CHUYÊN đề kỹ THUẬT DI TRUYỀN và ỨNG DỤNG

Sự tái tổ hợp DNA được đánh giá là thành công chỉsau khi đưa được phân tử DNA tái tổ hợp vào trong tế bào sống và chúng biểuhiện các hoạt tính di truyền và ở thế hệ con cháu sẽ mang phân

HỘI CÁC TRƯỜNG THPT CHUYÊN KHU VỰC DUYÊN HẢI – ĐỒNG BẰNG BẮC BỘ

CHUYÊN ĐỀ: KỸ THUẬT DI TRUYỀN VÀ ỨNG DỤNG

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 2

1 Lý do chọn đề tài 2

2 Mục đích của đề tài 3

PHẦN 2: NỘI DUNG 5

1 NHÂN DÒNG ADN 5

1.1 Các enzyme cắt giới hạn 6

1.2 Vector tách dòng 10

1.3 Kỹ thuật nhân dòng 16

1.4 Các ứng dụng của kỹ thuật tách dòng 21

2 PCR – PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP 22

2.1 Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR 22

2.2 Phản ứng PCR xảy ra như thế nào 24

2.3 Các ứng dụng của phản ứng PCR 27

3 GIẢI MÃ TRÌNH TỰ ADN 28

3.1 Nguyên lý giải mã trình tự ADN 28

3.2 Phương pháp hóa học của Maxam-Gilbert 28

3.3 Phương pháp kết thúc chuỗi trùng hợp nhờ dideoxynucleotide 30

3.4 Giải mã trình tự ADN tự động 34

4 CÂU HỎI LUYỆN TẬP 36

PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

1 Kết luận 52

2 Đề nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Kỹ thuật di truyền là thao tác thay đổi gen bằng công nghệ sinh học Nó baogồm các phương pháp kỹ thuật dùng để thay đổi nhân tố di truyền của các tếbào, bao gồm sự dịch chuyển gen cùng loài và khác loài để tạo ra những sinh vậtmới hoặc hoàn hảo hơn

Những thành tựu rực rỡ của di truyền học đã đem lại những nhận thức mới vềcấu tạo và sự vận hành bộ máy di truyền của cơ thể sống Cùng với sự phát triểnmạnh mẽ của di truyền học, một lĩnh vực nghiên cứu mới của di truyền học rađời, đó là kỹ thuật di truyền hay còn gọi là công nghệ gen hoặc công nghệ ditruyền (genetic engineering) Có thể nói, kỹ thuật di truyền là một tập hợp củanhiều kỹ thuật như hóa học, sinh học phân tử, vi sinh vật học, mà trong đó, vaitrò hàng đầu thuộc về các tư duy và phương pháp của di truyền

Công nghệ di truyền sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để tách DNA từmột cơ thể sống và sau đó cắt, nối các gen trên DNA Bằng cách như vậy, người

ta có thể loại bỏ các gen không mong muốn và đưa vào các gen mới đặc hiệutheo chủ ý lựa chọn Các thao tác cắt, nối trên DNA được thực hiện bên ngoài cơthể sống trong các ống nghiệm (in vitro) Phân tử DNA mới được tạo dựng saucác thao tác cắt, nối có một số đặc điểm khác với phân tử DNA ban đầu đượctách ra từ tế bào sống, được gọi là DNA tái tổ hợp và kỹ thuật này được gọi là

kỹ thuật tái tổ hợp DNA Sự tái tổ hợp DNA được đánh giá là thành công chỉsau khi đưa được phân tử DNA tái tổ hợp vào trong tế bào sống và chúng biểuhiện các hoạt tính di truyền và ở thế hệ con cháu sẽ mang phân tử DNA tái tổhợp

Kỹ thuật di truyền đã được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau bao gồmnghiên cứ, y học, công nghệ sinh học, và nông nghiệp Trong nghiên cứu, GMOđược dùng để nghiên cứu về chức năng gen qua các phương pháp như làm mấtchức năng, tạo ra chức năng mới, theo dõi biểu hiện gen Bằng cách loại bỏ một

số gen với chức năng đã được biết đến, chúng ta có thể tạo ra sinh vật môhình động vật để nghiên cứu bệnh con người Ngoài việc có thể tạo ra nội tiết tố,vắc-xin, và các dược phẩm khác, kỹ thuật di truyền còn có tiềm năng chữa bệnhqua phương pháp điều trị gen Những phương pháp kỹ dùng để tạo ra dượcphẩm còn có các ứng dụng công nghiệp khác như sản xuất enzyme để tạo rathuốc tẩy, phô mai, và các sản phẩm khác.

Chính vì vậy, kỹ thuật gen thực sự trở thành nhu cầu của sự hiểu biết để conngười có thể sử dụng công nghệ nhằm phục vụ mục đích khác nhau Ở nước ta,

kỹ thuật gen không chỉ được giảng dạy ở bậc đại học và THPT mà ngày càngthâm nhập vào nhiều lĩnh vực hoạt động khoa học và lĩnh vực kinh tế khác Tuynhiên, ngoài nội dung kiến thức được dùng để ôn thi đại học thì kỹ thuật gen còntrở thành một trong những nội dung của các đề thi tuyển chọn học sinh giỏiQuốc gia và Olympic Sinh học Đây là nội dung tương đối khó, học sinh phải sửdụng nhiều kiến thức chuyên ngành và kiến thức thực tiễn để giải quyết vấn đềnày, một nội dung ít được tiếp cận trong chương trình sinh học THPT

Với mong muốn nâng cao chất lượng của HSG, cũng như cung cấp cho giáoviên và học sinh nguồn tư liệu để tham khảo, giảng dạy, học tập và quan trọng

hơn là hoàn thiện kiến thức của bản thân nên Tôi đã chọn nội dung “ Nguyên lý

kỹ thuật di truyền và Ứng dụng” làm đề tài nghiên cứu

- Xây dựng hệ thống câu hỏi liên quan đến các kỹ thuật di truyền, từ đó rènluyện kĩ năng trả lời câu hỏi cho học sinh.

