Nghiên cứu thực trạng vệ sinh thú y ở một số cơ sở giết mổ lợn và mức độ ô nhiễm vi khuẩn salmonelia trên thịt lợn tại huyện hoài đức hà nội

NGUYỄN DUY THẮNG NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG VỆ SINH THÚ Y Ở MỘT SỐ CƠ SỞ GIẾT MỔ LỢN VÀ MỨC ĐỘ Ô NHIỄM VI KHUẨN SALMONELLA TRÊN THỊT LỢN TẠI HUYỆN HOÀI ĐỨC - HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ

NGUYỄN DUY THẮNG

NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG VỆ SINH THÚ Y

Ở MỘT SỐ CƠ SỞ GIẾT MỔ LỢN VÀ MỨC ĐỘ

Ô NHIỄM VI KHUẨN SALMONELLA TRÊN THỊT LỢN

TẠI HUYỆN HOÀI ĐỨC - HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN – 2019

NGUYỄN DUY THẮNG

NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG VỆ SINH THÚ Y

Ở MỘT SỐ CƠ SỞ GIẾT MỔ LỢN VÀ MỨC ĐỘ

Ô NHIỄM VI KHUẨN SALMONELLA TRÊN THỊT LỢN

TẠI HUYỆN HOÀI ĐỨC - HÀ NỘI

Chuyên ngành: Thú y

Mã số ngành: 8 64 01 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên

THÁI NGUYÊN - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, ngày 10 tháng 11 năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Duy Thắng

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực tập và thực hiện đề tài này, tôi đã nhận được sự quan tâm, chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè

và sự động viên khích lệ của gia đình

Nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

GS.TS Nguyễn Quang Tuyên - Người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm khoa và các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Trạm thú y huyện Hoài Đức đã giúp tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc về sự ủng hộ, động viên, giúp

đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt luận văn này

Thái Nguyên, ngày 10 tháng 11 năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Duy Thắng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

3.1 Ý nghĩa khoa học 3

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tình hình ngộ độc trên thế giới và trong nước 5

1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên thế giới 5

1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam 5

1.2 Tình hình nghiên cứu một số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt 7

1.2.1 Tập đoàn vi khuẩn hiếu khí 7

1.2.2 Vi khuẩn Salmonella 8

1.3 Phân loại vi sinh vật có trong thịt 17

1.3.1 Vi khuẩn 17

1.3.2 Nấm mốc 18

1.3.3 Nấm men 18

1.6 Quá trình nhiễm khuẩn của thịt 18

1.6.1 Sự nhiễm khuẩn tại cơ sở giết mổ 18

1.6.2 Nhiễm khuẩn do cơ thể động vật 19

1.6.3 Nhiễm khuẩn do không khí 19

1.6.4 Nhiễm khuẩn từ nước 19

1.6.5 Nhiễm khuẩn do con người 20

1.6.6 Sự nhiễm khuẩn do vận chuyển 20

1.6.7 Sự nhiễm khuẩn nơi bày bán 21

1.7 Tình hình nghiên cứu các biện pháp hạn chế ô nhiễm vi sinh vật đối với

thịt trong cơ sở giết mổ 21

Chương 2 24

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng, phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 24

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 24

2.1.4 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019 24

2.2 Nôi dung nghiên cứu 24

2.3 Vật liệu nghiên cứu 25

2.3.1 Mẫu điều tra thực trạng, mẫu bệnh phẩm dùng phân lập vi khuẩn 25

2.3.2 Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 25

2.3.3 Động vật thí nghiệm: 25

2.4 Phương pháp nghiên cứu 26

2.4.1 Phương pháp đánh giá thực trạng giết mổ lợn 26

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm 26

2.4.3 Phương pháp xác định vi sinh vật 27

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 35

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1 KẾT QUẢ ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH HOẠT ĐỘNG GIẾT MỔ LỢN TRÊN ĐỊA BÀN HUYỆN HOÀI ĐỨC, TP HÀ NỘI 36

3.1.1 Địa điểm, số lượng và quy mô các cơ sở giết mổ lợn trên địa bàn huyện Hoài Đức, TP Hà Nội 36

3.1.2 Điều kiện vệ sinh thú y trong hoạt động giết mổ tại các cơ sở giết mổ lợn tại huyện Hoài Đức, TP Hà Nội 37

3.1.3 Kiểm tra mức độ ô nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí trong thịt lợn tại một số cơ sở giết mổ 48

3.1.4 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu tổng số Coliform 50

3.2 TỶ LỆ NHIỄM VI KHUẨN SALMONELLA TRÊN THỊT LỢN TẠI MỘT SÓ CƠ SỞ GIẾT MỔ LỢN TRÊN ĐỊA BÀN HUYỆN HOÀI ĐỨC 52

3.2.1 Kết quả giám định một số đặc tính nuôi cấy và sinh hóa của một số chủng Salmonella phân lập được từ thịt lợn 52

3.2.2 Kết quả giám định bằng kỹ thuật PCR 55

3.3 Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ thịt lợn trên chuột nhắt trắng 58

3.4 Kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của một số chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được từ thịt lợn 60

3.5 Đề xuất một số giải pháp hạn chế sự ô nhiễm vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn tại các cở sở giết mổ thịt lợn và nguy cơ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella 62

3.5.1 Giải pháp trước mắt 62

3.5.2 Giải pháp lâu dài 64

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65

1 Kết luận 65

2 Đề nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn của tổ chức Y tế thế giới WHO (World Health

Organisation) về sinh vật của nước uống 20 Bảng 3.1 Quy mô và số lượng các cơ sở giết mổ lợn theo từng xã, thị trấn

trên địa bàn huyện Hoài Đức, TP Hà Nội 36 Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra, đánh giá các chỉ tiêu cơ sở giết mổ lợn quy định

tại Thông tư 09/2016/TT-BNNPTNT 40 Bảng 3.3 Kết quả kiểm tra mức độ ô nhiễm vi khuẩn hiếu khí trong không

khí tại cơ sở giết mổ lợn tại huyện Hoài Đức 45

Bảng 3.4 Kết quả chỉ tiêu Coliform trong nước sử dụng cho hoạt động giết

mổ lợn tại các CSGM trên địa bàn huyện Hoài Đức 46

Bảng 3.5 Kết quả chỉ tiêu E coli trong nước sử dụng cho hoạt động giết mổ

lợn tại các CSGM trên địa bàn huyện Hoài Đức 47 Bảng 3.6 Kiểm tra mức độ ô nhiễm tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thịt lợn 49 Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra tổng số Coliform trong thịt lợn tại các cơ sở giết

mổ 51 Bảng 3.8 Kết quả giám định một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn

Salmonella phân lập được từ thịt lợn 54

Bảng 3.9 Kết quả phản ứng PCR phát hiện Salmonella 55 Bảng 3.10 Kết quả kiểm tra vi khuẩn Salmonella trong thịt tại các cơ sở giết

mổ tại huyện Hoài Đức, TP Hà Nội 56

Bảng 3.11 Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được

từ thịt lợn trên chuột nhắt trắng 58 Bảng 3.12 Kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của một số chủng

vi khuẩn Salmonella phân lập được từ thịt lợn 60

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình ảnh 3.1: Giết mổ GSGC ngay trên sàn, nền nhà tại lò giết mổ lợn tại

xã La Phù, huyện Hoài Đức 74 Hình ảnh 3.2: Cạo lông lợn trên nền gạch 74 Hình ảnh 3.3: Nước thải của khu vực giết mổ lợn tại xã Đông La, huyện

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Vấn đề an toàn thực phẩm và vệ sinh an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới Ở Việt Nam, ngộ độc thực phẩm đang là vấn đề nóng của toàn xã hội và đã trở thành mối lo lớn nhất cho sức khỏe cộng đồng Theo báo cáo của Cục an toàn thực phẩm - Bộ Y tế cho biết hằng năm có hàng trăm vụ ngộ độc thực phẩm, với hàng nghìn người mắc, có người bị tử vong Có rất nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra ngộ độc thực phẩm ở người, do nhiều yếu tố khác nhau, nhưng do vi khuẩn vẫn chiếm phần

lớn Salmonellosis là một bệnh do vi khuẩn Salmonella được lây nhiễm qua đường tiêu hoá Salmonella được biết đến như là một nguyên nhân gây ngộ

