Xác định đồng thời vitamin b1, b6 và b12 trong sữa bột và sữa tươi dielac grow plus và dielac alpha gold bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold .... Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tu

Trang 1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN GIA HUY

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI VITAMIN B1, B6 VÀ B12 TRONG SỮA BỘT VÀ SỮA TƯƠI DIELAC GROW PLUS

VÀ DIELAC ALPHA GOLD BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Ngành: Hoá Phân tích

Mã số: 8.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Giảng viên hướng dẫn khoa học: PGS.TS Mai Xuân Trường

THÁI NGUYÊN - 2019

Trang 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất cứ một công trình nào Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019

Tác giả luận văn Nguyễn Gia Huy

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Mai Xuân Trường người đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học và các cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập, nghiên cứu

và hoàn thiện luận văn

Do thời gian có hạn và trình độ còn hạn chế, luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong được sự đóng góp ý kiến của thầy cô để luận văn này được hoàn thiện hơn

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019

Người thực hiện Nguyễn Gia Huy

Trang 4

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN iv

DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN v

DANH MỤC CÁC HÌNH CỦA LUẬN VĂN vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về vitamin B1 3

1.1.1.Tên gọi 3

1.1.2 Công thức hóa học 3

1.1.3 Tính chất vật lý 3

1.1.4 Tính chất hóa học 4

1.2.1 Tên gọi 5

1.3.1 Tên gọi 6

1.4 Nhu cầu vitamin B1, B6, B12 và nguồn thực phẩm 8

1.5 Giới thiệu sữa Dielac Grow Plus và sữa Dielac Alpha Gold 11

1.6 Tổng quan xác định vitamin B1, B6 và B12 theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 12

Trang 5

1.6.1 Phương pháp sắc ký lỏng sử dụng cột tách pha đảo RP-LC, detector

UV-Vis 12

1.6.2 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector huỳnh quang 13

1.6.3 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector PDA 14

Chương 2: THỰC NGHIỆM 16

2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 16

2.1.1 Nội dung nghiên cứu 16

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2 Thực nghiệm 20

2.2.1 Dụng cụ 20

2.2.2 Hóa chất 20

2.2.3 Các dung dịch tiêm sắc ký 20

2.3 Sơ đồ nghiên cứu của phương pháp phân tích 23

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 Khảo sát các điều kiện sắc ký 24

3.1.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng 24

3.1.2 Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng chảy 25

3.1.3 Khảo sát lựa chọn tỉ lệ pha động 26

3.2 Đánh giá phương pháp định lượng 28

3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ vitamin B1, B6, B12 28

3.2.2 Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ vitamin B1, B6, B12 theo phương pháp thêm chuẩn 30

3.2.3 Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống 50

3.3 Xác định vitamin B1, B6, B12 trong sữa Dielac Grow Plus và sữa Dielac Alpha Gold 53

3.3.1 Xác định vitamin B1, B6, B12 trong sữa bột Dielac Grow Plus và sữa bột Dielac Alpha Gold 53

Trang 6

3.3.2 Xác định vitamin B1, B6, B12 trong sữa tươi Dielac Grow Plus và

sữa tươi Dielac Alpha Gold 56

3.3.3 Xác định vitamin B1, B6, B12 trong sữa Dielac Grow Plus và sữa Dielac Alpha Gold theo phương pháp thêm chuẩn 61

KẾT LUẬN 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

PHỤ LỤC 74

Trang 7

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng

cao PDA Photometric Diode Array Dãy diod quang

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

UV – Vis Ultra Violet – Visble Phổ tử ngoại – khả kiến

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN

Bảng 1.1: Tính chất vật lí của 3 dạng vitamin B6 6

Bảng 1.2 Nhu cầu cung cấp vitamin B1, B6 và B12 của người 10

Bảng 2.1 Các điều kiện tiến hành sắc ký 19

Bảng 3.1 Bước sóng hấp thụ cực đại của vitamin B1, B6 và B12 25

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1, B6 và B12 28

Bảng 3.3 Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold 31

Bảng 3.5 Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold 32

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B1 bằng phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold 32

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold 33

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold 34

Bảng 3.9 Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus 36

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B1 bằng phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus 37

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus 38

Trang 9

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B12 theo phương

pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus 39 Bảng 3.15 Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm

chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold 41 Bảng 3.16 Xây dựng đường chuẩn vitamin B6 theo phương pháp thêm

chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold 41 Bảng 3.17 Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm

chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold 42 Bảng 3.18 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B1 bằng phương

pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold 42 Bảng 3.19 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B6 theo phương

pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold 43 Bảng 3.20 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B12 theo phương

pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold 44 Bảng 3.21 Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm

chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus 46 Bảng 3.22 Xây dựng đường chuẩn vitamin B6 theo phương pháp thêm

chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus 46 Bảng 3.23 Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm

chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus 47 Bảng 3.24 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B1 bằng phương

pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus 47 Bảng 3.25 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B6 theo phương

pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus 48 Bảng 3.26 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B12 theo phương

pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus 49 Bảng 3.27 Kết quả khảo sát thời gian lưu 50 Bảng 3.28 Kết quả khảo sát diện tích pic 51

Trang 10

Bảng 3.29 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 52

Bảng 3.30 Kết quả phân tích sữa bột Dielac Alpha Gold 53

Bảng 3.31 Kết quả phân tích sữa bột Dielac Grow Plus 55

Bảng 3.32 Kết quả phân tích sữa tươi Dielac Grow Plus 180 mL 57

Bảng 3.33 Kết quả phân tích sữa tươi Dielac Alpha Gold 180mL 59

Bảng 3.34 Bảng thêm chuẩn vitamin B1 trong sữa bột Dielac Alpha Gold 61

Bảng 3.37 Kết quả phân tích sữa bột Dielac Alpha Gold theo phương pháp thêm chuẩn 62

Bảng 3.38 Bảng thêm chuẩn vitamin B1 trong sữa bột Dielac Grow Plus 63

Bảng 3.41 Kết quả phân tích sữa bột Dielac Grow Plus theo phương pháp thêm chuẩn 64

Bảng 3.42 Bảng thêm chuẩn vitamin B1 trong sữa tươi Dielac Alpha Gold 65

Bảng 3.45 Kết quả phân tích sữa tươi Dielac Alpha Gold theo phương pháp thêm chuẩn 67

Bảng 3.46 Bảng thêm chuẩn vitamin B1 trong sữa tươi Dielac Grow Plus 68

Bảng 3.49 Kết quả phân tích sữa tươi Dielac Grow Plus theo phương pháp thêm chuẩn 69