- Xây dựng được mạch kiến thức cơ bản của chuyên đề, có thể áp dụng để dạynền cho mọi đối tượng học sinh

PHẦN 2: NỘI DUNG

1 NHÂN DÒNG ADN

Nhân dòng gen là khái niệm chỉ một nhóm các phương pháp được sửdụng để phân lập một một trình tự gen (ADN) đặc hiệu từ hỗn hợp các phân tửADN ban đầu được tách chiết từ các mẫu sinh học vốn có cấu trúc phức tạp,kích thước lớn; khuếch đại (sao chép) trình tự lên một số lượng lớn đủ để có thểtiến hành phân tích về cấu trúc và chức năng của gen tương ứng

Khả năng tinh sạch các đoạn gen (ADN) đặc hiệu có số lượng đủ lớn làcần thiết để có thể “thao tác” các đoạn gen đó vì các mục tiêu nghiên cứu khácnhau Chẳng hạn, từ các phân đoạn ADN được tách dòng, người ta có thể tạo racác phân tử ADN tái tổ hợp mang các phân đoạn ADN mang nguồn gốc khácnhau Các phân tử ADN tái tổ hợp mới có thể làm thay đổi mức độ biểu hiệnbình thường của một gen (chẳng hạn bằng việc dung hợp giữa một trình tự mãhóa của một loài này với trình tự promoter của một loài khác) hoặc thậm chí mãhóa tổng hợp một loại protein “dung hợp” mới (protein lai) mang các trình tựaxit amin từ các protein có nguồn gốc khác nhau Hiện nay, các kỹ thuật táchdòng phân tử (bao gồm cả PCR) đã trở thành các công cụ thiết yếu trong nghiêncứu về sự điều hòa và biểu hiện của các gen và hệ gen ở các loài sinh vật khácnhau

Quá trình tách dòng ADN và tạo nên các phân tử ADN tái tổ hợp điểnhình thường liên quan đến việc sử dụng các véctơ là trình tự mang thông tin điềukhiển hoạt động nhân lên (khuếch đại) và/hoặc biểu hiện trong tế bào của phân

tử ADN tái tổ hợp mang đoạn ADN cài (đoạn trình tự được phân lập) bao gồmtrình tự gen được quan tâm nghiên cứu Các “công cụ” chính để tạo nên cácphân tử ADN tái tổ hợp là các enzym giới hạn giúp cắt các phân tử ADN tại các

vị trí xác định và các enzym nối cho phép ghép nối các phân đoạn ADN cónguồn gốc khác nhau với nhau Bằng việc tạo nên các phân tử ADN tái tổ hợp

có thể tự nhận lên trong tế bào chủ, một đoạn ADN cài xác định nào đó có thểđược phân lập, tinh sạch và nhân lên thành một số lượng lớn các bản sao

Tiếp theo đây, chúng ta sẽ mô tả bằng cách nào các phân tử ADN đượccắt, tái tổ hợp và nhân lên, đồng thời đề cập đến việc xây dựng thư viện hệ gengồm tập hợp các phân tử ADN lai chứa các đoạn cài xuất phát từ một hệ gen cầnđược thiết lập để phục vụ cho việc nghiên cứu, phân tích một hệ gen Thôngthường một thư viện hệ gen được thiết lập bằng việc sử dụng chung cùng mộtloại véctơ mang các phân đoạn ADN cài khác nhau Chúng ta sẽ thấy bằng cáchnào các phân đoạn ADN đặc hiệu có thể được xác định và phân lập từ các thưviện hệ gen.

1.1 Các enzyme cắt giới hạn

1.1.1 Enzyme giới hạn

Là một enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt ADN đặc hiệu.Những enzyme này phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khung ADN mạchđôi mà không gây tổn hại đến bases Các liên kết hóa học mà bị enzyme này cắt

có thể được nối trở lại bằng loại enzyme khác là các ligases, vì thế các phânđoạn giới hạn (sản phẩm của phản ứng cắt RE) mà bị cắt từ các nhiễm sắcthể hoặc gene khác nhau có thể được ghép cùng nhau nếu có trình tự đầu dính

bổ sung với nhau Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền đều dựavào các enzyme giới hạn