độc thực phẩm trên thế giới và là mối đe dọa đến sức khoẻ cộng đồng ở hầu hết các nước đang phát triển cũng như các nước phát triển (Cox L.A và cộng

sự, 2008) Mặc dù Salmonella đã được nghiên cứu hàng trăm năm nay, tuy

nhiên nó vẫn thu hút được sự quan tâm các nhà khoa học do các trường hợp

ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn này, đặc biệt là Salmonella enteritidis ngày một tăng Thịt lợn được coi là một trong những nguồn lây nhiễm Salmonella

quan trọng ở rất nhiều nước (Berends và cộng sự, 1997); Chiu C.H và cộng

sự, 2002); Chang C.C và cộng sự, 2005); Murugkar H.V., 2005) đặc biệt là thực hành giết mổ tại các lò giết mổ (Berends B.R và cộng sự (1998); Botteldoorn N và cộng sự (2003); Hurd H.S.và cộng sự (2005) Trong hơn 30 năm trở lại đây, tiêu thụ thịt lợn ở Việt Nam dao động ổn định ở mức 75% so với các sản phẩm thịt khác Khảo sát thị trường bán lẻ thịt lợn cho thấy tỷ lệ

nhiễm vi khuẩn Salmonella chiếm khoảng 33% đến 40% số mẫu kiểm tra

(Dao H.T.A and P.T Yen (2006); Thuy D.N., và cộng sự (2006) Bệnh do vi

khuẩn Salmonella thường xuất hiện ở người già và trẻ em với các triệu chứng

như sốt, đau bụng dữ dội, ỉa chảy và đôi khi nôn mửa (CDC, 2006; Toyofuku

H và cộng sự (2006) Cho tới nay đã xác định được có khoảng hơn 3000

chủng vi khuẩn Salmonella khác nhau, tuy nhiên khoảng 250 chủng có khả năng gây bệnh cho người, đặc biệt hai chủng Salmonella enteritidis và

Salmonella typhimurium được đánh giá là có nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm

rất cao (Aarestrup F.M và cộng sự, 2007); Hendriksen R.S và cộng sự, 2011) Trong quá trình giết mổ, sự lây nhiễm chéo đặc biệt xảy ra ở các khâu như dội nước nóng, cạo lông, mổ bụng và lấy phủ tạng (Humphrey T (2000) Mặt khác, giết mổ lợn là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thực phẩm có nguy

cơ nhiễm vi khuẩn Salmonella cao đối với thịt lợn sau khi giết mổ Mức độ ô

nhiễm phụ thuộc vào điều kiện vệ sinh của các lò giết mổ cũng như thực hành

vệ sinh trong quá trình giết mổ Nguy cơ nhiễm Salmonella ở lợn càng rõ ràng

hơn từ giai đoạn vỗ béo đến khi giết mổ Lò giết mổ cũng là một nguồn tàng trữ vi khuẩn có thể lây nhiễm sang người (Laval, A (2000) Hơn nữa, ô

nhiễm Salmonella tại các trang trại nuôi lợn được cho là có nguyên nhân từ vệ

sinh môi trường kém, thức ăn và nước uống sử dụng trong chăn nuôi bị ô nhiễm Tình trạng này cùng với sự kém kiểm tra giám sát các hoạt động giết

mổ, đặc biệt là điều kiện vệ sinh giết mổ, dẫn đến sự lưu hành của vi khuẩn

Salmonella trong các mẫu thịt lợn (Luu Q.H và cộng sự, 2006; Thu T.L và

cộng sự, 2006)

Huyện Hoài Đức có 20 đơn vị hành chính, bao gồm 1 thị trấn và 19 xã

Là huyện liền kề Trung tâm Thủ đô nên hoạt động giết mổ gia súc, gia cầm cung cấp thực phẩm cho người dân nội thành của Hoài Đức khá sôi động Toàn huyện có 30 điểm giết mổ gia súc thủ công, trong đó, 22 điểm giết mổ lợn, 8 điểm giết mổ trâu, bò Ngoài ra, còn nhiều cơ sở giết mổ gia súc, gia cầm nhỏ lẻ trong khu dân cư Trên địa bàn huyện việc giết mổ và bán thịt mới chỉ dừng lại ở quy mô nhỏ lẻ là chính, tư nhân, chưa phát triển cơ sở giết mổ tập trung Những năm gần đây, Trạm chăn nuôi và Thú y huyện cùng Chi cục Thú y Hà Nội đã có nỗ lực phối hợp với chính quyền địa phương, các ngành chức năng tăng cường kiểm tra chấn chỉnh việc kinh doanh mua bán

giết mổ gia súc, nhưng chưa có sự phối hợp và giải pháp mạnh, đồng bộ, chưa

có cơ sở khoa học mang tính thực tế cao để khắc phục tình trạng trên Vì vậy, việc lập lại trật tự trong việc kinh doanh là cần thiết để mua bán, giết mổ gia súc trên địa bàn huyện Hoài Đức tuân theo quy định của pháp luật, đảm bảo

vệ sinh an toàn thực phẩm, vệ sinh môi trường, bảo vệ sức khỏe cho con người, cho phát triển của xã hội Muốn giải quyết được vấn đề này đòi hỏi phải có một giải pháp cụ thể, khoa học Tuy nhiên có rất ít những nghiên cứu

về xác định nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm cũng như nguồn gốc của sự ô nhiễm trong chăn nuôi và thực hành giết mổ tại huyện Điều đó

đã đặt ra yêu cầu bức thiết hiện nay là phải đánh giá thực trạng hoạt động giết

mổ gia súc trên địa bàn huyện và mức độ ô nhiễm vi khuẩn gây ngộ độc thực

phẩm như Salmonella từ đó đề ra những giải pháp khắc phục, xây dựng các

cơ sở giết mổ gia súc đạt tiêu chuẩn phù hợp với điều kiện địa phương Xuất

phát từ yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:“ Nghiên

cứu thực trạng vệ sinh thú y ở một số cơ sở giết mổ lợn và mức độ ô nhiễm vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn tại huyện Hoài Đức - Hà Nội ”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát được thực trạng hoạt động giết mổ lợn trên địa bàn huyện Hoài Đức, TP Hà Nội (về địa điểm, trang thiết bị, điều kiện vệ sinh thú y, )

- Xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn tại các

cơ sở giết mổ lợn

- Xác định được độc lực và tính kháng kháng sinh của các chủng

Salmonella trong thịt lợn tại các cơ sở giết mổ lợn

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài được nghiên cứu có hệ thống, lý luận, gắn liền với thực tiễn của

cơ sở, xác định mức độ nhiễm vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn tại địa bàn

huyện Hoài Đức, TP Hà Nội Kết quả nghiên cứu này giúp các nhà quản lý

xây dựng các chiến lược phòng ngừa ô nhiễm vi sinh vật trên thịt lợn, đảm bảo cung cấp thực phẩm an toàn cho người tiêu dùng

Kết quả nghiên cứu là những thông tin giúp các nhà quản lý quy hoạch

hệ thống cơ sở giết mổ trên địa bàn huyện Hoài Đức, thành phố Hà Nội và cũng là cơ sở khoa học phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo về công tác quản

lý giết mổ lợn và đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Đồng thời đóng góp bổ sung thêm tư liệu tham khảo cho cán bộ, sinh viên của các trường đại học, cao

đẳng nghiên cứu về lĩnh vực này

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu giúp xác định được thực trạng giết mổ lợn và mức

độ ô nhiễm vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn trên địa bàn huyện Hoài Đức,

TP Hà Nội Từ đó đưa ra khuyến cáo đề xuất các giải pháp hạn chế sự nhiễm

vi khuẩn trên thịt lợn và nguy cơ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình ngộ độc trên thế giới và trong nước

Trên thế giới, nền kinh tế của các nước ngày càng phát triển, vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được quan tâm Ngộ độc thực phẩm đang là mối đe dọa đối với người tiêu dùng trên toàn thế giới Ở các nước phát triển

có tới 10% dân số bị ngộ độc thực phẩm và mắc bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm mỗi năm; với các nước kém phát triển tỷ lệ này cao hơn nhiều Ngộ độc thực phẩm ở Mỹ chiếm 5% dân số/năm (>10 triệu người trên năm), ở Úc là 4,2 triệu ca/năm

Nhiều ghi nhận về các vụ ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới trong thời gian vừa qua, là vấn đề dáng quan tâm về sức khỏe cộng đồng và mức độ ảnh hưởng của bệnh này đối với toàn cầu

1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam

Đảm bảo ATVSTP là một trong những vấn đề hàng đầu được Đảng

và Nhà nước quan tâm Tuy nhiên đây là một trong những thách thức cho những nhà quản lý Đặc biệt là sự ô nhiễm vi sinh vật vào các loại thịt tươi,

thịt đã được chế biến sẵn bán tại các chợ rất phổ biến, song bên cạnh đó thì các điều kiện vệ sinh về trang thiết bị bày bán, dụng cụ chế biến chưa đảm bảo Quy trình từ chăn nuôi đến sản xuất chế biến lưu thông và tiêu dùng nhiều mặt hàng thực phẩm của Việt Nam được các chuyên gia WHO khẳng định

là chưa an toàn và chưa sạch

Nguyên nhân gây ngộ độc rất đa dạng: Ngộ độc do thức ăn bị nhiễm

vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn, do nấm mốc và độc tố của nấm mốc, do thuốc bảo vệ thực vật, do kim loại nặng, các loại phụ gia thực phẩm, hàn the Nhưng trong số ấy nguyên nhân do vi sinh vật chiếm tỷ lệ khá cao từ