Trang 11

DANH MỤC CÁC HÌNH CỦA LUẬN VĂN

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của vitamin B1 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của vitamin B6 5

Hình 1.3 Hidroxocobalamin 7

Hình 1.4 Xianocobalamin 7

Hình 1.5 Sữa Dielac Grow Plus 11

Hình 1.6 Sữa Dielac Alpha Gold 11

Hình 3.1 Sắc đồ quét phổ hấp phụ vitamin B1 24

Hình 3.4 Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 ở tốc độ 0,8 mL/phút 25

Hình 3.5 Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 ở tốc độ 1 mL/phút 25

Hình 3.6 Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 ở tốc độ 1,2 mL/phút 26

Hình 3.7 Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 tỉ lệ pha động 10:90 26

Hình 3.10 Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 28

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin B1 29

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin B6 29

Trang 12

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và

diện tích pic của vitamin B12 30Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và

diện tích pic của vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold 33Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và

diện tích pic của vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus 38Hình 3.18 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và

diện tích pic của vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold 43Hình 3.21 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và

diện tích pic của vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold 44Hình 3.22 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và

diện tích pic của vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alapha Gold 45

Trang 13

Hình 3.23 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và

diện tích pic của vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus 48Hình 3.24 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và

diện tích pic của vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus 49Hình 3.25 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và

diện tích pic của vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus 50Hình 3.26 Biểu đồ thể hiện sự chênh lệch về hàm lượng giữa lí thuyết

và thực tế của các vitamin trong sữa bột Dielac Alpha Gold 54Hình 3.27 Biểu đồ thể hiện sự chênh lệch về hàm lượng giữa lí thuyết

và thực tế của các vitamin trong sữa bột Dielac Grow Plus 56Hình 3.28 Biểu đồ thể hiện sự chênh lệch về hàm lượng giữa lí thuyết

và thực tế của các vitamin trong sữa tươi Dielac Grow Plus

180 mL 58Hình 3.29 Biểu đồ thể hiện sự chênh lệch về hàm lượng giữa lí thuyết

và thực tế của các vitamin trong sữa tươi Dielac Alpha Gold

180 mL 60

Trang 14

MỞ ĐẦU

Vitamin là một nhóm các hợp chất hữu cơ, có cấu tạo hóa học rất khác nhau

do đó các tính chất hóa học cũng như lí học cũng khác nhau, nhưng chúng đều giống nhau ở chỗ là rất cần thiết cho hoạt động sống của bất kỳ cơ thể nào Hiện nay người ta đã nghiên cứu và phân lập được trên 30 loại vitamin khác nhau, đồng thời đã nghiên cứu các thành phần, cấu tạo và tác dụng sinh lý của chúng

Vitamin nhóm B bao gồm các loại: B1, B2, B3, B5, B6, B7, B8, B9, B12 Nhìn chung, vitamin nhóm B đều có tác dụng hỗ trợ quá trình sản xuất năng lượng trong cơ thể cũng như trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng trong tế bào

Vitamin B1 còn gọi là thiamin có vai trò vô cùng quan trọng trong việc duy trì các hoạt động tương tác của tế bào trong cơ thể, nhất là việc sản xuất năng lượng Trong đó các tế bào của cơ thể đã dùng oxi để chuyển hóa cacbonhydrat và các loại đường thành năng lượng

Hiện tượng thiếu hụt vitamin B1 được chuyên môn gọi là hiện tượng beri beri rất ít khi xảy ra nhưng khi xuất hiện thường kèm theo các dấu hiệu như giảm tính ngon miệng, mệt mỏi, ngại vận động, khó tiêu hóa, táo bón, lo sợ, đặc biệt các cơ bắp xuất hiện hiện tượng như có kim châm, đầu ngón chân ngón tay bị tê cứng…

Vitamin B6là một vitamin hòa tan trong nước và là một phần của nhóm vitamin B Vitamin B6 hoạt động như một coenzym giúp chuyển hóa tryptophan thành niacin Nó đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa chất đạm, chất béo, cacbonhydrat Sự thiếu hụt vitamin B6có thể gây ra nhiều triệu chứng: mệt mỏi, mất ngủ, khó chịu, rối loạn tâm thần, môi nứt nẻ, da khô, rụng tóc Ở trẻ em thiếu vitamin B6 thường chậm lớn và có thể có những cơn co giật

Vitamin B12 rất cần thiết cho quá trình nhân lên của tế bào Thiếu vitamin B12 ảnh hưởng một cách đặc biệt đến tất cả các mô mà trong đó quá trình nhân đôi xảy ra nhanh chẳng hạn ở máu, niêm mạc ruột non, nội mạc tử cung Vitamin B12 tham gia vào chức năng của hệ thống thần kinh (trí nhớ, khả năng học ) và quá trình phát triển hài hòa ở trẻ em

Trang 15

Việc xác định chính xác hàm lượng vitamin B1, B6 và B12 được bổ sung rất có ý nghĩa trong việc đảm bảo quyền lợi và sức khỏe của người tiêu dùng

Để xác định hàm lượng vitamin nhóm B trong thực phẩm và dược phẩm, có rất nhiều phương pháp phân tích đã được nghiên cứu và áp dụng để phân tích riêng

rẽ hoặc đồng thời các vitamin nhóm B như phương pháp điện hóa, phương pháp động học huỳnh quang, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Trong các phương pháp này, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, detector

UV - Vis và detector PDA với cột tách C18 được sử dụng một cách rộng rãi do khả năng tách rất tốt các vitamin và đáp ứng nhu cầu cho phân tích đồng thời lượng nhỏ các vitamin nhóm B trong dược phẩm và lượng vết vitamin trong thực phẩm…

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi chọn để tài: “Xác định đồng thời vitamin B1 và B6 và B12 trong sữa bột, sữa tươi dielac grow plus và dielac alpha gold bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”

Trang 16

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về vitamin B1

1.1.1.Tên gọi

 Tên thông thường: Vitamin B1 hay thiamin

 Tên IUPAC: 2-[3-[(4-amino-2-pyrimidin-5-yl)metyl]-4- thiazol-5-yl]etanol

metyl-1.1.2 Công thức hóa học

Công thức phân tử: C12H17SON4

Khối lượng mol phân tử: 265,35 (g/mol)

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của vitamin B1

Công thức cấu tạo của vitamin B1 cho thấy nó là một dẫn xuất pyrimidin gắn với dẫn xuất thiazol qua nhóm metylen

1.1.3 Tính chất vật lý

Vitamin B1 là những tinh thể trắng nhỏ hay bột kết tinh, có mùi đặc trưng Khi tiếp xúc với không khí, chế phẩm khan nhanh chóng hút ẩm (khoảng 4 % nước) Dung dịch trong nước có môi trường axit, nóng chảy ở

