CHUYÊN đề CÔNG NGHỆ di TRUYỀN ĐỘNG vật và bài tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN si06

- Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật.Vì thế, sản lượng củachúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài thường

HỘI THẢO KHOA HỌC

CHUYÊN ĐỀ

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN ĐỘNG VẬT

VÀ BÀI TẬP CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN

CHUYÊN ĐỀ CÔNG NGHỆ Di TRUYỀN ĐỘNG VẬT VÀ BÀI TẬP

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN

A PHẦN MỞ ĐẦU

Công nghệ sinh học là một bước tiến quan trọng trong nỗ lực lâu dài, có nhiều lĩnh vực côngnghệ sinh học khác nhau theo đối tượng ứng dụng như công nghệ sinh học phân tử, công nghệsinh học thực vật, công nghệ sinh học động vật… Công nghệ sinh học có ứng dụng rộng rãi trong

y dược, lương thực, thực phẩm, năng lượng, hóa chất, vật liệu mới nông lâm ngư nghiệp, bảo vệmôi sinh và ngày nay trong thể thao đỉnh cao công nghệ sinh học cũng ñược áp dụng một cáchhiệu quả

Công nghệ sinh học động vật (Animal Biotechnology) là một lĩnh vực chủ yếu của công nghệsinh học và công nghệ di truyền trên cơ sở ứng dụng các kỹ thuật và khoa học hiện đại mang tínhcông nghệ vào tế bào động vật Tế bào được coi là đối tượng trung tâm vô cùng quan trọng,chúng có cấu trúc phức tạp và tinh vi, thực hiện quá trình trao đổi chất như một nhà máy hóa họcvới nhiều ưu việt Do tế bào có nhiều ưu thế nên công nghệ sinh học đã sử dụng tế bào làm nhàmáy sản xuất và là công cụ thử nghiệm

Giới hạn của chuyên đề chỉ giới thiệu các thao tác và ứng dụng của công nghệ di truyềntrên tế bào động vật, và với thời gian soạn thảo ngắn, trình độ hạn chế cho nên chuyên đề khôngtránh khỏi sai sót, bản thân tôi rất mong nhận được sự đóng góp của các thầy cô giáo và các bạnđồng nghiệp để chuyên đề được hoàn thiện Một số câu hỏi sưu tầm đưa vào phần câu hỏi tự giảichưa có hướng dẫn, xin gởi đến các thầy cô tham khảo và đóng góp lời giải, xin chân thành cảm

ơn !

B PHẦN NỘI DUNG

I LÝ THUYẾT

1 Nuôi cấy tế bào động vật

1.1 Lược sử nuôi cấy tế bào động vật

- Nuôi cấy tế bào động vật triển khai lần đầu tiên năm 1907, hơn 40 năm sau mới thực sựtriển khai một cách quy mô

- Những năm đầu thập kỷ 50 thế kỷ XX, tế bào động vật có vú được nuôi với số lượng lớn đểnuôi các chủng của virus gây bại liệt ( Poliomyelite virus) dùng để chế vacxin phòng chống bạiliệt

- Nuôi cấy tế bào người để nhân nuôi nhiều chủng của virus khác nhằm sản xuất các khángthể đặc hiệu và interferon Sự phát triển của phương pháp nuôi cấy tế bào động vật và người dẫnđến sự phát triển công nghệ vacxin và các chế phẩm miễn dịch.

- Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đã tạo cơ hội để nghiên cứu các tế bào ung thư, phân loạicác khối u ác tính, mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất, xác định sự tươnghợp của mô trong cấy ghép và nghiên cứu các tế bào đặc biệt cùng sự tương tác của chúng

- Năm 1907, Harrison là người đầu tiên đã nuôi cấy thành công một mảnh mô phôi ếch trong

dịch bạch huyết với kỹ thuật “giọt treo” (Hanging drop) Năm 1923, Carel đã hoàn thiện kỹ thuật

nuôi cấy tế bào trong các bình thủy tinh (in vitro), dễ tiệt trùng và tạo điều kiện cho tế bào pháttriển tốt Nhưng phải chờ đến những năm 1960, khi hoàn thiện được môi trường nuôi cấy nhântạo thì kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật mới được phát triển mạnh và được ứng dụng vào nhiềungành công nghệ sinh học

1.2 Đặc điểm của tế bào động vật

1.1.2 Đặc điểm cấu trúc tế bào động vật

Hình 1 Cấu trúc tế bào động vật

- Trong cấu trúc tế bào động vật không có thành xenlulôzơ, không có lục lạp, hóa dị dưỡng,không có không bào trung tâm (nếu có thì rất nhỏ).Có trung thể, chất dự trữ glycogen và phânbào có sao và phân tế bào chất bằng eo thắt ở trung tâm

- Các tế bào dịch huyền phù: Tế bào hồng cầu và bạch huyết là các mô liên kết không điển hìnhdạng thể lỏng Các tế bào máu hoặc dịch bạch huyết là các tế bào dịch huyền phù (suspensioncells), hoặc không dính bám khi chúng sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro Các tế bào không dínhbám không đòi hỏi bề mặt để sinh trưởng Chẳng hạn, các tế bào bạch huyết (lymphocytes) bắtnguồn từ mô bạch huyết là các tế bào không dính bám và có hình cầu đường kính từ 10-20 µm.Chúng có thể được nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng theo phương thức tương tự vi khuẩn

2

- Các tế bào dính bám: Hầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào dính bám, vì thếchúng cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng Trong các ứng dụng, người ta sử dụng rộng rãicác loại tế bào dính bám là tế bào biểu mô và nguyên bào sợi (fibroblast) Các tế bào dính bámcần có một bề mặt ẩm để sinh trưởng như là thủy tinh hoặc plastic Các tế bào động vật thườngđược sử dụng trong nuôi cấy: tế bào bạch huyết, tế bào biểu mô, nguyên bào sợi

Hình 2: Các tế bào động vật thường được sử dụng trong nuôi cấy

(a) tế bào bạch huyết, (b) tế bào biểu mô, (c) nguyên bào sợi

- Sự liên kết giữa các tế bào : Các tế bào động vật là tế bào eukaryote, chúng được liên kết vớinhau bởi các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô, cơ quan và hệ cơ quan Các tế bào thường kếtnối, tương tác và thông tin với nhau thông qua sự tiếp xúc vật lí trực tiếp Mô động vật thườngđược phân chia theo bốn nhóm:

Biểu mô (epithelium): tạo thành lớp phủ và lớp lót trên các bề mặt tự do của cơ thể, cả bên

trong và bên ngoài

Mô liên kết (connective tissue): các tế bào thường được bao bọc trong thể gian bào rộng(kéo dài), đó có thể là chất lỏng, hơi rắn hoặc rắn

Mô cơ (muscle): Các tế bào mô cơ thường thon dài và được gắn với nhau thành một phiến

hoặc một bó bởi mô liên kết Mô cơ chịu trách nhiệm cho hầu hết chuyển động ở động vật bậccao

Mô thần kinh (nerve): Các tế bào mô thần kinh gồm có thân bào chứa nhân và một hoặc

nhiều phần mở rộng dài và mảnh được gọi là sợi Các tế bào thần kinh được kích thích dễ dàng vàtruyền xung động rất nhanh

- Các mối nối giữa các tế bào ở mô động vật.

