Nghiên cứu tinh sạch chondroitin sulfate bằng phương pháp hóa học và hóa lý

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Tổng quan tài liệu về Chondroitin Sulfate, nguyên liệu sụn ức gà; phương pháp siêu âm, enzyme dùng trong việc thủy phân để thu nhận dung dịch Chondroitin Sulfate

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ LỆ VIÊN

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH CHONDROITIN SULFATE

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC VÀ HÓA LÝ

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Mã số: 60540101

LUẬN VÃN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2018

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS TS Đống Thị Anh Đào

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Lê Ngọc Liễu

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Nguyễn Hoài Hương

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP HCM

Thời gian: Ngày 17 tháng 07 năm 2018

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tinh sạch Chondroitin Sulfate bằng phương pháp hóa học và hóa lý

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tổng quan tài liệu về Chondroitin Sulfate, nguyên liệu sụn ức gà; phương pháp siêu

âm, enzyme dùng trong việc thủy phân để thu nhận dung dịch Chondroitin Sulfate thô; phương pháp lọc màng và hóa học để tinh sạch

- Phân tích một số thành phần hóa học cơ bản của sụn ức gà

- Khảo sát các phương pháp xử lý nguyên liệu sụn: hóa học (NaOH), sinh học (enzyme Alcalase), vật lý (chần)

- Thiết lập quy trình công nghệ trích ly, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến thu nhận dung dịch Chondroitin Sulfate thô từ sụn ức gà bằng phương pháp vật lý (sóng siêu âm) và sinh học (chế phẩm enzyme: Alcalase)

- Tối ưu hóa quá trình thu nhận dung dịch Chondroitin Sulfate thô

- Thiết lập quy trình công nghệ, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh sạch Chondroitin Sulfate bằng phương pháp lọc màng và hóa học

- Tối ưu hóa quá trình tinh sạch Chondroitin Sulfate

- Đánh giá chất lượng bột cs sau khi tinh sạch bằng các phương pháp: HPLC, GPC, SEM, FTIR

Họ tên học viên : Nguyễn Thị Lệ Viên

Ngày, tháng, năm sinh : 01/07/1994

15/01/2018 01/07/2018

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt công trình nghiên cứu khoa học này, lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm on Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách khoa

TP Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm on các quý thầy cô của Bộ môn Công nghệ thực phẩm đã truyền đạt những kiến thức bổ ích và giải đáp những thắc mắc ttong suốt thời gian học

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm on và tri ân sâu sắc đến cô GS.TS Đống Thị Anh Đào

đã giao cho tôi đề tài này, chỉ dẫn tận tình, định hướng rõ ràng để tìm ra phưong pháp giải quyết vấn đề một cách khoa học và hiệu quả nhất

Tôi xin chân thành cảm on cô Nguyễn Thị Nguyên - Quản lý phòng thí nghiệm B10

đã tạo mọi điều kiện về cor sở vật chất, ừang thiết bị để tôi có thể tiến hành thí nghiệm luận văn

Bên cạnh đó, tôi cũng xin cảm on các anh chị, các bạn học viên cao học, các em sinh viên KI3 đã gắn bó và giúp đỡ tôi rất nhiều

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm on gia đình, cùng bạn bè đã hỗ ừợ, khích lệ tinh thần và bên cạnh tôi nhũng lúc khó khăn nhất

Kính chúc sức khỏe đến các quý thầy cô, gia đình và bạn bè

Trân ttọng cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 07 năm 2018

Học viên thực hiện

Nguyễn Thị Lệ Viên

TÓM TẮT

Glycosaminoglycans (GAGs) là một hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide, tham gia vào hoạt động cấu tạo mô sụn, có thể được thu nhận từ mô sụn động vật như sụn cá mập, sụn gà, cá nhám Trong GAGs chứa lượng lớn Chondroitin sulfate (CS) có tác dụng phòng ngừa và hỗ Irợ điều trị các bệnh về khớp Do đó việc trích

