Chuyên đề điện DI ADN TRÊN GEL AGAROSE và ỨNG DỤNG

Nguyên tắc điện di a và Hệ thống điện di dung dịch b Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm buffer để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách cá

HỘI THẢO DUYÊN HẢI VÀ ĐỒNG BẮC BẮC BỘ

Chuyên đề:

ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE VÀ ỨNG DỤNG

\

MỤC LỤC

PHẦN I MỞ ĐẦU 4

I Lý do chọn đề tài 4

II Mục đích của đề tài 4

III Đối tượng, phạm vi áp dụng 4

PHẦN II NỘI DUNG 5

A TÓM LƯỢC LÝ THUYẾT CƠ BẢN 5

CHƯƠNG 1 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG CỦA ADN 5

I Cấu trúc và chức năng của ADN 5

1 Cấu trúc hóa học của các đơn phân trong ADN 5

2 Cấu trúc chuỗi polynucleotide 6

3 Cấu trúc không gian của ADN 6

4 Chức năng của ADN 8

II Cấu trúc và chức năng của gen 8

1 Khái niệm gen 8

2 Cấu trúc chung của gen cấu trúc 8

III Các loại ADN 9

1 ADN độc bản (single - copy ADN) 9

2 ADN lặp (repetitive ADN) 10

CHƯƠNG 2 ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE 11

I Giới thiệu chung về điện di 11

1 Khái niệm 11

2 Nguyên tắc hoạt động 11

3 Các loại điện di trên gel 12

II Sử dụng enzym giới hạn trong điện di để phân tích ADN 13

1 Khái niệm enzyme giới hạn 13

2 Phân loại enzyme giới hạn 14

III Điện di ADN trên gen agarose 16

1 Giới thiệu về gel agarose 16

2 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose 16

CHƯƠNG III ỨNG DỤNG CỦA ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE 20

I Ứng dụng điện di để xác định kích thước, đặc điểm các phân tử ADN 20

II Điện di để tinh sạch và thu nhận mẫu 21

III Ứng dụng điện di cho Southern Blot 21

IV Ứng dụng điện di để phân tích các sản phẩm PCR 22

V Ứng dụng điện di để phân tích các ADN tiểu vệ tinh và vi vệ tinh 24

B CÂU HỎI VẬN DỤNG 26

I CÂU HỎI TỰ LUẬN 26

II CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM 38

PHẦN III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

Có nhiều phương pháp khác nhau có thể được sử dụng để phân tích ADN và ARN, nhưng chođến nay điện di trên gel là phương pháp được sử dụng phổ biến hơn cả nhờ ưu điểm nhanh vàtương đối đơn giản Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đạiphân tử đặc biệt là các acid nucleic và các protein trên cơ sở kích thước khối lượng, điện tích vàcấu hình của chúng

Trong các loại điện di ADN trên gel thì điện di ADN trên gel agarose là một công cụ được sửdụng rộng rãi và quan trọng để phân tích các phân tử sinh học Agarose gel là một loại gel thôngdụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn ADN có kíchthước trong khoảng 0.5 – 20 kb Kỹ thuật này đơn giản và thực hiện nhanh Hơn nữa, vị trí củaADN trong gel được xác định trực tiếp: các băng ADN trong gel được nhuộm ở nồng độ thấp củathuốc nhuộm huỳnh quang và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại

Phương pháp này được ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau như kiểm tra huyết thống,

chẩn đoán bệnh di truyền, gây đột biến điểm, phân tích mẫu ADN cổ, xác định kiểu gene của cácđột biến, so sánh mức độ biểu hiện của gene

Với vai trò quan trọng như thế nên trong các đề thi học sinh giỏi các cấp thường có phần câuhỏi về điện di Vì vậy với mong muốn nâng cao chất lượng của học sinh giỏi, cũng như cung cấpcho giáo viên và học sinh nguồn tư liệu để tham khảo, giảng dạy, học tập và quan trọng hơn hết làhoàn thiện kiến thức của bản thân về phần phân tích ADN bằng phương pháp điện di, tôi đã chọn

nội dung “Điện di ADN trên gel agarose và ứng dụng” làm đề tài nghiên cứu.

II Mục đích của đề tài

- Nghiên cứu một số vấn đề chung về cấu trúc và chứa năng ADN

- Nghiên cứu sự về phương pháp điện di ADN trên gel agarose và ứng dụng

- Định hướng tư duy cho học sinh bằng một số bài tập vận dụng

III Đối tượng, phạm vi áp dụng

- Giáo viên và học sinh lớp chuyên sinh

- Giáo viên và học sinh lớp không chuyên, yêu thích môn sinh học

PHẦN II NỘI DUNG

A TÓM LƯỢC LÝ THUYẾT CƠ BẢN CHƯƠNG 1 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG CỦA ADN

I Cấu trúc và chức năng của ADN

Axit deoxyribonucleic (ADN) là polyme có phân tử lượng lớn, có mặt trong tất cả tế bào sống.ADN tập trung chủ yếu ở các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào, ngoài ra còn có một số lượng nhỏnằm ở ty thể và lục lạp - là các ADN ngoài nhân Số lượng ADN là không thay đổi trong nhân củacác tế bào cùng loài

1 Cấu trúc hóa học của các đơn phân trong ADN

a b Hình 1 Bốn loại base của ADN (a) và cấu trúc một nucleotide - dAMP (b)