Mối nối kín: Màng tế bào của các tế bào liền kề bị nén rất khít, gắn kết nhau nhờ những

Protein đặc hiệu Tạo thành đường bịt kín liên tục quanh các tế bào, các mối nối kín ngăn cản sự

rò rỉ dịch ngoại bào qua lớp tế bào biểu mô

Ghép nối desmosome (thể nối): Thể nối có chức năng như những chiếc đinh tán, xiết các tế

bào thành tấm chắc Thể nối được neo vào tế bào chất nhờ các sợi trung gian cấu tạo từ proteinkeratin

Mối nối hở (các mối nối thông tin): Tạo ra các kênh tế bào chất từ một tế bào đến các tế

bào liền kề Các mối nối hở được cấu tạo từ các Protein màng, bao lấy các lỗ qua đó các phân tử

có thể lưu thông từ tế bào này sang tế bào khác

1.3 Các ưu điểm của nuôi cấy tế bào động vật

- Hệ thống tế bào động vật là các “nhà máy tế bào” thích hợp cho việc sản xuất các phân tửphức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị hoặc chẩn đoán

- Các tế bào động vật đáp ứng được quá trình hậu dịch mã chính xác đối với các sản phẩm proteinsinh-dược (biopharmaceutical)

- Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen (biến nạp một gen bình thường vào trong

tế bào soma mang gen tương ứng bị khiếm khuyết để chữa bệnh do sự khiếm khuyết đó gây ra).Các mục đích chính của liệu pháp này là các bệnh ung thư, hội chứng suy giảm miễn dịch (HIV),chứng viêm khớp, các bệnh tim mạch và xơ hóa u nang

- Sản xuất các tế bào động vật để dùng làm cơ chất in vitro trong nghiên cứu độc chất học vàdược học

- Phát triển công nghệ mô hoặc phát sinh cơ quan để sản xuất các cơ quan thay thế nhân tạohoặc sinh học, các dụng cụ trợ giúp, chẳng hạn :

+ Da nhân tạo để chữa bỏng

+ Mô gan để chữa bệnh viêm gan

+ Đảo Langerhans để chữa bệnh tiểu đường

1.4 Một số hạn chế của nuôi cấy tế bào động vật

Mặc dù tiềm năng ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật là rất lớn, nhưng việc nuôi cấy một

số lượng lớn tế bào động vật thường gặp các khó khăn sau:

- Các tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn các tế bào vi sinh vật

- Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật.Vì thế, sản lượng củachúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài thường gặpnhiều khó khăn hơn

- Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tếbào dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật, và kết quả là chúng rất dễ bị biếndạng và vỡ

- Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ, và môitrường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền

- Tế bào động vật là một phần của mô đã được tổ chức (phân hóa) hơn là một cơ thể đơn bàoriêng biệt như vi sinh vật

4

- Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt.

1.5 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

1.5.1 Các yêu cầu cơ bản của nuôi cấy tế bào: Có bốn yêu cầu cơ bản để nuôi cấy tế bàothành công

- Nhà xưởng, trang thiết bị : Các trang thiết bị tối thiểu cần phải có: Tủ an toàn sinh học, máy lytâm chuyên sử dụng cho nuôi cấy tế bào, tủ ấm CO2, bể ổn nhiệt, kính hiển vi Đối với các tế bào

linh trưởng, tế bào ung thư, tế bào bị nhiễm Mycoplasma  cần nuôi cấy trong tủ an toàn sinh học

cấp độ 2 trở lên Hệ thống nuôi cấy cần đạt tiêu chuẩn bảo vệ cả người làm việc và tế bào không

bị lây nhiễm, được thiết kế theo các yêu cầu an toàn phòng thí nghiệm (ISO, GMP)

- Yêu cầu về vô trùng : Tủ an toàn sinh học cần phải được hoạt động trước khi bắt đầu làm việc ítnhất 15 phút để làm sạch không khí có thể bị nhiễm từ trước đó Khu vực làm việc bên trong tủcấy phải được khử trùng ( thường sử dụng cồn 70o hoặc isopropanol) Các nguyên vật liệu cũngcần được khử trùng trước khi đưa vào khu vực làm việc (hấp sấy tiệt trùng, lau cồn hoặc bật đèntím) Người làm việc phải mặc trang phục bảo hộ đầy đủ

- Nguồn nguyên vật liệu phải đạt tiêu chuẩn Các tế bào rất nhạy cảm đối với điều kiện dinhdưỡng, pH, điều kiện nuôi cấy… Do đó, cần chọn nguồn nguyên vật liệu phù hợp Các vật liệudùng trong nuôi cấy nên được kiểm tra xác nhận chất lượng và đảm bảo không bị nhiễm khuẩn,đặc biệt đối với huyết thanh Vì vậy, nên sử dụng các sản phẩm của những nhà cung cấp có uytín

- Người thực hiện nuôi cấy tế bào phải có kiến thức và kinh nghiệm thực hành tốt Đồng thờichấp hành các quy trình chuẩn đã được thẩm định đảm bảo cho sự thành công của việc nuôi cấy

tế bào

1.5.2.Chuẩn bị tế bào để nuôi cấy

Nuôi cấy tế bào động vật có vú có nhiều công đoạn khác nhau Công đoạn đầu tiên là chuẩn

bị tế bào để đưa vào nuôi cấy

Trước hết, các mảnh mô được tách ra khỏi cơ thể động vật trong điều kiện vô trùng Tiếptheo, các mảnh mô này được xử lý với các enzym protease, thường dung enzym trypsin để thuhuyền phù tế bào Sau khi loại bỏ tripsin, dịch huyền phù được chuyển vào bình nuôi cấy chuyêndụng bằng nhựa plastic hoặc thủy tinh Bình nuôi có đáy phẳng, rộng, có chứa môi trường nuôicấy dạng lỏng thích hợp cho từng loại mô Tế bào phải trải qua pha log (từ thời điểm bắt đầu đếnlúc có dấu hiệu phân chia tế bào đầu tiên), các tế bào sẽ tự gắn vào đáy bình nuôi và bắt đầu phânchia nguyên phân Kiểu nuôi trực tiếp tế bào có nguồn gốc từ các mô đã phân hóa gọi là nuôi cấy