ly và thu nhận cs từ nguồn phụ phẩm của ngành công nghiệp giết mổ gia súc, gia cầm là cần thiết nhằm thay thế hàng ngoại nhập Sau khi xử lý sụn gà bằng dung dịch NaOH 0,05M ở 30°C ưong vòng 1 giờ, tiến hành thủy phân sụn ức gà bằng enzyme Alcalase ở pH = 7,5; hàm lượng enzyme/cơ chất = 3,58 % w/wpro; nhiệt độ = 55°C; thời gian =198 phút thì hiệu suất thu hồi GAGs cao nhất đạt được là 22,02% so với chất khô nguyên liệu Sau đó tiến hành quá trình tinh sạch bằng phương pháp hóa học: nồng độ CPC = 1,4% (w/wdd); nồng độ NaCl = 2,57M, nồng độ KSCN = 1,5% (w/wdd) thì hiệu suất thu hồi cs đạt được 22,68% (so với chất khô nguyên liệu ban đầu) Mẩu sau khi sấy phun, phân tích các thành phần theo phương pháp HPLC: hàm ẩm đạt 8,47%, protein đạt 2,2%, hàm lượng tro đạt 22% và độ tinh sạch mẫu đạt 97,8% Các kết quả trên cũng phù hợp với điều kiện tiêu chuẩn của USP

- 39 Bên cạnh đó, mẫu sản phẩm cũng được tiến hành xác định KLPT bằng phương pháp GPC: 157000 Da, kết quả chạy FTIR cũng chỉ ra rằng mẫu cs thu được có độ tương đồng 97,94% so với mẫu chuẩn CS4

Từ khóa: Glycosaminoglycans, Chondroitin sulfate, sụn ức gà, thủy phân.

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm Các kết quả nghiên cứu và kết luận ttong bài luận văn này là trung thực, không sao chép từ bất cứ nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào

Việc tham khảo các tài liệu liên quan đã được trích dẫn nguồn cụ thể và rõ ràng theo đúng yêu cầu trích dẫn tài liệu tham khảo

Tôi xin cam đoan!