Phân tử ADN được cấu tạo từ các đơn phân là nucleotide Mỗi nucleotide có 3 thành phần cơbản: (1) một đường pentose deoxyribose; (2) một nhóm phosphate và (3) một trong bốn loại basenitơ Hai loại base cytosine (X) và thymine (T) có cấu trúc vòng đơn carbon nitrogen được gọi làcác pyrimidine Hai loại base adenine (A) và guanine (G) có cấu trúc vòng kép (hình 1a) Tên củacác loại base được dùng để đặt tên cho các nucleotide

Khi một bazơ nitơ liên kết với phân tử đường pentose bằng liên kết β-glycoside sẽ tạo thànhmột nucleoside Liên kết β-glycoside này hình thành giữa nguyên tử carbon thứ nhất (C1') củađường pentose với nguyên tử thứ 9 (N9) của bazơ purine hoặc với nguyên tử thứ nhất (N1) củabazơ pyrimidine Đồng thời gốc đường pentose cũng nối với nhóm phosphate tại nguyên tử

carbon thứ năm (C5') bằng một liên kết phosphomonoester để tạo thành một nucleotit hoàn chỉnh(hình 1b).

Do có chứa gốc photphat nên các nucleotide thường có tính acid mạnh và tan trong nước.

Các nucleoside monophosphate được xem là các axit đúng như tên gọi phản ảnh Vì vậy, các

nucleotit có mang điện tích âm.

2 Cấu trúc chuỗi polynucleotide

Các nucleotide trong ADN nối với nhau bằng các mối liên kết cộng hoá trị có tên là liên kết 3',5'-phosphodiester giữa gốc đường của nucleotide này với nhóm phosphate của nucleotide kế tiếp, tạo thành chuỗi polynucleotide Vì vậy, các chuỗi này bao giờ cũng được kéo dài theo chiều

Hình 2 Cấu trúc chuỗi polynucleotide của ADN

3 Cấu trúc không gian của ADN

Năm 1953, J Watson và F Crick: tổng hợp các số liệu phân tích hóa học và tán xạ của tia X, đểxây dựng nên mô hình cấu trúc phân tử ADN Theo mô hình này, phân tử ADN có những đặctrưng chủ yếu trong cấu trúc không gian như sau:

- ADN gồm hai chuỗi đối song song (antiparallel) một mạch có chiều 3' - 5' và mạch kia có

chiều 5'– 3’, cùng uốn quanh một trục trung tâm theo chiều xoắn phải, với đường kính 20Ao

(1angstrom = 10-10m) gồm nhiều vòng xoắn lặp lại một cách đều đặn và chiều cao mỗi vòng xoắn

là 34Ao, ứng với 10 cặp base (base pair, viết tắt là bp)

- Các bộ khung đường-phosphate phân bố ở mặt ngoài chuỗi xoắn và các base nằm ở bêntrong; chúng xếp trên những mặt phẳng song song với nhau và thẳng góc với trục phân tử, vớikhoảng cách trung bình 3,4Ao

- Hai sợi đơn gắn bó với nhau bằng các mối liên kết hydro (vốn là lực hóa học yếu) được hình thành giữa các cặp base đối diện theo nguyên tắc bổ sung "một purine - một pyrimidine" Cụ thể

là, trong ADN chỉ tồn tại hai kiểu kết cặp base đặc thù là A-T (với hai liên kết hydro) và G-C (với

ba liên kết hydro)

Hình 3 Cấu trúc không gian của ADN theo mô hình J Watson và F Crick

- Tính chất bổ sung theo cặp base dẫn đến sự base giữa hai sợi đơn của mỗi chuỗi xoắn kép Vìvậy, trong ADN sợi kép bao giờ cũng có: A = T và G = C (quy luật Chargaff); nghĩa là (A+G) =(T+C) hay tỷ số (A+G)/ (T+X) = 1, còn tỉ lệ (A+T)/ (G+X) đặc thù cho từng loài

Ngoài mô hình của J.Oatxơn, F.Cric nói trên đến nay người ta còn phát hiện ra 4 dạng nữa đó làdạng A, C, D, Z các mô hình này khác với dạng B (theo J.Watson, F.Crick) ở một vài chỉ số: sốcặp nuclêôtit trong một chu kỳ xoắn, đường kính, chiều xoắn

Ở một số loài virut và thể ăn khuẩn ADN chỉ gồm một mạch pôlinuclêôtit ADN của vi khuẩn,ADN của lạp thể, ti thể lại có dạng vòng khép kín

4 Chức năng của ADN

ADN có 2 chức năng: vừa lưu giữ và bảo quản thông tin di truyền vừa truyền thông tin ditruyền qua các thế hệ

a ADN lưu giữ và bảo quản thông tin di truyền

– Thông tin di truyền tức thông tin về cấu trúc của các phân tử prôtêin được mã hóa trong ADNdưới dạng trình tự các bộ ba nulêôtit kế tiếp nhau, trình tự này qui định trình tự sắp xếp của cácaxit amin trong phân tử prôtêin được tổng hợp

– Mỗi đoạn của phân tử ADN mang thông tin qui định cấu trúc của một loại prôtêin được gọi là

gen cấu trúc Bình thường, một gen cấu trúc chứa khoảng từ 600 đến 1500 cặp nuclêôtit

b ADN truyền thông tin di truyền qua các thế hệ

– ADN có khả năng tự nhân đôi và phân li Sự nhân đôi và phân li của ADN kết hợp với nhânđôi và phân li của nhiễm sắc thể trong phân bào là cơ chế giúp sự truyền thông tin di truyền từ tếbào này sang tế bào khác, từ thế hệ cơ thể này sang thế hệ cơ thể khác

