít 83

Hình 3.28 Quy trình nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống Bioreactor 20 lít 85

Hình 3.29 Nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống bioreactor 20 lít 86

Hình 3.30 Hàm lượng các alkaloid tích luỹ trong rễ tơ và ở rễ tự nhiên 87

Hình 3.31 Sắc ký bản mỏng các alkaloid, cao chiết tổng MeOH của rễ tơ

và rễ TN cây Bá bệnh

88

Hình 3.32 (A) và (B) Sắc ký HPLC của mẫu rễ tơ được nuôi cấy trên hệ

thống bioreactor 20 lít và rễ tự nhiên cây Bá bệnh 89

MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) là cây thuốc phổ biến ở nước ta,

phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền Trung, Kon tum, Đồng Nai, Phú Quốc và Vườn quốc gia Bái Tử Long Cây Bá bệnh được dùng bồi bổ sức khoẻ, tăng lượng testosterone ở nam giới, có hoạt tính kháng viêm mạnh, chống ung thư tốt và một

số tác dụng khác như chữa sốt rét, chống loãng xương, trị tiểu đường Các công trình nghiên cứu về cây Bá bệnh cho thấy cây có chứa nhiều hoạt chất alkaloid có giá trị trong kháng sốt rét, chống viêm, gây độc tế bào ung thư và tăng cường sinh lực… Hiện nay, cây Bá bệnh đang bị khai thác quá mức ngoài tự nhiên do nhu cầu

sử dụng thảo dược ngày càng tăng Hơn nữa, Bá bệnh khó nuôi trồng và nhân rộng, với thời gian thu hoạch được rễ có chất lượng phải cần ít nhất 5-6 năm dẫn tới nguồn nguyên liệu cung cấp cho sản xuất dược phẩm còn gặp nhiều khó khăn Đến nay, nuôi cấy rễ được xem là một giải pháp thay thế đầy tiềm năng để thu nhận ổn định được một lượng lớn sinh khối sạch trong thời gian ngắn từ 30-40 ngày, làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược liệu Công nghệ nuôi cấy mô sẹo hay nuôi cấy huyền phù tế bào cần phải bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (CĐHST) Tuy nhiên, sự tồn dư CĐHST ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người sử dụng Vấn đề này có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối rễ tơ do rễ tơ có thể sinh trưởng và phát triển liên tục không cần bổ sung CĐHST Hơn thế, rễ tơ có nhiều ưu điểm khác như có thể sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và có sự di truyền

ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô sẹo

Trong nuôi cấy in vitro, việc gây kích kháng hay bổ sung các elicitor giúp

tăng đáng kể khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong quá trình nhân nhanh

sinh khối rễ Nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh in vitro, dù môi trường giàu dinh dưỡng

giúp rễ phát triển nhanh, nhưng hàm lượng alkaloid phân tích được rất thấp Hơn nữa, quá trình tích lũy một số chất không diễn ra do thiếu một số yếu tố kích kháng, dẫn đến hàm lượng alkaloid nội sinh thấp hơn so với rễ thu ngoài tự nhiên Kể từ khi các stress do sự thay đổi về ánh sáng, nhiệt độ hay tác động từ các tác nhân gây hại cây trồng được phát hiện làm kích thích tích lũy các hợp chất thứ cấp thông qua con đường truyền tín hiệu của các elicitor như jasmonic acid (JA), salicylic

acid (SA), yeast extract (YE)… lần lượt kích hoạt biểu hiện các gen phòng vệ, đồng thời sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp Các elicitor đã được ứng dụng rộng rãi vào nuôi cấy để gia tăng hoạt chất saponin trong nuôi cấy nhiều loài cây dược liệu quý Việc nghiên cứu bổ sung các elicitor trong việc tăng cường khả năng tích

lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy in vitro vẫn chưa có

Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cây trồng cung cấp trên thị trường, giá thành lại cao; do việc phải cấy chuyền, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện bằng tay, tốn nhiều lao động lại dễ bị nhiễm Chính vì vậy cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới làm sao có thể tự động hóa giúp giảm thiểu nhân công, thời gian và số lượng cây nhiều Trong nuôi cấy lỏng người ta chia ra ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc và nuôi cấy Bioreactor, tất cả đều được dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh cơ quan Hiện nay đang có xu hướng dùng Bioreactor để nhân sinh khối rễ tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp

Xuất phát từ các cơ sở khoa học và luận cứ trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài nhằm tìm kiếm những alkaloid có hoạt tính sinh học đồng thời nghiên cứu những hoạt tính mới từ những alkaloid từ đó nghiên cứu nuôi cấy tăng tích luỹ hàm lượng các alkaloid bằng cách bổ sung các elicitor Sau đó, rễ tơ được nghiên cứu nhân sinh khối lớn phục vụ định hướng làm dược liệu bằng cách tối ưu hoá hệ thống bioreactor 20 lít "Nghiên cứu tăng cường tích luỹ một số alkaloid có hoạt

tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy trên

hệ thống bioreactor 20 lít”

Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát hoạt tính sinh học của các alkaloid phân lập từ rễ tơ cây Bá bệnh

Bá bệnh in vitro

Xây dựng được thống bioreactor 20 lít để nhân sinh khối rễ tơ

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cao chiết

alkaloid trong sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh

Nội dung 2: Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng rễ

tơ và tích luỹ các alkaloid (1) 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid) (7-MCPA), (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong rễ

tơ cây Bá bệnh

Nội dung 3: Xây dựng kỹ thuật nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên

hệ thống bioreactor 20 lít Đánh giá hàm lượng của các alkaloid (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one có trong sinh khối thu được nuôi cấy ở hệ thống bioreactor 20 lít so với rễ tự nhiên

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa thực tiễn

Luận án xác định được môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và hệ thống nuôi cấy tối ưu cho rễ tơ cây Bá bệnh tăng sinh khối Đồng thời, luận án giúp nâng cao chất lượng rễ thông qua việc sử dụng các elicitor để tăng hàm lượng các alkaloid như 7-MCPA, 9-methoxycanthin-one và 9-hydroxycanthin-6-one Làm chủ được công nghệ nuôi cấy sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên hệ thống bioreactor

20 lít Kết quả của luận án có thể ứng dụng vào sản xuất sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên quy mô lớn nhằm giải quyết vấn đề khan hiếm nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm

Ý nghĩa khoa học

Luận án cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về các nghiên cứu hoạt tính sinh học và tăng cường tích lũy các hợp chất alkaloid trong rễ tơ cây

Bá bệnh Luận án thiết lập được những phương pháp nghiên cứu tăng sinh khối rễ

tơ cây Bá bệnh Đồng thời luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu ích cho việc nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực hoá sinh, sinh lý thực vật và nuôi cấy mô tế bào thực vật