Tác giả luận vãn

Nguyễn Thị Lệ Viên

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Nội dung nghiên cứu 2

1.5 ứng dụng 2

Chương 2: Tổng quan 4

2.1 Tổng quan về Chondroitin sulfate 4

2.1.1 Đặc điểm và cấu trúc của cs 4

2.1.2 Phân loại cs 5

2.1.3 Nguồn gốc 6

2.1.4 ứng dụng của cs 8

2.1.5 Thu nhận và định lượng Chondroitin sulfate 12

2.1.6 Các nghiên cứu về cs 14

2.2 Sụn ức gà 15

2.3 Chăn nuôi ở Việt Nam 16

2.3.1 Tình hình chăn nuôi 16

2.3.2 Tình hình tiêu thụ thịt gà ở Việt Nam 17

2.3.3 Phụ phẩm từ chế biến gà thịt 18

2.4 Tổng quan về phương pháp thu nhận cs thô 18

2.4.1 ứng dụng của sóng siêu âm thu nhận cs thô 18

2.4.2 ứng dụng của hệ enzyme protease để thu nhận cs thô 20

2.5 Tổng quan phương pháp tinhsạch từ dung dịch cs thô 23

2.5.1 ứng dụng phương pháp lọc màng để tinh sạch cs 23

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

3.1 Nguyên liệu 33

3.1.1 Sụn ức gà 33

3.1.2 Chế phẩm enzyme Alcalase 33

3.2 Hóa chất và thiết bị 34

3.2.1 Hóa chất phân tích 34

3.2.2 Thiết bị 34

3.2.3 Dụng cụ 35

3.3 Sơ đồ nghiên cứu thu nhận cs 35

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu thu nhận cs thô 36

3.3.2 Sơ đồ nghiên cứu thu nhận cs tinh sạch 37

3.4 Quy trình thu nhận cs 38

3.4.1 Quy trình thu nhận cs thô 38

3.4.2 Quy trình thu nhận cs tinh sạch 42

3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 44

3.4.4 Phương pháp xử lí số liệu 55

3.4.5 Các phương pháp phân tích và công thức tính toán 55

Chương 4: Kết quả và bàn luận 59

4.1 Thành phần cơ bản của sụn ức gà 59

4.2 Khảo sát các quá trình xử lý sụn ức gà 60

4.2.1 Xử lí sụn ức gà bằng dung dịch NaOH 60

4.2.2 Xử lí sụn ức gà bằng chế phẩm enzyme 62

4.2.3 Xử lí sụn ức gà bằng quá trình nhiệt 64

4.3 Kết quả và bàn luận phương pháp thu nhận cs thô 65

4.3.1 Phương pháp sử dụng sóng siêu âm 65

4.3.2 ứng dụng thủy phân sụn ức gà bằng enzyme Alcalase 70

4.4 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân bằng chế phẩm enzyme Alcalase 77

4.5 Xác định các thành phần nguyên liệu bột cs thô 82

4.6 Kết quả và bàn luận phương pháp tinh sạch cs 83

4.6.1 Phương pháp lọc màng qui mô PTN 83

4.6.2 Tinh sạch bằng phương pháp hóa học 98

4.7 Tối ưu hóa quá trình tinh sạch 104

4.8 Đánh giá chế phẩm cs thu được sau tinh sạch bằng phương pháp hóa học 111

4.8.1 Kết quả phân tích hàm lượng mẫu cs thu được sau tinh sạch 111

4.8.2 Cấu trúc bề mặt của Chondroitin sulfate 112

4.8.3 Kết quả đo KLPT bằng GPC 112

4.8.4 Kết quả chạy FTIR 113

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 114

5.1 Kết luận 114

5.1.1 về mặt khoa học 114

5.1.2 về mặt ứng dụng 114

5.2 Đề nghị 115

TÀI LIỆU THAM KHẢO 116

PHỤ LỤC

A CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 121

B CÁC GIÁ TRỊ PHÂN TÍCH THỰC NGHIỆM 134

c CÁC BẢNG THỐNG KÊ 162

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: cấu trúc hóa học của cs 4

Hình 2.2: cấu tạo hóa học của cs 5

Hình 2.3: Các đồng phân của cs 6

Hình 2.4: Một số nguồn nguyên liệu thu nhận cs 7

Hình 2.5: Một số sản phẩm chứa bột cs 8

Hình 2.6: Mô phỏng cấu tạo khớp 8

Hình 2.7: cấu trúc của proteoglycan 9

Hình 2.8: Sụn ức gà: khi còn mô và mỡ (a) và sau khi được làm sạch (b) 15

Hình 2.9: Biểu đồ ước tính sản lượng chăn nuôi gia cầm qua các năm 16

Hình 2.10: Tình hình tiêu thụ thịt gà (năm 1997 - 2015) 17

Hình 2.11: Bột thịt xương (a) và bột lông vũ (b) 18

Hình 2.12: Nguyên lý tạo và vỡ bọt khí 19

Hình 2.13: Sơ đồ phân loại protease 21

Hình 2.14: Cơ chế xúc tác của protease 22

Hình 2.15: Sơ đồ mô tả quá trình phân riêng bằng màng 24

Hình 2.16: Định nghĩa các đại lượng quan ttọng trong đặc trưng các loại màng 25

Hình 2.17: Sơ đồ phân loại cấu tạo màng 27

Hình 2.18: Phân loại các công nghệ màng tiến hành nhờ chênh lệch áp suất 28

Hình 2.19: Vị trí lọc nano tính trên áp suất làm việc và lọc phân riêng 30

Hình 3.1: Quy trình thu nhận bột cs thô 38

Hình 3.2: Quy trình thu nhận cs tinh sạch 42

Hình 4.1: Sụn gà chưa xử lí (a) và xử lí màng thịt bên ngoài (b) 59

Hình 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý NaOH đến hàm lượng thất thoát GAGs ’ ’ 60