sơ cấp Việc nuôi cấy sơ cấp các tế bào bình thường chỉ tạo một lớp đơn do hiện tượng kìm hãm

tiếp xúc kiểm soát quá trình phân bào của chúng Nếu ta lấy một phần của lớp tế bào để tạo rakhoảng trống thì tế bào tiếp tục phân chia tới khi khoảng trống được lấp kín thì dừng lại Nuôi các

mô, cơ, da, thận, phổi … của phôi sẽ thuận lợi hơn nuôi các tế bào của các mô của cơ thể trưởngthành Các tế bào của quá trình nuôi sơ cấp sẽ được tách khỏi bình nuôi bằng cách xử lý vớitrypsin hoặc EDTA Các tế bào này dùng làm nguyên liệu khởi đầu cho việc tạo ra dòng nuôi thứcấp (secondary cultures) Chúng được “gieo” vào môi trường sinh dưỡng với mật độ cao Các tếbào này được nhân lên với tốc độ ổn định qua nhiều lần cấy chuyển liên tiếp nhau Kết quả thuđược từng nhóm tế bào, được gọi là một chủng tế bào (cell strain) Các tế bào không tăng lên vôhạn mà chúng chỉ có khả năng phân chia một số lần nhất định cho đến khi khả năng phân chiagiảm sút và cuối cùng bị chết Ví dụ, các chủng tế bào người thường chỉ phân chia tối đa là 100lần trước khi chết

1.5.3 Các dòng tế bào liên tục (Continuous cell lines)

Không phải tất cả các dòng tế bào nuôi sơ cấp và tạo ra các dòng tế bào đều bị chết sau một

số lần phân chia mà có một số tế bào biến đổi và chúng có thể tồn tại lâu dài Ví dụ, khi nuôi tếbào chuột thì có phần lớn các tế bào bị chết sau khi phân chia 30 – 50 lần Một số ít tế bào bị biếnđổi và chúng có hình thái khác, tăng trưởng nhanh hơn và có khả năng tạo dòng tế bào riêng.Những tế bào ngoại lệ này có thể tồn tại lâu dài khác với các chủng tế bào khởi đầu của chúng vàđược gọi là các dòng tế bào (cell lines)

Trong quá trình cấy chuyển liên tục, các dòng tế bào chịu sự biến đổi sâu sắc Sự thay đổi nàydẫn đến hình thành các cụm tế bào thay cho lớp đơn và sự sắp xếp các cụm tế bào này không đều.Các dòng tế bào bị biến đổi này được gọi chung là mô ung thư và chúng có khả năng gây ung thưkhi đem các tế bào này cấy vào các cơ thế động vật tương ứng ban đầu của chúng Các tế bào ungthư này thường ở dạng lệch bội giống như trường hợp cơ thể bị nhiễm virut ung thư Để giảiquyết vấn đề này, chúng ta cần phải giữ tế bào nuôi cấy ở điều kiện đông lạnh trong niều năm, chỉkhi chúng ta cần thì sẽ nuôi cấy tế bào này sau khi đã được thực hiện giải đông Thực tế người tatiến hành trộn các chất phụ gia (glyxerin, dimethylsulphoxit) để ngăn cản sự tác hại của các tinhthể khi đưa vào đông lạnh

1.5.4 Các môi trường nuôi cấy tế bào

- Tế bào động vật có vú đòi hỏi điều kiện môi trường nuôi cấy phức tạp, đủ các chất dinhdưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng, phân chia của tế bào khi chúng đã bị tách ra khỏi cơ thể củachúng

- Nhu cầu dinh dưỡng của các tế bào động vật có vú lớn hơn vi sinh vật do, không giốngcác vi sinh vật, động vật không trao đổi chất nitrogen vô cơ Vì thế, nhiều amino acid và vitamin

6

cần phải được bổ sung vào môi trường Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vậtbao gồm các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối khoáng vàglucose Ngoài ra, môi trường cần được cung cấp từ 2-20% (theo thể tích) huyết tương của độngvật có vú Mặc dù huyết thanh có thành phần chưa được xác định đầy đủ, nhưng nhiều nghiêncứu đã cho thấy nó rất cần thiết cho sự phát triển và tồn tại của tế bào trong nuôi cấy.

- Môi trường hóa chất: Môi trường hóa chất được sáng chế từ những năm 1950 đã thay thếhoàn toàn cho các dịch sinh học như dịch chiết từ phôi gà, huyết tương,… Môi trường hóa chấtđược điều chế hàng loạt, cất giữ được lâu, dễ thay thế, thêm, bớt các chất cần thiết, ít bị lâynhiễm… Môi trường nuôi cấy có chứa đủ các chất dinh dưỡng (Cacbonhydrat, acid amin,vitamin, nguyên tố vi lượng, hormon, nhân tố sinh trưởng) Hiện nay, người ta dùng một số môitrường nuôi cấy như môi trường Eagle, môi trường Dulbecco,…Môi trường nuôi cấy phải đẳngtrương để duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu Người ta thường dùng bicacbonat để tạo hệ đệm kếthợp với hệ làm giàu CO2 môi trường (5-10% CO2/95% không khí) trong đó tế bào được nuôi Độ

pH thích hợp là 7,4 Người ta thường sử dụng đỏ phenol để kiểm tra độ pH của môi trường, nếumôi trường chuyển dần từ đỏ sang vàng cam thì tế bào phát triển tốt, nếu chuyển sang vàng nhạt

là môi trường bị nhiễm khuẩn

- Nhân tố sinh trưởng: Nếu không có nhân tố sinh trưởng thì tế bào động vật sẽ không pháttriển Người ta thường phải bổ sung huyết thanh bê vào môi trường nuôi cấy (10-15%) vì tronghuyết thanh có chứa nhân tố sinh trưởng Nhưng dùng huyết thanh vừa đắt tiền lại vừa dễ bịnhiễm khuẩn cho nên ngày nay người ta thường dùng các chất bổ trợ để thay thế cho huyết thanhnhư: insulin, transferin, ethanolamin,… hoặc sử dụng lớp tế bào nuôi

- Môi trường nuôi cấy phải đạt những tiêu chuẩn sau:

+ Môi trường phải chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cho sự tồn tại và sinh sản của tế bào + Phải duy trì pH môi trường ( pH = 7,0 – 7,3) bằng các hệ đệm thích hợp cho từng loại môcủa loài nghiên cứu