32,8 -55,8% trong đó có sự tham gia của vi khuẩn Salmonella gây ra nhiều

vụ ngộ độc thực phẩm

Tại Việt Nam từ năm 2005 tới nay đã có hơn 1.000 vụ ngộ độc thực phẩm với khoảng 27.000 người mắc, trên 300 người tử vong Trong đó 60% xảy ra ở các bếp ăn tập thể, thức ăn đường phố Năm 2016 cả nước xảy ra 129

vụ ngộ độc thực phẩm với 4.139 người mắc, trong đó có 12 người tử vong Tình trạng mất an toàn thực phẩm ngày càng cao, nhất là ở các bếp ăn tập thể như trường học, bệnh viện, khu công nghiệp, nơi tập trung đông người Riêng trong 4 tháng đầu năm 2017 cả nước xảy ra 8 vụ ngộ độc thực phẩm làm 114 người mắc, 109 người đi viện, không ghi nhận tử vong Về căn nguyên, 03/08

vụ do vi sinh vật, 02/08 vụ do độc tố tự nhiên, 03/08 trường hợp chưa xác định được nguyên nhân ngộ độc Tích lũy từ đầu năm 2017 đến tháng 4 năm

2017 toàn quốc xảy ra 129 vụ ngộ độc thực phẩm với 755 người mắc, 736 người đi viện và 15 trường hợp tử vong tăng so với cùng kỳ năm 2016 (Bộ y

tế, 2017) Năm 2018, trên địa bàn cả nước xảy ra 79 vụ ngộ độc thực phẩm, làm 2.847 người bị ngộ độc (11 trường hợp tử vong), trong đó vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng xảy ra tại trường mầm non ở Đông Anh, Hà Nội làm hơn 200 học sinh và giáo viên bị ngộ độc do nhiễm khuẩn đường tiêu hóa vào tháng 11/2018

1.2 Tình hình nghiên cứu một số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt

1.2.1 Tập đoàn vi khuẩn hiếu khí

Thuật ngữ “vi khuẩn hiếu khí” trong vệ sinh thực phẩm được hiểu bao gồm cả vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tuỳ tiện Theo Varhagen và cộng sự (1991), hệ vi khuẩn có mặt trong thịt được xác định là 2 nhóm, căn cứ dựa theo nhiệt độ phát triển của chúng, gồm: Nhóm vi khuẩn ưa nhiệt phát triển tốt ở nhiệt độ 370C và không phát triển ở nhiệt độ 10C Nhóm ưa lạnh sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ thấp hơn

Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm được sử dụng như một nhân tố chỉ điểm về điều kiện vệ sinh, nhiệt độ và thời gian bảo quản của quá trình giết mổ, chế biến cũng như vận chuyển thực phẩm Nó được coi là phương pháp tốt nhất để ước lượng vi khuẩn xâm nhập vào thực phẩm (Helrick, 1997)

Trong thân thịt khi phát hiện số lượng lớn vi khuẩn hiếu khí trong thân thịt, chứng tỏ rằng điều kiện vệ sinh giết mổ là rất kém Theo ISO13722:1996, nhiệt độ thích hợp nhất để nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm được áp dụng cho mọi vùng là 300C

Nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm là do bị nhiễm khuẩn

Theo các số liệu thống kê, các loài vi khuẩn Salmonella từ lâu đã được xác

định là một trong số các tác nhân vi khuẩn thường nhiễm và quan trọng nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm, dịch tiêu chảy trên toàn thế giới Các nhà khoa học đã ước tính rằng, có tới 95% các trường hợp mắc bệnh tiêu chảy ở người là có liên quan đến việc ăn phải các thực phẩm có nhiễm vi khuẩn này như thịt gia cầm, thịt bò, thịt lợn, trứng và các sản phẩm tươi sống (Mead và

cộng sự, 1999) Salmonella có mặt ở trong đường tiêu hóa của động vật và dễ

dàng xâm nhập vào chuỗi (dây truyền) chế biến thực phẩm, gây ô nhiễm các loại thịt động vật, đặc biệt là thịt lợn, thịt gà, thịt bò, trứng và các sản phẩm tươi sống (Mead và cộng sự, 1999) Người tiêu dùng, khi ăn phải các loại

thực phẩm bị ô nhiễm và chưa được nấu chín kỹ sẽ dễ dàng bị tiêu chảy (Escartin và cộng sự, 2000) Ngoài ra, việc tiếp xúc trực tiếp với các động vật

bị nhiễm bệnh cũng có thể là nguồn tiềm tàng lây nhiễm Salmonella (Tauxe,

1992, Benenson và cộng sự , 1995) Do khả năng gây ngộ độc trầm trọng ở người của vi khuẩn này và khả năng truyền lây bệnh của chúng thông qua thức ăn có nguồn gốc động vật nên các nghiên cứu về vi khuẩn hết sức cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao

1.2.2 Vi khuẩn Salmonella

1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Salmonella

* Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1885, Dannel E Salmon nhà bác học thú y ở Mỹ lần đầu tiên

phát hiện Salmonella từ ruột của một con lợn và được đặt tên là

Salmonella cholerae suis (Zhao Cuiwei và cộng sự, 2001) Vi khuẩn Salmonella sau này mới được biết là nguyên nhân gây bệnh ở người

(Winkler G và cộng sự, 2002)

Salmonellosis là một bệnh truyền nhiễm phức tạp của nhiều loài động

vật và người Bệnh có đặc điểm dịch tễ khác nhau giữa các vùng địa lý, phụ thuộc vào khí hậu, mật độ động vật, tập quán canh tác, kỹ thuật thu hoạch và chế biến thực phẩm, thói quen tiêu dùng và đặc tính sinh học các chủng

Salmonella

Trong hệ thống phân loại của Ewing, dựa vào khả năng gây bệnh và

thích nghi với vật chủ là người hay động vật mà Salmonella có thể được chia

làm 3 nhóm chính như sau:

- Nhóm 1: Salmonella gây bệnh cho người, gồm Salmonella typhi và

Salmonella paratyphi A, B và C Chúng có thể lây nhiễm trực tiếp hoặc gián

tiếp qua thức ăn, nước uống, từ người này sang người khác

- Nhóm 2: Gây bệnh trên động vật, như Salmonella dublin ở trâu bò,

Salmonella cholerae suis ở lợn

- Nhóm 3: Gây bệnh cho nhiều loài động vật, là nguyên nhân gây nên những vụ ngộ độc nghiêm trọng ở người và động vật, trong đó điển hình là

Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium

Adeyanju G.T và Ishola O (2014) đã thu thập 53 mẫu thịt gà và 46

mẫu thịt gà tây từ các điểm bán lẻ thuộc Nigeria để đánh giá tỷ lệ nhiễm E

coli và Salmonella spp Kết quả cho thấy có 32,1% số mẫu thịt gà và 34,8%

số mẫu thịt gà tây dương tính với Salmonella spp.; 43,4% số mẫu thịt gà và 39,1% số mẫu thịt gà tây nhiễm vi khuẩn E coli

Vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra được rất nhiều các nhà

vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm Mục đích của các nghiên cứu này nhằm tìm ra các biện pháp có hiệu quả để góp phần ngăn chặn và đẩy lùi bệnh

do Salmonella gây ra ở động vật và ở người

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về ngộ độc thực phẩm do

trọng trong chuỗi thực phẩm có nguy cơ nhiễm vi khuẩn Salmonella cao đối

với thịt lợn sau khi giết mổ Mức độ ô nhiễm phụ thuộc vào điều kiện vệ sinh của các lò giết mổ cũng như thực hành vệ sinh trong quá trình giết mổ Nguy

cơ nhiễm Salmonella ở lợn càng rõ ràng hơn từ giai đoạn vỗ béo đến khi giết

mổ Lò giết mổ cũng là một nguồn tàng trữ vi khuẩn có thể lây nhiễm sang người

Angkititrakul (2005) nghiên cứu đặc điểm dịch tễ tính kháng kháng

sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập từ thịt lợn, thịt gà và người ở Thailan

Pulsrikarn (2012) nghiên cứu serotype, tính mẫn cảm với kháng sinh và

genotyoe của Salmonella phân lập từ lợn và thịt lợn ở tỉnh Sa Kaew, Thailan

Nowak (2007) cũng đã nghiên cứu về mức độ ô nhiễm vi khuẩn

Salmonella trên lợn ở các lò mổ và trang trại

Ở Hàn Quốc, năm 2011 tác giả Kim đã tiến hành nghiên cứu tỷ lệ

nhiễm và tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella spp và Escherichia

coli phân lập từ lợn tại lò mổ

* Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, Vi khuẩn Salomnella có thể gây bệnh thương hàn, phó

thương hàn và chứng ngộ độc thức ăn ở người Cũng như bệnh phó thương hàn ở lợn, bệnh có thể lây lan giữa người và gia súc

Theo Nguyễn Hữu Bình (1991), bệnh thương hàn ở người là bệnh truyền nhiễm lây lan, hay gây thành dịch do trực khuẩn thương hàn