2480C và phân hủy

Vitamin B1 có tính axit, hoà tan tốt trong môi trường nước, axit axetic, nhưng khó tan trong etanol 96 % và metanol, không tan trong ete, benzen hay clorofom và chịu nhiệt khá nên không bị phân huỷ khi nấu nướng Vitamin B1

Trang 17

nóng chảy ở 2330C - 2520C Vitamin B1 bền trong môi trường axit, còn trong môi trường kiềm nó rất dễ bị phân huỷ khi đun nóng

Trong môi trường không phân cực vitamin B1 hấp thụ tại 2 bước sóng λmax1 = 246,9 nm và λmax2 = 264,5 nm

Vitamin B1 không ổn định với ánh sáng và độ ẩm Mất hoạt tính trong môi trường trung tính và bazơ Ổn định tính chất ở pH = 4

Dạng chế phẩm của vitamin B1 có thể tồn tại ở dạng thiamin monohydroclorua, thiamin mononitrat [8]

dễ tan trong nước và vững bền hơn thiamin bazơ

Do nguyên tử N bậc 4 nên vòng thiazol trong thiamin kém vững bền đặc biệt trong môi trường kiềm Trong môi trường này vòng bị mở và lúc đó dễ bị oxi hóa thành các sản phẩm không có hoạt tính vitamin Do vậy khi pha chế dung dịch thiamin phải đựng trong cốc thủy tinh trung tính, pH của dung dịch phải axit

Thiamin bị oxy hóa bởi K3[Fe(CN)6] trong môi trường kiềm tạo thành thiocrom màu vàng phát huỳnh quang màu xanh da trời Phản ứng này được dùng để định tính thiamin và định lượng thiamin bằng phương pháp đo huỳnh quang [8]

Trang 18

Nhóm -OH trong phân tử làm cho thiamin có thể ete hóa hay este hóa tạo thiamin panmitat, thiamin stearat, thiamin phtalat… song quan trọng nhất là tạo với H3PO4 thiamin pyrophotphat (TPP) - là coenzym xúc tác nhiều quá trình chuyển hóa trong cơ thể

1.2.1 Tên gọi

 Tên thông thường: Vitamin B6 hay piridoxin

 Tên IUPAC: 4,5-đihidroximetyl-2-metylpiridin-3-ol

1.2.2 Công thức hóa học

Công thức phân tử: C8H11NO3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của vitamin B6

Vitamin B6 là tinh thể không màu, vị hơi đắng, hòa tan tốt trong nước và trong rượu, chịu nhiệt, nhiệt độ nóng chảy ở 1600C Vitamin B6 bền khi đun sôi trong axit hay kiềm, không bền trong môi trường có tính oxy hóa Vitamin B6 nhạy cảm với ánh sáng, chúng phân hủy nhanh khi chiếu sáng ở môi trường kiềm hay trung tính

Vitamin B6 tồn tại ở 3 dạng: Piridoxin, Piridoxal, Piridoxamin Ba dạng này có thể chuyển hoá lẫn nhau

Trang 19

Vitamin B6 giữ vai trò đặc biệt trong chuyển hóa axit amin

Ngoài ra, vitamin B6 còn tham gia vào quá trình tách CO2 của các axit amin và liên quan đến cân bằng năng lượng cơ thể Các phản ứng chuyển hóa liên quan đến sự hình thành chất trung gian thần kinh và các chất điều hòa khác: taurine, histamine…

1.3.1 Tên gọi

Tên thông thường: Vitamin B12 hay cobalamin

Tên IUPAC: α-(5,6-dimetylbenzimidazolyl)cobanmitxianide

Vitamin B6

Trang 20

1.3.2 Công thức hóa học

Công thức phân tử: C16H88CoN14O14P

Vitamin B12 thường tồn tại ở hai dạng: xianocobalamin hoặc hidroxocobalamin

Hình 1.3 Hidroxocobalamin Hình 1.4 Xianocobalamin

Vitamin B12 thường ở trạng thái kết tinh, có kích thước rất nhỏ, có màu

đỏ sẫm, không mùi, không vị Vitamin B12 tan tốt trong nước, không tan trong các dung môi hữu cơ như ete, axeton, benzen, clorofom Vitamin B12 bền trong bóng tối ở nhiệt độ thường, khá bền với nhiệt Vitamin B12 dễ bị phân hủy bởi ánh sáng Khi tiếp xúc với kim loại nặng dễ bị mất hoạt tính và không bền trong môi trường kiềm (pH > 7)

Trang 21

thứ hai là phần nucleotit gồm 5,6-dimetylbenzimidazol đã este hóa bởi axit photphoric Hai phần này nối với nhau qua cầu nối là isopropanol

Nguyên tử coban liên kết cộng hóa trị với một nguyên tử nitơ của một nhân pyrol, liên kết cho nhận với ba nguyên tử nitơ còn lại và nguyên tử nitơ trong nhân benzimidazol; liên kết ion với nguyên tử oxi của phân tử axit photphoric Nguyên tử coban còn liên kết với các nhóm chức khác nhau tạo ra các vitamin B12 khác nhau Vitamin B12 thường tồn tại ở hai dạng: xianocobalamin khi nguyên tử Co liên kết với nhóm -CN và hidroxocobalamin khi nguyên tử Co liên kết với nhóm -OH

Vitamin B12 là thành phần cấu tạo nên các enzim xúc tác cho phản ứng chuyển hóa ribonucleotit thành deoxyribonucleotit Vitamin B12 là xúc tác quan trọng của hai loại phản ứng thiết yếu: đồng phân hóa, vận chuyển nhóm metyl

1.4 Nhu cầu vitamin B1, B6, B12 và nguồn thực phẩm

Với nồng độ cao vitamin B1 được hấp thụ bằng cơ chế thụ động nhưng ở nồng độ thấp nó được hấp thụ bằng hệ thống vận chuyển chủ động qua trung gian một số chất mang Vitamin B1 sau khi được hấp thụ trong ruột non và tá tràng, nó chuyển vào gan liên kết với photpho thành dạng hoạt động, rồi vào máu để phân bố đi khắp cơ thể Trong máu, vitamin B1 gắn với protein huyết tương mà chủ yếu là albumin và hồng cầu Các cơ quan dự trữ vitamin B1 bao gồm cơ, tim, gan, thận và não, trong đó cơ là nơi dự trữ chính Hàm lượng vitamin B1 trong các mô là rất ít, vì thế hàm lượng B1 trong cơ thể phụ thuộc vào lượng đưa vào qua thức ăn