Hình 4.3: Ảnh hưởng quá trình xử lý sụn của enzyme đến hàm lượng cs thất thoát 62

Hình 4.4: Ảnh hưởng của quá trình chần đến hiệu suất thất thoát GAGs 64

Hình 4.5: Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung dịch (w/v) đến hiệu suất thu hồi GAGs66 Hình 4.6 : Ảnh hưởng của pH huyền phù đến hiệu suất thu hồi GAGs 67

Hình 4.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hiệu suất thu hồi GAGs 68

Hình 4.8: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất thu hồi GAGs 69

Hình 4.9: Ảnh hưởng của tỉ lệ sụn: đệm đến hiệu suất thu hồi GAGs 71

Hình 4.10: Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm đến hiệu suất thu hồi GAGs 72

Hình 4.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi GAGs 74 Hình 4.12: Ảnh hưởng hàm lượng enzyme Alcalase/cơ chất đến hiệu suất thu hồi GAGs 75 Hình 4.13: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu

hồi GAGs 76 Hình 4.14: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu

hồi GAGs thô 81

Hình 4.15: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme/cơ chất và thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi GAGs thô 81

Hình 4.16: Độ phân riêng carbohydrate và protein của các loại màng 84

Hình 4.17: Thông lượng dòng qua các loại màng 85

Hình 4.18: Trở lực màng theo áp suất của các loại màng 86

Hình 4.19: Trở lực màng (m_1) 86

Hình 4.20: Độ phân riêng của carbohydrate khi thay đổi áp suất vận hành 88

Hình 4.21: Độ phân riêng cấu tử protein khi thay đổi áp suất vận hành 88

Hình 4.22: Thông lượng dòng qua màng ở các điều kiện áp suất khác nhau 89

Hình 4.23: Trở lực tổng qua các loại màng (m'1) 90

Hình 4.24: Độ phân riêng carbohydrate khi thay đổi thời gian lọc màng 92

Hình 4.25: Độ phân riêng protein khi thay đổi thời gian lọc màng 92

Hình 4.26: Thông lượng dòng qua màng theo thời gian 93

Hình 4.27:Đường chuẩn thông lượng dòng qua các loại màng theo áp suất 94

Hình 4.28: Trở lực các loại màng 95

Hình 4.29: Tỉ lệ loại bỏ protein qua màng PS10 và PS20 96

Hình 4.30: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của cs theo thời gian lọc 96

Hình 4.31: Thông lượng dòng qua màng theo hệ số cô đặc 97

Hình 4.32: Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng cs thu hồi 99

Hình 4.33: Ảnh hưởng của nồng độ CPC đến hiệu suất thu hồi 100

Hình 4.34: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hàm lượng cs thu hồi 102

Hình 4.35: Ảnh hưởng của nồng độ KSCN đến hàm lượng cs thu hồi 103

Hình 4.36: Ảnh hưởng của pH và nồng độ CPC đến hiệu suất thu hồi cs 109

Hình 4.37: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl và KSCN đến hàm lượng cs thu hồi 109

Hình 4.38: sắc kí đồ mẫu cs tinh sạch 111

Hình 4.39: cấu trúc bề mặt cs chuẩn, bột cs thô và cs tinh sạch 112

Hình 4.40: sắc kí đồ KLPT của cs chuẩn và mẫu cs tinh sạch 112

Hình 4.41: Kết quả sác kí đồ FTIR của mẫu cs chuẩn và cs tinh sạch 113

Bảng 4.9: Các yếu tố cố định khi khảo sát thời gian thủy phân bằng chế phẩm enzyme 76 Bảng 4.10: Các mức yếu tố thí nghiệm tối ưu hóa trong bài toán tối ưu hóa các yếu to pH, nhiệt độ, hàm lượng enzyme/cơ chất và thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi GAGs thô

(%) của lần lượt các enzyme 77

Bảng 4.11: Kết quả hiệu suất thu hồi GAGs thô (%) theo các yếu tố pH, nhiệt độ, hàm lượng enzyme/cơ chất và thời gian thủy phân khi tiến hành thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm 78