+ Môi trường phải có các ion cần thiết và đảm bảo áp suất thẩm thấu chuẩn xác

+ Môi trường phải có các hợp chất cung cấp năng lượng như glucose

+ Có chứa phenol red để chỉ thị pH

- Có 2 loại môi trường là môi trường tự nhiên và môi trường tổng hợp

+ Môi trường tự nhiên: Môi trường tự nhiên là các dung dịch chiết từ cơ thể động vật như:dịch huyết tương, dịch nước ối bào thai, dịch chiết phôi …

+ Môi trường tổng hợp: Môi trường nuôi cấy tế bào được tổng hợp từ các chất vô cơ và hữu

cơ đơn giản Với các môi trường muối cân bằng, tế bào có thể tồn tại một số giờ nhưng chúng

không phân chia Muốn cho tế bào phân chia cần bổ sung vào môi trường các amino axit(Arginin, Glutamin, Histidin,Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin… bổ sung các vitamin cầnthiết (Cholin chlorit, axit floric, nicotinic axit, pyridoxin, riboflavin, thiamin) và chất đệm nhưbicarbonat natri.

Ngoài ra, để chống hiện tượng nhiễm khuẩn, nhiễm nấm người ta bổ sung kháng sinh nhưpenicillin để kháng khuẩn và nystatine để kháng nấm và một số loại kháng sinh khác nhưtetracyline, kanamycine, gentamycine để kháng các loại khuẩn mycoplasma Cần bổ sung thêm

5 – 10 % huyết thanh vì trong huyết thanh còn chứa những thành phần như glubiline miễn dịch ,hooc môn sinh trưởng … đó là các chất rất cần thiết cho sự phân chia tế bào

Tất cả các dụng cụ nuôi phải sạch khuẩn, có tính trung tính Nước cất sử dụng để pha chếphải tinh khiết, không có các ion lạ

- Các chất kháng sinh: Các chất kháng sinh như penecillin, streptomicin hoặc amphotericin

B thường được dùng để chống nhiễm khuẩn cho mẻ cấy Tuy nhiên, các chất kháng sinh thườngđộc vì vậy phải dùng với liều lượng thích hợp và phải kết hợp với quy trình tiệt trùng chu đáo

8

Bảng 1 Thành phần môi trường Eagle (1959)

1.5.5.K ỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật :

Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền đầu tiên

(subculture)

Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là một hỗn hợp các dòng tế bào khácnhau, hoặc chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó có những tế bào quan tâm và những tế bàokhác (được gọi là tế bào nhiễm) Có thể loại bỏ các tế bào nhiễm bằng cơ học hay enzyme khitách mô hay bằng cách duy trì các điều kiện chọn lọc dương tính cho sự sống sót của một kiểu tếbào quan tâm cần thu nhận

Qui trình nuôi cấy sơ cấp gồm:

+ Bước 1: Thu nhận mô (tươi hoặc đông lạnh) có chứa tế bào sống

+ Bước 2: Phẫu tích và tách rời tế bào, xác định nồng độ

+ Bước 3: Nuôi cấy tế bào

Thu nhận mẫu và xử lý sơ bộ:

Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kỳ mô nào của cơ thể, trước khi lấy phải làm sạch mô tại vịtrí lấy, đưa mô vào bảo quan trong dung dịch DPBS, nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm

Xử lí mẫu sơ bộ bao gồm rửa nhiều lần bằng dung dịch PBS có bổ sung kháng sinh, kháng nấm,sau đó cắt bỏ các phần mô chết, phần thừa,… mẫu mô cần được cắt nhỏ thành từng mảnh 2-3

mm2

Tách rời các tế bào:

Có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như:

- Tách tế bào bằng cơ học: nghiền, ép

- Tách tế bào bằng cách ủ với enzyme trypsin hay collagenase

- Tách tế bào bằng phương pháp li tâm theo gradient tỷ trọng

- Tách tế bào bằng phương pháp dựa vào marker bề mặt

Kết quả của giai đoạn này thu được dịch tách tế bào

Nuôi cấy

- Dùng pipetman hút vào bốn eppendorf, mỗi cái 1 ml dịch tách tế bào

- Li tâm 1000 vòng/ph trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi

- Cho vào mỗi eppendorf 1 ml môi trường nuôi, huyền phù tế bào bằng vortex

- Hút dịch huyền phù tế bào ở bốn eppendorf cho vào một bình nuôi cấy (bình Roux) và bỏ sung1ml môi trường

- Ủ ở 37,50C trong tủ nuôi, sau 24h thay môi trường mới và tiếp tục ủ

Sau lần nuôi cấy sơ cấp sẽ thu được các tế bào sơ cấp Đối với trường hợp lượng mẫu mô quá

ít, người ta nuôi cấy nguyên mảnh mô để thu nhận tế bào sơ cấp

10

Hình 3: Sơ đồ nuôi cấy sơ cấp

Thu nhận mẫu mô

Cắt nhỏ (Chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô

chết)

Cắt nhỏ

(Mảnh nhỏ để nuôi)

Tách TB bằng cơ

học

(nghiền, ép)

Tách TB bằng enzyme

(ủ,…)

Nuôi mẫu mô sơ cấp

Thu nhận tế bào mới

Nuôi mảnh mô thứ cấp

1.6 Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy

Sự sinh trưởng của tế bào động vật invitro thường trải qua 4 giai đoạn:

   - Pha chậm (Lag phase): là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trường nuôi cấy cho đến khi

tế bào bắt đầu phát triển Thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của môđược lấy tế bào

  - Pha logarit (Log Phase): hay pha tiến triển (exponential phase) là giai đoạn tế bào phân chia

liên tục, tăng nhanh số lượng tế bào. Trong giai đoạn này, tế bào sinh trưởng và phân cắt với nhịp

độ tối đa so với bản tính di truyền của chúng nếu gặp môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp.Nhịp độ sinh trưởng của chúng là không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôimột cách đều đặn Quần thể tế bào trong giai đoạn này có trạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản

là như nhau, cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hóahọc và sinh lý học tế bào Sinh trưởng logarit là sinh trưởng đồng đều, tức là các thành phần tếbào được tổng họp với tốc độ tương đối ổn định Nếu cân bằng dinh dưỡng hay các điều kiện môitrường thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trưởng không đồng đều Sự sinh trưởng khi nhịp độ tổng hợpcác thành phần của tế bào tương đối biến hóa sẽ biến đổi theo cho đến khi đạt tới một sự cân bằngmới Phản ứng này rất dễ quan sát thấy khi làm thực nghiệm chuyển tế bào từ một môi trườngnghèo dinh dưỡng sang một môi trường giàu hơn Tế bào trước hết phải tạo nên các ribosomemới có thể nâng cao năng lực tổng hợp protein, sau đó là sự tăng cưởng tổng hợp protein vàDNA Cuối cùng tất yếu dẫn đến tốc độ phát triển nhanh chóng