Phân loại enzyme giới hạn

Các nhà sinh hóa chia enzyme cắt giới hạn nói chung thành ba loại, gọi làLoại I, Loại II và Loại III Đối với hai loại I và III, cả hoạt tính phân giải acidnucleic hay phân giải nhóm methyl đều thực hiện chung bởi một phức hợpenzyme lớn Mặc dù những enzyme thuộc hai loại này cũng nhận biết nhữngtrình tự ADN đặc hiệu, vị trí cắt thường cách xa vị trí nhận biết, có khi đến cảtrăm base Chúng cũng cần ATP để hoạt động Những enzyme này bắt đầu bằngviệc kiểm tra tình trạng methyl hóa của 2 adenine trong vùng nhận biết Nếu cảhai adenine đều không được methyl hóa (dấu hiện cho thấy đây là ADN ngoạilai), phức hợp enzyme thay đổi cấu hình và thực hiện hoạt tính phân giải Tuynhiên, nếu một trong hai adenine được methyl hóa, chứng tỏ là ADN của tế bào,enzyme khi đó sẽ thực hiện chức năng của một enzyme methyl hóa cho gốc

adenine còn lại để duy trì sự ổn định cho ADN bộ gene Với enzyme giới hạnloại II, chức năng phân giải của nó không liên quan đến chức năng methyl hóahay phân giải nhóm methyl, và vị trí cắt cũng nằm ngay bên trong hay kế cạnh

vị trí nhận biết Ngày nay người ta biết rất nhiều enzyme khác nhau loại này vàchúng là một trong những công cụ sinh học phân tử thiết yếu, đặc biệt thườnggặp trong các ứng dụng dòng hóa gene hay phân tích ADN

Một số enzyme cắt giới hạn (RE)

Vị trí điểm cắt

Enzyme giới hạn chỉ cắt các trình tự lặp đối xứng khi đọc theo chiều 5´-3´trên mạch ADN (palindrome) gọi là trình tự nhận biết Vị trí điểm cắt củaenzyme giới hạn có thể nằm trong hoặc ngoài trình tự nhận biết này Một sốenzyme tạo ra các vết cắt trên mạch đối diện tức thời, tạo ra các đoạn ADN "đầubằng" Hầu hết các en đều tạo ra các vết cắt hơi chéo nhau (hình chữ chi), tạo ra

các "đầu dính" Các enzyme giới hạn có ba chức năng quan trọng, mỗi chứcnăng cắt ADN bằng các cơ chế khác nhau.

(a) Đầu bằng (Rsal)

(b) Đầu dính 5’ (EcoRI)

(c) Đầu dính 3’ (Kpnl)

2.1.2 Các loại enzyme cắt giới hạn tạo các đoạn ADN khác nhau

Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là

một kĩ thuật để phân tích các phân tử ADN, RNA hay protein dựa trên các đặcđiểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện

tích (isoelectric point) Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn

diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose haypolyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chấtnhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trícác phân tử trên gel sau khi điện di

Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vàocác phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel) Gel cấu tạo bởi cácchuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thốngmạng lưới với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử(agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo Các phân tử được phântách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của (a)lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau) (b)

kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và (c) hình dạng, độ cồngkềnh của phân tử.

Gel agarose: Là một polysaccharide, thường được chiết xuất từ rong biển đỏ

nhất định Nó là một polymer tuyến tính được tạo thành từ đơn vị lặp đi lặp lạicủa agarobiose, là một disaccharide tạo thành từ D -galactose và 3,6-anhydro- L-galactopyranose Agarose là một trong hai thành phần chính của thạch, và đượctinh chế từ thạch bằng cách loại bỏ thành phần khác của agar, agaropectin.Agarose có cấu trúc dạng lưới ba chiều các kênh có đường kính từ 50 nm đến>

200 nm tùy thuộc vào nồng độ agarose được sử dụng - nồng độ cao hơn manglại đường kính lỗ chân lông trung bình thấp hơn Cấu trúc 3-D được tổ chứccùng với liên kết hydro và do đó có thể bị gián đoạn do làm nóng trở lại trạngthái lỏng

Quy trình điện di gel trên agarose

Chuẩn bị dung dịch đệm và

bản gel

Agarose được sử dụng làm chất nền để phân tách các đoạn ADN

Các lỗ trên bản gel là các giếng chứa ADN

Nạp mẫu vào các giếng

cũng có thể được hình thành thành các hạt và được sử dụng trong một sốphương pháp sắc ký để làm sạch protein

Bản gel sau khi nhuộm, rửa nước thì được đặt vào máy có tia soi UV để quan sát kết quả điện di.

Các phân tử ADN có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm

Đoạn ADN mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển

ở các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng

độ agarose khác nhau Agarose có khả năng phân tách các phân tử có kích thước lớn khác nhau trong khoảng 20kb.

Mời các bạn cùng theo dõi những bước cơ bản trong quá trình điện di ADN trên gel agarose qua link video sau https://www.youtube.com/watch?v=BKgi6aJMIWw

1.2 Vector tách dòng

Vector tách dòng (cloning vector) là một phân tử ADN có kích thước nhỏ cho

phép cài gắn một đoạn ADN ngoại lai vào nhằm mục đích nhân đoạn ADNngoại lai lên với số lượng lớn

Các đặc điểm cần có của một véctơ tách dòng:

- Có khả năng cài gắn các đoạn ADN ngoại lai

- Có kích thước nhỏ để xâm nhập tế bào chủ

- Có thể tái bản độc lập không phụ thuộc vào bộ gen của tế bào chủ

- Có chứa các gen chỉ thị, chọn lọc (gen kháng kháng sinh, gen chỉ thịmàu )

Tùy thuộc vào kích thước đoạn ADN mà chúng ta muốn cài mà sử dụng các vector tách dòng khác nhau Các loại vector tách dòng thường dùng như là

Plasmid, Cosmid, Phage, BAC (Bacterium artificial chromosomes), YAC (yeast artificial chromosomes)

Lamda cosmids E.coli 35 – 45 kb

1.2.1 Vector chuyển gen là plasmid

Các plasmid là những mẫu ADN nhỏ, ngắn, dạng vòng (khép kín), sợi đôinằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên trong tế bào một số vi khuẩn.Chúng sao chép được là nhờ một số enzyme có mặt trong tế bào vi khuẩn vàkhông phụ thuộc vào sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn Tùy các kiểu củaplasmid mà số bản sao plasmid bởi vi khuẩn sẽ khác nhau Một số plasmid chỉ

có một bản sao duy nhất vì chúng tự tái bản chỉ một lần trong mổi lần phân bào

Plasmid pGEX-3x là một vector tách dòng phổ biến.