– ADN còn có khả năng sao mã tổng hợp ARN và qua đó điều khiển giải mã tổng hợp prôtêin.Prôtêin được tổng hợp tương tác với môi trường thể hiện tính trạng của cơ thể

II Cấu trúc và chức năng của gen

Nhiễm sắc thể chứa ADN là cấu trúc mang gen Gen được truyền từ bố mẹ sang con cái vàđược xem là đơn vị cơ bản của sự di truyền, ảnh hưởng lên mọi cấu trúc và chức năng của cơ thể

1 Khái niệm gen

Gen là một đoạn xác định của phân tử ADN (một số virut là ARN) có chức năng di truyền nhấtđịnh – một chuỗi pôlipeptit hay một phân tử ARN

Ở tế bào nhân thực ngoài các gen nằm trên NST trong nhân tế bào còn có các gen nằm trongcác bào quan ở tế bào chất

2 Cấu trúc chung của gen cấu trúc

Hình 4 Cấu trúc chung của gen cấu trúc

- Mỗi gen mã hóa cho prôtêin điển hình gồm 3 vùng trình tự nuclêôtit:

+ Vùng điều hòa nằm ở đầu 3' mạch mã gốc của gen mang tín hiệu khởi động và kiểm soátphiên mã

+ Vùng mã hóa mang thông tin mã hóa cho các axit amin

+ Vùng kết thúc nằm ở đầu 5' mạch mã gốc của gen, mang tín hiệu kết thúc phiên mã

Vùng mã hóa có cấu trúc phân mảnh hoặc không phân mảnh tùy thuộc vào sinh vật Các gencủa sinh vật nhân sơ có vùng mã hóa liên tục Phần lớn các gen của sinh vật nhân thực có vùng

mã hóa không liên tục Xen kẽ giữa các đoạn mã hóa axit amin (exon) là các đoạn không mã hóaaxit amin (intron) Các gen như vậy gọi là gen phân mảnh Số lượng exon và intron của các genkhác nhau là khác nhau

Ở sinh vật nhân sơ có vùng mã hóa liên tục (gen không phân mảnh)

Ở sinh vật nhân thực có vùng mã hóa không liên tục: xen kẽ các đoạn mã hóa axit amin (exôn)

là các đoạn không mã hóa axit amin (intron) Vì vậy, các gen này được gọi là gen phân mảnh

III Các loại ADN

Mặc dù ADN mang thông tin mã hóa cho các protein nhưng trong thực tế chỉ có ít hơn 5%trong số 3 tỷ cặp nucleotide trong genome của người thực sự làm chức năng này, còn lại phần lớn

vật liệu di truyền chưa được biết chức năng Người ta chia ADN thành các loại ADN độc bản và

ADN lặp

1 ADN độc bản (single - copy ADN)

ADN độc bản chiếm khoảng 45% genome và gồm các gene mã hoá cho các protein Các đoạnADN loại này chỉ được thấy một lần duy nhất (hoặc vài lần) trong genome Tuy nhiên phần mãhóa cho protein chỉ chiếm một phần nhỏ trên loại ADN này mà thôi, phần lớn còn lại là các intronhoặc là các đoạn ADN nằm xen giữa các gene

2 ADN lặp (repetitive ADN)

ADN lặp chiếm 55% còn lại của genome, đây là các đoạn ADN được lặp đi lặp lại có thể lêntới hàng nghìn lần trong genome, có 2 loại chính:

* ADN vệ tinh (satellite ADN): Loại ADN này chiếm khoảng 10% genome và tập trung ở một

số

vùng nhất định trên NST, ở đó chúng sắp xếp nối đuôi nhau, cái này tiếp theo cái kia ADN vệtinh được chia thành 3 loại nhỏ:

- ADN vệ tinh alpha: có kích thước 171bp, lặp đi lặp lại nhiều lần với chiều dài hàng triệu bp

hoặc hơn Loại này được thấy cạnh tâm động của NST

ADN tiểu vệ tinh (minisatellite ADN): Đó là các trình tự base lõi lặp lại có kích thước từ 14

-500 bp, lặp đi lặp lại với chiều dài thay đổi từ 1.000 base (1 KB) đến 30.000 base (30 KB) Cáctiểu vệ tinh này hiện diện rải rác tại nhiều vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh đa vị trí; hay chỉ có tạimột vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh đơn vị trí

- ADN vi vệ tinh (microsatellite ADN): Là các trình tự có có kích thước nhỏ từ 1 - 13 bp, lặp lại

nhiều lần (từ 10 đến 60 lần) với tổng chiều dài dưới 1000 base Do kích thước nhỏ nên các trình

tự này còn được gọi là các STRs (Short TADNem Repeats, các trình tự lặp lại)

Hai loại ADN tiểu và vi vệ tinh có sự khác nhau rất lớn trong chiều dài giữa người này với người khác và điều này làm chúng trở nên rất hữu ích trong việc lập bản đồ gene ADN tiểu vệ

tinh và vi vệ tinh được gặp với tần số trung bình là 1 trên mỗi 2kb trong genome và chúng chiếmkhoảng 3% genome

* ADN lặp lại rải rác: Loại ADN này chiếm khoảng 45% genome, gồm 2 loại:

- Các yếu tố rải rác có kích thước ngắn (SINEs: short interspersed elements): kích thước từ 90

mẹ sang con cái theo quy luật di truyền Tuy nhiên khác với gen, rất khó tìm thấy sự khác biệt về

trình tự base của gen giữa các cá nhân, có khá nhiều trình tự base lặp lại giúp có thể giúp phân

biệt được cá nhân này với các nhân khác, và chẳng những thế, có thể giúp tìm xem họ có quan

hệ huyết thống với nhau hay không Các trình tự base lặp lại này được gọi là các dấu vân tayADN

CHƯƠNG 2 ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE

I Giới thiệu chung về điện di

1 Khái niệm

Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điệntrường Sự dịch chuyển này do thành phần lực điện trong lực Lorentz

Nhiều phương pháp nghiên cứu về phân tử ADN đều liên quan đến điện di trên gel

Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để phân

tích các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước,hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point)

2 Nguyên tắc hoạt động

a b

Hình 6 Nguyên tắc điện di (a) và Hệ thống điện di dung dịch (b)

Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản

gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử và các chất nhuộm khác nhau (ethidiumbromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di

Nguyên tắc của phương pháp là khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường,chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng.Khác với protein, loại phân tử có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, các nucleic acid luôn cóđiện tích âm nhờ khung phosphate của nó và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương Cácphân tử ADN khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳnghay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode)với tốc độ di chuyển khác nhau Vì vậy, chúng dần dần tách nhau ra trên trường điện di, qua đóngười ta có thể thu thập và phân tích được từng phân đoạn ADN hoặc gen riêng rẽ Trên điệntrường các phân đoạn ADN có kích thước càng nhỏ thì có tốc độ di chuyển càng nhanh và ngượclại

Độ linh động hoặc tốc độ chuyển động của phân tử

tăng lên khi hiệu điện thế và điện tích của phân tử tăng

lên và ngược lại độ linh động giảm khi ma sát giữa các

phân tử hoặc độ nhớt của môi trường tăng làm cản trở

dòng di chuyển

Sau khi điện di kết thúc, các phân tử ADN có thể quan

sát thấy nhờ sử dụng các thuốc nhuộm phát huỳnh quang,

chẳng hạn như ethidium (chất này gắn kết với ADN bằng

cách cài vào khe ở giữa các nucleotit) Mỗi một băng điện

di thường phản ánh một tập hợp các phân tử ADN có

cùng kích thước (hình 7)

3 Các loại điện di trên gel

Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy

điện di trên một khuôn đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặcpolyacrylamide gel Trong đó gel của agarose và polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất.Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp mẫu Gel được ngâmtrong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ởmột giá trị không đổi tương đối

Gel được cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thốngmạng lưới với kích thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử và phản ứng tạoliên kết chéo Các kiểu điện di:

 Điện di trên gel agarose: khả năng phân tách gel 50bp – 20kb

 Điện di trên gel polyacrylamide : khả năng phân tách gel 5bp – 1kb

 Ngoài ra còn điện di trong trường xung (PFGE _ Pulse Field Gel Electrophonesic)Trong đó, gel polyacrylamid có khả năng phân tách cao, nhưng khoảng kích thước ADN có thểphân tích hẹp Vì vậy, điện di trên gel polyacrylamid có thể phân tách được các phân đoạn ADNkhác nhau thậm trí chỉ một cặp nucleotit (1 bp) duy nhất, nhưng thường chỉ để phân tích các đoạnADN kích thước vài trăm bp Còn gel agarose có khả năng phân tách thấp hơn đối với các phânđoạn ADN kích thước nhỏ, nhưng rất hiệu quả khi phân tách các phân đoạn ADN kích thước lớntới hàng chục hoặc hàng trăm kb (1 kb = 1000 bp)

Các phân đoạn ADN kích thước lớn không thể “lọt” qua các lỗ có kích thước nhỏ trên các bảngel, kể cả gel agarose Thay vào đó, chúng sẽ “trườn” qua mạng lưới của gel bằng việc đầu nàycủa phân tử đi trước, còn đầu kia theo sau Kết quả là các phân đoạn ADN kích thước lớn (từ 30đến 50 kb) có tốc độ di chuyển trên điện trường gần như tương đương và khó phân tách đượcbằng phương pháp điện di thông thường Đối với các phân đoạn ADN kích thước lớn như vậy,

Hình 7 Minh họa kết quả hình

ảnh điện di

người ta có thể phân tách bằng việc sử dụng phương pháp điện di xung trường (pulsed-field gel

electrophoresis) Trong phương pháp này, người ta sử dụng 2 cặp điện cực nằm chéo góc trên bảnđiện di Việc “bật” và “tắt” luân phiên 2 cặp điện cực sẽ làm cho các phân đoạn ADN lớn thay đổichiều di chuyển Các phân đoạn ADN có kích thước càng lớn càng chậm hơn trong quá trình thayđổi chiều di chuyển Nhờ vậy, các phân đoạn có kích thước khác nhau sẽ phân tách ra khỏi nhautrong quá trình di chuyển Kỹ thuật điện di xung trường trong thực tế có thể sử dụng để xác địnhđược kích thước đầy đủ của nhiễm sắc thể vi khuẩn, hoặc nhiễm sắc thể các loài sinh vật nhânchuẩn bậc thấp, như nấm men Những loài này có kích thước hệ gen khoảng vài Mb