Salmonella typhi và trực khuẩn phó thương hàn Salmonella paratyphi A,B,C

gây nên

Các serotyp Salmonella phân lập ở thịt lợn, phân bố theo các nhóm sau:

57 serotyp nhóm E1; 6 serotyp nhóm E; 1 serotyp nhóm C1; 3 serotyp nhóm C2

Như vậy, các serotyp Salmonella khác nhau đã thấy ở lợn và công nhân sát sinh Hà Nội Đặc biệt các serotyp Salmonella ở người, từ trước tới nay

thường là lây từ gia súc sang, rất ít trường hợp nguyên phát

Trần Xuân Hạnh (1995) khi phân lập từ lợn 2 - 4 tháng tuổi và giám

định vi khuẩn Salmonella ở lợn tại thành phố Hồ Chí Minh cho biết:

Salmonella typhisuis ở lợn bệnh là 16,9%; ở lợn bình thường 6 - 16 tuần tuổi

là 4,2%; Salmonella paratyphi ở lợn 6 - 16 tuần tuổi là 2,8% Đặc biệt, vi khuẩn Salmonella choleraesuis chiếm 38,7% ở lợn bệnh và 2,8% ở lợn bình thường Khi phân lập được 6 serotyp Salmonella với tỷ lệ nhiễm như sau: S

cholerae suis 35,9%; S.derby 17,95%; S typhimurium và S london 10,25%

và thấp nhất là S newport 7,69%

Vi khuẩn Salmonella sống trong phủ tạng của gia cầm, gia súc và vấy

nhiễm vào thịt khi giết mổ Chúng cũng có mặt ở phân và dễ dàng xâm nhập

vào trứng gia cầm qua những lỗ nhỏ li ti ở vỏ Salmonella là một trong những

thủ phạm chính gây ngộ độc thực phẩm (Đào Thị Thanh Thủy, 2012)

Lê Minh Sơn và cộng sự (1996), nghiên cứu về tỷ lệ phân lập được vi

khuẩn Salmonella trong thịt đông lạnh xuất khẩu tại Khánh Hòa là 4,54%,

Nam Trung Bộ là 6,25%

Trần Xuân Đông và cộng sự (2002) cho biết tỷ lệ nhiễm Salmonella

trong thịt ở cơ sở giết mổ trên địa bàn Quảng Ninh là 2,12% Tỷ lệ mẫu thịt

phân lập được Salmonella tại các cơ sở giết mổ ở Hà Nội là 12,63%

Nguyễn Thị Nguyệt và cộng sự (2005) khi tìm hiểu tình hình nhiễm khuẩn trong thịt gà tại một số điểm giết mổ ở thành phố Hồ Chí Minh cho biết

tỷ lệ nhiễm E coli là 98%, Salmonella là 29,3%

Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Tuân và cs (2006) cho thầy tỷ lệ thịt lợn

nhiễm Salmonella ở các tỉnh miền Tây Nam Bộ từ năm 2004-2005 là 59,7%

Nguyễn Viết Không và cs (2012) khi nghiên cứu tình trạng ô nhiễm

Salmonella ở các điểm giết mổ gia cầm quy mô nhỏ tại các huyện ngoại thành

Hà Nội cho biết tỷ lệ thịt nhiễm Salmonella là 40,6%

Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở các mẫu lau hậu môn, manh tràng; nền

chuồng chờ giết mổ; lau sàn giết mổ và mẫu lau thân thịt lần lượt là 59,72%; 48,26%; 37,50% và 60,00% (Phạm Thị Ngọc và cộng sự, 2013)

Cầm Ngọc Hoàng và cộng sự (2014) cho biết: Tỷ lệ mẫu thịt đạt chỉ

tiêu vi sinh vật cao nhất đối với vi khuẩn Salmonella (90,24%), tiếp theo là E

coli (76,83%) và thấp nhất là chỉ tiêu S aureus (68,29%)

Các nghiên cứu trên đã đánh giá thực trạng nhiễm Salmonella trong

thực phẩm tại một số địa phương, kết quả nghiên cứu đã góp phần đưa ra một

số giải pháp cần thiết cũng như các biện pháp tối ưu nhằm làm giảm thiểu các

vụ ngộ độc thực phẩm tại các địa phương

1.2.2.2 Những đặc tính của vi khuẩn Salmonella

* Đặc tính về hình thái:

Theo Bergey’s (1957) vi khuẩn Salmonella là những trực khuẩn gram

âm, hai đầu tròn, kích thước 1 - 3 x 0,4 - 0,6 micromet Vi khuẩn có từ 7 - 12

lông xung quanh thân nên có khả năng di động mạnh, trừ Salmonella

pullorum và Salmonella gallinarum gây bệnh cho gia cầm là không có lông

Vi khuẩn Salmonella không hình thành nha bào và không có giáp mô

* Đặc tính nuôi cấy:

Đào Thị Thanh Thủy và cộng sự (2012) cho biết: Salmonella sống hiếu

khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường Nhiệt độ thích hợp 370C (sống được ở nhiệt độ từ 7 - 450C), pH = 7,2 - 7,4 (tồn tại được ở pH = 5,0)

- Hiện nay có rất nhiều loại môi trường chọn lọc được các nhà vi sinh

vật thú y sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và phân lập Salmonella như môi

trường thạch DHL (Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose agar), sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc tròn, lồi, bóng láng (dạng S), có màu vàng nhạt Các chủng sinh H2S thì giữa khuẩn lạc có màu đen

- Trên môi trường thạch MacConkey: Bồi dưỡng ở 35 - 370C sau 18 -

24 giờ vi khuẩn Salmonella mọc thành những khuẩn lạc tròn, trong, không

màu, nhẵn bóng và hơi lồi ở giữa

- Trên môi trường thạch CHROMTM Salmonella, sau 24 giờ nuôi

cấy, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trơn, tròn, bóng láng (dạng S) và có màu tím hồng

- Trong môi trường thạch sắt 3 đường TSI (Triple Sugar Iron), vi khuẩn

Salmonella do sản sinh alkaline nên phần thạch nghiêng có màu đỏ (pH=7,3),

đáy ống nghiệm màu vàng (pH=6,8) do vi khuẩn chỉ lên men đường glucose Phần giữa ống nghiệm có màu đen do vi khuẩn sản sinh ra khí H2S Nếu để lâu (quá 24 giờ), màu đen môi trường thường làm át phản ứng tạo axit ở phần

đáy ống nghiệm (không nhìn thấy màu vàng) Vi khuẩn sinh hơi làm nứt thạch, có khi đẩy thạch khỏi đáy ống nghiệm (Quinn và cs, 2002)

- Trong môi trường LIM (Lysine Indole Motility), vi khuẩn không làm chuyển màu môi trường, môi trường có màu tím nhạt

- Môi trường Malonate, vi khuẩn không phát triển nên không làm thay

đổi màu môi trường

* Đặc tính sinh hóa:

Vi khuẩn Salmonella lên men sinh hơi glucose, lên men manitol,

dulcitol, sorbitol, rhamnose, arabinose, maltose, xylose và trehalose Không lên men lactose, saccarose, salicin và adonitol, urease, indol, VP âm tính Không làm tan chảy gelatin, MR và H2S dương tính, sử dụng citrate

Dựa trên các đặc điểm sinh vật, hóa học đặc trưng để xác định các

serotyp Salmonella là một phần quan trọng trong sơ đồ phân loại của

Kauffmann - F (1966)

Mặc dù vi khuẩn Salmonella không lên men lactose, saccarose, urease

và indol âm tính, nhưng trong thực tế chúng ta có thể gặp những chủng không

đặc trưng Theo Bulac Burn Ellis (1989), có đến 15,6% chủng Salmonella

phân lập được từ sản phẩm sữa khô lên men lactose

* Khả năng đề kháng của vi khuẩn Salmonella:

Với nhiệt độ, vi khuẩn có sức đề kháng yếu, 500C bị diệt sau 1h, 700C trong 20 phút, sôi 1000C sau 5 phút, khử trùng bằng phương pháp Pasteur cũng diệt được vi khuẩn (Đào Thị Xuân, 2014)

Trên mặt đất, Salmonella abortus equi có khả năng sống trong vòng 10

ngày, ở độ sâu 0,5 cm sống 2 tháng; nơi khô ráo, ánh sáng phân tán sống 5 tháng; ở sàn gỗ sống 87 ngày (Trần Thị Hạnh và cộng sự, 1994)

1.2.2.3 Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella

* Kháng nguyên O: Kháng nguyên O là yếu tố độc lực giúp vi khuẩn chống

lại khả năng phòng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tổ chức, chống lại sự thực bào của đại thực bào (Morris và cộng sự, 1976)

Kháng nguyên O kích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể đặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng Cơ chế phòng vệ này giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn (Mintz

và cộng sự, 1983)

* Kháng nguyên K:

Bằng phương pháp điện di, người ta đã phát hiện được bản chất hóa học của kháng nguyên K là polysaccharides Kháng nguyên K dễ dàng bị chiết tách bởi dung dịch phenol 45%, sau đó đem ly tâm siêu tốc, dung dịch ly tâm chứa kháng nguyên K Để thu được kháng nguyên K tinh khiết, dùng cetyl trimethyl ammonium bromide hoặc cetyl pyridinium chloride cho vào dung dịch trên, thu được kết quả chính là kháng nguyên K (Mayer và cộng sự, 1976)

- Kháng nguyên K có hai nhiệm vụ chính:

+ Hỗ trợ phản ứng ngưng kết cùng kháng nguyên O Vì vậy thường được ghi cùng kháng nguyên O trong cấu trúc

+ Tạo hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh và hiện tượng thực bào

Vai trò của kháng nguyên K chưa thống nhất Nhiều ý kiến cho rằng kháng nguyên K có ý nghĩa về mặt độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước các yếu tố phòng vệ của cơ thể, chống lại các hiện tượng thực bào (Evans và cộng sự, 1973)

* Kháng nguyên H (Flagella):

Kháng nguyên H là kháng nguyên không chịu nhiệt, bị vô hoạt ở nhiệt

độ 600C, bị cồn phá hủy nhưng bền vững với Formol Kháng nguyên H có 2 pha: Pha đặc hiệu là thành phần kháng nguyên chứa yếu tố đặc hiệu cho loài, chủng vi khuẩn Loài này ký hiệu bằng các chữ thường a, b, c, d Còn pha không đặc hiệu được ký hiệu 1,2; 1,5; 1,7

* Yếu tố bám dính (Fimbriae): Bám dính là một khái niệm chỉ mối quan

hệ của sự liên hệ vững chắc, thuận nghịch giữa bề mặt vi khuẩn và tế bào vật

chủ Tất cả các cấu trúc thể hiện chức năng bám dính được gọi là yếu tố bám dính

(Jones G.W., 1982)

Khả năng bám dính của vi khuẩn lên tế bào biểu mô ruột đến nay đã được khẳng định là yếu tố gây bệnh quan trọng, nó giúp cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể vật chủ và gây bệnh Những vi khuẩn có độc lực cao có khả năng bám dính tốt hơn là vi khuẩn có độc lực thấp

* Khả năng xâm nhập và nhân lên trong tế bào của vi khuẩn Salmonella:

Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác động làm biến

đổi bề mặt màng tế bào bằng cách thay đổi hình dạng các sợi actin dẫn tới hình thành giả túc bao vây tế bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn Cơ chế làm biến dạng các sợi actin màng tế bào vật chủ là do tác động của vi khuẩn làm tăng hàm lượng Ca++ nội bào, tín hiệu đó hoạt hoá actin depolimerizing enzymes dẫn tới sắp xếp lại cấu trúc sợi actin Sau khi hình

thành các không bào chứa vi khuẩn Salmonella được hấp thu vào trong tế bào

dưới hình thức hấp thu nội bào Bên trong tế bào vi khuẩn tiếp tục tồn tại trong không bào rồi nhân lên với số lượng lớn và phá vỡ tế bào vật chủ (Frost

và cộng sự, 1997)

* Khả năng kháng kháng sinh: Việc sử dụng thường xuyên các loại

kháng sinh phòng trị bệnh gia súc, gia cầm là một nguy cơ tồn tại làm tăng khả năng kháng kháng sinh cũng như duy trì bản chất gây bệnh của vi khuẩn đối với sức khoẻ con người và gia súc

1.2.2.4 Độc tố của vi khuẩn Salmonella

Ngoài yếu tố gây bệnh giúp Salmonella bám dính, xâm nhập tế bào, các

vi khuẩn đường ruột còn tiết ra các loại độc tố gây bệnh chủ yếu cho người và

gia súc Đối với vi khuẩn Salmonella chúng sản sinh ít nhất 3 loại độc tố

chính, đó là độc tố đường ruột (Enterotoxin), nội độc tố (Endotoxin) và độc tố

tế bào (Cytotoxin)

* Enterotoxins: Là một loại độc tố thường xuyên được vi khuẩn tiết vào

môi trường nuôi cấy, là thành phần chủ yếu của nhóm exotoxin của vi khuẩn

đường ruột Các enterotoxin của Salmonella có quan hệ gần gũi với Toxin

Cholera cả về cơ chế tác động và sản sinh nên gọi là Choleratoxin like Enterotoxin - (CT), chúng có cấu trúc chức năng sinh học và đặc tính kháng

nguyên giống với CT và enterotoxin do E coli sản sinh (Clarker và cộng sự,

1993) Gen di truyền khả năng sản sinh enterotoxin bằng tiếp hợp, có thể

truyền từ Salmonella typhimurium sang cho E coli Enterotoxin tạo ra sự rút

nước từ cơ thể vào lòng ruột gây tiêu chảy

Độc tố enterotoxin của vi khuẩn Salmonella có 2 thành phần chính là

độc tố thẩm xuất nhanh (Rapid permeability factor: RPF) và độc tố thẩm xuất chậm (Peterson J.W., 1980)

* Cytotoxins: Thành phần của cytotoxin không phải là

lipopolysaccharide (Non-LPS) nằm ở màng ngoài vi khuẩn Salmonella Đặc

tính chung của Cytotoxin là có khả năng ức chế tổng hợp protein của tế bào Eukaryotic và làm trương tế bào Theo Clark S và cộng sự (1995), làm tổn thương tế bào biểu mô là đặc tính quan trọng của cytotoxin

*Endotoxins: Thành phần chủ yếu của Endotoxins là Lipopolysaccharide

Vì vậy, để hiểu cơ chế tác động của độc tố này cần hiểu về cấu trúc phân tử của Lipopolysaccharide

- Cấu tạo phân tử Lipopolysaccharide (LPS): LPS là một thành phần cơ

bản cấu tạo màng ngoài tế bào vi khuẩn Salmonella Phân tử LPS của vi khuẩn

gram (-) có cấu tạo phân tử lớn gồm 3 vùng riêng biệt với các đặc tính đối lập nhau Vùng thứ nhất là vùng ưa nước, vùng lõi ở trung tâm và vùng lipid A Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi polysaccharide chứa các đơn vị cấu trúc kháng nguyên O Vùng lõi có bản chất là acid heterooligo saccharide nối kháng nguyên O với vùng lipid A (Orskov I và công sự, 1977)

1.2.2.5 Plasmid - Cơ quan di truyền các yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella

Plasmid là cơ quan cần thiết di truyền các yếu tố độc lực của rất nhiều

chủng Salmonella Mỗi một serotyp chứa một số lượng lớn khoảng từ 50 đến

100 Plasmid (Krause M và cộng sự, 1995)

1.3 Phân loại vi sinh vật có trong thịt

Trong thịt và các sản phẩm có nguồn gốc từ thịt có 3 loại vi sinh vật chính đó là: vi khuẩn, nấm mốc, nấm men

1.3.1 Vi khuẩn

Vi khuẩn có trong thực phẩm thuộc lớp Shizomycetes, phân lớp thuộc

bộ Pseudomonales và Eubacterales Các lớp và các bộ vi khuẩn này chia

thành nhiều giống và loài, có ảnh hưởng đến thịt và các thực phẩm khác có ngồn gốc động vật Tuy nhiên các nhóm vi khuẩn quan trọng ở thịt gồm các giống và loài sau:

- Nhóm vi khuẩn lactic thuộc nhóm Lactobacteriaceac: Vi khuẩn lactic

được chia thành cầu khuẩn và trực khuẩn Vi khuẩn lactic ở thịt, phát triển

trong thịt ở nhiệt độ thấp như Lactobacillus salimandus phát triển trong xúc xích

- Nhóm vi khuẩn acetic: Phân lớp thuộc giống Acetobacter họ

Achromobacteraceae, một số thuộc giống Bacterium (sản sinh acid acetic), Flavobactrium có sắc tố vàng đến vàng cam làm mất màu trên bề mặt của thịt

- Nhóm vi khuẩn dung giải protein và lipid: Bao gồm các loài Bacillus,

Proteus, Streptococus jaecalis, Micrococcus caseoticus, Achromobacter, Alcaligenes

- Nhóm vi khuẩn đường ruột: Trực khuẩn E.coli và cầu khuẩn thường theo phân nhiễm và thực phẩm, ngoài ra còn có Clostridium

- Nhóm vi khuẩn ưa nhiệt (Thermophiles): Những vi khuẩn này thích nghi với nhiệt độ trên 450C (1130F) thường tồn tại trong các thực phẩm xử lý ở nhiệt độ

cao như những loài Bacillus làm chua thực phẩm đóng hộp và Clostridium

thermosaccharolyticum sinh hơi làm phồng đồ hộp Lactobacillus thermophilus

cũng là một vi khuẩn ưa nhiệt

- Nhóm vi khuẩn ưa lạnh (Psychrophiles): Những vi khuẩn này phát

triển trong thực phẩm ướp lạnh, thuộc giống Pseudomonas, Achromobacter,

Flavobacterium, Alcaligens, Micrococcus, Lactobacillus và Aermomobacter

- Nhóm vi khuẩn ưa muối (Halophiles): Những vi khuẩn này phát triển

trong môi trường đường có nồng độ cao, phân lớp thuốc giống Leuconostoc

- Nhóm vi khuẩn sinh sắc tố: Vi khuẩn sinh sắc tố có nhiều giống khác

nhau Trong thực phẩm ướp lạnh Lactobacillus riridescens làm xám xúc xích

Flavobacterium có sắc tố vàng đến vàng cam, làm mất mầu trên bề mặt thịt Pseudomonas fluorescene sinh sắc tố lục đến nâu vàng