Những đóng góp mới của luận án

Đã phân lập và xác định cấu trúc hoá học được một chất mới (7-MCPA ) từ cao chiết alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh

Đánh giá được hoạt tính mới của ba alkaloid (1) 7-MCPA, (2) methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one như hoạt tính kháng viêm trên dòng tế bào chuột RAW264.7, đại thực bào của chuột và dòng tế bào người THP-

9-1 có giá trị IC50 từ 0,95–16,0 µM; hoạt tính gây độc của chất (1), (2) trên các dòng

tế bào ung thư KB, MCF-7, Hep-G2, LU-1 và chất (3) trên dòng LU-1

Lần đầu tiên tìm được điều kiện nuôi cấy thích hợp cho rễ tơ cây Bá bệnh tăng trưởng để thu sinh khối và tăng tích luỹ ba hoạt chất 7-MCPA , 9-methoxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6-one

Xây dựng được hệ thống bioreactor sục khí dạng cầu 20 lít sử dụng cho nhân sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh với các điều kiện tối ưu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây Bá bệnh

1.1.1 Đặc điểm sinh học và phân bố

Bá bệnh, còn gọi là mật nhân, bách bệnh, mật nhơn, bá bịnh có tên khoa học

là Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Simaroubaceae Phân bố phổ biến nhất ở Miền

Trung, cây mọc ở ven rừng còi Kon tum, từ Đồng Nai đến Phú Quốc, cây cũng được tìm thấy tại Vườn quốc gia Bái Tử Long, mọc tự nhiên ở hầu hết các diện tích đất rừng tại đây [1] Ngoài ra, cây còn có ở một số nước Đông Nam Á như Indonesia, Malaysia, Lào, Campuchia và Philippines và vùng ranh giới Ấn Độ - Trung Quốc

Phân loại

Hình 1.1 Hình thái của cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack)

A-Cây; B-Hoa; C-Quả; D-Rễ

Về đặc điểm hình thái thực vật, Bá bệnh là loại cây gỗ nhỏ, thân nhỏ, cao 2-8

m ít phân cành, lúc nhỏ ít khi có nhánh, vỏ và rễ rất đắng Lá dài, gồm hơn 10 cặp lá chét, mọc đối, hình bầu dục, cuống lá rất ngắn, gốc lá thuôn, đầu nhọn, mặt trên bóng, mặt dưới có lông màu xám Hoa chùm kép mọc ở thân hoặc đầu cành, hoa màu vàng,

ra hoa vào tháng 3-11, 5 cánh hoa, đài hoa có 5-6 lá đài hình tam giác, 5 tiểu nhuỵ

Quả hình trứng dài 1-2 cm, rộng 0,5- 1cm, vỏ nhẵn có rãnh dọc, khi chín quả màu đỏ

sẫm chứa 1 hạt Toàn cây (trừ quả chín) có vị đắng [1]

Cây Bá bệnh non cần nhiều ánh sáng để sinh trưởng Cây có dạng rễ chùm, lan rộng bám chặt vào đất Cây thường mọc ở vùng đồi núi có sườn dốc cao hơn mực nước biển chừng 700 m, vùng đất cát có tính axít, nghèo chất dinh dưỡng mọc dưới tán cây, thích hợp ở những nơi có nhiệt độ trung bình 250C và độ ẩm khoảng 86% mọc trong các khu rừng ven bờ biển hoặc rừng nguyên sinh, rừng tái sinh và các khu rừng hỗn tạp, rừng thưa, cây ưa axít và đất cát ở độ cao khoảng 700 m so với mực nước biển [1]

1.1.2 Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học các alkaloid của cây Bá bệnh

Với việc được sử dụng khá phổ biến và hiệu quả trong y học cổ truyền, cây Bá bệnh đã sớm được các nhà khoa học trên thế giới để ý Từ cây này, rất nhiều các hợp chất sinh học thứ cấp đã được tách chiết, tinh sạch, sàng lọc hoạt tính và nhiều trong

số chúng có hoạt tính tốt, hứa hẹn khả năng được áp dụng vào thực tiễn Các hoạt tính thường được thăm dò là: hoạt tính gây độc với các tế bào ung thư, hoạt tính kháng viêm, khả năng chống các gốc oxy hóa… Ngoài ra, tùy theo những tác dụng của loài trong y học dân gian, tùy theo tính chất của các chất, người ta có thể thăm dò các hoạt tính khác như: tính tăng cường sinh lực cho nam giới, ức chế phóng xạ, chống tiểu đường… Dưới đây, chúng tôi xin giới thiệu về những hoạt tính sinh học của các hợp chất alkaloid đã được tách từ loài cây Bá bệnh này

Năm 2004, Kuo và cs đã tách được một số hợp chất từ rễ cây Bá bệnh E

longifolia Trong đó, có alkaloid 9-methoxycanthin-6-one (1) và canthin-6-one (2) đã

chứng minh độc tính mạnh đối với A-549 và các dòng tế bào MCF-7 [2]

Từ loài E longifolia, Tran Thi Van Anh và cs đã tách được một chất mới

eurycomalide C cùng với 27 hợp chất đã biết bao gồm 11 quassinoids, 6 alkaloids, 2 coumarins, 1 squalene derivative, 1 triterpenoid, and 6 phenolic Các hợp chất

alkaloid 9-methoxycanthin-6-one (1); 9-hydroxycanthin-6-one (3); methoxycarbonyl-β-carboline (4); 9,10-dimethoxycanthin-6-one (5) thể hiện là chất

1-ức chế NF-κB mạnh, với giá trị IC50 lần lượt là 29,3; 3,8; 7,4; 19,5 µM [3]

Ba chất mới n-pentyl-b-Carboline-1-propionate (6),

5-hydroxymethyl-9-methoxycanthin-6-one (7), 1-hydroxy-9-5-hydroxymethyl-9-methoxycanthin-6-one (8) và các chất alkaloid cũ 9-methoxycanthin-6-one (1), canthin-6-one (2), canthin-6-one 9-O-b-

glucopyranoside (9), 9-mehthoxycanthin-6-one 3N-oxide (10), b

-carboline-1-propionic acid (11), 7-methoxy-b-carboline-1-propionic acid (12) được phân lập từ

rễ của E longifolia Các hợp chất này đã được sàng lọc trong in vitro gây độc tế bào

ung thư và chống sốt rét kết quả cho thấy chất (1) và (2) gây độc tính tế bào đáng kể

chống lại ung thư phổi ở người (A-549) và ung thư vú ở người (MCF-7) đạt giá trị

IC50 lần lượt với các dòng tế bào trên là chất (1) (<2,5 và 4,5 µg/ml); chất (2) (3,6 và