Điện di không những có thể phân tách các phân đoạn ADN khác nhau về kích thước mà cả vềhình dạng và cấu hình không gian của chúng Các phân tử ADN ở dạng mạch vòng giãn xoắnhoặc bị “đứt gãy” ở một số nucleotit di chuyển chậm hơn trên trường điện di so với các phân tửADN ở dạng mạch thẳng có cùng khối lượng Tương tự như vậy, các phân tử ADN ở dạng siêuxoắn, kích thước và thể tích thu nhỏ thường di chuyển nhanh hơn trên trường điện di so với cácphân tử ADN dạng mạch vòng giãn xoắn hoặc có mức độ cuộn xoắn thấp hơn có cùng khốilượng

Như vậy, các phân tử âm hay dương trong một điện trường sẽ di chuyển trong gel với vận tốckhác nhau nhờ vào sự khác nhau của:

 Lực điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau)

 Kích thước của phân tử so với kích thước của lỗ gel

 Hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử

II Sử dụng enzym giới hạn trong điện di để phân tích ADN

Hầu hết các phân tử ADN trong tự nhiên đều lớn hơn nhiều so với kích thước có thể thao tác vàphân tích một cách thuận lợi trong phòng thí nghiệm Trong các tế bào, phần lớn các nhiễm sắcthể thường là một phân tử ADN dài chứa hàng trăm thậm trí hàng nghìn gen khác nhau Vì vậy, để

có thể phân lập và phân tích từng gen, người ta phải cắt các phân tử ADN kích thước lớn thành

các phân đoạn nhỏ Công việc này được thực hiện bởi một nhóm các enzym đặc biệt gọi là enzym

giới hạn.

1 Khái niệm enzyme giới hạn

Enzyme giới hạn (restriction enzyme, RE) là một enzyme endonuclease có vị trí nhận biết

điểm cắt ADN đặc hiệu Những enzyme này phân huỷ liên kết phosphodieste của bộkhung ADN mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases Các liên kết hóa học mà bị enzyme này

cắt có thể được nối trở lại bằng loại enzyme khác là các ligases, vì thế các phân đoạn giới hạn (sản phẩm của phản ứng cắt RE) mà bị cắt từ các nhiễm sắc thể hoặc gene khác nhau có thể

được ghép cùng nhau nếu có trình tự đầu dính bổ sung với nhau Nhiều kỹ thuật sinh học phân

tử và kỹ thuật di truyền đều dựa vào các enzyme giới hạn

Thuật ngữ giới hạn xuất phát từ việc các enzyme này được khám phá từ các chủng E coli màđang hạn chế sự phát triển của các thực khuẩn thể Vì thế enzyme giới hạn được cho là cơ chế của

vi khuẩn nhằm ngăn chặn sự tấn công của virus và giúp loại bỏ các trình tự của virus

2 Phân loại enzyme giới hạn

Enzyme cắt giới hạn được chia thành ba loại là Loại I, Loại II và Loại III Đối với hai loại I vàIII, cả hoạt tính phân giải acid nucleic hay phân giải nhóm methyl đều thực hiện chung bởi mộtphức hợp enzyme lớn Mặc dù những enzyme thuộc hai loại này cũng nhận biết những trình tựADN đặc hiệu, vị trí cắt thường cách xa vị trí nhận biết, có khi đến cả trăm base Chúng cũng cầnATP để hoạt động Những enzyme này bắt đầu bằng việc kiểm tra tình trạng methyl hóa của 2adenine trong vùng nhận biết Nếu cả hai adenine đều không được methyl hóa (dấu hiện cho thấyđây là ADN ngoại lai), phức hợp enzyme thay đổi cấu hình và thực hiện hoạt tính phân giải Tuynhiên, nếu một trong hai adenine được methyl hóa, chứng tỏ là ADN của tế bào, enzyme khi đó sẽthực hiện chức năng của một enzyme methyl hóa cho gốc adenine còn lại để duy trì sự ổn địnhcho ADN bộ gene Với enzyme giới hạn loại II, chức năng phân giải của nó không liên quan đếnchức năng methyl hóa hay phân giải nhóm methyl, và vị trí cắt cũng nằm ngay bên trong hay kếcận vị trí nhận biết

Bảng 1 Điểm khác nhau giữa 3 loại enzim cắt giới hạn

Điểm cắt Cách xa điểm nhận biết

(trên 1000bp)

Nằm trong điểmnhận biết

Nằm ngoài điểm nhậnbiết (gần hơn loại I)Khả năng metyl hoá

Ngày nay, người ta biết rất nhiều enzyme khác nhau loại II và chúng là một trong những công

cụ sinh học phân tử thiết yếu, đặc biệt thường gặp trong các ứng dụng dòng hóa gene hay phântích ADN nhờ vị trí và trình tự cắt của chúng được xác định rõ Các trình tự giới hạn của enzymnhóm II thường gồm 4 - 8 bp, thông thường có tính đối xứng và vị trí cắt thường nằm trong trình

tự giới hạn này Ví dụ như enzym giới hạn EcoRI được tìm thấy ở vi khuẩn E coli có trình tự giới

hạn là 5’-GAATTC-3’ với vị trí cắt ở giữa G và A Tên enzym gồm 3 ký tự đầu chỉ tên loài vi

khuẩn mà từ đó enzym được tìm thấy (Eco = Escherichiacoli), các ký tự sau chỉ tên của chủng vi khuẩn và số thứ tự của enzym được tìm thấy ở loài vi khuẩn đó (EcoRI là enzym giới hạn đầu tiên được tìm thấy ở E coli).