- Nhóm vi khuẩn gây hoá nhầy: Thuộc giống Micrococcus, Pseudomonas,

Alitobacter gây hư thối thịt đông lạnh

- Nhóm vi khuẩn sinh hơi: Thuộc các giống Leuconostoc, Lactobacillus,

Propionibacterium, Echerichia, Proteus, Bacillus, Clostridium

- Nhóm vi khuẩn gây trúng độc thực phẩm và vi khuẩn gây bệnh: Các

vi khuẩn gây trúng độc thực phẩm bao gồm các giống vi khuẩn sản sinh độc

tố như: Salmonella và Streptococcus Trong thực phẩm còn có thể tìm thấy các vi khuẩn gây bệnh kiết lỵ do Shigella, sảy thai do Brucella, lao và các

bệnh khác

1.3.2 Nấm mốc

Các loại nấm mốc thường thấy là Alternaria, Fusarium, Penicillium

(S.carnis gây hoại tử làm phát triển những chấm trắng trên thịt đông lạnh) Assprergilum và Thamnidium (T.elegan tìm thấy trong thịt bảo quản lạnh)

1.3.3 Nấm men

Nấm men thuộc các giống sinh bào tử như Candida, Mycotorula,

Saccharomyces

1.4 Quá trình nhiễm khuẩn của thịt

1.4.1 Sự nhiễm khuẩn tại cơ sở giết mổ

Thịt thường bị lây nhiễm vi khuẩn từ bên ngoài vào trong quá trình

mổ và xẻ thịt Nguyên nhân là do không khí trong cơ sở giết mổ (CSGM) bị

ô nhiễm, nước không sạch, các thiết bị, dụng cụ giết mổ và phương tiện vận chuyển không đảm bảo vệ sinh, đặc biệt là từ nền sàn

Đồng thời, thân thịt cũng nhiễm bẩn bởi cơ thể động vật và con người trong quá trình giết mổ như quần áo mang bụi, rửa tay không sạch, tóc, nữ trang, hắt hơi, ho, vết thương…

1.4.2 Nhiễm khuẩn do cơ thể động vật

Cơ thể động vật chứa nhiều loài vi khuẩn bao gồm hệ vi khuẩn tự nhiên của cơ thể động vật, lông, da, vi sinh vật đường ruột… và vi khuẩn

có nguồn gốc từ đất, chịu nhiệt, nước, thức ăn

Bề mặt thịt sẽ bị lây nhiễm vi khuẩn do tiếp xúc trực tiếp với nhau hoặc với chất chứa trong khi mổ lấy lòng

1.4.3 Nhiễm khuẩn do không khí

Trong các yếu tố môi trường thì yếu tố không khí là quan trọng Không chỉ sự biến đổi về thành phần hóa học của không khí, các khí độc,

mà các vi sinh vật, các chất thải trong quá trình giết mổ cũng ảnh hưởng đến sức khỏe người lao động và mức độ bảo đảm vệ sinh trong khi giết mổ Chênh lệch áp suất không khí là nguyên nhân làm cho không khí di chuyển từ vùng sạch đến vùng bẩn mà không có trường hợp ngược lại Sự tồn tại của vi khuẩn trong không khí phụ thuộc nhiệt độ, ẩm độ của không khí Bụi và những giọt nước nhỏ trong không khí thường mang nhiều loại

vikhuẩn, đáng chú ý nhất là Salmonella, E coli và Clostridium perfringens

1.4.4 Nhiễm khuẩn từ nước

Nước là yếu tố cực kỳ quan trọng trong hoạt động giết mổ động vật Tất cả các giai đoạn của quy trình giết mổ đều sử dụng nước Nước sử dụng phải là nước uống được Nước có thể là nguyên nhân gây lây nhiễm cho thịt trong cơ sở giết mổ, vì vậy nước phải được kiểm tra về chất lượng định kỳ

Chất lượng nước uống về vi khuẩn thường được đánh giá qua sự chịu

nhiệt tích Coliforms tổng số và Coliforms chịu nhiệt Về nguyên tắc chung, kiểm tra Coliforms tổng số và Coliforms chịu nhiệt 2 lần/năm

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn của tổ chức Y tế thế giới (WHO-World Health

Organisation) về vi khuẩn của nước uống

Nước uống được sau khi lọc và sát khuẩn thông

Nước uống được sau khi đã triệt khuẩn theo các

phương thức cổ điển (lọc, làm sạch, khử khuẩn) 50 - 5.000 VK/100ml Nước ô nhiễm chỉ dùng được sau khi đã triệt khuẩn

rất cẩn thận và đúng mức

5.000 - 10.000 VK/100ml Nước rất ô nhiễm, không dùng nên tìm nguồn nước

1.4.5 Nhiễm khuẩn do con người

Công nhân làm việc trong cơ sở giết mổ có thể gây nhiễm cho thân thịt

Sự di chuyển của người lao động trong cơ sở giết mổ cần được kiểm soát nghiêm ngặt và nếu cần chỉ được di chuyển từ khu sạch sang khu bẩn

Tuy nhiên, trên thực tế điều này không dễ dàng thực hiện Để giảm thiểu tối

đa nguy cơ gây lây nhiễm cho thân thịt từ người lao động thì cần phải thực hiện giết mổ theo dây chuyền, chịu nhiều công lao động, có nơi rửa tay chân đầy đủ tiện nghi, có phòng thay áo quần, phòng tắm, phòng vệ sinh,

1.4.6 Sự nhiễm khuẩn do vận chuyển

Sau khi giết mổ thịt sẽ được vận chuyển đến nơi tiêu thụ và đây là một khâu sẽ gây nhiễm khuẩn cho thân thịt nếu sử dụng các phương tiện vận chuyển không đúng theo quy định là phải dùng các xe chuyên dùng có bảo quản lạnh thích hợp

Theo Herry (1990) tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella vào thực phẩm

trong quá trình vận chuyển là 40%

1.4.7 Sự nhiễm khuẩn nơi bày bán

Hầu hết thịt được bày bán lẻ ở khắp mọi nơi, thường là nơi đông người qua lại và được bày trên những bàn bằng gỗ, inox không đảm bảo vệ sinh, tay người mua thường xuyên sờ thịt hoặc dụng cụ dao, thớt dùng cắt thịt không được vệ sinh thường xuyên, đây là các nguồn gây nhiễm vi khẩn rất quan trọng cho thân thịt Đồng thời sự nhiễm khuẩn còn phụ thuộc vào các loài côn trùng, loài gậm nhấm, bụi từ nền sàn, Các vi sinh vật nhiễm trên quầy thịt sẽ phát triển và ngấm sâu dần vào bên trong làm hư hỏng sản phẩm (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002)

1.5 Tình hình nghiên cứu các biện pháp hạn chế ô nhiễm vi sinh vật đối với thịt trong cơ sở giết mổ

Vệ sinh an toàn thực phẩm đang được nhiều nước trên thế giới và toàn xã hội quan tâm Vệ sinh an toàn thực phẩm không những có vai trò quan trọng đối với cuộc sống, tính mạng của con người, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ, tuổi thọ, chất lượng cuộc sống mà còn quyết định uy tín thương hiệu của sản phẩm thực phẩm xuất khẩu trên thị trường quốc tế Thực phẩm có chất lượng phải đảm bảo các yêu cầu chủ yếu về:

- Chất lượng dinh dưỡng: Phù hợp với thuộc tính đặc trưng của thực phẩm

- Chất lượng vệ sinh: Sạch, không vượt quá giới hạn cho phép về vi sinh vật, dư lượng (thuốc trừ dịch hại, phóng xạ, kháng sinh, hormone, ), độc tố (hàm lượng kim loại nặng, độc tố vi nấm và vi sinh vật), chất phụ gia (chất đực phép sử dụng với hàm lượng và tỉ lệ cho phép)

- Chất lượng thương phẩm: Bao bì ghi nhãn

- Tổ chức tiêu chuẩn thế giới (ISO) với 108 thành viên Việt Nam tham gia vào tổ chức này từ năm 1997, ISO có một ban kỹ thuật tiêu chuẩn với 14 tiểu ban và 4 nhóm cộng tác Đến nay ISO đã ban hành được 485 tiêu chuẩn về nông sản thực phẩm