7,3 µg/ml) [4]

(10) (11) (12)

K Miyake và cs, năm 2010 đã phân lập được hai loại alkaloid canthin-6-one

mới là 4,9-dimethoxycanthin-6-one (13) và 10-hydroxy-11-methoxycanthin-6-one (2) cùng với 37 hợp chất đã biết từ thân cây Bá bệnh Tất cả các chất phân lập được

đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào sợi HT-1080 của người Trong số

đó, có hai alkaloid 9,10-dimethoxycanthin-6-one (14), methoxycanthin-6-one (15) có hoạt tính gây độc tế bào đạt giá trị IC50 lần lượt là 5,0

10-hydroxy-9-và 7,2 µM [5]

Trong một nghiên cứu khác của K Mitsunaga và cs năm 1994, các chất alkaloid

phân lập từ vỏ và thân cây E longifolia bao gồm: chất mới canthin-6-one (2),

9,10-dimethoxycanthin-6-one (14), 10-hydroxy-9-methoxycanthin-6-one (15), hydroxy-10-methoxycanthin-6-one (16); 5,9-dimethoxycanthin-6-one (17) và 9- methoxy-3-methylcanthin-5,6-dione (18) Cấu trúc của chúng được xác định bằng

11-phương pháp phổ cộng hưởng từ 1 chiều và 2 chiều NMR [6]

LB Kardono và cs 1991, tiến hành tách chiết rễ của cây Bá bệnh được thu thập

ở Kalimantan, Indonesia Kết quả thu được bốn alkaloid canthin-6-one là

9-methoxycanthin-6-one (1), 9-9-methoxycanthin-6-one-Noxide (19), 6-one (3), b-carboline-1-propionic axit (20) Các hợp chất này được đánh giá hoạt

9-hydroxycanthin-tính gây độc tế bào ung thư vú, đại tràng, u xơ, phổi, khối u ác 9-hydroxycanthin-tính, KB và KB-VI

Kết quả nghiên cứu cho thấy, các alkaloid từ (1), (3), (19) có hoạt động với tất cả các dòng tế bào được kiểm tra ngoại trừ dòng tế bào KB-V1 Alkaloid (20) không hoạt

động đáng kể với các tế bào thử nghiệm [7]

1.1.3 Tác dụng dược lý của cây Bá bệnh

Bá bệnh là một cây có giá trị phong phú về thành phần hoác học cũng như hoạt tính sinh học Trong bảng 1.1 thể hiện rất nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của các chất phân lập từ cây này

Ngoài ra, còn rất nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của từng bộ phận cũng như cao chiết tổng của cây như:

Cao chiết cây Bá bệnh có khả năng tăng cường sức khoẻ tình dục cho nam giới, kích thích cơ thể tăng tiết hormon giới tính nam (testosteron) một cách tự nhiên, duy trì sự hưng phấn và phong độ tình dục ở nam giới, ngăn chặn các dấu hiệu suy giảm khi bước vào tuổi trung niên [8-12]

Cao chiết Bá bệnh được sử dụng phổ biến cho chống sốt rét và có tác

dụng tốt chống lại P falciparum [7,13,14]

Cao chiết Bá bệnh có tác dụng chống tăng sinh các dòng tế bào ung thư khác nhau của người, cũng như các khối u rắn, bao gồm ung thư phổi, ung thư vú và cổ tử cung [15, 16]

Lá và rễ cây Bá bệnh đã được dùng để kiểm soát đường huyết [17] Chiết xuất

từ rễ Bá bệnh làm tăng độ nhạy cảm insulin thông qua việc tăng cường sự hấp thu glucose nhiều hơn 200 % tại 50 mg/ml và ức chế sự tích tụ lipid, cho thấy Bá bệnh

ngăn chặn sản xuất lipid sẽ cung cấp thêm các lợi ích trong điều trị bệnh tiểu đường [18]

Lá và rễ cây Bá bệnh đã được dùng để kiểm soát đường huyết Nhóm của Husen đã thử dịch chiết nước của rễ Bá bệnh ở 3 liều (50; 100 và 150 mg/kg) theo

mô hình Steptozotocin trên chuột bình thường và chuột có đường huyết cao Kết quả cho thấy ở nồng độ 150 mg/kg cao nước rễ Bá bệnh có khả năng làm hạ đường huyết

ở lô thử và không gây giảm có ý nghĩa ở lô chứng [17]

Các thành phần khác của Bá bệnh như alkaloids và triterpenes, cũng có thể làm giảm mất xương và duy trì các tỷ lệ hình thành xương [19] Cao chiết rễ Bá bệnh cho tác dụng tăng androgenic (chống loãng xương và có khả năng thay thế cho testosterol) [20] Do vậy, Bá bệnh có thể dùng như một liệu pháp thay thế triển vọng

ở người loãng xương do thiếu hụt hay suy giảm androgen

Bảng 1.1.Các thành phần hoá học được phân lập từ cây Bá bệnh và tác dụng dược

lý của chúng [21]

Các hợp chất hoá học

Bộ phận Tác dụng dược lý

Thuốc chống sốt rét chống lại P falciparum Chất ức chế NF-

5a,14b,15b-Trihydroxyklaineanone

11-Dehydroklaineanone

12-epi-11-Dehydroklaineanone

HT 1080 của người Thuốc

chống sốt rét chống lại P falciparum

rễ

đường Hoạt tính kháng viêm và kích thích sự ham muốn

Hoạt tính ức chế phóng xạ, và gây độc tế bào Gây độc tế bào ung thư phổi ở người (A-549)

và ung thư vú (MCF-7)

Thuốc chống sốt rét chống lại P falciparum Hoạt tính chống

loét Chất ức chế NF-kB Hoạt tính gây độc tế bào chống lại các loại tế bào ung thư của người (vú, ruột, phổi, u hắc tố, KB) và bệnh bạch cầu lymphocytic (P-388) ở chuột b-Carboline alkaloids

viêm thông qua ức chế con đường NF-kB

Pasakbumin-A, -B, -C, -D (C20)

Rễ

Chống loét Gây độc tế bào ung thư phổi ở người (A-549) và ung thư vú (MCF-7)

Tirucallane-type triterpenes

(Niloticin, dihydroniloticin, piscidinol A,

bourjotinolone A, 3-episapelin A,

melianone, and hispidone)