Giả sử có một phân tử ADN mạch thẳng có 6 vị trí cắt của enzym EcoRI Việc cắt phân tử ADN này bằng EcoRI sẽ cho ra 7 phân đoạn ADN khác nhau Do đó, khi điện di trên gel sản phẩm cắt,

7 phân đoạn ADN sẽ phân tách nhau ra do chúng khác nhau về khối lượng (vì chúng khác nhau vềthành phần và trình tự các nucleotit) Như vậy, một phân đoạn ADN sẽ tương ứng với một vùngcủa phân tử ADN ban đầu

Việc sử dụng một enzym giới hạn khác, chẳng hạn HindIII cũng có trình tự giới hạn gồm 6 bp,

nhưng có trình tự giới hạn thay đổi (5’-AAGCTT-3’) sẽ cho ra các sản phẩm cắt khác với khi sử

dụng EcoRI (với cùng phân tử ADN ban đầu) Như vậy, việc sử dụng đồng thời nhiều enzym giới

hạn sẽ tạo ra một kiểu hình phổ điện di các phân đoạn cắt giới hạn đặc thù đối với từng gen phântích

Đối với một số enzym giới hạn

khác, chẳng hạn như Sau3A1 (ở vi

khuẩn Staphylococcusaureus) có

trình tự giới hạn ngắn hơn

(5’-GATC-3’), nên tần số cắt của chúng

thường cao hơn các enzym có trình

tự giới hạn dài Theo xác

suất, Sau3A1 có trung bình 1 vị trí

cắt trong một đoạn trình tự khoảng

dài đoạn trình tự giới hạn đặc trưng của chúng, mà chúng còn khác nhau về cách “cắt” phân tử

ADN Chẳng hạn như enzym HpaI và EcoRV tạo ra các phân tử ADN dạng đầu bằng (đầu tù), còn các enzym EcoRI, HindIII và PstI cắt phân tử ADN tạo ra các phân đoạn có đầu dính (hình 8).

Gọi là “đầu dính” bởi phần các trình tự ở hai đầu sau khi được enzym cắt ra bổ trợ với nhau theonguyên tắc Chargaff và vì vậy chúng có xu hướng “dính” trở lại với nhau, hoặc với các phân tửADN được cắt bởi cùng một loại enzym giới hạn Tính chất này được ứng dụng rộng rãi trongcông nghệ ADN tái tổ hợp và các kỹ thuật tách dòng phân tử

Hình 8 Enzim cắt giới hạn đầu dính và đầu bằng

III Điện di ADN trên gen agarose

1 Giới thiệu về gel agarose

Agarose là một polysaccharide, thường được

chiết xuất từ rong biển nhất định Nó là một

polymer tuyến tính được tạo thành từ đơn vị lặp đi

lặp lại của agarobiose, là một disaccharide tạo thành

từ D -galactose và 3,6-anhydro- L -galactopyranose

(hình 9) Agarose là một trong hai thành phần chính

của thạch và được tinh chế từ thạch bằng cách loại

bỏ thành phần khác của agar, agaropectin

Agarose gel là một chất trong suốt (transparent) hoặc trong mờ (transluent) giống như agar,được tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100oC và sau

đó được làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45oC Polyme agarose có thể chứa tới 100 đơn

vị monomer, với khối lượng phân tử trung bình vào khoảng 10000 Da Agarose có cấu trúc dạnglưới ba chiều các kênh có đường kính từ 50 nm đến > 200 nm tùy thuộc vào nồng độ agaroseđược sử dụng - nồng càng độ cao đường kính lỗ càng nhỏ Cấu trúc 3-D được tổ chức cùng vớiliên kết hydro và do đó có thể bị gián đoạn do làm nóng trở lại trạng thái lỏng

Vì có cấu trúc dạng lưới phù hợp nên agarose thường được sử dụng trong sinh học phân tử đểtách các phân tử lớn, đặc biệt là ADN, bằng điện di Các tấm gel agarose (thường là 0,7 - 2%) đốivới điện di được chuẩn bị dễ dàng bằng cách đổ dung dịch ấm, lỏng vào khuôn Một loạt cácagaroses khác nhau của trọng lượng phân tử khác nhau và tài sản là thương mại có sẵn cho mụcđích này Agarose cũng có thể được hình thành thành các hạt và được sử dụng trong một sốphương pháp sắc ký để làm sạch protein

Đoạn ADN mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau qua các bản gelchứa các nồng độ agarose khác nhau Do đó, dùng gel ở các nồng độ khác nhau có thể phân táchđược các đoạn ADN có kích thước khác nhau Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách cácđoạn ADN nhỏ, trong khi đó nồng độ agarose thấp lại cho phép phân tách các đoạn ADN lớn hơn

2 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose

2.1 Chuẩn bị gel agarose

Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di, loại agarose dùng tốt nhất trongthí nghiệm là type-II-agarose có nội thẩm thấu thấp (low-endo-osmotic) Nó dễ dàng chảy ra vàtạo thành một dung dịch trong suốt, kết quả là gel đàn hồi thậm chí ở các nồng độ thấp Tuynhiên, type-II-agarose dễ bị bẩn bởi sulphate polysaccharides (SP), hơn nữa SP còn ức chế cácenzyme như ligase, polymerase và RE Vì thế, các đoạn ADN dung ly từ những gel như thế phải

Hình 9 Cấu trúc phân tử của agarose.