   - Pha dừng (Stationary phase): Qua giai đoạn Logarit sự sinh trưởng sẽ dừng lại. Số lượng tế

bào cuối cùng quyết định bởi ảnh hưởng chung của điều kiện dinh dưỡng, chủng loại và các nhân

tố khác Trong giai đoạn này, số lượng tế bào sống là không thay đổi, có thể do số lượng tế bàomới sinh ra cân bằng với số lượng tế bào chết đi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn giữnguyên hoạt tính trao đổi chất Nguyên nhân chủ yếu là sự hạn chế của chất dinh dưỡng Nếu mộtchất dinh dưỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng thì sự sinh trưởng sẽ chậm lại Cũng có thể sựsinh trưởng dừng lại khi môi trường có nhiều các sản phẩm trao đổi chất có hại Sau nữa là, một

số chứng cứ cho thấy, khi số lượng tế bào đạt đến một giới hạn nhất định thì sự sinh trưởng có thể

bị dừng lại

   - Giai đoạn tử vong (Death Phase): Việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc tích lũy các chất thải

độc hại sẽ làm ảnh hưởng đến môi trường sống của tế bào, làm cho số lượng tế bào sống giảmxuống Đó là đặc điểm của giai đoạn tử vong Giống như giai đoạn logarit, sự tử vong của tế bàocũng có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi) Muốn cho tế bào tiếp tục sinhtrưởng cần thực hiện các mẻ cấy chuyền với môi trường mới

1.7 Tiềm năng của nuôi cấy tế bào động vật

Mặc dù tiềm năng ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật là rất lớn, nhưng việc nuôi cấy một sốlượng lớn tế bào động vật thường gặp các khó khăn:

   - Các tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn các tế bào vi sinh vật

   - Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật Vì thế, sản lượngcủa chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài thường gặpnhiều khó khăn hơn

   - Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế bàodày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật, và kết quả là chúng rất dễ bị biến dạng vàvỡ

   - Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ, môi trườngnuôi cấy cần bổ sung thêm huyết thanh, rất đắt tiền

   - Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt

Tế bào động vật thích hợp cho việc sản xuất các phân tử phức tạp và các kháng thể dùng làmthuốc phòng bệnh, điều trị hoặc chẩn đoán Một vài sản phẩm gene của động vật có vú cũng cóthể được sản xuất bởi vi khuẩn bằng cách dùng công nghệ ADN tái tổ hợp Tuy nhiên, vi khuẩnthiếu khả năng sửa đổi sau dịch mã (post-translational modifications) bao gồm việc phân giảiprotein, liên kết các tiểu đơn vị (subunit) hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác nhau nhưglycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành các cầu nối isulfide hoặcphosphoryl hóa (phosphorylation) các gốc amino acid Những sửa đổi này rất quan trọng ảnhhưởng đến hoạt tính sinh học của sản phẩm Do vậy, tế bào động vật vẫn là một nguồn cung cấpquan trọng, khó có khả năng thay thế trong tương lai gần

1.8 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

1.8.1 Nuôi cấy và tạo tế bào lai soma động vật

1.8.1.1 Tế bào lai soma (hybridoma)

- Nuôi cấy in vitro có thể nuôi cấy các loại tế bào của cùng một mô, của các mô khác nhautrong cùng một cơ thể, của các cơ thể khác nhau trong cùng một loài, thậm chí người ta có thểnuôi cấy các tế bào giữa các loài khác xa nhau để tạo nên tế bào lai soma

- Năm 1960, lần đầu tiên, các tác giả Barski, Sorieul, Cornefert thông báo là đã tạo được tếbào lai soma in vitro khi nuôi cấy trộn lẫn các tế bào sarcoma của chuột thuộc hai dòng khácnhau Các dòng tế bào nuôi cấy khác biệt nhau ở nhiều đặc điểm: Khả năng tạo thành u khi tiêmchúng vào chuột mang tính tương hợp mô và số lượng, hình thái nhiễm sắc thể của chúng cũngkhác nhau

12

- Tế bào đồng nhân (Homocaryon – lai giả): Là tế bào lai được hình thành từ các tế bàocùng một khởi nguồn.

- Tế bào lai dị nhân (Heterocaryon – lai thật): Là các tế bào lai được nuôi cấy thuộc các cơthể khác nhau về bậc phân loại khác

- Khi nuôi cấy trộn lẫn các tế bào thuộc hai loài khác nhau người ta vẫn có thể thu được tếbào lai một cách ngẫu nhiên nhưng xảy ra với tần số rất thấp Vì vậy, để thu được tế bào lai dễdàng với tần số cao hơn người ta thường phải sử dụng các nhân tố kích thích, thông thường người

ta dùng hóa chất hoặc virut làm nhân tố kích thích Một số virut được sử dụng làm nhân tố kíchthích đã trở nên phổ biến là các virut chứa ADN (nhóm virut Herpes, virut đậu mùa,…), các virutchứa ARN (virut lợn, virut Niucatson, virut Sendai,…) hoặc các virut gây ung thư (virut SarcomaRous),…

1.8.1.2 Đặc tính của tế bào lai soma:

- Sự hoạt hóa của nhân:

+ Khi lai các tế bào mang nhân hoạt hóa như limpho bào của chuột, tế bào ung thư Hela củangười với tế bào mang nhân bất hoạt ví dụ tế bào hồng cầu của gà, người ta thu được tế bào lai cóchứa nhân lai ở trạng thái hoạt hóa, trong đó các gen của hồng cầu gà trước đây bất hoạt nay đãtrở nên hoạt hóa, tổng hợp ARN và protein đặc trưng cho gà

+ Khi sử dụng tế bào nhân bất hoạt nhưng ở mức độ vừa phải so với nhân hồng cầu gà, ví dụ đạithực bào chẳng hạn (bình thường các đại thực bào không tổng hợp ADN và tế bào ở giai đoạnbiệt hóa G1, chúng chứa hạch nhân nhỏ và tổng hợp ít ARN) Khi nuôi cấy các đại thực bào (củachuột hoặc thỏ) với các tế bào hoạt hóa như tế bào Hela hoặc tế bào melanom của người, sẽ tạonên các tế bào lai heterocaryon, trong đó nhân đại thực bào tăng cao thể tích và chúng tổng hợpARN tăng 4-10 lần so với bình thường chỉ 1 giờ sau dung hợp và 3 giờ sau xảy ra tổng hợp ADN.Điều này chứng tỏ so với nhân hồng cầu gà, nhân đại thực bào bất hoạt ở mức thấp hơn