Cho đến nay khoa học chưa thấy hiện tượng thừa vitamin B1 Ngược lại thiếu vitamin B1 là một bệnh khá phổ biến trên phạm vi toàn cầu

Trang 22

Hầu hết những người thiếu vitamin B1 trên thế giới là do ăn kém Thiếu vitamin B1 cũng thường gặp hơn ở các nước dùng gạo làm lương thực chính do vitamin B1 có nhiều ở lớp vỏ ngoài ngay sát hạt gạo Do vậy việc xay sát các loại ngũ cốc (gạo, mì) quá kỹ sẽ làm cho lượng vitamin B1 bị hao hụt nhiều…

Ở các nước phương Tây, nguyên nhân chủ yếu gây thiếu vitamin B1 là nghiện rượu và bệnh mãn tính Rượu ảnh hưởng gián tiếp đến sự hấp thu vitamin B1 Bệnh nhân suy dinh dưỡng và bệnh nhân mắc bệnh gan do rượu có nguy cơ thiếu vitamin B1 vì lượng vitamin B1 dự trữ trong gan và cơ bị giảm Người lao động nặng tăng tiêu hao nhiều năng lượng, người cao tuổi do ăn uống kém

dễ bị thiếu vitamin B1.

Thiếu hụt vitamin B1 có thể xảy ra khi chế độ ăn uống nghèo nàn, ít thức

ăn động vật (thịt, cá, trứng ) hoặc do một số bất thường liên quan đến hệ tiêu hóa thì có thể dẫn đến mắc bệnh Beriberi Chính vì vậy, hằng ngày cần bổ sung các loại thực phẩm giàu vitamin B1 như: gạo, thịt, cá, trứng, các loại đậu…

Vitamin B6 khi vào cơ thể được hấp thu nhanh và dự trữ phần lớn ở gan, một phần ở não và cơ Nếu lượng vitamin B6 đưa vào cơ thể vượt quá nhu cầu thì sẽ bị đào thải ra ngoài qua thận dưới dạng chuyển hóa

Hiếm gặp tình trạng thiếu hụt vitamin B6 ở người tuy nhiên vẫn có thể xảy ra đối với phụ nữ thời kỳ mang thai hoặc cho con bú, trẻ em chậm lớn, người già, vận động viên phải tập luyện nặng Các trường hợp rối loạn chuyển hóa bẩm sinh, rối loạn hấp thu, rối loạn do dùng thuốc

Khi bị thiếu hụt vitamin B6 có thể dẫn đến thiếu máu nguyên bào sắt, viêm dây thần kinh ngoại vi, viêm da tăng bã nhờn và khô nứt môi Do đó, cần thiết phải bổ sung vitamin B6

Vitamin B6 có nhiều trong các loại thực phẩm như: thịt bò, thịt gia cầm, thịt lợn, trứng, cá, ngũ cốc nguyên hạt, khoai tây, đậu nành, đậu hạt, lạc, cà

Trang 23

rốt Không nên dùng vượt quá 100 mg mỗi ngày vì có thể gây tổn thương hệ thần kinh

Bảng 1.2 Nhu cầu cung cấp vitamin B1, B6 và B12 của người

Nhóm / giới/ tình

Nhu cầu vitamin B1 (mg/ngày)

Nhu cầu vitamin B6 (mg/ngày)

Nhu cầu vitamin B12 (μg/ngày)

Nữ vị thành niên 10-18 1,1 1,2 2,4 Phụ nữ có thai 1,4 1,9 2,6

Bà mẹ cho bú 1,5 2,0 2,8

Vitamin B12 khi đi vào cơ thể sẽ phân bố vào máu, tích lũy nhiều ở gan, thần kinh trung ương, tim và nhau thai Ở người bình thường, tổng số vitamin B12 dự trữ khoảng 1 - 10 mg Trong khi đó nhu cầu tối thiểu hàng ngày của vitamin B12 chỉ bằng 0,1 mcg Chỉ khi cơ thể không được cung cấp vitamin B12 trong thời gian dài (khoảng 5 năm trở lên), lượng B12 trong cơ thể mới cạn kiệt và tình trạng thiếu vitamin B12 mới xảy ra

Trong thực tế, thiếu vitamin B12 rất hiếm gặp Hầu hết thiếu vitamin B12 ở người là do kém hấp thu B12, hoặc những người ăn chay, hoàn toàn không ăn thịt cá, những người có bệnh ở dạ dày, người uống nhiều vitamin C

Thiếu vitamin B12 có thể gây ra thiếu máu, các bệnh liên quan đến thần kinh (alzheimer, bệnh hoang tưởng, trầm cảm…) Khi đó cơ thể cần bổ sung kịp thời vitamin B12 Một số thực phẩm cung cấp vitamin B12 như: thịt, ngũ cốc, phô mai và sữa

Trang 24

1.5 Giới thiệu sữa Dielac Grow Plus và sữa Dielac Alpha Gold

Dielac là nhãn hiệu sữa công thức của vinamilk - thương hiệu sữa hàng đầu Việt Nam hiện nay Trong đó Dielac Grow Plus và sữa Dielac Alpha Gold

là hai loại sữa tốt và phù hợp nhất cho sự phát triển của trẻ nhỏ

Sữa Dielac Grow Plus và sữa Dielac Alpha Gold là hai sản phẩm của công ty vinamilk Nhà máy Sữa Việt Nam được trang bị dây chuyển sản xuất sữa tươi tiệt trùng với thiết bị hiện đại và công nghệ sản xuất tiến tiến hàng đầu hiện nay Nhà máy hoạt động tren một dây chuyền tự động, khép kín, từ khâu nguyên liệu đầu vào đến đầu ra sản phẩm

Hình 1.5 Sữa Dielac Grow Plus Hình 1.6 Sữa Dielac Alpha Gold

- Đối tượng nghiên cứu của luận văn bao gồm:

 Sữa bột Dielac Alpha Gold 100 gam của công ty vinamilk sản xuất, lô số R3, ngày 26/02/2019 có hạn sử dụng đến ngày 26/02/2021 có thành phần 0,63 mg B1; 0,75 mg B6 và 1,5 μg B12

 Sữa bột Dielac Grow Plus 100 gam của công ty vinamilk sản xuất, lô số E7, ngày 26/02/2019 có hạn sử dụng đến ngày 26/02/2021 có thành phần 1,1 mg B1; 1,1 mg B6 và 2,2 μg B12