được làm sạch cẩn thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất cho cácenzyme này

* Đệm pH

Một số đệm điện di thích hợp cho ADN sợi đôi thường được dùng là Tris-acetate-EDTA (TAE),Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM và pH 7,5-7,8 Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn(conductivity) Nếu chúng ta dùng nước thay vì là đệm trong quá trình điện di, thì sẽ không có sựdịch chuyển cần thiết của ADN trong gel Ngược lại, nếu sử dụng đệm nồng độ đậm đặc (ví dụ:dung dịch stock ×10), thì nhiệt độ trong gel có thể tăng cao và làm nóng chảy nó

* Các bước chuẩn bị gel agarose như sau:

- Cho lượng thích hợp agarose và

dung dịch đệm vào bình tam giác

- Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút

trong nồi hấp cao áp ở 115°C hoặc

bằng vi sóng Chú ý khi dùng lò vi

sóng cần quan sát để tránh trào gel ra

ngoài, nên chờ đến khi gel sôi thì cắt

điện, lấy ra, lắc đều rồi cho vào làm sôi

lần nữa Lặp lại ba lần cho agarose tan

hoàn toàn

- Cho vào chậu cho đến khi dịch gel

đạt đến khoảng 50 – 60oC thì cho vào

gel một lượng dung dịch ethidium bromide để có hàm lượng cuối cùng của chất màu này là 50μg/ml (Nếu không cho ethidium bromide vào gel lỏng trước khi rót gel vào khuôn thì ngâm bảngel vào dung dịch này sau khi đã điện di)

- Rót gel vào khuôn đã được chắn hai đầu bằng băng dán hoặc bằng kẹp, đã cài sẵn lược và đặttrên mặt phẳng

- Chờ cho đến khi gel rắn hoàn toàn thì cẩn thận tháo lược ra khỏi gel

Hình 10 Chuẩn bị gel agarose

lỗ răng lược thì nằm gọn trong đó và có màu rõ ràng Dung dịch màu tải mẫu 6× chứa 30%glycerol, 0,25% bromophenol blue (BPB) và 0,25% xylencyanol (XC).

- Bằng micropipet hút mẫu ADN, mỗi mẫu là một hỗn hợp nhiều phân đoạn ADN khác nhauđược tra vào các giếng riêng biệt (các lỗ răng lược) ở đầu mỗi bản gel (hình 11)

Hình 11 Tra dung dịch chứa các phân đoạn ADN vào các giếng

- Bật dòng điện một chiều để thực hiện điện di Cường độ dòng điện khoảng 50 đến 150 V tùyloại thiết bị điện di Thời gian điện di thay đổi phụ thuộc vào độ lớn của ADN, nồng độ agarosecủa gel và cường độ dòng điện

2.3 Nhuộm ADN trong agarose gel bằng EtBr

Phương pháp quan sát ADN trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm huỳnh quangEtBr Thuốc nhuộm này phát huỳnh quang màu hồng dưới nguồn ánh sáng cực tím, cho phép pháthiện các băng ADN riêng rẽ Vì sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid vàcho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel Mặc dù tính linh động điện di của ADN sợi đôimạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhưng khả năng xác định gel trực tiếpdưới ánh sáng UV trong suốt quá trình điện di hoặc ở

giai đoạn cuối có ưu thế rõ rệt

Cách nhuộm: Sau khi chạy điện di xong lấy nhẹ

bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr

nồng độ 0,5% trong thời gian 30-45 phút, tốt nhất

trên một máy lắc nhẹ (độ 10 vòng/phút) Đổ dịch

nhuộm EtBr vào một bình riêng để xử lý và rửa bản

gel bằng cách ngâm trong nước cất hai lần, mỗi lần 15-20 phút EtBr thường pha sẵn ở dạng đậmđặc 5 mg/mL và giữ ở 4oC trong tối

2.4 Kiểm tra băng ADN

- Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh sáng có bước sóng 302nm Dùng thiết bịchuyên dụng để phân tích và lưu trữ hình ảnh ADN (Gel Documentation System)

- Nếu điện di ADN trong gel có pha sẵn ethidium bromide thì chiếu tia tử ngoại (UV) nucleidacid sẽ hiện ra dưới dạng những vạch màu đỏ cam Mỗi băng chứa hàng nghìn phân tử đoạn ADN

có kích thước giống nhau

Hình 13 Kiểm tra băng ADN dưới ánh sáng UV

- Nếu không cho trước ethidium bromide thì sau khi điện di cần ngâm gel 30 - 60 phút trongdung dịch thuốc nhuộm này ở nồng độ 0,5 μg/ml

- Nếu cần chụp ảnh lưu tư liệu thì có thể dùng máy ảnh pollaroid với ống kính có phin lọc ánhsáng thích hợp với film pollaroid 667, hoặc dùng thiết bị phân tích gel số hóa (gel documentationsystem)

Hình 14 Hệ thống máy chụp ảnh điện di Hình 15 Kết quả điện di trên gel agarose

chụp bằng ánh sáng UV

CHƯƠNG III ỨNG DỤNG CỦA ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE

Điện di ADN được ứng dụng trong nhiều phân tích để trả lời các nghi vấn sinh học khác nhau.Dưới đây là một số ứng dụng phổ biến

I Ứng dụng điện di để xác định kích thước, đặc điểm các phân tử ADN

Kích thước của phân tử ADN có thể được xác định bởi so sánh kích thước của đoạn ADN đãbiết Đoạn ADN đã biết kích thước được phân tách trên gel agarose 0.8% cùng với mẫu chưa biết.Giá trị di chuyển tương đối (Rf) của mỗi băng ADN được tính từ gel agarose Giá trị di chuyểntương đối và kích thước của ADN được sử dụng để vẽ đường cong chuẩn hóa để tính kích thướccủa mẫu ADN chưa biết