Bảng 4.12: Hệ số phương trình hồi quy và độ tin cậy của các hệ số tương ứng với các yếu tố của quá trình thủy phân 79

Bảng 4.13: Hệ số Lack of Fit của quá trình thủy phân 80

Bảng 4.14: Ket quả hiệu suất thu hồi GAGs (%) từ phương trình hồi quy và thực nghiệm .' .? 82

Bảng 4.15: Thành phần nguyên liệu chế phẩm thô82 Bảng 4.16: Hệ số tách protein so với chondroitin Sulfate ứng với từng loại màng khác nhau 85

Bảng 4.17: Bảng giá trị trở lực màng của các loại màng 86

Bảng 4.18: Hệ số tách protein so với carbohydrate ở các áp suất vận hành khác nhau 89

Bảng 4.19: Bảng giá trị của trở lực tổng qua các loại màng 90

Bảng 4.20: Hệ số tách protein/carbohydrate ở các chế độ thời gian lọc màng khác nhau 93 Bảng 4.21: Các giá trị của trở lực qua các loại màng 94

Bảng 4.22: Dự đoán cơ chế gây tắc nghẽn của màng PS20 và các giá trị i; k của phương DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Bảng phân loại cs 6

Bảng 2.2: Lượng thịt gà nhập khẩu vào Việt Nam năm 2012 - 2015 [1] 17

Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng 34

Bảng 3.2: Bảng quy hoạch cấu trúc có tâm xoay cấp hai, bon yếu tố ảnh hưởng 49

Bảng 4.1: Các thành phần hóa học trong sụn ức gà 59

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý NaOH đến hàm lượng thất thoát GAGs ’ 60

Bảng 4.3: Giá ttị ảnh hưởng quá trình xử lý sụn của enzyme đến hàm lượng cs thất thoát ' 62

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của quá trình chần đến hiệu suất thất thoát GAGs 64

Bảng 4.5: Các yếu tố cốđịnh khi khảo sát tỉ lệ nguyên liệu sụn: dung dịch đệm 70

Bảng 4.6: Các yếu tố cốđịnh khi khảo sát pH của quá trình thủy phân enzyme 72

Bảng 4.7: Các yếu tố cốđịnh khi khảo sát nhiệt độ của quá trình thủy phân 73

Bảng 4.8: Các yếu tố cốđịnh khi khảo sát hàm lượng enzyme/cơ chất của quá trình thủy phân 75

trình Hermia 97

Bảng 4.23: Các mức yếu tố thí nghiệm tối ưu hóa Ương bài toán tối ưu hóa các yeu to pH,

nồng độ CPC, NaCl, KSCN đến quá trình tinh sạch cs 104

Bảng 4.24: Quy hoạch thực nghiệm 105

Bảng 4.25: Hệ số phương trình hồi quy và độ tin cậy của các hệ số tương ứng với các yếu

tố của quá trình tinh sạch 106

Bảng 4.26: Hệ số Lack of Fit của quá trình thủy phân 108

Bảng 4.27: Kết quả hiệu suất thu hồi cs tinh sạch (%) từ phương trình hồi quy và thực

nghiệm 110

Bảng 4.28: Kết quả phân tích hàm lượng cs sau tinh sạch bằng HPLC 111

Bảng 4.29: Kết quả Mw, Mn, PI của sản phẩm cs chuẩn và cs tinh sạch 112

Mw weight - average molecular weight

1

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Tình hình chăn nuôi gia cầm, đặc biệt là chăn nuôi gà ở Việt Nam phát triển nhanh chóng ưong những năm qua Năm 2005 luợng tiêu thụ là 322 ngàn tấn đen năm 2015 tiêu thụ 862 ngàn tấn, sau 10 năm luợng tiêu thụ tăng đến 267,7% Năm 2016, đàn gia cầm cả nuớc đạt 356,72 triệu con và cuối năm 2017 có 385,46 hiệu con Theo nhu kế hoạch phát triển của cục chăn nuôi, đến năm 2020, số luợng đàn gia cầm uớc tính khoảng 397,9 triệu con