 Sữa tươi Dielac Alpha Gold 180 mL của công ty vinamilk sản xuất, lô số 0D72GPG03, ngày 28/6/2019 có hạn sử dụng đến ngày 27/12/2019 có thành phần 0,14 mg B1; 0,2 mg B6 và 0,58 μg B12

 Sữa tươi Dielac Grow Plus 180 mL của công ty vinamilk được sản xuất,

lô số 0E72GPG15, ngày 28/6/2019 có hạn sử dụng đến ngày 27/12/2019

có thành phần 0,2 mg B1; 0,36 mg B6 và 0,67 μg B12

Trang 25

1.6 Tổng quan xác định vitamin B1, B6 và B12 theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Hiện nay, phương pháp HPLC là một phương pháp được sử dụng rộng rãi để xác định các vitamin trong các loại thực phẩm và dược phẩm Mỗi đối tượng khác nhau thì các điều kiện tiến hành sắc ký cũng khác nhau

1.6.1 Phương pháp sắc ký lỏng sử dụng cột tách pha đảo RP-LC, detector UV-Vis

Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector UV-Vis được ứng dụng rất phổ biến, mặc dù detector UV vốn đã có độ nhạy thấp hơn so với sử dụng detector huỳnh quang Tuy nhiên quá trình xử lý mẫu cho detector UV thì đơn giản hơn nhiều so với sử dụng detector huỳnh quang Phương pháp HPLC

sử dụng detector UV đã được sử dụng thành công trong việc phân tích vitamin B1, B6 trong các sản phẩm ngũ cốc, sản phẩm gạo và một vài loại nấm lớn

Năm 1979, Toma và Tabekhia áp dụng phương pháp sắc ký sử dụng cặp ion trong pha động và cột tách pha đảo đã tách được vitamin B1 và B6 trong gạo và các sản phẩm tử gạo [15] Kể từ đó, phương pháp sắc ký sự dụng cặp ion trong pha động và cột tách pha ngược đă được sử dụng cho nhiều đối tượng khác nhau như trứng, sữa…

Năm 1997, Soledad Albalá - Hurtado đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC để xác định đồng thời 06 vitamin tan trong mẫu sữa bột và sữa tươi [20] Sử dụng phương pháp sắc ký cặp ion với cột tách pha đảo

C18 Tổng thời gian phân tích cho các vitamin này là 55 phút Pha động gồm kênh A là metanol và kênh B là nước với tỉ lệ 15:85 về thể tích Tốc độ dòng 1,0 mL/phút Detector UV tại các bước sóng khác nhau Với các điều kiện sắc

ký như trên đã cho kết quả tách có độ tin cậy cao về độ tuyến tính, độ chính xác

và độ nhạy của phương pháp Giới hạn phát hiện nằm trong khoảng từ 0,02 đến 0,1 mg/L Giới hạn định lượng nằm trong khoảng từ 0,03 đến 0,25 mg/L

Năm 2005, Amidzic nghiên cứu xác định các vitamin B1, B6 và B12 trong thuốc đa vitamin [21] Độ thu hồi của phương pháp đạt giá trị từ 90,4 đến 108,5%, với độ lệch chuẩn RSD từ 0,5 đến 4,1%

Trang 26

Năm 2017, Nguyễn Thu Hằng đã thiết lập phương pháp xác định đồng thời vitamin B1, B6 và B12 trong thuốc Neuribion và Scanneuron bằng phương pháp sắc kỷ lỏng pha đảo Pha động gồm kênh A là dung dịch NaH2PO4 0,015M và kênh B là axetonitril với tỉ lệ 83:17 về thể tích Tốc độ dòng là 0,9 mL/phút Sử dụng detector UV-Vis với bước sóng 278 nm Kết quả cho thấy phương pháp có độ chính xác cao kết quả tương đối tốt

Ngoài ra, trong các mẫu thịt và gan, Esva Barma đã thiết lập phương pháp HPLC sử dụng detector UV để xác định vitamin B1

1.6.2 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector huỳnh quang

Phương pháp này chủ yếu dùng để tách các ion có sẵn ánh sáng tự nhiên huỳnh quang Do đa số các vitamin không có ánh sáng huỳnh quang nên muốn thực hiện tách các vitamin này thì cần thực hiện dẫn xuất cho các vitamin để thu được dẫn xuất ánh sáng huỳnh quang tương ứng Chủ yếu, phương pháp sắc

ký lỏng HPLC sử dụng detector huỳnh quang được sử sử dụng để xác định hàm lượng của vitamin B6 vì đây là vitamin có ánh sáng huỳnh quang tự nhiên

Trên thế giới, M Bergaentzle đã thực hiện quá trình tách vitamin B6 trong các mẫu sữa bột, bột dinh dưỡng trẻ em, ngũ cốc được thực hiện bằng phương pháp sắc ký cặp ion, detector huỳnh quang [18] Pha động gồm kênh A

là kali hidrophotphat có chứa natri octansulfonat và kênh B là axetonitril Detector huỳnh quang được sử dụng ở bước sóng kích thích là 290 nm và ở bước sóng phát xạ là 395 nm Kết quả phân tích cho thấy độ lặp lại của phương pháp nằm trong khoảng từ 3 - 18 % và phụ thuộc vào nồng độ của vitamin trong các mẫu khác nhau

Theo F Arella, quá trình xác định vitamin B1 trong các mẫu sữa bột, ngũ cốc, sữa chua, bột dinh dưỡng trẻ em được thực hiện bằng phương pháp sắc

ký lỏng pha đảo Pha động gồm metanol 0,05M và natri axetat với tỉ lệ 30:70

về thể tích Tốc độ dòng 1 ml/phút, detector huỳnh quang được sử dụng ở bước sóng kích thích là 366 nm và ở bước sóng phát xạ là 435 nm cho vitamin B1

Trang 27

Kết quả phân tích cho thấy hiệu suất thu hồi của phương pháp luôn đạt trên 89% [19]

Năm 2015, Định Thị Trường Giang đã thiết lập phương pháp xác định hàm lượng vitamin B1 và B6 trong một số loại nấm lớn ở vùng bắc trung bộ của Việt Nam bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo [6] Pha động gồm kênh

A là metanol và kênh B là H3PO4 0,01M trong axit heptansunfonic 0,05% có pH=3 với tỉ lệ 26:74 về thể tích Detector huỳnh quang được sử dụng ở bước sóng kích thích là 365 nm và ở bước sóng phát xạ là 435 nm đối với vitamin B1, bước sóng kích thích 290 nm và bước sóng phát xạ là 395 đối với vitamin B6 Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi của phương pháp luôn đạt trên 83%