- Khối thị trường chung C hâu Âu (EEC) cũng thành lập các tiểu ban

về vệ sinh thực phẩm cho khối

- Hội vệ sinh thực phẩm thú y thế giới (WAFVH) thành lập năm 1952 thường xuyên tổ chức các hội nghị hội thảo về vệ sinh thực phẩm trao đổi thông tin và những phát hiện mới về bệnh phát sinh từ thực phẩm, các phương pháp chuẩn đoán và kỹ thuật phân tích

- Viện Khoa học Đời sống Quốc tế Châu Âu (ILSI) có một bộ phận chuyên phân tích một cách có hệ thống các nguy cơ gây ra sự không an toàn vệ sinh thực phẩm trong sản xuất, phân phối và tiêu thụ sản phẩm

Để đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong thực tế mỗi một cơ sở giết mổ hoàn toàn khác nhau trong nhiều khía cạnh mà yếu tố kinh tế là căn bản và quyết định Tuỳ từng điều kiện cụ thể mà áp dụng các biện pháp khác nhau nhưng mục đích làm thế nào, không có nguy hại cho người tiêu dùng

Các biện pháp tập trung để hạn chế ô nhiễm của thịt trong giết mổ bao gồm:

1 Đào tạo công nhân: Để họ hiểu và tự giác chấp hành sự kiểm soát an toàn thực phẩm

2 Áp dụng ISO 9000: Là một tiêu chuẩn quốc tế, giúp cơ sở kiên trì trong việc thực hiện các thao tác kỹ thuật đã đề ra

3 Thanh tra và kiểm tra: Biện pháp để kiểm tra lại các bằng chứng mà tiêu chuẩn đã được thỏa mãn trong thời gian trước đây

4 Chương trình sản xuất tốt (GMP): Đây là một phương pháp được tiến hành hàng ngày để đạt được an toàn thực phẩm cản bản GMP là yêu cầu thực hiện các biện pháp khống chế vệ sinh bắt buộc Chỉ có đạt được GMP nhờ mối quan hệ tốt đẹp và lành mạnh giữa quản lý và công nhân GMP phải có trước HACCP GMP là nền tảng để xây dựng phương pháp HACCP Nếu có GMP chưa tồn tại thì quá trình hoạt động đó chưa sẵn sàng cho việc áp dụng phương pháp HACCP

5 Giám sát quá trình chế biến sản phẩm: Đây là vấn đề quan trọng nhằm đánh giá mức độ khống chế và sự an toàn Đây cũng là một đặc điểm của phương pháp HACCP nhưng sự giám sát được thực hiện bởi một công

ty, bất luận là ở cơ sở đó có vận hành HACCP hay không? Giám sát phải đều đặn và liên tục đối với các chỉ tiêu đã được xác định từ trước

6 Phương pháp điểm kiểm tra chủ chốt và phân tích các yếu tố độc hại (Hazard Analysis Critical Control Point): HACCP là một phương pháp khoa học tiên tiến, áp dụng cho bất kỳ một khâu nào trong hệ thống dây chuyền sản xuất thực phẩm nhằm hạn chế mức thấp nhất sự ô nhiễm các yếu tố độc hại có thể xảy ra (Baker D.A.1995)

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Một số cơ sở giết mổ lợn trên địa bàn huyện Hoài Đức, TP Hà Nội

- Các mẫu thịt lợn ở cơ sở giết mổ trên địa bàn huyện Hoài Đức, TP Hà Nội

- Vi khuẩn Salmonella ô nhiễm ở thịt lợn

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

- Một số cơ sở giết mổ lợn trên địa bàn huyện Hoài Đức, TP Hà Nội

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm đánh giá và lấy mẫu: Một số cơ sở giết mổ lợn trên địa bàn huyện Hoài Đức, TP Hà Nội

- Địa điểm phân tích: Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

2.1.4 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019

2.2 Nôi dung nghiên cứu

- Khảo sát tình hình hoạt động giết mổ lợn, vệ sinh thú y, vệ sinh môi trường nơi giết mổ trên địa bàn huyện Hoài Đức, TP Hà Nội

- Xác định mức độ ô nhiễm vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn tại một

số cơ sở giết mổ trên địa bàn huyện Hoài Đức

- Giám định một số đặc tính nuôi cấy, sinh hóa của một số chủng vi

khuẩn Salmonella phân lập được từ thịt lợn

- Xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được

- Xác định sự mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn

Salmonella phân lập được

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Mẫu điều tra thực trạng, mẫu bệnh phẩm dùng phân lập vi khuẩn

- Để điều tra đánh giá thực trạng vệ sinh thú y tại các điểm giết mổ lợn,

sử dụng mẫu đánh giá phân loại cơ sở giết mổ gia súc theo hướng dẫn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn và thiết lập bảng biểu thu thập số liệu phục vụ điều tra, phân tích

- Mẫu nước sử dụng tại một số cơ sở giết mổ Mẫu bệnh phẩm, các mẫu thịt lợn được lấy ở các thời điểm khác nhau tại các cơ sở giết mổ lợn trên địa bàn huyện Hoài Đức, TP Hà Nội

2.3.2 Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

2.3.2.1 Thiết bị và dụng cụ xét nghiệm

Tủ lạnh, tủ ấm, máy li tâm, nồi hấp ướt, buồng cấy vô trùng, tủ sấy, kính hiển vi Kéo cắt mẫu, pipetman, ống durham, bình tam giác các loại, đĩa petri, cân, que cấy, bông cồn, giá đựng, ống nghiệm đựng mẫu, túi nilon, cối, chày sứ, đèn cồn, khoanh giấy tẩm kháng sinh và các dụng cụ thí nghiệm khác theo Đỗ Đức Lực và cộng sự (2017)

2.3.2.2 Hóa chất xét nghiệm

- Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là môi trường chế sẵn Bao gồm: Môi trường nước thịt, môi trường thạch máu (Blood Agar Base) Môi trường thạch thường: XLD, MacConkey, Endo, Sapman, SS…Môi trường tăng sinh: BHI, Muler Kaffman, BPW (Buffered Pepton Water), RV (Rappaports Vassiliadis)…Hoá chất dùng để nhuộm Gram: Dung dịch thuốc nhuộm: tím Gientian và đỏ Fuchsine, cồn, dung dịch Lugol, nước cất Hoá chất dùng để thử phản ứng sinh hoá: Chất thử cho phản ứng Indole, các loại đường, một số hóa chất dùng trong phòng thí nghiệm khác

2.3.3 Động vật thí nghiệm

Số lượng: 50 chuột nhắt trắng khỏe mạnh, có trọng lượng 18 đến 20 gram

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện đề tài này chúng tôi áp dụng phương pháp nghiên cứu thường quy trong phòng xét nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn Quốc tế (ISO)

2.4.1 Phương pháp đánh giá thực trạng giết mổ lợn

- Phương pháp điều tra, phỏng vấn trực tiếp các chủ cơ sở, chủ kinh doanh và lấy mẫu xét nghiệm phân tích các chỉ tiêu

- Sử dụng phương pháp thống kê chuyên môn

- Thiết lập các bảng biểu thu thập số liệu về thực trạng giết mổ lợn tại các

cơ sở theo Thông tư 09/2016/TT-BNNPTNT

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm

- Mẫu thịt được lấy theo Quy chuẩn QCVN 01 - 04: 2009/BNNPTNT

và xử lý tại phòng thí nghiệm theo TCVN 4833-1:2002; TCVN 4833-2:2002 Thu thập mẫu thịt theo phương pháp ngẫu nhiên từ các cơ sở giết mổ tại huyện Hoài Đức, TP Hà Nội Lấy mẫu thịt: Sát trùng dao lấy mẫu bằng cồn

700, sau đó lấy nhiều vị trí trên bề mặt sản phẩm từ 100 - 200 gram thịt/mẫu, cho vào túi nilon vô trùng, dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết

Các mẫu thịt lợn sau khi lấy phải bảo đảm không lẫn nhau, sau khi mang về phòng thí nghiệm nếu không phân tích ngay phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 00C - 20C và phải kiểm tra trong vòng 24 giờ Kết quả được đánh giá theo TCVN 7046: 2009

- Mẫu nước được lấy và bảo quản mẫu theo tiêu chuẩn TCVN 6663/2011, kết quả được đánh giá theo quy chuẩn QCVN 01: 2009/BYT

Dụng cụ lấy mẫu, vật chứa mẫu phải sạch, vô trùng và không ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật của mẫu thịt

- Mẫu không khí được lấy mẫu theo phương pháp lắng bụi Koch:Là phương pháp kiểm tra mức độ vi khuẩn trong không khí Bụi vi khuẩn trong không khí rơi xuống trên mặt đĩa thạch phát triển thành khuẩn lạc.Sau khi đếm số lượng các khuẩn lạc trên đĩa Petri ra số lượng vi khuẩn có trong 1m3

không khí theo tiêu chuẩn việt nam:TCVN 5376:1991

Phương pháp nhiều ống (số có xác suất cao nhất)