Do đó sau quá ưình giết mổ và sản xuất thịt gà, nguồn phụ phẩm nhu: xương, sụn, đặc biệt là sụn ức gà rất lớn và bán ra thị truờng với giá rẻ Mặt khác thành phần sụn ức gà lại chứa nhiều họp chất quý nhu glycosaminoglycans, hong đó có hợp chất chondroitin sulfate có chức năng tái tạo các mô sụn và xương, nuôi duỡng tế bào giác mạc mắt Qua

đó cho thấy: sụn ức gà là nguyên liệu đầy tiềm năng để trích ly và thu nhận Chondroitin Sulfate

Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về tách chiết, tinh sạch chondroitin sulfate từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau trong đó có sụn gà Sản phẩm bột cs đuợc ứng dụng rộng rãi trong ngành duợc phẩm, thục phẩm chức năng, giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều ưị các bệnh về xương khớp Tuy nhiên, ở nuớc ta mới chỉ có một nghiên cứu duy nhất thu nhận cs từ sụn cá đuối, cá nhám

Truớc thục hạng này, tiến hành nghiên cứu đua ra quy trình thu nhận và tinh sạch cs

là cần thiết Do đó, đề tài luận văn “Trích ly - Tinh sạch Chondroitin Sulfate từ sụn ức gà bằng phương pháp hóa học và hóa sinh” đã đuợc nghiên cứu nhằm góp phần giải quyết vấn

đề đầu ra và giúp nâng cao giá ttị gia tăng cho phụ phẩm của ngành chăn nuôi - giết mổ gia cầm nói chung và gà nói riêng Không những mang lại doanh thu cho các công ty gia cầm, đặc biệt là giúp cho người nông dân có thêm nguồn thu nhập mà còn tạo ra một sản phẩm

có lợi cho sức khỏe của người tiêu dùng với giá thành hợp lý, hỗ trợ thêm cho ngành y tế trong việc điều trị các bệnh về xương khớp Bên cạnh đó cũng giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường từ nguồn phụ phẩm

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm được điều kiện xử lý màng thịt bám bên ngoài sụn tốt nhất bằng các phương pháp: hóa học, hóa sinh và vật lý

- Khảo sát các quá trình thu nhận cs thô bằng phương pháp vật lý và hóa sinh Sau

đó tiến hành tối ưu hóa điều kện thu nhận cs thô tốt nhất

- Đối tượng nghiên cứu là sụn ức gà mua tại Công ty TNHH Phạm Tôn

- Enzyme Alcalase sử dụng cho nghiên cứu là sản phẩm của Công ty Brenntag

1.4 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào các nội dung sau:

- Tổng quan tài liệu về cs, chức năng sinh học và các phương pháp thu nhận

- Tổng quan về nguyên liệu sụn ức gà và enzyme dùng ừong thủy phân

- Tổng quan về siêu âm, lọc màng, tinh sạch bằng phương pháp hóa học

- Phân tích một số thành phần hóa học cơ bản của sụn ức gà

- Xác định hoạt độ enzyme Alcalase

- Khảo sát phương pháp xử lý nguyên liệu sụn: NaOH; enzyme Alcalase và Chần

- Thiết lập quy trình công nghệ trích ly và thu nhận cs thô từ sụn ức gà bằng phương pháp siêu âm và thủy phân Tối ưu hóa các yếu tố trong phương pháp thu nhận cs thô tốt nhất

- Thiết lập quy trình tinh sạch cs bằng phương pháp lọc màng và phương pháp hóa học Tối ưu hóa phương pháp thu nhận cs tinh tốt nhất

- Phân tích và đánh giá cs thu được

3 phẩm chức năng giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh về xưorng khớp tại Việt Nam mà không cần phải nhập nguyên liệu từ nước ngoài.