Thân Hoạt tính chống ung thư bạch

1.2 Ứng dụng của cây Bá bệnh trong Y học cổ truyền

Bá bệnh được dùng nhiều trong y học cổ truyền để chữa bệnh đau lưng, khó tiêu, thuốc bổ sau khi sinh đẻ, sử dụng để điều trị sốt, vàng da, suy mòn và cổ chướng [21, 9, 22 ] Bá bệnh là một trong những thuốc dân gian phổ biến cho các tác dụng kích thích tình dục và điều trị sốt rét [23] Nước lá nấu được sử dụng trị ngứa ngoài

da, trong khi quả được sử dụng chữa kiết lỵ, vỏ được sử dụng như một loại thuốc tẩy giun [22] Rễ được sử dụng để chữa rối loạn chức năng tình dục, sốt rét, ung thư, tiểu đường, phục hồi sau tập thể dục, sốt, tăng sức mạnh, bệnh loãng xương, căng thẳng, giang mai và sưng tuyến, cũng như nó được sử dụng như một loại thuốc kích dục, thuốc kháng sinh và kích thích ngon miệng [2, 5] Tuy chữa được rất nhiều bệnh nhưng cây Bá bệnh cũng có một số tác dụng phụ khi dùng liều cao như gây mất ngủ, làm thân nhiệt tăng khi sử dụng trong thời gian dài vì thế không nên dùng liên tục và dài hạn

Ngày nay, có hơn 200 sản phẩm từ cây Bá bệnh được bán sẵn ở Malaysia, chủ yếu là được pha trộn với các loại trà và cà phê hay ở dạng bột rễ thô hoặc như viên nang trộn với các loại thảo mộc khác được bán trên thị trường như là thực phẩm chức năng [24], một số sản phẩm đang bán trên thị trường như xích thổ vương, khang dược, sâm Alipas, giải độc gan tuệ linh… (hình 1.2) Hiện nay, ở Malaysia khoảng 21.000

kg Bá bệnh được thu hoạch mỗi năm, với nhu cầu khoảng hơn 54.000 kg mỗi năm [21] Cây Bá bệnh có giá trị về dược liệu cao nhưng sinh trưởng chậm Rễ Bá bệnh đang bị săn lùng, thu gom để bán Phần lớn các cây Bá bệnh tại các khu vực thuận lợi đều đã bị đào lấy củ và làm mất khả năng tái sinh, làm cho số lượng của loài này suy giảm nhanh Việc khai thác tràn lan và không có phương pháp quản lý hiệu quả Thêm

vào đó là thời gian trồng kéo dài, phải mất từ 4-7 năm mới thu được rễ có chất lượng Chính vì vậy mà nguồn rễ ngày càng cạn kiệt đã dẫn đến không đủ đáp ứng nhu cầu cung cấp nguyên liệu cho các ngành dược liệu, mỹ phẩm Đứng trước tình hình trên, công nghệ nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật là một giải pháp khả thi nhất được ưu tiên sử dụng Nhằm tạo được nguồn nguyên liệu cung cấp cho các công ty sản xuất thuốc Công nghệ sinh khối tế bào thực vật như nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù

tế bào, nuôi cấy rễ bất định… đơn giản là nuôi vô tính các dòng tế bào để tạo khối lượng lớn sản phẩm Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần thiết bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn do tồn dư của các chất điều tiết sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng Tuy nhiên việc này này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ

Hình 1.2 Một số sản phẩm được sản xuát từ cây Bá bệnh

1.3 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ

1.3.1 Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối rễ tơ

Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các rễ nhỏ có lông được sản sinh ra mạnh mẽ

tại vị trí bị nhiễm bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes T-DNA từ A rhizogenes

sau khi chuyển vào tế bào thực vật thì chúng sẽ được gắn vào bộ gene của thực vật,

từ đó tế bào thực vật sẽ làm nhiệm vụ biểu hiện các gene rol và gen aux (tổng hợp

ra IAA) làm tăng khả năng tạo các rễ nhỏ có lông một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí

bị tổn thương ở mô thực vật đó Số lượng các rễ nhỏ có lông được tạo ra khá nhiều, phát triển thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ [25]

Điểm đặc trưng nổi bật của hệ thống rễ tơ là chúng có khả năng phát triển nhanh và ổn định trên môi trường nuôi cấy không cần bổ sung chất điều hòa sinh

trưởng thực vật Với sự chuyển gene của A rhizogenes vào tế bào, rễ tơ có khả

năng tổng hợp ra nhiều loại hợp chất tự nhiên với hiệu suất cao mà các tế bào không phân hóa và các rễ bất định không chuyển gen không tổng hợp được hay tổng hợp với hàm lượng không đáng kể Rễ tơ được xem như là một nguồn nguyên liệu có giá trị trong sản xuất các hợp chất tự nhiên có lợi như dược phẩm, các chất phụ gia trong ngành mỹ phẩm và thực phẩm

Phương pháp chuyển gene tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Chuẩn bị mẫu cấy và vi khuẩn A rhizogenes

Tương tự như những phương pháp nuôi cấy in vitro khác, để đảm bảo hiệu quả

trong suốt quá trình sản xuất thì yếu tố đầu tiên cần quan tâm đến là nguồn nguyên liệu ban đầu Nguồn nguyên liệu ban đầu phải sạch bệnh, thể hiện khả năng tổng hợp được HCTC với hàm lượng cao và ổn định

Bên cạnh việc chuẩn bị mẫu thực vật thì ở phương pháp nuôi cấy rễ tơ còn có

thêm bước chuẩn bị giống vi khuẩn A rhizogene để chuyển gene vào trong tế bào thực vật Một số chủng A rhizogenes đã được ứng dụng nhiều trong việc cảm ứng tạo rễ tơ như A rhizogenes ATCC 15834, A rhizogenes A4, A rhizogenes LBA 9402, LBA 9360 … Vi khuẩn A rhizogenes sẽ được nuôi cấy trong môi trường lỏng với

các thành phần dinh dưỡng thích hợp trong một thời gian ngắn (khoảng 48h) và sau

đó được ly tâm tách sinh khối và huyền phù hóa trở lại bằng môi trường có thành phần giống môi trường nuôi cấy lúc đầu

Chuyển gene và cảm ứng tạo rễ tơ

Giai đoạn chuyển gene và cảm ứng tạo rễ tơ bao gồm 3 bước cơ bản phải được

thực hiện: chuyển gene để cảm ứng tạo rễ tơ, loại bỏ vi khuẩn A rhizogenes sau khi chuyển gene và kiểm tra chọn lọc dòng rễ tơ đã được chuyển gene

Để thực hiện việc chuyển gene bằng A rhizogenes có hai phương pháp chủ

yếu được tiến hành là ủ trực tiếp mẫu với dịch huyền phù vi khuẩn đậm đặc trên môi trường rắn hoặc đồng nuôi cấy mẫu với tế bào trong môi trường lỏng Mẫu được nuôi trong tối, 2 ngày