1.6.3 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector PDA

Trong các nghiên cứu gần đây, kỹ thuật tách 9 vitamin nhóm B đã được tối ưu hóa bàng việc sử dụng detector PDA Phương pháp này dựa trên việc kết hợp hai bước Đầu tiên cần loại bỏ axit và tách enzyme để giải phóng ra protein

và sau đó xác định các vitamin bằng phương pháp sắc ký lỏng HPLC Phương pháp này đã rất thành công trong việc áp dụng xác định các vitamin nhóm B trong các sản phẩm thực phẩm cho trẻ em như sữa bột trẻ em, sản phẩm nguồn gốc đậu nành, ngũ cốc, các sản phẩm nguồn gốc từ hoa quả

Pilar đã thực hiện tách một số vitamin tan trong nước trong sữa bột trẻ

em bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo [17] Kỹ thuật phân tích sử dụng chế độ tách gradient với pha động ACN và đệm photphat sử dụng detector PDA Kết quả cho thấy phương pháp cho độ tuyến tính, độ chính xác, độ nhạy

và độ thu hồi tin cậy Phương pháp này áp dụng thành công cho việc xác định các vitamin nhóm B trong các thực phẩm trẻ em khác nhau như: sữa bột trẻ em, ngũ cốc và các sản phẩm hoa quả

Alberto Zafra-Gomez đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC để xác định đồng thời các vitamin nhóm B trong các mẫu sữa bột và sữa tươi [16] Quá trình tách các vitamin sử dụng hệ thống HPLC 2695

Trang 28

Alliance, detector PDA, cột tách C18 Waters Spherisorb ODS-2 (25 cm x 4,6

mm, 3 μm); nhiệt độ cột 40°C, tốc độ dòng l mL/phút Quá trình chạy pha động

sử dụng hai kênh A và B với đệm photphat và dung môi ethanol Quá trình chạy gradient tổng cộng là 30 phút với tỉ lệ thành phần hai kênh được đặt thay đổi theo thời gian: 94/6 sau 4 phút; 70/30 sau 12 phút; 60/40 sau 17 phút và quay trở lại điều kiện ban đầu sau 22 phút và giữ trong 8 phút để đưa điều kiện cột về trạng thái ban đầu

Maria cũng sử dụng phương pháp HPLC với detector PDA để xác định đồng thời 5 vitamin nhóm B tan trong nước, với cột phân tích Restek Ultra Aqueous Cl8 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) Quá trình chạy pha động sử dụng hai kênh A (CH3COONH4 : CH3OH = 99 : 1) và kênh B (CH3OH : H2O =50 : 50)

Năm 2009, PGS TS Chu Ngọc Châu, PGS TS Tạ Thị Thảo và các cộng sự đã xác định một số vitamin nhóm B bằng phương pháp HPLC trong mẫu sữa bột trẻ em và mẫu thuốc Phương pháp sắc ký lỏng pha ngược HPLC

sử dụng detector PDA, bước sóng chọn lọc đối với từng vitamin B1 (246 nm); B6 (290 nm), B12 (361 nm) cột tách Supelco C18 Thành phần pha động theo chế độ rửa giải gradient gồm hai kênh, dung môi A là đệm photphat pH = 3 và

5 mM Natri heptan sulfonat; dung môi B là axetonitril, tốc độ dòng l mL/phút Phương pháp đã khảo sát, đánh giá được độ tin cậy của phương pháp thông qua các đại lượng: sai số tương đối (RSD < 5%), độ thu hồi (80 % - 98% đối với mẫu sữa và 89 - 103% đối với mẫu thuốc) Xác định được giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng đổi với từng vitamin B [5]

Trang 29

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Nội dung nghiên cứu

Các nội dung nghiên cứu gồm các nội dung sau:

 Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng chảy

 Chuẩn bị các dung dịch phân tích

 Khảo sát độ tuyến tính của chất phân tích

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.2.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký

 Chọn detector

Các vitamin B1, B6 và B12 hấp thụ ánh sáng mạnh trong vùng tử ngoại (UV) Mặt khác detector PDA cho pháp quan trắc các vitamin tại bước sóng trong vùng từ 200 nm đến 400 nm trong cùng một phép đo Đây là điểm ưu việt của detector PDA Căn cứ vào những điều trên, chúng tôi chọn detector phù hợp cho phép phân tích là detector PDA

 Chọn pha tĩnh

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống HPLC Cột pha tĩnh thông thường được làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10-30cm, đường kính trong 3-10 μm Chất nhồi cột có ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng phân tích mẫu Pha tĩnh thông dụng nhất là silicagan có gắn gốc ankyl mạch

Trang 30

dài, không phân cực, thông dụng nhất là -C18H37 Khoảng 61% các máy HPLC

sử dụng loại cột chứa pha tĩnh này Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn cột C18 với đường kính hạt pha tĩnh là 5 μm, chiều dài cột tách

250 mm, và đường kính cột 6,1 mm để tìm các điểu kiện khác tối ưu hóa việc tách để xác định vitamin B1, B6 và B12

 Lựa chọn dung môi

Các vitamin B1, B6 và B12 đều là những chất hoà tan tốt trong môi trường nước và axit axetic tuy nhiên khó tan trong etanol 96 % và metanol, không tan trong ete, benzen hay clorofom Vitamin B1 bền trong môi trường axit, còn trong môi trường kiềm nó rất dễ bị phân huỷ khi đun nóng Vitamin B6 bền khi đun sôi trong axit hay kiềm, không bền trong môi trường có tính oxy hóa Vitamin B12 bền trong bóng tối ở nhiệt độ thường, khá bền với nhiệt Vitamin B12 dễ bị phân hủy bởi ánh sáng Khi tiếp xúc với kim loại nặng dễ bị mất hoạt tính và không bền trong môi trường kiềm (pH > 7)

Căn cứ vào tính chất của các vitamin B1, B6 và B12 và các tài liệu tham khảo Chúng tôi chọn dung dịch đệm photphat (pH=3) làm dung môi cho quá trình nghiên cứu

 Chọn pha động

Trong quá trình sắc ký, pha động được chọn như thế nào là tùy thuộc vào tính chất của mẫu phân tích hoặc nồng độ Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp nhiều dung môi được trộn theo tỉ lệ thích hợp Khi chọn pha động cần chú ý đến một

số yêu cầu sau:

- Trơ và không tác dụng hóa học với pha tĩnh

- Bền và ổn định trong quá trình chạy sắc ký

- Hòa tan tốt hỗn hợp các chất phân tích

- Phù hợp với loại detector đã chọn

Pha động là một yếu tố rất linh động, ta có thể dễ dàng thay đổi để thu được kết quả tách tốt nhất bằng cách thay đổi tỉ lệ thành phần các loại dung môi