4

Chưong 2: Tổng quan

2.1 Tổng quan về Chondroitin sulfate

2.1.1 Đặc điểm và cấu trúc của cs

Chondroitin sulfate (CS) là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide, gồm các monome là các đơn vị disaccharide chứa nhóm: glucuronic acid (GlcA) và N- acetyl-galactosamine (GalNAc) liên kết với nhau bởi liên kết glucoside (GlcA p (1—>3) GaỉNAc) (hình 2.1) tạo thành Chondroitin sulfate glycosaminoglycans (CS-GAGs) không phân nhánh Một chuỗi CS-GAGs có thể chứa từ 20 - 40 đơn vị disaccharide và các disaccharide liên kết với nhau bởi liên kết 1 —>4 glycoside[l], [2]

Mỗi nhóm OH cùa CS-GAGs được thay thế bởi nhóm sulphate (SO42) tại vị trí carbon C4 hoặc C6 của GalNAc và vị trí carbon C2 hoặc C3 của GlcA sẽ tạo ra các đồng phân của

cs (hình 2.1) [4],

[51

L: GlcA(2S.}- GãlMAtì([6S)

M; GlcA(3S>-GalNAc(4, BSJ

Hình 2.1: cấu trúc hóa học của cs

Sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO42) gốc đường với các nhóm carboxyl (COO ) của gốc đường acid làm cho phân tử chondroitin có điện tích âm rất cao, dễ dàng liên kết cộng hóa ttị với các protein trong proteoglycan (PG) Trong các nghiên cứu của Kato (1994) và Bemfield (1999) đã cho thấy cs thường gắn với các protein bằng liên kết o- glycosỉd tạo thành một PG, là hợp chất hữu cơ thuộc nhổm mucopolysaccharide [24]

Chuỗi cs được gắn với nhóm - OH của gốc serine ở một số protein Sự gắn kết chuỗi GAGs bắt đầu với bốn gốc đường đơn theo phương thức cố định bởi liên kết tetra - saccharide: xylose - galactose - galactose - glucuronic acid (Xyl - Gal - Gal - GlcA) (hình 2.2) trong đó xylose được gắn với protein trong mạng lưới nội bào, còn các phân tử đường khác được gắn trong hệ Golgỉ.[6],[22]

CH,

O: GlcA-GalNAe A: GlcA-GalNAc(4S) C: GlcA-GalNAc{6S) D: GlcA(2S)-GíỉlNAc(6S)

E: GlcA-GalN Ac{4, 6S)

K; GlcA(3S)-GalNAc(4S>

5

Hình 2.2: cấu tạo hóa học của cs

cs ưa nước vì thế hàm lượng nước trong mô sụn cao Các điều kiên thủy phân cũng có

thể làm giảm trọng lượng phân tử trung bình của sản phẩm thu được Mỗi phân tử đường có

thể bị sulfate hóa 1, 2 lần hoặc không bi sulfate hóa Đa phần nhốm OH ở vị trí cacbon 4 và

6 của GalNac được sulfate hóa Quá trình này nhờ các enzyme sulfotransferase đặc hiệu Việc

sulfate hốa ở các vị trí carbon khác nhau tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù của cs [3]

2.1.2 Phân loại cs

Chondroitin có 3 loại chính A, B và c, chúng được đặc trưng bởi số lượng và vị trí gắn

sulfate trong nhóm dissacharide cùa chuỗi polysaccharide [5],[9], [32]

- Chondroitin sulfate A: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 (Chondroitin-4-sulfate, CS4) có

nhiều ở mô sụn, có thể kết hợp với protein tạo nên chondromucoỉt

- Chondroitin sulfate B: acid iduronic thay thế acid glucuronic, thường có nhiều ở

da, gan, vân tím, thành mạch Vị trí bị sulfate hóa ở C-4 của GlcNac và C-5 của

glucuronic acid bị epime hóa thành iduronic acid

- Chondroitin sulfate C: gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 (Chondroitin-6-sulfate, CS6)