Một số khác có số bản sao lớn vì chúng tái bản được nhiều lần trong mỗichu kỳ phân bào Những plasmid có từ 10 đến 100 bản sao trong tế bào chủđược xem như plasmid có bản sao cao Plasmid khác có từ 1 đến 4 bản sao trong

tế bào chủ, được xếp vào nhóm có bản sao thấp Trong sinh vật eucaryote,plasmid chỉ có trong tế bào nấm men

Mỗi plasmid đều có một chuỗi mã di truyền (sequence) mang chức măng

tự tái bản ADN Nếu không có vị trí khởi đầu phiên mã (ori) này, ADN không

thể tự tái lập trong tế bào chủ Với tính chất tự tái bản, plasmid là một vectorchuyển gen để nhân dòng ADN cần thiết.

Do kích thước nhỏ nên plasmid chỉ chứa rất ít gen chọn lọc, thường đặctính chọn lọc là kháng kháng sinh Từ khi được phát hiện đến nay, các plasmidkhông ngừng được cải tiến và ngày càng được có thêm nhiều đặc tính quí choviệc tạo dòng

Trong phòng thí nghiệm, người ta sử dụng các plasmid nhân tạo mà được tạo ra

từ các plasmid tự nhiên và cài thêm một số chuỗi ADN

pBR322 có kích thước 4.363bp và hai gen

kháng thuốc, một chống chịu được

ampicilline (ampR) và một chống chịu được

tetracycline (tetR)

Có nhiều điểm nhận biết bởi enzyme cắt hạn

chế và trong số đó có nhiều điểm nhận biết

nằm trong gen kháng kháng sinh Ví dụ, gen

kháng ampicilline có ba trình tự nhận biết bởi

ba enzyme cắt hạn chế là PstI, PvuI, ScaI

Còn gen kháng tetracycline có sáu điểm nhận

biết là: EcoRV, BamHI, SphI, SlaI, XmaIII,

Việc cài ADN lạ được tiến hành một trong hai gen kháng thuốc Nếu chỉ cònmột gen kháng với kháng sinh là do một trong hai gen đã không nhận đoạn cài.Điều này cho phép để chọn lựa các plasmid tái tổ hợp Một ứng dụng nữa củapBR322 là chúng có số bản sao lớn Thực nghiệm cho thấy cứ 15 plasmid tái tổhợp được biến nạp trong E Coli, số lượng này có thể tăng lên từ 1.000 đến3.000 bản sao trong điều kiện nuôi cấy tốt

1.2.2 Các vector chuyển gen là phage

Lamda phage làm vector chuyển những đoạn gen có kích thước nhỏ

Phage (thực khuẩn thể) là virus xâm nhiễm vi khuẩn làm phân giải vikhuẩn Việc sử dụng phage làm vector chuyển gen có nhiều ưu điểm hơn so vớivector là plasmid

- Dễ xâm nhập vào vi khuẩn,

- Khả năng nhân lên nhanh trong tế bào chủ,

- Khả năng tiếp nhận đoạn ADN lạ lớn hơn plasmid

Tuy nhiên, việc sử dụng phage có nhiều bất lợi như

1.2.3 Các vector chuyển gen khác

- Các cosmid: là những vector lai nhân tạo từ một plasmid với các trình tự cos

của phage λ (được sử dụng từ năm 1978) Các trình tự cos này điều khiển sựđóng gói ADN tái tổ hợp vào đầu của phage Khi bao gói các vùng cos đều bịcắt, chỉ còn một phần ADN của cosmid được giới hạn bởi các đầu dính với đoạncài ADN lạ được bao gói Trong phản ứng bao gói in vitro, các protein cần thiếtcho sự tạo thành đầu và đuôi phải được thêm vào để cho các phage có thể tự hợpthành

Vector chuyển là cosmid

Cosmid là những plasmid có các vùng giới hạn mà tại đây, người ta có thểcài lắp ADN lạ và một gen chống chịu ampicilline Kích thước cosmid ≈ 5kb do

đó, nó có thể nhận được đoạn cài 35÷45kb Vào thời điểm gây nhiễm E Coli,

ADN tái tổ hợp được phóng vào vi khuẩn Trong vi khuẩn các đầu dính sẽ bắtcặp tạo ra cosmid tái tổ hợp khép kín dạng vòng và tái bản như một plasmid

Ưu điểm và ứng dụng của cosmid: Cũng như phage, cosmid cho khả năng xâm

nhiễm tế bào vi khuẩn lớn, nhận đoạn cài có kích thước lớn Trong tế bào chủ,

nó tự nhân bản như plasmid Cho nên người ta nhận được những khuẩn lạc, chứkhông phải đĩa phân giải trên mặt thạch, thuận lợi cho việc quan sát Với nhữngtiện lợi trên, người ta dùng cosmid để tách dòng từ những gen lớn để tạo ngânhàng genom (bộ gen) Những vi khuẩn mang vector này có khả năng chống chịuvới môi trường có ampiciline

- Vector chuyển là các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC (Yeast Artificial Chromosomes)

Do nhu cầu tạo dòng với những trình tự ADN ngày càng lớn, các nhà nghiêncứu tìm tòi phát triển những vector ngày càng mới Ngày nay người ta đã tạo raYAC cho phép tạo dòng với những đoạn ADN dài 150÷1.000kb, trung bình là350kb Bằng nghiên cứu cho thấy ở nấm men (Saccharomyces Cerevisiae),nhiễm sắc thể muốn nhân đôi và phân ly tốt cần ba trình tự.