Nguyên tắc: Cấy các phần mẫu thử đã được pha loãng hoặc không pha loãng vào một dãy ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy chọn lọc dạng lỏng có lactoza Kiểm tra các ống thử sau 24h và 48h nuôi ở nhiệt độ 35°C hoặc 37°C; cấy chuyển tiếp từ mỗi ống có biểu hiện đục kèm sinh khí vào

một ống môi trường khẳng định chọn lọc hơn và khi muốn tìm E coli giả

định cấy vào một môi trường mà qua đó có thể quan sát thấy sự tạo thành indol Nuôi các môi trường khẳng định này cho tới 48h ở nhiệt độ 35°C

hoặc 37°C để xác định các loại Coliform chịu nhiệt và E coli giả định Bằng các bảng thống kê, tính toán số xác suất cao nhất các dạng Coliform,

Coliform chịu nhiệt và E coli giả định có thể có trong 100ml mẫu thử từ số

các ống thử có kết quả xác nhận dương tính

Nuôi cấy: Chuẩn bị mẫu thử, tiến hành pha loãng mẫu cấy vào môi trường phân lập các phần mẫu thử theo ISO 8199

Cấy và ủ mẫu vào môi trường Trypton Lauryl Sulfat (TLS): Mỗi nồng

độ pha loãng cấy vào 3 dãy liên tiếp mỗi dãy chứa 5 ống môi trường TLS Cấy 10ml mẫu thử vào mỗi ống ở dãy 5 ống đầu tiên, 1ml mẫu thử vào mỗi ống ở dãy 5 ống tiếp theo và 0,1ml mẫu thử vào mỗi ống ở dãy 5 ống cuối cùng Nuôi cấy ở 37ºC, đếm số lượng các ống TLS cho kết quả dương tính ở mỗi dãy sau 24h - 48h

Để khẳng định Coliform: Cấy chuyển một vòng que cấy từ mỗi ống TLS

dương tính sang một ống nghiệm chứa môi trường Brilliant Green Bile 2% broth (BGB), ủ ở 30ºC trong 24 h

Để khẳng định E coli cần thực hiện tiếp:

Cấy chuyển và ủ môi trường Escherichia coli broth (EC): Cấy chuyển

một vòng que cấy từ mỗi ống nghiệm TLS dương tính sang mỗi ống nghiệm đựng canh thang EC, ủ ở 44ºC trong 24h  2h Đếm số lượng các ống EC cho kết quả dương tính ở mỗi dãy Các ống dương tính trong môi trường EC được cấy chuyển sang môi trường nước pepton không indol để kiểm tra sự sinh Indol Cấy và ủ môi trường nước pepton không Indol:

Cấy một vòng que cấy canh khuẩn từ mỗi ống nghiệm EC dương tính sang mỗi ống nghiệm đựng 5-10ml nước pepton không Indol, ủ ở 44ºC trong 24h  2h Sau đó kiểm tra sự sinh khí Indol

Kiểm tra sự sinh Indol:

Nhỏ 0,5 ml thuốc thử Kovac vào các ống nghiệm chứa nước pepton không Indol đã được ủ, trộn kỹ và kiểm tra sau 1 phút Nếu xuất hiện vòng

màu đỏ phía trên chứng tỏ là có mặt E coli Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E coli dương tính ở mỗi độ pha loãng của mẫu

Tính kết quả: Từ số lượng các ống nghiệm có E coli, Coliform dương

tính ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng bảng thống kê trong ISO 8199,

số có xác suất cao nhất của vi khuẩn Coliform và E coli giả định

2.4.3.2 Phương pháp xác định vi khuẩn Salmonella trong thịt

Nguyên lý:

Quá trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm cần qua 4 giai đoạn kế

tiếp nhau: (1) Tăng sinh sơ bộ mẫu đã được đồng nhất để đảm bảo phát hiện

một lượng nhỏ hoặc Salmonella đã bị suy giảm hoạt tính → (2) Tăng sinh

chọn lọc ở môi trường lỏng → (3) Phân lập nhằm tách và nhận dạng

Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu → (4) Khẳng định

đặc tính sinh hóa, huyết thanh học Một số môi trường đặc đổ đĩa sử dụng để

phân lập Salmonella như: thạch XLD, HE, Mỗi môi trường giúp nhận dạng

các loài thuộc giống này dựa trên các đặc tính sinh hoá đặc trưng tương ứng

Bao gồm các bước sau:

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh Nutrient

Broth Bồi dưỡng ở 370C/16 - 24h

Cấy 1ml dịch sang 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc trên 2 môi trường Rappaport-Vassiliadis (RVS) và

Tetrathionate Broth Muller-Kauffmann (MKTTn) Bồi dưỡng

ở 430C/24h

Phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường chọn lọc đặc biệt

(XLD) Bồi dưỡng 370C/24h

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ Salmonella giám định

đặc tính sinh hóa: lên men đường, H2S, Indole, urease,

citrate…

Salmonella dương tính/âm tính trong 25g mẫu Bước 1: Lấy mẫu, đồng nhất và tăng sinh lần 1

Lấy thịt lợn ngẫu nhiên ở nhiều vị trí khác nhau của mẫu, cho vào cối

sứ vô trùng nghiền nhỏ Cân chính xác trong điều kiện vô trùng 25g mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml môi trường Nutrient Broth, lắc đều trong thời gian nhất định được dung dịch mẫu với độ pha loãng 10-1 Để tủ

ấm 370C/16 - 24h

Bước 2: Tăng sinh lần 2 mẫu đã đồng nhất (tăng sinh chọn lọc): Lắc để

trộn đều dịch tăng sinh, sau đó dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường RVS, ủ ở 41,5°C/24h

Chuyển 1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống chứa 10ml môi trường MKTTn, ủ 37°C/24h

Bước 3: Phân lập và nhận diện

Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa thạch XLD (Xylose Lysine Deoxycholate Agar - loại môi trường phân lập đặc trưng cho vi khuẩn

Salmonella) Sau đó bồi dưỡng ở 370C/24h rồi đọc kết quả

- Salmonella phát triển mạnh, khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, ở giữa có tâm

đen (do sản sinh H2S), đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, không lên men lactose

Bước 4: Giám định đặc tính sinh vật, hóa học

Từ môi trường phân lập, chọn khuẩn lạc nghi Salmonella, kiểm tra hình

thái, kích thước 0,4 - 0,6 × 1 - 3µm, không có giáp mô, không sản sinh nha

bào, di động được do có lông, từ 7 - 12 lông (trừ Salmonella pullorum và

Salmonella gallinarum), bắt màu Gram âm

Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là: lên men

đường glucose (+), lactose (-), H2S (+), Indol 370C (-), urease (-), citrat (+), catalase (+)

Kiểm tra khả năng sản sinh Indole của vi khuẩn: Lấy khuẩn lạc từ đĩa thạch

đã cấy thuần, cấy vào môi trường Nutrient Broth, bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370C trong 18 - 24h, vi khuẩn sẽ sinh trưởng, phát triển và sản sinh Indole (nếu có) Tiến hành kiểm tra bằng cách nhỏ 2 - 3 giọt dung dịch Kovac’s vào ống nghiệm

+ Phản ứng dương tính ( + ): Trên bề mặt môi trường thí nghiệm xuất hiện một vòng nhẫn màu đỏ tím hay màu hồng (đó là phản ứng kết hợp giữa Kovac’s màu cafe và Indole không màu)

+ Phản ứng âm tính ( - ): Không có sự thay đổi màu

- Phản ứng Catalase: Lấy một phiến kính sạch, dùng que cấy cẩn thận lấy một phần của khuẩn lạc đặt lên giữa phiến kính Nhỏ một giọt hydrogen peroxidaza (H2O2) lên vùng có khuẩn lạc Phản ứng được cho là dương tính nếu ngay sau

khi nhỏ chất phản ứng, bọt khí được hình thành Ngược lại không có bọt khí hình thành, kết quả âm tính

Bước 5: Giám định vi khuẩn Salmonella bằng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

- Cách tiến hành tách chiết DNA

* Tách chiết DNA vi khuẩn bằng Kit QIAgen

Bước 1: Dùng pipet hút 20µl Proteinase K vào ống eppendorf 1,5ml,

thêm 100 µl mẫu và cho thêm PBS cho đủ 220 µl Để bất hoạt RNA trong phản ứng thì bổ sung thêm 4µl RNase A (100mg/ml), ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút

Bước 2: Cho 200 µl đệm Buffer AL và trộn đều bằng vortex trong 15

Bước 5: Đặt cột vào ống 2ml sạch mới Cẩn thận mở nắp cột DNeasy

Mini spin, thêm 500µl Buffer AW1 không để rơi lên thành, miệng, đóng nắp

và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới

Bước 6: Đặt cột vào ống 2ml sạch mới Cẩn thận mở nắp cột DNeasy

Mini spin, thêm 500µl Buffer AW2 và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút

và loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới

Bước 7: Đặt cột DNeasy Mini spin sang ống 1,5 ml mới và loại bỏ phần

dung dịch ở phía dưới Thêm 200 µl đệm AE trực tiếp lên màng DNeasy Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới

Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa DNA tổng số.Cuối cùng

ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -200C hoặc -700C