Sau khi ủ cần phải loại bỏ vi khuẩn A rhizogenes ra khỏi mẫu đã nhiễm Phương pháp được cho là hiệu quả nhất trong việc loại trừ vi khuẩn A rhizogenes là

chuyển mẫu qua nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường MS có bổ sung ampicillin

Rễ tơ thường xuất hiện sau khi đã chuyển gene khoảng 1-4 tuần tùy thuộc vào từng đối tượng và nhiều yếu tố khác Sau vài lần cấy chuyền trên môi trường có chứa kháng sinh, rễ tơ có thể được xem là sạch vi khuẩn và sẽ được chuyển qua môi trường MS không có ampicillin Nếu như mẫu không sạch vi khuẩn, thì sau vài ngày trên môi trường thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc của vi khuẩn và khi đó phải thực hiện tiếp việc cấy chuyền qua các môi trường MS bổ sung ampicillin đến khi rễ tơ thật sự sạch

vi khuẩn Nếu mẫu đã sạch thì có thể được chuyển qua môi trường lỏng để nuôi cấy Khi rễ tơ được nuôi trong môi trường lỏng ở quy mô bình lắc 250 ml thì cần phải được cấy chuyền định kì 3-4 tuần/ 1 lần Điều kiện thích hợp để cấy chuyền là khi rễ

tơ vẫn còn đang phát triển, nếu rễ trở nên già hay nâu thì khi cấy chuyền các đầu rễ

có thể sẽ bị chết [26]

Các rễ tơ chưa được chuyển gene thì sẽ không có khả năng phát triển ổn định trên môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng thực vật và khả năng tổng hợp hợp chất thứ cấp (HCTC) của chúng cũng rất thấp so với rễ đã chuyển gene Nếu như khi đưa vào sản xuất HCTC mà trong hệ thống nuôi cấy có lẫn tạp nhiều rễ bất định chưa chuyển gene thì khả năng tổng hợp HCTC sẽ không cao so với môi trường đồng nhất các dòng rễ tơ đã chuyển gene Cũng như là các dòng không chuyển gene đó sẽ không duy trì ổn định được trong suốt thời gian sản xuất Vì vậy để đảm bảo tất cả hệ

thống rễ tơ đưa vào sản xuất phải đều mang gene đã chuyển từ vi khuẩn A rhizogenes

ta cần phải tiến hành bước kiểm tra và chọn lọc Có nhiều phương pháp để kiểm tra

và chọn lọc dòng đã được chuyển gene Việc kiểm tra gián tiếp thông qua khả năng tổng hợp hợp chất opine ở rễ có thể kiểm tra được rễ đã được chuyển gene hay chưa Tuy nhiên phương pháp này không chính xác lắm vì khả năng tổng hợp opine ở rễ đã được chuyển gene là không ổn định Do đó các phương pháp xác định trực tiếp việc

có mặt của T-DNA trong bộ gene của rễ tơ sẽ cho kết quả chọn lọc chính xác hơn Các phương pháp đó chủ yếu là các phương pháp sinh học phân tử như Southern blotting, PCR,…

Một số hệ thống bioreactor ứng dụng trong nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống

thực vật Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cây trồng cung cấp trên thị trường, giá thành lại cao;

do việc phải cấy chuyền, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện bằng tay, tốn nhiều lao động lại dễ bị nhiễm Chính vì vậy, cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới làm sao có thể tự động hóa giúp giảm thiểu nhân công, thời gian và số lượng cây nhiều Năm 1981, Takayama và Misawa đã đề xuất một hệ thống nuôi cấy lỏng có hệ thống sục khí chủ động từ bên ngoài vào với tên gọi Bioreactor [27] Trong nuôi cấy lỏng người ta chia ra ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc và nuôi cấy bioreactor, tất cả đều được dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh cơ quan [28]

và hệ thống bioreactor là thường được dùng nhiều, chủ yếu để nuôi cấy huyền phù tế bào và sản xuất hoạt chất thứ cấp trên nhiều đối tượng nghiên cứu khác nhau [29] và hiện nay đang có xu hướng dùng bioreactor để nuôi cấy rễ tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp, bởi so với nuôi cấy huyền phù thì nuôi cấy rễ có ưu thế là ít bị biến đổi di truyền, không bổ sung chất ĐHST và chứa nhiều sản phẩm cần thu nhận hơn Sau đây là một vài hệ thống bioreactor phổ biến thường sử dụng

Hệ thống bioreactor có cánh khuấy

Ở loại bioreactor này, sự chuyển động của cánh khuấy hay cánh tuabin làm cho chất lỏng luôn được đảo trộn cùng không khí sạch Bộ phận cánh khuấy có khả năng đảo trộn các thành phần có trong bioreactor nhưng cũng làm ảnh hưởng đến rễ

tơ hay gây ra hiện tượng đứt gãy rễ Hệ thống này được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy sinh khối vi sinh vật, lên men hay nuôi cấy tế bào thực vật

Hệ thống bioreactor dạng sục

Ở bioreactor dạng sục khí, chuyển động của dòng khí và môi trường ảnh hưởng bởi việc cung cấp khí Việc cấp khí cũng như đảo trộn dưới tác dụng của sục khí có thể giảm khả năng đứt gẫy, đây là một lợi thế của dạng bioreactor này Mặt khác, nhược điểm không kiểm soát được dòng khí lưu động bên trong đã gây cản trở cho

khả năng sinh trưởng khi nuôi cấy với mật độ cao Loại bioreactor này phù hợp cho việc nuôi cấy tế bào thực vật và các cơ quan đó là nhạy cảm với các stress tế bào

Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu

Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu được thiết kế dựa trên nguyên lý hoạt động tương tự với bioreactor dạng sục khí Các bình bioreactor có cấu trúc đơn giản bao gồm bình chứa chính, đường cung cấp khí vào, đường thoát khí, các màng lọc khí vào và khí ra để đảm bảo vô trùng, hệ thống kiểm soát các điều kiện như pH, nhiệt

độ, độ oxy hòa tan Bioreactor dạng này ít tạo ra lực xé, phù hợp với việc nuôi cấy

rễ tơ (Hình 1.3) Son và cs thiết kế bioreactor dạng hình cầu cho khả năng sinh trưởng của tế bào cao hơn so với bioreactor dạng sục khí và cánh khuấy ở tế bào Taxus cuspidata Sinh khối rễ bất định sâm Hàn Quốc nuôi cấy trong bioreactor hình cầu cao hơn gấp 3 lần khi nuôi cấy trong biorreactor cánh khuấy ở cùng dung tích 20 lít Lượng sinh khối rễ bất định sâm Hàn quốc đạt giá trị cao nhất 2,2 kg sau khi nuôi cấy