Một ứng dụng hữu ích của kỹ thuật này là phân tích các đoạn giới hạn, chúng có thể nhanhchóng cung cấp các thông tin có ích về trình tự ADN Trong kiểu phân tích này người ta cắt phân

tử ADN bằng enzim cắt giới hạn, sau đó các đoạn ADN được phân tách trên gel điện di Khi hỗnhợp dịch chuyển qua trường điện di nó tạo nên một kiểu băng đặc trưng cho phân tử ADN gốcban đầu

Việc phân tích các đoạn giới hạn cũng rất hữu ích cho so sánh hai phân tử ADN khác nhau, đặcbiệt là so sánh hai alen của cùng một gen Một enzim giới hạn nhận ra một trình tự đặc thù vàthậm chí chỉ cần một thay đổi ở một cặp bazơ trên trình tự đó cũng đủ để bảo vệ nó không bị cắt

Vì vậy, nếu hai alen khác nhau về các nucleotit trong vị trí giới hạn thì việc xử lý bằng enzimnhận biết ra trình tự đó sẽ tạo nên hai hỗn hợp các đoạn khác nhau tương ứng với hai alen Mỗihỗn hợp như thế lại tạo nên các băng điện di riêng như ví dụ về đột biến bệnh hồng cầu lưỡi liềmhình 16 dưới đây

Hình 16

A Các vị trí giới hạn của Ddel ở alen bình B Điện di các đoạn giới hạn bắt nguồn

thường và alen đột biến hình lưỡi liềm thuộc

gen β-globin

từ alen bình thường và alen đột biến hình lưỡi liềm thuộc gen β-globin

II Điện di để tinh sạch và thu nhận mẫu

Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi hướng điện trường trong quá trình điện di Mỗi lần hướng

điện trường thay đổi thì phân tử ADN phải tự định hướng lại Sau khi điện di các vạch tương ứngvới ADN cần tinh sạch được phát hiện và thu nhận lại theo một trong những phương pháp:

 Phương pháp 1: phần agarose chứa các vạch đó được cắt ra và ADN được thu nhận sau khi

đã khuếch tán phân tử gel agarose vào một dung dịch đệm thích hợp

 Phương pháp 2: một “giếng” nhỏ được khoét trong agarose ngay trước vạch ADN “giếng”

này được bơm đầy dung dịch đệm và điện trường được tái lập ADN di chuyển vào giếng chứađầy dung dịch đệm và được thu nhận lại

 Phương pháp 3: Điện di được thực hiện trong một gel agarose đặc biệt (như Nusieve hay

Seaplaque) có điểm nóng chảy rất thấp (65°) Sau điện di vạch ADN được cắt ra, ủ trong mộtdung dịch đệm ở 65° Khi agarose đã hoàn toàn tan chảy, ADN được thu nhận lại sau nhiều côngđoạn tách chiết và tủa

III Ứng dụng điện di cho Southern Blot

Southern blot là quá trình chuyển các phân tử ADN từ gel agarose lên một màng và nhờ đógiúp các nhà nghiên cứu định vị trình tự ADN bên trong một hỗn hợp phức tạp Southern Blot cóthể được sử dụng để xác định vị trí một gen cụ thể trong toàn bộ hệ gen

Hình 17 Các bước trong kỹ thuật Southern Blot

Trong kỹ thuật Southern Blot, ADN hệ gene được cắt với Enzyme cắt giới hạn EcoRI hoặcBamHI để cắt những sợi ADN có khối lượng phân tử lớn thành những đoạn nhỏ hơn và các đoạnADN được điện di trên thạch agarose (agarose gel) để phân tách chúng theo kích thước Nếunhững đoạn ADN nào kích thước lớn hơn 15kb, thì trước khi thẩm tách, gel có thể được xử lý bởiacid (như HCl loãng) Cách này loại bỏ các đoạn ADN lớn, bẻ gãy chúng thành những mảnh nhỏ,

do đó cho phép sự dịch chuyển hiệu quả hơn từ gel tới màng Gel này được ủ với dung dịch kiềm

để biến tính sợi đôi ADN thành sợi đơn Một tấm màng nitrocellulose (hoặc nylon thay thế) đượcđặt bên trên (hoặc dưới, tùy thuộc vào hướng di chuyển) gel Áp lực được áp dụng đồng đều trêngel (hoặc dùng cách hút, hoặc đặt một chồng giấy và một khối lượng lên bên trên màng và gel,nhằm đảm bảo sự tiếp xúc tốt và đồng đều giữa gel và màng ADN được chuyển lên màngnitrocellulose bởi hoạt động mao dẫn bằng áp dụng một áp suất đồng nhất hoặc bởi áp suất húthoặc bởi đặt khăn giấy ướt Màng sau đó được nung trong chân không hoặc trong lò thôngthường ở 80°C trong 2 giờ để gắn vĩnh viễn ADN-di chuyển lên màng Màng sau đó được tiếpxúc với đầu dò lai ghép (hybridization probe) - một đoạn ADN đơn với một trình tự đặc biệt, cóxuất hiện trong trình tự ADN đích, để được xác định Đầu dò ADN (ADN probe) được đánh dấunhằm để được phát hiện, bằng cách liên kết với phóng xạ hoặc gắn với thuốc nhuộm huỳnh quanghoặc sắc tố nhuộm Trong vài trường hợp, đầu dò lai ghép có thể được tạo từ ARN chứ không