+ Khi nghiên cứu tiến trình tổng hợp các ARN và ADN trong tế bào lai giữa đại thực bào và tếbào melanom, người ta đã chứng minh sự tổng hợp ADN trong nhân đại thực bào không phụthuộc vào sự tổng hợp ARN và protein trong nhân đại thực bào mà phụ thuộc vào các nhân tố đến

từ tế bào chất của tế bào melanom

+ Khi lai tế bào soma với tinh trùng thì nhân của tinh trùng tồn tại trong tế bào lai rất lâu (vàitháng) và vẫn ở trạng thái bất hoạt, nhưng khi đem lai tinh tử với tế bào soma (ví dụ đem tinh tửcủa chuột cống lai với tế bào soma của chuột nhắt) thì tạo nên các tế bào lai có khả năng phânchia

+ Khi đem trứng chưa thụ tinh của chuột nhắt lai với các tế bào soma khác nhau như tế bào chuộtcống, khỉ hoặc người thì sẽ tạo nên tế bào lai và tế bào này có thể phát triển tới giai đoạn phôidâu.

- Sự thụ tinh

+ Là sự dung hợp giữa tinh trùng và trứng để tạo nên hợp tử chứa cả hai nhân – có thể được xemnhư một tế bào lai giữa hai tế bào đơn bội cùng nguồn hoặc đôi khi khác loài xảy ra in vivo, trongống dẫn trứng của con cái hoặc ở phần nào đó trong xoang bụng ngoài ống dẫn trứng là đã đượcchương trình hóa trong bộ gen của sinh vật Trong nuôi cấy in vitro, để thực hiện được sự thụ tinhgiữa tinh trùng và trứng thì tinh trùng phải được xử lý để làm thay đổi tính chất sinh lý, được gọi

là khả năng hóa (capacitation), nhưng khi sử dụng virut Sendai để kích thích thì không cần khảnăng hóa vẫn thực hiện được sự thụ tinh

- Sự điều hòa tổng hợp ADN và ARN trong tế bào lai

+ Khi sử dụng các dạng tế bào soma có đặc tính hoạt hóa hay bất hoạt khác nhau về tổng hợpADN và ARN trong nhân để tạo tế bào lai, thấy rằng:

+ Tế bào có hoạt tính càng cao tham gia vào tế bào lai sẽ kích thích nhân tế bào không có hoạttính, hoặc có hoạt tính thấp tổng hợp ADN và ARN càng tích cực hơn (trừ trường hợp tế bào íthoạt tính có kích thước lớn hơn nhiều so với tế bào hoạt tính cao, hoặc khi tế bào heterocaryonđược tạo thành từ các tế bào quá già)

+ Nhân không có hoạt tính hoặc hoạt tính thấp sẽ đạt mức tổng hợp ADN và ARN như ở nhân cóhoạt tính.Tín hiệu phát động sự tổng hợp ADN và ARN đến từ tế bào chất của tế bào có hoạt tínhcao và không mang tính đặc trưng mô hoặc loài

+ Cơ chế và nguyên tắc điều hòa sự tổng hợp ADN và ARN diễn ra trong tế bào lai tương tự như

ở tế bào bình thường Nhiều gen là bất hoạt trong các tế bào không có hoạt tính vẫn giữ trạng tháibất hoạt trong tế bào lai chứng tỏ chúng không mang tính ngược chiều, nhưng nhiều gen bất hoạt

đã trở lại hoạt động trong tế bào lai chứng tỏ chúng có tính ngược chiều Những công trình cấyghép nhân hoặc nhân bản vô tính từ tế bào soma chứng tỏ tùy loại tế bào, tùy mức độ và giai đoạnbiệt hóa mà tính ngược chiều của hoạt động gen thể hiện khác nhau từ các gen riêng lẻ, các họgen hay toàn bộ genom

- Biến đổi của bộ nhiễm sắc thể trong tế bào lai

+ Phân tích bộ nhiễm sắc thể của tế bào lai có tầm quan trọng trong việc xác định các tế bào dunghợp có thực sự là tế bào lai hay không và cho phép ta nghiên cứu nhiều vấn đề về cấu trúc, tậptính của nhiễm sắc thể như là cấu trúc hiển vi chứa thông tin di truyền của tế bào Bằng phươngpháp đánh dấu nhiễm sắc thể và phương pháp tế bào học khác như xây dựng kiểu nhân, nhuộm

14

cắt băng cũng như phương pháp lai ADN… người ta đã làm sáng tỏ nhiều vấn đề di truyền vàbiến dị của tế bào lai soma.

+ Trong tế bào lai khác loài, khi 2 bộ nhiễm sắc thể của 2 tế bào bố mẹ kết hợp lại với nhau sẽxảy ra sự biến mất một số nhiễm sắc thể của một trong hai bộ hoặc của cả hai bộ nhiễm sắc thể

Ví dụ: Khi lai giữa tế bào người và chuột nhắt thì bộ nhiễm sắc thể của người sẽ bị mất, lai giữachuột nhắt và chuột cống thì cả hai bộ nhiễm sắc thể cùng đều bị mất một số nhiễm sắc thể Sựgiữ lại hoặc loại thải nhiễm sắc thể nào trong bộ nhiễm sắc thể bố mẹ trong tế bào lai xảy rakhông phải ngẫu nhiên mà chắc chắn tuân theo các cơ chế tương tác giữa hai bộ gen trong trạngthái tế bào chất chung của tế bào lai và với môi trường nuôi cấy in vitro

+ Trong tế bào lai xảy ra sự biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể Các tế bào bố mẹ được sử dụng đểtạo tế bào lai có thể ở các giai đoạn khác nhau của chu kỳ tế bào, khi các tế bào bố mẹ dung hợptạo thành tế bào lai chứa một nhân dung hợp thống nhất với hai hoặc vài bộ nhiễm sắc thể,thường quan sát thấy sự biến đổi cấu trúc trong các nhiễm sắc thể như sự đông đặc hóa, đứt đoạn,

… Các nhiễm sắc thể bị đông đặc hoặc đứt mảnh sẽ bị loại thải qua các kỳ phân bào của tế bàolai