42 ngày trong bình có dung tích 20 lít với 240 g rễ ban đầu [30]

Hình 1.3 Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu

Hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời

Trong hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời, rễ được tiếp xúc với không khí xung quanh, hoặc hỗn hợp khí và chất lỏng dinh dưỡng, phân tán ở dạng phun sương vào rễ tơ Hệ thống này được thiết kế ứng dụng chủ yếu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp HCTC trong nuôi cấy rễ tơ

Ngày nay, ngoài việc tạo và nhân sinh khối rễ tơ trên hệ thống bioreactor, các

nhà nghiên cứu còn quan tâm đến hàm lượng các chất được tổng hợp trong rễ ở cả quá trình nuôi cấy, đặc biệt là các HCTC vì đây là các chất có nhiều ý nghĩa cho

con người và thực vật Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp các HCTC trong rễ như:

Sự lựa chọn dòng

Đây là yếu tố tiên quyết ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp HCTC ở hệ thống nuôi cấy rễ tơ Để chọn được dòng rễ tơ tốt thì cần phải chọn lọc kĩ nguồn nguyên

liệu thực vật ban đầu và giống A rhizogenes chuyển gene vào thực vật Đa phần các

thực vật có khả năng tổng hợp HCTC với hàm lượng cao thì cũng sẽ cảm ứng ra được các rễ tơ cho năng suất sản xuất cao [31]

Hình thái của rễ tơ sau khi đã chuyển gen

Hình thái của rễ tơ sau khi chuyển gene cũng ảnh hưởng mạnh đến khả năng tổng hợp HCTC của rễ tơ trong quá trình nuôi cấy Hình thái rễ tơ sau khi chuyển

gene bởi một chủng A rhizogenes phụ thuộc vào tỷ lệ các đoạn gene được gắn chèn

vào bộ gene của tế bào thực vật Thông thường chúng thường được biểu hiện thành

ba nhóm rễ tơ có dạng: phân nhánh nhiều, không phân nhánh và dạng giống mô sẹo Khả năng sinh tổng hợp HCTC của ba dạng này khác nhau và thường thể hiện tốt nhất ở dạng phân nhánh nhiều [32]

Sự tương tác giữa thực vật và vi sinh vật

Hiện nay, nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới công bố về tương tác giữa thực vật và vi sinh vật, trong đó vi sinh vật đóng vai trò như tác nhân ức chế sinh vật gây bệnh, tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật, cố định nitơ tự do, tăng cường tích lũy sản phẩm trao đổi chất Ngoài các vi sinh vật trên bề mặt hoặc tại vùng rễ thực vật, các vi sinh vật nội sinh (sống trong mô thực vật) gần đây được quan tâm do nhiều tương tác có lợi với thực vật Vi sinh vật nội sinh không gây ảnh hưởng xấu tới phát triển, giúp tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách chuyển hóa hoặc tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất

Giai đoạn phát triển của rễ tơ trong quá trình nuôi cấy

Khi nuôi cấy rễ tơ với quy mô lớn thì việc quan trọng là phải xác định được ở thời điểm nào trong quá trình nuôi cấy thì HCTC được tạo thành nhiều nhất Từ đó

đề ra biện pháp để điều khiển quá trình một cách hiệu quả sao cho sản lượng HCTC

là lớn nhất

Hàm lượng khí

Ba yếu tố chính tác động đến sự tổng hợp HCTC là O2, CO2, C2H4 Lượng O2

đã được khẳng định rất nhiều về vai trò hữu ích của chúng trong sự phát triển của hệ thống nuôi cấy rễ tơ Và oxy cũng thể hiện được vai trò quan trọng của chúng trong việc làm tăng khả năng tổng hợp HCTC Ngoài ra trong một số trường hợp, oxy còn

có vai trò trong việc điều khiển các sản phẩm tổng hợp được thoát ra ngoài môi trường, đó là một yếu tố thuận lợi cho quá trình thu nhận HCTC [31]

Ánh sáng

Ánh sáng đóng một vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và sự sản xuất HCTC ở rễ tơ Nhiều rễ tơ khi được chiếu sáng thì sẽ chuyển sang màu xanh và có sự trưởng thành của lục lạp với khả quang tổng hợp Điều đó không phải cho thấy rễ có màu xanh, mà chủ yếu là đã phản ánh được sự thay đổi sâu sắc trong sự chuyển hóa vật chất thứ cấp ở rễ tơ khi đáp ứng với tác động của ánh sáng

Các yếu tố khác

Các yếu tố ảnh hưởng khác như thành phần dinh dưỡng của môi trường, pH của môi trường, nhiệt độ, chu kì cấy chuyền, lực tác động,…cũng có ảnh hưởng đến khả năng sản xuất HCTC ở rễ tơ [31]

1.3.3.Ảnh hưởng của elicitor đến tích luỹ các HCTC trong quá trình nuôi cấy rễ tơ

Để tăng hiệu quả sản xuất saponin, gần đây mối tương quan giữa sản xuất HCTC và biểu hiện của enzyme quan trọng trong sinh tổng hợp HCTC đã được nghiên cứu trên các loài thực vật thông qua tác động của các elicitor

1.3.3.1 Chất elicitor

Khái niệm chung

Elicitor là các hợp chất kích thích mọi dạng tự vệ của thực vật Định nghĩa rộng về các elicitor bao gồm các chất của yếu tố gây bệnh (ngoại sinh) hoặc được giải phóng bởi chính thực vật do phản ứng với yếu tố gây bệnh (nội sinh) Các elicitor có thể gây ra một loạt các phản ứng phòng vệ dẫn đến gen được biểu hiện và kích thích tích luỹ các HCTC trong điều kiện không gây ảnh hưởng đối với thực vật hay trong nuôi cấy tế bào (hình 1.4)

Phân loại các elicitor: Elicitor là các nhân tố sinh học hay phi sinh học

Elicitor sinh học: bao gồm từ nấm, vi khuẩn, virus hay động vật, các thành

phần của vách tế bào thực vật

Elicitor phi sinh học: như các ion kim loại, các thành phần vô cơ

Hình 1.4 Cơ chế tác động lên tế bào của elicitor [33]

1.3.3.2 Cách xử lý và tác động của elicitor

Tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy mô tế bào thực vật thông qua vai trò của các elicitor đã mở ra một hướng nghiên cứu mới trong công nghiệp dược phẩm [34] Các tham số như thành phần và nồng độ elicitor, thời gian xử lý, tuổi nuôi cấy, dòng tế bào, phytohormone, thành phần dinh dưỡng và đặc điểm thành

tế bào phù hợp có thể tăng khả năng tích lũy các sản phẩm thứ cấp [35]