Trang 31

hữu cơ Pha động có thể là hệ dung môi không phân cực hoặc hệ dung môi phân cực người ta thường dùng nhất là hệ CH3OH - H2O hoặc hệ axetonitril - dung dịch đệm photphat Hệ sắc ký này có thể dùng để tách nhiều hỗn hợp từ phân cực đến không phân cực, vì vậy phạm vi sử dụng phong phú hơn Trong các nghiên cứu gần đây, phương pháp sắc ký lỏng pha ngược HPLC sử dụng thành phần pha động theo gồm kênh A là đệm photphat và kênh B là axetonitril được sử dụng rất hiệu quả trong việc phân tích các vitamin nhóm B trong sữa bột và các mẫu thực phẩm

Do đó, chúng tôi lựa chọn dung môi pha động gồm kênh A là đệm photphat và kênh B là axetonitril để xác định vitamin B1, B6 và B12 trong mẫu sữa

 Khảo sát bước sóng hấp thụ quang của các vitamin B1, B6 và B12

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chuẩn bị các dung dịch chuẩn vitamin B1 có nồng độ 2 (ppm), dung dịch chuẩn B6 có nồng độ 2 (ppm) và dung dịch chuẩn B12 có nồng độ 0,8 (ppm) sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi Do các vitamin nhóm B hấp thụ ánh sáng mạnh trong vùng tử ngoại (UV) Chúng tôi chọn detector PDA khảo sát các vitamin tại bước sóng trong vùng từ 200 nm đến 400 nm Các điều kiện khác cố định không đổi gồm kênh A là dung dịch đệm photphat, kênh B là axetonitril với tỉ

lệ 80:20 về thể tích, tốc độ dòng là 1 mL/phút để tiến hành quét phổ hấp thụ của dung dịch chứa các vitamin riêng rẽ B1, B6 và B12 từ bước sóng 200 nm đến 400 nm để tìm bước sóng tối ưu cho việc phân tích 3 vitamin

 Khảo sát lựa chọn tỉ lệ pha động

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chuẩn bị một dung dịch mẫu giả chứa hỗn hợp vitamin B1 có nồng độ 2 (ppm), vitamin B6 có nồng độ 2 (ppm) và vitamin B12 có nồng độ 0,8 (ppm) sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi Dựa trên tài liệu tham khảo, khi tăng tỷ lệ ACN thì thời gian lưu giữ các chất trên cột tăng, dẫn đến các vitamin có thể bị tách ra muộn gây doãn chân pic, ngược lại khi giảm tỷ lệ ACN thì thời gian lưu giữ các chất phân tích trên cột sắc ký giảm, các vitamin được tách ra sớm, chiều cao tăng tuy nhiên không tách được hoàn toàn các vitamin Dựa trên những điều tham

Trang 32

khảo ở trên, chúng tôi khảo sát hệ dung đôi pha động với tỷ lệ ACN trên dung dịch đệm photphat theo các tỉ lệ 30:70; 20:80 và 10:90 về thể tích Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm tốc độ dòng là 1 mL/phút, detector PDA với bước sóng chọn lọc đối với từng vitamin: B1 (246 nm); B6 (291 nm); B12 (361 nm) Tiến hành khảo sát để tìm ra tỉ lệ tối ưu giữa ACN và dung dịch đệm photphat

 Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng chảy

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chuẩn bị một dung dịch mẫu giả chứa hỗn hợp vitamin B1 có nồng độ 2 (ppm), vitamin B6 có nồng độ 2 (ppm) và vitamin B12 có nồng độ 0,8 (ppm) sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi Chúng tôi tiến hành khảo sát pha động ở các tốc độ là 0,8 mL/phút; 1 mL/phút và 1,2 mL/phút Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm kênh A là dung dịch đệm photphat, kênh B là axetonitril với tỉ lệ 80:20 về thể tích, detector PDA với bước sóng chọn lọc đối với từng vitamin: B1 (246 nm); B6 (291 nm); B12 (361 nm) Tiến hành khảo sát để tìm ra tốc độ dòng chảy tối ưu cho phép phân tích

Bảng 2.1.Các điều kiện tiến hành sắc ký

Pha động Kênh A: dung dịch đệm photphat (pH=3)

Kênh B: dung dịch axetonitril

Trang 33

 Vitamin B1 chuẩn của merck độ tinh khiết > 97,5%

 Sữa bột Dielac Alpha Gold của công ty vinamilk sản xuất, lô số R3,

 Sữa tươi Dielac Grow Plus của công ty vinamilk được sản xuất, lô số

0E72GPG15, ngày 28/6/2019 có hạn sử dụng đến ngày 27/12/2019

 Dung dịch axetonitril của merck, dung dịch H3PO4 đặc

2.2.3 Các dung dịch tiêm sắc ký

 Dung môi pha mẫu

- Cân chính xác 2,67 g Na2HPO4 vào bình 1 lít, sau đó định mức thành

1000 mL bằng nước cất 2 lần Dùng máy pH điều chỉnh pH = 3 bằng axit

H3PO4 đặc nồng độ 85 % ta được dung dịch đệm photphat có pH = 3

Trang 34

- Lấy chính xác 50,0 mL axetonitril cho vào bình định mức 250 mL, sau

đó định mức bằng dung dịch đệm photphat (pH=3) vừa pha Ta được dung dịch

để pha mẫu là dung dịch đệm photphat và axetonitril tỉ lệ 80:20 về thể tích

 Dung dịch chuẩn gốc:

- Dung dịch B1 chuẩn: Cân chính xác 0,0100 g vitamin B1 cho vào bình định mức 100 mL sau đó cho thêm vào dung môi pha mẫu, rung siêu âm và định mức đến 100 mL Ta được dung dịch vitamin B1 có nồng độ 100 (ppm)

Từ dung dịch này ta pha loãng ra các nồng độ 28 (ppm); 24 (ppm); 20 (ppm);

18 (ppm); 14 (ppm); 10 (ppm); 4 (ppm); 2,8 (ppm); 2,2 (ppm); 1,6 (ppm); 1,4 (ppm); 1,2 (ppm); 0,8 (ppm); 0,4 (ppm)

- Dung dịch B6 chuẩn: Cân chính xác 0,0100 g vitamin B6 cho vào bình định mức 100 mL sau đó cho thêm vào dung môi pha mẫu, rung siêu âm và định mức đến 100 mL Ta được dung dịch vitamin B6 có nồng độ 100 (ppm)

Từ dung dịch này ta pha loãng ra các nồng độ 28 (ppm); 24 (ppm); 20 (ppm);