- Sự biểu hiện của gen thành các tính trạng kiểu hình ở tế bào lai

+ Khi ta cho lai hai loại tế bào soma khác loài in vitro ta thu được tế bào lai heterocaryon chứahai nhân hoặc vài nhân riêng biệt, về sau các nhân trong heterocaryon dung hợp tạo nên một nhânđộc nhất chứa tổ hợp các bộ nhiễm sắc thể trong một tế bào lai được gọi là syncaryon Cácheterocaryon có thể tồn tại rất lâu hoặc chết đi hoặc biến thành syncaryon Người ta theo dõi sốphận và đời sống của các tế bào lai qua các đặc tính như biểu hiện của hệ gen thành các tính trạngkiểu hình để đánh dấu, chủ yếu là tổng hợp protein, các enzyme, sự tạo thành các siêu cấu trúc, sựbiệt hóa tế bào về hình thái và một số đặc tính sinh lý, sinh hóa khác như phản ứng với các tácnhân kích thích, sự sinh sản và phát triển,…

+ Sử dụng các kiểu đánh dấu ta có thể theo dõi sự biểu hiện của các gen trong nhiễm sắc thểthường, hoặc các gen trên nhiễm sắc thể giới tính, đặc biệt là nhiễm sắc thể X

+ Để nghiên cứu quá trình biệt hóa tế bào lai, người ta thường sử dụng tế bào bố mẹ, đặc biệt làcác tế bào ung thư hoặc các tế bà của các chủng quần biệt hóa cao, ổn định như limpho, tế bàosợi, tế bào gốc hồng cầu,…

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật không chỉ được phục vụ cho nghiên cứu về di truyền học, tếbào học, sinh lý học, phân loại học,… mà còn phục vụ cho công nghệ tế bào

1.8.2.Công nghệ nhân bản vô tính động vật

Nhân bản vô tính là thuật ngữ được dùng để chỉ quá trình hình thành cơ thể đa bào không bằngcon đường sinh sản hữu tính tự nhiên mà thông qua sự phát triển của tế bào soma bằng cách phânbào nguyên nhiễm và biệt hóa tế bào thành cơ thể trong điều kiện nuôi cấy in vitro Đối với đa sốđộng vật sinh sản hữu tính thì kỹ thuạt nhân bản có nhiều thủ thuật đặc biệt.

1.8.2.1 Kỹ thuật chuyển nhân:

Trong nhân của tế bào soma có chứa 2n NST, chứa hệ gen quy định nên tất cả các tính trạng của

cơ thể giống như bộ NST của hợp tử Qua quá trình phát triển, từ hợp tử sẽ phân bào và biệt hóa

để cho ra các tế bào và mô khác nhau Quá trình biệt hóa là thể hiện sự hoạt động biệt hóa trong

hệ gen theo thời gian và không gian của phôi đang phát triển dưới sự kiểm soát của các yếu tố nộibào và ngoại bào Nhân còn ít biệt hóa thì càng có nhiều tiềm năng biệt hóa, vì vậy sử dụng tế bàogốc để nhân bản vô tính là dễ thực hiện hơn so với tế bào đã biệt hóa Bình thường người ta táchnhân từ tế bào cho (tế bào soma) và đem cấy chuyển vào tế bào trứng chưa thụ tinh đã bị lấy hoặchủy nhân để tạo nên một tế bào 2n giống như hợp tử chứa nhân của tế bào soma và tế bào chấtcủa tế bào trứng Vì nhân 2n của tế bào cho đã biệt hóa đến một mức độ nhất định nào đó do tếbào chất của nó quy định phù hợp với thời gian và không gian phát triển của phôi Khi nhân nàyđược cấy chuyển vào tế bào chất của trứng là môi trường giống với hợp tử thì nhân sẽ tái biệt hóatrở lại trạng thái như nhân của hợp tử và hệ gen của nó sẽ hoạt hóa theo đúng chương trình pháttriển do các nhân tố của trứng điều khiển

Những thành công của nhân bản vô tính bằng cấy nhân được thực hiện ở ếch, bằng cách sử dụngnhân của các tế bào soma lấy ở giai đoạn phôi Năm 1952, lần đầu tiên, hai nhà khoa học taiPhiladelphia là R Briggs và T King đã nhân bản vô tính con nòng nọc bằng kỹ thuật chuyển cấynhân từ tế bào phôi nang ếch Từ những năm 1960, J Gordon đã nhân bản vô tính thành công conếch trưởng thành từ nhân tế bào ruột nòng nọc và về sau là từ nhân của tế bào ruột ếch Đến nayngười ta đã thành công trong việc nhân bản vô tính nhiều động vật như cá và cả động vật có vú

1.8.2.2 Nhân bản vô tính động vật có vú

Đối với động vật có vú là động vật thụ tinh trong và phôi phát triển trong dạ con của mẹ dưới sựnuôi dưỡng qua nhau thai Vì vậy, kỹ thuật nhân bản vô tính khó khăn và phức tạp hơn các loàiđộng vật khác rất nhiều Từ những năm 1960-1980, các nhà khoa học đã thành công trong kỹthuật thụ tinh trong ống nghiệm để tạo nên phôi người và cấy chuyển phôi vào dạ con người mẹ

và sinh ra em bé được gọi là em bé sinh ra từ ống nghiệm (Em bé đầu tiên là Brown, 1978, tạiAnh)

Kết hợp kỹ thuật chuyển nhân với kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm từ 1983, người ta đã nhânbản thành công đối với chuột từ nhân lấy ở giai đoạn phôi nang, và từ 1984 – 1986 đã thực hiện

16

thành công ở bò, cừu,… từ nhân lấy ở giai đoạn phôi Trước năm 1992, các nhà khoa học chorằng, đối với động vật có vú chỉ có thể nhân bản vô tính thành công với nhân lấy từ giai đoạnphôi, còn đối với nhân của tế bào soma trưởng thành thì không thể thực hiện được vì tính biệt hóacủa chúng là không thể đảo ngược Tuy nhiên, sự kiện tháng 2/1997, khi báo chí công bố con cừuDolly ra đời (ngày 5 tháng 7 năm 1996) bằng kỹ thuật nhân bản vô tính với nhân lấy từ tế bàotuyến vú của cừu mẹ trưởng thành 6 năm tuổi do I Wilmut, Campbel và cộng sự ở Viện Roselin(Scottland) thực hiện Tế bào được thu nhận từ sinh thiết tuyến vú của một cừu cái giống FinnDorset ở giai đoạn 3 tháng cuối của thai kỳ, lúc tế bào đang tăng sinh và biệt hóa Các tế bào nàyđược nuôi cấy, sau đó được đưa vào môi trường rất nghèo huyết thanh nhằm làm ngừng hoàntoàn chu kỳ tế bào Đồng thời, một trứng của cừu cái giống Scottish Blackface (Đầu đen) có chu

kỳ tế bào ngừng ở kỳ giữa giảm phân II, bị hút bỏ bộ nhiễm sắc thể đơn bội cùng với thể cực vàmột ít tế bào chất, phần còn lại của trứng được chuyển vào môi trường nuôi cấy ở 370C, hoạt hóabằng một xung điện rồi cho kết hợp với tế bào tuyến vú của Finn Dorset bằng một loạt xung điệnkhác Kết quả tạo thành một phôi, phôi này được đưa vào nuôi cấy tự nhiên trong ống dẫn trứng