Một số elicitor phổ biến trong nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật

Dịch chiết nấm men (Yeat extract - YE) cũng là một elicitor ngoại sinh có

nguồn gốc sinh khối tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae, trong đó YE chứa

hàng loạt thành phần có thể kích thích phản ứng phòng vệ thực vật và dẫn đến sự gia tăng các hợp chất thứ cấp như chitin, N-acetylglucosamine oligomers, β-glucan, glycopeptides và ergosterol… [36] Các hợp chất phenol có thể tương tác với protein giàu proline của YE để tạo ra chất kết dính, có khả năng tương tác với protein đã dẫn

tới tầm quan trọng của chúng trong ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và nông nghiệp [37]

Vai trò của YE tuy chưa được ứng dụng rộng rãi trong nuôi cấy loài cây Bá bệnh nhưng đã có rất nhiều nghiên cứu cho thấy hiệu quả tăng cường sản xuất các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy thực vật [37, 38] Khi bổ sung 250 và 500 mg/l YE

đã làm tăng đáng kể lượng noradrenaline trong nuôi cấy rễ tơ Portulaca oleracea L

[39]

Salicylic acid (SA) là một elicitor nội sinh hay elicitor sinh học có nguồn gốc

là các hormone nội sinh, được biết nhiều nhất với vai trò là một chất cảm ứng truyền tín hiệu đến trong hệ thống kháng tạp nhiễm ở thực vật [36] SA nhanh chóng được tích lũy ở vị trí bị xâm nhiễm trong suốt quá trình tấn công của tác nhân gây bệnh và

nó lan sang những phần khác của cây để cảm ứng đáp ứng phòng vệ trên diện rộng [40] Salicylic acid kích hoạt các gen liên quan đến phản ứng phòng vệ và có ảnh hưởng lớn đến khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp ở thực vật, đặc biệt ở các cây dược liệu và các loài nhân sâm quý SA là tín hiệu gây đáp ứng miễn dịch ở tất cả loài thực vật, nhưng tác động của nó ở mỗi loài cây rất khác nhau, trên từng bộ phận cũng không giống nhau [35,41]

Jasmonic acid (JA) là một elicitor nội sinh trong nhóm elicitor sinh học có nguồn gốc là các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có tiềm năng thương mại cao, có tác động truyền tín hiệu kích thíc mạnh phản ứng phòng vệ, làm ức chế sinh trưởng

và phát triển thực vật [36, 41] JA được xem là "hormone" bởi vì chúng gây ra những phản ứng của tế bào ở nồng độ thấp Hàm lượng JA trong thực vật thông thường khoảng 0,01-3 ng/g trọng lượng tươi [36] Từ lâu, JA đã được xem như là những hợp chất chuyển đổi các tín hiệu elicitor để sản sinh các hợp chất biến dưỡng thứ cấp Jasmonic acid và nhiều dẫn xuất khác như methyl JA, 2-hydroxyethyl jasmonate,…

là các tín hiệu JA ngoại sinh được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào và cơ quan thực vật gây kích thích sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp, hình thành

cơ quan dự trữ, cảm ứng hệ thống bảo vệ chống lại các stress sinh học (động vật ăn

cỏ và các mầm bệnh) và phi sinh học (hạn hán và ozons), ức chế sự tăng trưởng trong các mô như rễ cây và chồi non [36]

1.3.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về nuôi cấy sinh khối rễ tơ thu nhận các HCTC

1.3.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Ở trên thế giới đã có một số tác giả nghiên cứu về rễ tơ của một số loài khác nhau Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào về rễ tơ của loài Bá bệnh Các nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Bá bệnh mới chỉ dừng lại ở phân tích thành phần hóa học

và các tác dụng dược lý, những nghiên cứu về rễ tơ của một số loài cũng còn rất hạn chế Việc nghiên cứu thu nhận sinh khối rễ tơ của các loài cây dược liệu và thu nhận HCTC hiện nay không chỉ dừng ở quy mô phòng thí nghiệm mà đã được công nghiệp hoá bằng nuôi cấy bioreactor

Rễ tơ được xem như là một nguồn nguyên liệu có giá trị trong sản xuất các hợp chất tự nhiên có lợi như dược phẩm, các chất phụ gia trong ngành mỹ phẩm và thực phẩm Vào năm 2002, Sevon đã tổng kết lại những hợp chất alkaloid quan trọng

nhất trong ngành dược được sản xuất bởi các hệ thống rễ tơ, bao gồm A tropabelladonna L., Catharanthus tricophyllus L., và Datura candida L

Nghiên cứu của Lodhi (1996) đã chứng minh rằng hàm lượng anthraquinone

và alizarin trong hệ thống nuôi cấy rễ tơ của Rubia peregrina L tăng cao khi gắn

đoạn gen mã hóa ra enzyme isochorismate synthase vào đoạn T-DNA [42] theo

Banerjee thì rễ tơ của A belladonna được chuyển gen P450 2E1 thể hiện khả năng

tổng hợp chất tự nhiên với mức độ rất cao [43]

Thu nhận ginsenoside bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ của Panax ginseng

Hệ thống nuôi cấy rễ tơ P ginseng trong bioreactor có thể đạt được hiệu quả tổng

hợp ginsenoside cao hơn khi được thiết lập quá trình nuôi cấy hai giai đoạn Giai đoạn đầu (giai đoạn tăng sinh khối), rễ tơ được nuôi cấy trong điều kiện tối với hàm lượng sucrose 2% và nhiệt độ là 200C/130C (chu kì 16h/10h) Giai đoạn sau (giai đoạn tổng hợp ginsenoside), rễ tơ được chiếu sáng bằng ánh sáng huỳnh quang với nồng độ sucrose trong môi trường nuôi cấy là 3-5% và ở nhiệt độ 250C Ngoài các yếu tố trên thì việc bổ sung chất cảm ứng cũng có ảnh hưởng mạnh đến khả năng sản xuất

ginsenoside từ rễ tơ P ginseng cũng như là khả năng phát triển của rễ tơ Chất cảm

ứng là acid jasmonic thì cho hiệu quả tốt nhất trong việc làm tăng hàm lượng ginsenoside Hàm lượng ginsenoside (mg/g sinh khối khô) tăng lên gấp 4 lần và hiệu

suất sản xuất (mg/l) tăng lên 2 lần khi acid jasmonic được sử dụng ở nồng độ là 5 mg/l [44]