YAC làm vector chuyển những đoạn gen có kích thước lớn

- 2 TEL (telomere): Trình tự đầu cuối của NST

- CEN (centrmere - tâm động): Trình tự trung tâm của NST, đảm bảo sự chia đôi

và đi về 2 cực của tế bào

- ARS (autonomously replicating sequence): Trình tự sao chép tự chủ tương tựnhư ori ở plasmid

Dựa vào đó người ta đã cấu tạo NST nhân tạo có đủ ba trình tự nói trên với cấutạo gồm 2 cánh tay, giữa 2 cánh tay người ta có thể cài đặt một đoạn ADN cầntạo dòng với kích thước khoảng 150 đến 1.000kb Trên mỗi cánh tay gồm cácgen đánh dấu di truyền để chọn lọc các tế bào nấm men có chứa YAC và cácchuỗi tận cùng có chức năng telomer đoạn cuối của NST Một trong hai cánh taymang một mảnh ADN hoạt động như một tâm động và một nguồn tái bản ori.Việc cài ADN lạ vào gen mã hóa chất ức chế tRNA vận chuyển tyrsine sẽ làmbiến đổi màu sắc khuẩn lạc tế bào gốc có mang gen hổ phách (khuẩn lạc từ trắng

sang đỏ) khi có mặt của ADN lạ Đây là dấu hiệu về sự hiện diện của YAC tái tổhợp trong tế bào nấm men.

Các nhiễm sắc thể này được đưa vào tế bào chủ (nấm men), nó được nhân lênnhư NST khác ở trong tế bào nấm men và ta có được những gen mong muốn

1.3 Kỹ thuật nhân dòng

Kỹ thuật tách dòng bao gồm việc phải cài một mảnh (chuỗi) ADN lạ vàomột vector (plasmide hoặc phage λ) bằng phương pháp hóa sinh Sau đó, đưaphân tử lai này vào tế bào chủ đã chọn lựa bằng phương pháp biến nạp hoặc tảinạp Trường hợp muốn tạo dòng tổng hợp enzyme thì mảnh ADN định cài phải

mã hóa cho gen cấu trúc của một enzyme nào đó

Các bước của kỹ thuật nhân dòng

Mời các bạn cùng theo dõi những bước cơ bản trong quá trình nhân dòng qua link video sau:

https://www.youtube.com/watch?

v=DiUH4nCUSV0&list=PLjFxRogufQiNh8eJtI5k0jpZxC4UFxxZC&index=3&t=25s

1.3.1 Tạo ADN tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp)

Việc tạo ADN tái tổ hợp bằng cách ghép ADN lạ vào vector đã được cắt cùngmột enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lạivới nhau nhờ bắt cặp bổ sung Một phản ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của

enzyme ADN ligase của E Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai.

Tách lập các ADN lạ cần tạo dòng: Chọn và cắt ADN lạ của tế bào cho bằng

một enzyme cắt hạn chế (RE) Phân lập đoạn ADN (gen quí) phù hợp với vector

và mục đích cần tạo dòng Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng một gen chưa

biết, người nghiên cứu có thể tổng hợp hóa học đoạn ADN cần tạo dòng khi dựđoán cấu trúc protein do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp cADN từ mRNA

Chọn và xử lí vector: Chọn vector cần phải chú ý những yêu cầu sau: độ lớn

của gen lạ (đoạn cài), loại tế bào chủ tiếp nhận vector và phương pháp ứng dụng.Cắt vector bằng enzyme cắt hạn chế cùng loại với enzyme đã cắt ADN nói trên(để tạo những vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghép sau này) Khửnhóm phosphat bằng enzyme alkanline phosphotase để tránh hai đầu vectorđóng kín trở lại

Công đoạn nối với sự có mặt của ADN ligase: Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là nối

các đoạn ADN vào vector chuyển gen để tạo plasmid có mang ADN lạ Phản ứng nối được thực hiện nhờ enzyme ADN ligase ADN ligase là một enzyme xúc tác các phản ứng nối hai mảnh ADN bằng cách tạo cầu nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai nucleotide đứng cạnh nhau (Hình 6-2) Trong sinh học phân tử, người ta coi ADN ligase như một chất keo phân tử để kết dính các mẫu ADN lại với nhau.

Nối đầu bằng

Khi hai đoạn ADN đầu bằng đứng

cạnh nhau Dưới tác dụng của enzyme

ligase, liên kết phosphodiester giữa

đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) được hình

thành và hai nucleotide được nối lại

với nhau Khả năng nối hai đoạn ADN

đầu bằng rất thấp Để tăng hiệu suất

phản ứng, thường người ta phải tăng

nồng độ của các đoạn ADN.