đã thắt của một cừu cái khác Khi phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu hay phôi nang, chúngđược cấy vào tử cung của cừu cái mang, từ phôi này phát triển thành cừu Dolly Điều đáng chú ý

là trong số 277 phôi được tạo ra ban đầu, đến giai đoạn phôi nang chỉ còn 29 và chỉ có 1 trong số

đó phát triển được thành cừu con Cừu Dolly đã sống được 6 năm tuổi nhưng những phân tíchtrên tế bào chứng minh rằng nó đã 12 năm tuổi

1.8.3 Ứng dụng trong lĩnh vực y tế

- Cấy ghép mô, cơ quan : Với công nghệ nuôi cấy tế bào, người ta đã nuôi cấy thành công gần

như tất cả mọi bộ phận trên cơ thể con người

- Ghép thành công tế bào sừng tự thân nuôi cấy

1.8.4 Nuôi cấy tế bào trong mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất:Một hóa chất trị bệnh, trước khi được phép lưu hành, phải trải qua nhiều thử nghiệm, trong đó cógiai đoạn thử nghiệm trên động vật như chuột, thỏ, khỉ,… Các thử nghiệm này đã gặp phải sửphản đối kịch liệt của các phong trào bảo vệ động vật hoang dã, đồng thời những thử nghiệm nàynhiều khi không thể mở rộng trên người, thí nghiệm lâu dài và tốn kém,… Vì vậy, người ta nghĩ

ra hướng sử dụng tế bào nuôi cấy làm mô hình thử nghiệm, khi có thể nuôi cấy bất kỳ loại tế bàonào

1.8.5 Nuôi cấy tế bào trong độc chất học

Người ta có thể chủ động tạo ra các hư hại đặc trưng trên tế bào bằng các chất độc, từ đó pháthiện ra các bào quan bị ảnh hưởng và xác định các cơ chế sinh hóa và phân tử của quá trìnhchuyển hóa chất độc.

1.8.6 Nuôi cấy tế bào để sản xuất chế phẩm sinh học

Tế bào động vật nuôi cấy cũng đã được ứng dụng trong việc sản xuất các chế phẩm sinh học Cácvaccine virus sản xuất từ tế bào động vật nuôi cấy đã có những đóng góp cho lĩnh vực y tế cộngđồng trên thế giới mà điển hình nhất là hiệu quả ngừa bệnh đậu mùa và chứng bại liệt ở trẻ em,trong ngành thú y là vaccine ngừa bệnh lở mồm long móng ở gia súc Để sản xuất vaccine, người

ta cho nhiễm và nhân virus trong tế bào nuôi cấy để đạt đến mật độ tối đa Sau đó, virus được lytrích và xử lý bằng các tác nhân gây bất hoạt trước khi sử dụng làm vaccine

2 Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng:

2.1 Đại cương về kháng thể và kháng thể đơn dòng

2.1.1 Kháng thể (antibody) :

- Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho

B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóacác tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện mộtepitope kháng nguyên duy nhất

- Cấu tạo:

Hình 4: Bề mặt của kháng thể IgG

Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptid, gồm hai chuỗi nặng (H, heavy) giống nhau

và hai chuỗi nhẹ (L, light) cũng giống nhau Có hai loại chuỗi nhẹ (kappa) và  (lambda), do đó

hai chuỗi nhẹ của mỗi phân tử immunoglobulin chỉ có thể cùng là  hoặc cùng là  Các chuỗicủa immunoglobulin liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide và có độ đàn hồi nhất định Mộtphần cấu trúc của các chuỗi cố định nhưng phần đầu của hai "cánh tay" chữ Y thì rất biến thiên

18

giữa các kháng thể khác nhau, để tạo nên các vị trí kết hợp có khả năng phản ứng đặc hiệu vớicác kháng nguyên tương ứng, điều này tương tự như một enzyme tiếp xúc với cơ chất của nó Trên kháng thể có 2 vùng:

+ Vùng biến đổi (ký hiệu là V): Vùng phía đầu -NH2 có trật tự axit amin luôn thay đổi ở cáckháng thể khác nhau gọi là vùng biến đổi, vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ kết hợp vớinhau tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratôp Vùng này khác nhau ở các loại Ig, làphần đầu 2 nhánh chữ Y nên mỗi phân tử Ig có hai vị trí kết hợp với kháng nguyên Vị trí nàychiếm khoảng 1% diện tích bề mặt của Ig

+ Vùng cố định (ký hiệu là C): Vùng phía đầu –COOH có trật tự axit amin không thay đổigọi là vùng cố định Vùng này giống nhau ở tất cả các Ig, không có khả năng liên kết với khángnguyên Chuỗi nhẹ có 1 vùng cố định (CL) còn chuỗi nặng có 3 vùng cố định (CH1, CH2, CH3)

Hình 5: Cấu trúc của một phân tử kháng thể.

Dựa vào đặc điểm của vùng cố định phân biệt 5 phân lớp kháng thể:

Các Ig Phân bố Chức năng sinh học

IgG

(Monomer)

Chiếm 75% - 85%

các kháng thể cótrong huyết tương, comặt trong các dịchmô

Có số lượng lớn nhất đóng vai trò bảo vệ cơ thểchống tác nhân gây bệnh, tăng thực bào, trung hòađộc tố và virut, hoạt hoá bổ thể

Là kháng thể duy nhất truyền qua thai nhi, bảo vệcon trong những tuần đầu đời sau khi sinh khi hệmiễn dịch của trẻ chưa phát triển

Xuất hiện đầu tiên sau khi nhiễm trùngLiên kết với kháng nguyên

Là các ngưng kết tố chống ngưng kết nguyên A và Bcủa nhóm máu ABO

IgA

(dimer)

Có trong chất tiết nhưdịch nhầy, dịch ruột,nước bọt, nước mắt

và sữa

Trung hòa kháng nguyên, chống các tác nhân gâybệnh bám vào lớp biểu bì và xâm nhập các mô phíadưới

Có trong sữa giúp miễn dịch thụ động cho thai nhi.IgD

(monomer)

Gắn trên mànglimpho B

Làm nhiệm vụ thụ thể cho kháng nguyên