Thu nhận plumbagin bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ Plumbago indica (P rosea) Các nhà khoa học đã khảo sát trên nhiều phương pháp in vitro để sản xuất ra Plumbagin như nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy rễ bất định

và nuôi cấy rễ tơ của loài Plumbago indica và một số loài khác Trong đó, phương pháp nuôi cấy rễ tơ đã thể hiện hiệu quả cao nhất với hàm lượng plumbagin thu được

gần bằng hoặc cao hơn hẳn so với hàm lượng của chúng trong rễ của cây nguyên vẹn Theo kết quả từ các nghiên cứu, hàm lượng plumbagin thu được bằng phương pháp

nuôi cấy huyền phù tế bào P.indica vào khoảng 4,5 mg/g tế bào khô [45] Hàm lượng plumbagin thu được từ phương pháp nuôi cấy rễ bất định P.indica là 0.129 ± 0.0139

% khối lượng khô Trong khi đó, hệ thống nuôi cấy rễ không cần bổ sung hormone

thực vật và cho hàm lượng plumbagin là 7,8 mg/g sinh khối khô, cao hơn hẳn so với các hệ thồng nuôi cấy trên Từ đó cho thấy hệ thống nuôi cấy rễ tơ P.indica có ý nghĩa lớn trong việc sản xuất plumbagin với năng suất cao và thể hiện tính khả thi của việc

áp dụng hệ thống nuôi cấy trên quy mô lớn

Thu nhận resveratrol bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ của cây đậu phộng

(Arachis hypogaea L) Với rễ tơ Arachis hypogaea L được chuyển gene bởi giống A rhizogenes R1601 được nuôi cấy trong điều kiện bình thường (không sử dụng các

biện pháp làm tăng hàm lượng hợp chất tổng hợp) thì lượng resveratrol tổng hợp được cao nhất là 1,5 mg/g khối lượng khô [46] Và khi hệ thống nuôi cấy này được bổ sung chất cảm ứng thì khả năng tiết sản phẩm ra ngoài môi trường nuôi cấy của rễ tơ tăng lên rất nhiều, dẫn đến hàm lượng resveratrol tăng lên gần 60 lần so với trường hợp không dùng chất cảm ứng Đặc điểm này góp phần phát triển hệ thống nuôi cấy rễ tơ này lên quy mô nuôi cấy liên tục để thu nhận được resveratrol hàm lượng cao và liên

tục Ngoài ra, cũng đã có nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung oxygen lên sự phát triển tế bào và sản xuất saponin trong nuôi cấy bioreactor của Panax ginseng Nhóm

tác giả này nhận thấy việc bổ sung oxygen trong nuôi cấy bioreactor ginseng là cần thiết cho sự phát triển của tế bào và tích lũy saponin

Ali và cs (2008) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của cacbon dioxid lên enzyme

chống oxy hóa và sản xuất ginsenoside ở rễ Panax ginseng được nuôi cấy lỏng Theo

kết quả quan sát được, nồng độ enzyme chống oxy hóa gia tăng có thể ảnh hưởng đến phản ứng chống lại sự tổn hại tế bào bởi CO2 Như vậy, sự gia tăng nồng độ CO2 có thể ảnh hưởng không tốt cho tích lũy ginsenoside nhưng lại tốt cho rễ phát triển [47]

Bảng 1.2 Sản xuất hợp chất thứ cấp bằng kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ từ một số loài cây thuốc

Một số tác dụng sinh học

Fabaceae Pueraria

phaseoloides

Puerarin Hạ nhiệt, co thắt, hạ

áp, chốn loạn nhịp

Ginkgoaceae Gingko biloba Ginkgolid Phòng chống bệnh

tim mạch và tuổi già

[49] Hệ thống Bioreactor đặc biệt rất hiệu quả trong nuôi cấy trên quy mô lớn rễ P ginseng [50]

Tại Hàn Quốc, một số công ty đang sản xuất rễ tơ nhân sâm với bioreactor có dung tích 10.000 đến 20.000 lít Sản phẩm này được làm nguyên liệu cho các dạng thực phẩm chức năng và thực phẩm khác nhau trên thị trường Đã có rất nhiều nghiên cứu thành công trong tạo các hoạt chất từ nuôi cấy sinh khối rễ tóc (bảng 1.2) [51]

Với tiềm năng to lớn của công nghệ nuôi cấy rễ tơ, các hệ thống rễ tơ của nhiều

loài thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất hợp chất tự nhiên in vitro Đặc biệt là những cây thuốc có ứng dụng lớn cho việc chữa bệnh Tình hình

nghiên cứu hiện nay trên thế giới về tái sinh và đặc biệt là thu nhận sinh khối thông

qua nuôi cấy in vitro đã có một bước tiến rất dài, nguồn sinh khối thu được từ nuôi cấy in vitro đã góp phần làm giảm việc khan hiếm nguồn nguyên liệu cho công nghiệp

dược phẩm cũng như mỹ phẩm

1.3.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hà Thị Loan và cs, đã nghiên cứu tạo rễ tơ sâm Ngọc Linh Việt Nam Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ tơ từ mô cuống lá (14,8 %) cao hơn

mô lá (3,3 %); số rễ tạo ra trên mẫu cuống lá (2,8), cao hơn so với mẫu lá (1,6) Kết quả phân tích những rễ tóc này trên sắc kí lỏng siêu hiệu năng (UFLC) cũng khẳng định sự hiện diện của 3 hoạt chất saponin đặc trưng trong sâm ngọc linh là MR2 (Majonoside-R2), Rb1 (Ginsenoside-Rb1) và Rg1 (Ginsenoside-Rg1) [52]

Khi thử nghiệm trên chuột sau 7 ngày uống liên tục với liều 1,38 g/kg cao chiết

từ rễ sâm Ngọc Linh chuyển gen đã làm tăng thời gian bơi của chuột (160,36 phút)

và tỉ lệ thời gian bơi (455,71 %) đạt ý nghĩa thống kê so với đối chứng Kết quả chỉ

ra rằng rễ chuyển gen sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro có tác dụng tăng cường

sinh lực trên chuột thí nghiệm [53]

Phan Trung Hải và cs đã chọn lọc được ba chủng vi khuẩn (CO2, C18 và C26) cho tỷ lệ cảm ứng hình thành rễ tơ cao trên cây Hoa Móng tay Dòng rễ tơ được cảm ứng từ chủng CO2 cho khả năng sinh trưởng nhanh nhất [54]

Một nghiên cứu tạo rễ tơ khác trên cây Thổ Nhân sâm (Talinum paniculatum Gaertn) Kết quả cho thấy, trong 3 loại vật liệu lây nhiễm với A rhizogenes (lá mầm,

đoạn thân mang mắt chồi bên, mô lá) thì mô lá là vật liệu thích hợp cho tạo rễ tơ [55]

Nhóm Phạm Bích Ngọc và cs năm 2013 đã nghiên cứu thành công việc tạo rễ

tơ từ cây Bá bệnh [56]