18 (ppm); 14 (ppm); 10 (ppm); 4 (ppm); 2,8 (ppm); 2,2 (ppm); 1,6 (ppm); 1,4 (ppm); 1,2 (ppm); 0,8 (ppm); 0,4 (ppm)

- Dung dịch B12 chuẩn: Cân chính xác 0,0100 g vitamin B12 cho vào bình định mức 100 mL sau đó cho thêm vào dung môi pha mẫu, rung siêu âm

và định mức đến 100 mL Ta được dung dịch vitamin B12 có nồng độ 100 (ppm) Từ dung dịch này ta pha loãng ra các nồng độ 28 (ppm); 24 (ppm); 20 (ppm); 18 (ppm); 14 (ppm); 10 (ppm); 4 (ppm); 2,8 (ppm); 2,2 (ppm); 1,6 (ppm); 1,4 (ppm); 1,2 (ppm); 0,8 (ppm); 0,4 (ppm); 0,05 (ppm); 0,01 (ppm)

- Dung dịch mẫu giả: Lấy lần lượt 10 mL dung dịch B1 có nồng độ 10 (ppm); 10 mL dung dịch B6 có nồng độ 10 (ppm) và 10 mL dung dịch B12 có nồng độ 4 (ppm) cho vào bình định mức 50 mL và định mức thành 50mL bằng dung môi pha mẫu được dung dịch chuẩn chứa hỗn hợp vitamin B1 có nồng độ

2 (ppm), vitamin B6 có nồng độ 2 (ppm) và vitamin B12 có nồng độ 0,8 (ppm)

Trang 35

 Xử lí mẫu sữa

- Đối với mẫu sữa bột trẻ em: Cân lượng chính xác 5,0000 gam sữa bột vào ống nhựa ly tâm (50 mL) Thêm 25 mL dung môi pha mẫu Lắc đều, rung siêu âm, sau đó ly tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,45 μm trước khi bơm vào hệ thống HPLC

- Đối với mẫu sữa tươi: Hút chính xác 15 mL sữa tươi vào ống nhựa li tâm (50 mL), thêm dung môi pha mẫu thành 25 mL Lắc đều, rung siêu âm, ly tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,45 μm trước khi bơm vào hệ thống HPLC

 Dung môi pha động:

- Kênh A: Cân chính xác 2,6700 g Na2HPO4 cho vào bình 1 lít, sau đó định mức thành 1000 mL bằng nước cất 2 lần Dùng máy pH điều chỉnh pH = 3 bằng axit H3PO4 đặc nồng độ 85 % ta được dung dịch đệm photphat có pH = 3 Dung dịch đệm photphat trong bình 1000 mL được lọc qua màng lọc 0,45 μm trước khi đưa vào hệ thống HPLC

- Kênh B: đưa vào kênh B của hệ thống máy HPLC dung dịch axetonnitril của merck

Trang 36

2.3 Sơ đồ nghiên cứu của phương pháp phân tích

Khảo sát điều kiện sắc ký

Kết luận

Trang 37

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Khảo sát các điều kiện sắc ký

3.1.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng

Tiến hành quét phổ hấp thụ của dung dịch chứa các vitamin riêng rẽ B1, B6 và B12 từ bước sóng 200 nm đến 400 nm Các điều kiện khác cố định không đổi gồm kênh A là dung dịch đệm photphat, kênh B là axetonitril với tỉ lệ 80:20

về thể tích, tốc độ dòng là 1 mL/phút Sắc đồ quét phổ thu được như sau:

Hình 3.1 Sắc đồ quét phổ hấp phụ vitamin B1

Trang 38

Nhận xét: Trong cùng điều kiện, Khi tiến hành quét phổ hấp thụ của

dung dịch chứa các vitamin riêng rẽ B1, B6 và B12 thì các bước sóng cực đại phát hiện của 3 vitamin thu được tương ứng ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Bước sóng hấp thụ cực đại của vitamin B1, B6 và B12

Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn Detector PDA với bước sóng chọn

lọc đối với từng vitamin: B1 (246 nm); B6 (291 nm); B12 (361 nm)

3.1.2 Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng chảy

Chúng tôi tiến hành khảo sát pha động ở tốc độ là 0,8 mL/phút; 1,0 mL/phút và 1,2 mL/phút Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm kênh

A là dung dịch đệm photphat, kênh B là axetonitril với tỉ lệ 80:20 về thể tích, detector PDA với bước sóng chọn lọc đối với từng vitamin: B1 (246 nm); B6 (291 nm); B12 (361 nm) Kết quả thu được như sau

Trang 39

Hình 3.6 Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 ở tốc độ 1,2 mL/phút

Nhận xét: Kết quả ở hình 3.4; 3.5 và 3.6 cho thấy, với tốc độ dòng là 0,8

mL/phút thì các pic không cân xứng, có hiện tượng doãng chân pic Với tốc độ dòng là 1,0 mL/phút và 1,2 mL/phút thì các vitamin được tách ra hoàn toàn, tuy nhiên tốc độ dòng là 1,2 mL/phút thì diện tích pic và chiều cao pic giảm Dựa trên việc khảo sát ở trên, chúng tôi chọn tốc độ dòng là 1,0 mL/phút cho quá trình sắc ký

3.1.3 Khảo sát lựa chọn tỉ lệ pha động

Chúng tôi sử dụng chế độ chạy sắc ký với thành phần pha động không đổi Khảo sát hệ dung môi pha động với tỷ lệ ACN trên dung dịch đệm photphat (pH=3) theo các tỉ lệ 30:70, tỉ lệ 20:80 và tỉ lệ 10:90 Các điều kiện khác cố định không đổi bao gồm tốc độ dòng là 1 mL/phút, detector PDA với bước sóng chọn lọc đối với từng vitamin: B1 (246 nm); B6 (291 nm); B12 (361 nm) Kết quả thu được như sau

Hình 3.7 Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 tỉ lệ pha động 10:90

B1 B6

B12

B1 B6

B12

Trang 40

Nhận xét: Kết quả ở hình 3.7; 3.8 và 3.9 cho thấy, với tỉ lệ pha động là

30:70 thì các chất được tách ra tương đối tốt nhưng thường bị doãng chân pic Với tỉ lệ pha động 10:90 thì B6 và B12 gần như không tách ra khỏi nhau Chính

vì vậy, tỉ lệ pha động 20:80 là tối ưu nhất để tách 3 vitamin ra khỏi nhau

 Kết luận chung: Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn điều kiện tối ưu

cho phép xác định vitamin B1, B6, B12 bằng phương pháp HPLC là:

Định dạng
Số trang	87
Dung lượng	1,88 MB