Nối đầu lệch

Đầu tiên, hai mảnh ADN đầu lệch do

có những bazơ bổ sung nên chúng tiến

gần lại nhau để tạo liên kết hydro giữa

các bazơ nitơ bổ sung Sau đó, hai

nucleotide của hai đầu nối tạo liên kết

este giữa OH(3’) và P(5’) dưới tác

dụng của enzyme ADN ligase

Biến nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thểcho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), không cần sự tiếp xúc giữahai tế bào hoặc nhân tố trung gian là phage hoặc virus Biến nạp được thực hiệnvới vector chuyển gen là plasmid Có nhiều phương pháp biến nạp như hóa biếnnạp, điện biến nạp, biến nạp tế bào trần, phương pháp bắn gen và phương pháp

vi tiêm

Tải nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho

D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception) qua nhân tố trung gian là virus.Tải nạp được thực hiện với vector chuyển gen có nguồn gốc là virus như phage,cosmid,

Chuyển plasmid vào tế bào bằng cách xử lý CaCl 2 ở nhiệt độ 42 o C trong 30 giây

Chuyển plasmid vào tế bào bằng cách dùng xung điện ở 15kV/cm trong 5.10 -3 giây

Plasmid được đưa vào tế bào nhận bằng cách xử lý hóa học

1.3.3 Phát hiện dòng cần tìm

Công việc tiếp theo là kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn Việcchọn lựa những chủng như ý muốn là không đơn giản, vì cách tiến hành thínghiệm trong một hỗn hợp không đồng nhất nên các dòng vi khuẩn có thể mọclên theo ba khả năng

- Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp,

- Tế bào nhận plasmid nhưng không có gen lạ,

- Tế bào vi khuẩn nhận được plasmid tái tổ hợp

Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà người ta có các phương pháp khác nhau

để xác định dòng cần tìm Nếu mục đích là nghiên cứu đoạn gen chưa biết,

người ta thường dùng đầu dò Nếu đoạn ADN đã biết (cADN), công việc sẽ đơngiản và nhanh chóng.

Tùy từng trường hợp cụ thể mà người nghiên cứu đưa ra những phươngpháp kiểm tra thu hồi sản phẩm của gen tái tổ hợp Nếu là mục đích thiết lậpngân hàng cADN, ta phải tiến hành các bước sau: Đầu tiên người ta phải táchplasmid tái tổ hợp ra khỏi dịch nuôi cấy, sau đó, cắt plasmid tái tổ hợp bằngenzyme RE loại II và thu được hai băng ADN, một có độ dài bằng khung vector,còn băng khác có độ dài tương ứng đúng bằng cADN Cách kiểm tra lại cADN

đã được cắt bằng cách điện di trên gel agarose 0,8% và kiểm tra lại độ dài củanhững băng cADN thu được Những đoạn có kích thước khác nhau sẽ di chuyểnnhững khoảng cách khác nhau trên gel

Nếu sản phẩm của gen tái tổ hợp là protein, enzyme, hormone, vaccine,kháng sinh, người ta có thể thu nhận sản phẩm bằng phương pháp chiết táchlắng lọc ly tâm kết tủa phân đoạn hoặc trao đổi ion

Một số phương pháp xác định dòng cần tìm

Phương pháp lai axit nucleic

- Nguyên tắc của phương pháp lai axit nucleic: Dựa vào khả năng biến tính khinhiệt độ tăng và hồi tính khi hạ nhiệt độ từ từ của ADN Khi tăng nhiệt độ củaADN lên quá nhiệt độ sinh lý (thường ở khoảng 80 đến 95°C), hai sợi đơn ADN

sẽ tách rời nhau do liên kết hydro bị đứt Khi hạ nhiệt độ từ từ của khối ADN đãbiến tính cùng với các điều kiện thích hợp khác, các mạch đơn bắt cặp trở lại Sựbắt cặp chỉ có thể xảy ra khi hai trình tự ADN hoàn toàn bổ sung cho nhau Tínhđặc hiệu cực lớn của phản ứng lai này cho phép bất kỳ trình tự mạch đơn nàocũng tìm gặp mạch bổ sung với nó, mặc dù chúng nằm trong hàng triệu các trình

tự ADN và RNA khác nhau Có thể dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu để pháthiện đoạn lai

- Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu (đầu) dò đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng

xạ hoặc hóa chất Biến tính dòng cần tìm ở dưới dạng một sợi, sau đó hạ nhiệt

độ từ từ, các sợi đơn tương đồng bắt cặp với nhau Sự bắt cặp xảy ra giữa ADN

và ADN, RNA và ADN, RNA và RNA

Phương pháp sử dụng kháng thể

- Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng đặc trưng của một số protein và kháng thể mà

chúng ta có thể nhận biết được qua phản ứng đặc trưng đó như phản ứng tạomàu, phản ứng kết tủa

- Cách tiến hành: Chọn kháng thể đặc trưng cho protein (thuốc thử cho protein).Tách protein được biểu hiện trong quá trình tạo dòng Ủ protein với kháng thểđặc trưng Sau đó tiến hành nhận biết thông qua các dấu hiệu của phản ứng đặctrưng giữa protein và kháng thể

- Ứng dụng: Chủ yếu sử dụng trong y học với hai yêu cầu là ADN cần nghiêncứu được gắn vào vector phải biểu hiện protein khi tạo dòng và đồng thời,vector tạo dòng phải là vector biểu hiện (ví dụ như vector λgt11) Protein biểuhiện cần phải có kháng thể đặc trưng

Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn

- Nguyên tắc: Dựa vào sự mất khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector

tái tổ hợp khi chúng được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh

- Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng cho vector có từ hai gen kháng thuốctrở lên, ví dụ như vector pBR

1.4 Các ứng dụng của kỹ thuật tách dòng

- Xác định các gen gây bệnh: Việc tách dòng ADN giúp xác định các gen bị

hỏng hoặc sai lệch, đột biến gây nên các bệnh di truyền chẳng hạn như bệnhthiếu máu hồng cầu hình liềm, rối loạn dinh dưỡng cơ, các gen gây ung thư vàgen ức chế khối u có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển khối u Việcnghiên cứu đặc tính của các gen này giúp nâng cao hiểu biết về cơ chế phát sinhbệnh

- Lập bản đồ gen: Việc xác định và làm rõ đặc tính các dòng gen nằm gần

nhau trên nhiễm sắc thể được sử dụng để lập bản đồ gen Nhờ ứng dụng có thểxác định được vị trí tương đối của các gen trên nhiễm sắc thể

- Các protein tái tổ hợp: Kỹ thuật tách dòng gen được sử dụng để sản xuất một

lượng lớn các loại protein có giá trị trong y học, chẳng hạn như insulin trongđiều trị bệnh đái tháo đường, protein yếu tố VIII trong điều trị chứng thiếu máu

Các gen mã hóa các loại protein hữu ích được tách dòng nhờ các vector biểuhiện và biến nạp vào một cơ thể chủ thích hợp chẳng hạn như nấm men để cácgen tách dòng có thể được biểu hiện và sản xuất ra một lượng lớn protein theonhu cầu.

- Tạo ra các cơ thể biến đổi di truyền GMO: Người ta có thể sử dụng kỹ thuật

tách dòng gen để khuếch đại, chuyển các gen ngoại lai mong muốn vào một cơthể sinh vật nào đó để tạo ra những cơ thể( động vật, thực vật) mới mang các đặctính di truyền mong muốn

2 PCR – PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP

Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR (DNA polymerase chain reaction) là một kĩthuật hữu hiệu được sử dụng rộng rãi và có vai trò quan trọng trong hầu hết cácnghiên cứu hiện nay ADN nhiễm sắc thể trong tế bào chứa hàng ngàn gen Điều

đó làm cho việc phân tích và phân lập một gen riêng lẻ trở nên khó khăn Phảnứng PCR là công cụ cho phép chúng ta sao chép nhiều lần một trình tự ADN đặcthù, thông thường tướng ứng với các gen hoặc từng phần của các gen đó, xuấtphát từ mẫu ADN nhiễm sắc nhờ một phản ứng enzyme đơn giản Yêu cầu duynhất của quá trình này là cần phải biết một số trình tự của hai đầu của đoạnADN cần khuếch đại

Đoạn ADN được quan tâm nghiên cứu được nhân lên (khuếch đại) hàng triệulần và trở thành đoạn ADN chiếm ưu thế sau khi phản ứng PCR kết thúc LượngADN của đoạn trình tự được quan tâm nghiên cứu lúc đó đủ lớn để có thể sửdụng trong các nghiên cứu chi tiết tiếp theo về gen hoặc sử dụng cho mục đíchthao tác di truyền liên quan đến các đoạn gen được khuếch đại

2.1 Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR

ADN mạch khuôn: Phân tử ADN này chứa đoạn ADN cần khuếch đại Phân tử

ADN mạch khuôn thường là một hỗn hợp phức tạp của nhiều trình tự ADN khácnhau vì được chiết suất từ ADN nhiễm sắc thể Tuy vậy, mọi phân tử AND chứađoạn trình tự đích đều có thể sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Phân tửPCR cũng có thể sử dụng làm mạch khuôn cho phản ứng PCR nhờ việc sử dụng

enzyme phiên mã ngược( reverse transcriptase) để chuyển trình tự ARN thànhtrình tự ADN

Đoạn mồi oligonucleotide: Một phản ứng PCR thường cần một cặp mồi

oligonucleotide Đây là những phân tử AND mạch đơn ngắn ( thường gồmkhoảng 10-20 base nitơ) thu được nhờ quá trình tổng hợp hóa học Các đoạn mồiđược chọn sao cho trình tự các oligonuceotid của chúng bổ trợ với trình tự ở haiđầu đoạn ADN cần khuếch đại( trên mạch đối diện)

Một số đoạn mồi cho quá trình khuếch đại PCR theo chiều 5’ – 3’ và 3’ – 5’

ADN polymerase: Một số loại ADN polymerase được sử dụng trong phản ứng

PCR Những enzym này là các enzyme bền ở nhiệt độ cao, có thể ổn định và

hoạt động ở nhiệt độ tới 100 độ C Enzym được sử dụng phổ biến nhất là Taq ADN polymerase có nguồn gốc từ Thermus aquaticus, một loại vi khuẩn được

phát hiên ở suối nước nóng Vai trò của ADN polymerase trong phản ứng PCR

là xúc tác quá trình sao chép các phân tử ADN Enzym này gắn vào chuỗi ADNmạch đơn và tổng hợp ADN mới có trình tự bổ trợ với mạch ADN làm khuôn( mạch gốc) Tuy vậy, enzyme AND polymerase đòi hỏi phải có một đoạn ADNmạch kép để có thể khởi đầu phản ứng trùng hợp phân tử ADN.Trong quá trìnhphản ứng PCR xảy ra, đoạn mồi oligonucleotid gắn vào hai đầu của đoạn ADNcần khuếch đại theo nguyên tắc bổ trợ và tạo ra các vùng ADN sợi kép ngắn.Nhờ vậy, các đoạn mồi giúp định hướng để enzyme ADN polymerase tiến hànhkéo dài chuỗi polynucleotide và chỉ sao chép đoạn trình tự AND đích

Cấu trúc không gian enzim DNA polymerase

beta ở người

Enzim này xúc tác phản ứng hóa học sau

Deoxynucleoside triphotphate + ADN n ↔

Diphotphate + ADN n+1

Xúc tác mở rộng DNA-template của 3'- cuối của

một sợi DNA của một nucleotide tại một thời điểm.

Các tiểu phân dNTP (deoxyribonucleotid trisphotphate): Các đơn phân tử

này tương ứng với bốn loại base nitơ có mặt trong phân tử ADN( adenine,guanine, thymine và cytosine), đồng thời chúng là cơ chất hoạt động của enzymADN polymerase Mỗi phản ứng PCR cần 4 loại dNTP (dATP, dTTP, và dCTP)

như các tiểu phân cấu trúc hình thành nên phân tử

2.2 Phản ứng PCR xảy ra như thế nào

Phản ứng PCR cho phép khuếch đại các đoạn trình tự ADN đích thông quanhiều chu kỳ tổng hợp ADN lặp đi lặp lại nhiều lần Mỗi một phân tử ADN đíchđược tổng hợp mới sau đó lại được sử dụng làm mạch khuôn cho chu kỳ tổnghợp tiếp theo Kết quả là lượng ADN của đoạn trình tự đích tăng lên nhanhchóng sau mỗi chu kỳ và trở thành phân tử chiếm ưu thế sau khi phản ứng kếtthúc Trong các chu kỳ đầu tiên, quá trình tổng hợp ADN tăng lên theo hàm số

mũ, nhưng ở các chu kỳ sau vì lượng ADN đích được sao chép tăng lên và cácthành phần tham gia phản ứng được sử dụng hết, lượng ADN được khuếch đạităng lên theo kiểu tuyến tính, sau đó không tăng lên nữa

Mỗi một chu kỳ tổng hợp ADN liên quan dến 3 giai đoạn là biến tính, gắn mồi,

kéo dài chuỗi, trong đó mỗi giai đoạn xảy ra ở một chế độ nhiệt khác nhau đến

khi một phân tử ADN mới được tổng hợp hoàn chỉnh

Giai đoạn biến tính:

Nhiệt độ phản ứng được nâng lên trên 90°C Ở nhiệt độ này, cấu trúc ADN xoắnkép bị biến tính và tách ra thành hai mạch đơn riêng biệt và có thể dùng làm

khuôn để tổng hợp nên phân tử ADN mới nhờ hoạt dộng của enzym ADNpolymerase.

Phân tử ADN được khuếch đại sau nhiều chu kỳ

Giai đoạn gắn mồi:

Phản ứng được làm lạnh về nhiệt độ phù hợp cho việc gắn của các đoạn mồi vàophân tử ADN mạch đơn làm khuôn, nhưng không làm các mạch đơn làm khuôn

liên kết trở lại với nhau thành mạch kép Vì vậy, giai đoạn này gọi là giai đoạn

gắn mồi Nhiệt độ của giai đoạn này có thể thay đổi (35 - 60°C) tuỳ thuộc vào

chủng loại và số lượng các nucleotid có trong đoạn mồi

Giai đoạn kéo dài chuỗi:

Giai đoạn này diễn ra ở nhiệt độ mà enzym ADN polymerase có hoạt tính cao.Đối với Taq polymerase, nhiệt độ này là 72°C Nhờ sự định hướng của đoạn

mồi, enzym ADN polymerase tiến hành sao chép phân tử ADN theo nguyên tắckéo dài chuỗi polynucleotid dựa trên một mạch ADN làm khuôn Một phản ứngPCR điển hình thường gồm tổng cộng 20 - 40 chu kỳ tùy thuộc vào lượng trình

tự ADN đích có trong phân tử ADN làm khuôn Phản ứng PCR có thể sử dụng

để khuếch đại các đoạn ADN có kích thước đến vài ngàn cặp base nitơ Để cóthể thực hiện một số lượng lớn các chu kỳ biến đổi nhiệt độ khác nhau, phản

ứng PCR được tiến hành nhờ máy biến nhiệt theo chu kỳ (thermal cycler).

Trong chu kỳ đầu tiên, các phân tử ADN dược tổng hợp đến đầu tận cùng củachuỗi ADN gốc, đó là do không có sự ngăn cản enzym ADN polymerase tiếnhành sao chép cho đển đầu tận cùng cùa mạch ADN gốc Tuy vậy, trong các chu

kỳ tiếp theo, phân tử ADN mới được tổng hợp có đầu tận cùng là trình tự củađoạn mồi được sử dụng làm khuôn, và vì vậy việc tổng hợp các phân tử ADNmới chỉ giới hạn trong đoạn trình tự được giới hạn bởi các đoạn mồi, hay nóicách khác chỉ đoạn trình tự ADN đích được tổng hợp

Sự thay đổi nhiệt độ qua các giai đoạn DNA denaturation – Biến tính ở 92 0 C; Primer annealing – Gắn mồi ở 35 - 60°C và Primer extension – Kéo dài chuỗi ở 72°C

Mời các bạn cùng theo dõi những bước cơ bản trong quá trình khuếch đại qua link video sau

https://www.youtube.com/watch?v=MyLrs_h1OlE