(CS6) Chondroitin sulfate D Cacbon 2 của glucuronic acid

and 6 của GalNAc

Chondroitin-2,6-sulfate

(C2,S6) Chondroitin sulfate E

Cacbon 4 và 6 của GalNAc

Chondroitin-4,6-sulfate

(C4,S6)

Số lượng đồng phân của cs được tìm thấy rất nhiều Điều này cho thấy rằng, cấu trúc chuỗi cs không mang tính ngẫu nhiên và những chuỗi cs có thể chứa những thông tin sinh học, cấu trúc phân tử đặc biệt ảnh hưởng đến chu trình sinh học của cơ thể theo Robert M Lauder và các cộng sự (2009) [1]

2.1.3 Nguồn gốc

cs phân bố khắp cơ thể người, động vật có vú, động vật không xương sống và trong một số loài vi khuẩn Tại các mô khớp, cs chiếm khoảng 20%, một số lượng tuy không lớn nhưng đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự bền chắc và đàn hồi của mô sụn Ngoài ra, các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy tại giác mạc cs chiếm khoảng 20% [10]

Nguồn gốc của cs ttên thị trường hiện tại được chiết xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu như: phụ phẩm của heo (lỗ tai và mõm heo), sụn cá mập (xưorng sọ, xưorng sống và vây),

7

ống khí quản bò, sụn bò và có thể dùng cs từ sụn khí quản động vật (khí quản gà, vịt ) để thay thế cho sụn cá mập, giảm giá thành nhưng vẫn đảm bảo chất lượng của sản phẩm

Trong các nghiên cứu khoa học đã đưa ra hàm lượng cs của một số nguyên liệu Sụn

từ xưorng hàm cá sấu và sụn ức gà là những nguyên liệu chứa nhiều cs, lần lượt là 14,84%

và 14,08% tính theo ừọng lượng sụn khô [10] Theo một nghiên cứu khác của Luo và cộng

sự (2002) thì hàm lượng cs từ sụn ức gà chiếm 16,8% [23] Hàm lượng cs từ các sụn khác như: sụn xưomg ức cá sấu 11,55%, sụn khí quản cá sấu 9,51%, sụn vây cá mập 9,6%, sụn sườn cá sấu 5,56%, và sụn cá đuối 5,27% (tính theo chất khô) [10] Hàm lượng cs ừong khí quản vịt được nghiên cứu là khoảng từ 9,7% đen 10,6% theo hàm lượng chất khô [46]

Hình 2.4: Một số nguồn nguyên liệu thu nhận cs

cs trong mô động vật liên kết chặt chẽ với protein trong dạng phức proteoglycan cho nên việc đầu tiên là phải tách cs ra khỏi protein nhờ việc làm yếu các liên kết giữa cs - Protein

và phân hủy protein để giải phóng cs [24]

8

Tùy vào nguồn gốc xuất xứ mà cs có cấu trúc hóa học khác nhau, mỗi cấu trúc hóa học của mạch polyme khác nhau có chức năng sinh học khác nhau Một ttong những yếu tố quyết định đến giá ưị của cs đó là chất lượng và sự công nhận của các cơ quan có thẩm quyền Một số sản phẩm có thể chứa hàm lượng cs ít hơn so với quy định đã đãng ký nhưng không nhỏ hơn 10%, do đó cần phải tiến hành kiểm ưa chất lượng và nguồn gốc của cs trong các sản phẩm thương mại [4],[7],

2.1.4 ứng dụng của cs

cs đã được sử dụng rộng rãi ưong các thực phẩm chức năng và thị trường các chế phẩm bổ sung dinh dưỡng cs và glucosamine rất lớn Chỉ ưong vòng một năm (1998 - 1999), doanh thu bán lẻ tại Mỹ đạt được 500 triệu USD cs có nhiều tác dụng trong điều ưị bệnh lý cũng như ưong các lĩnh vực khác

Hình 2.5: Một số sản phẩm chứa bột cs

2.1.4.1 Bệnh khớp

Khớp là bộ phận liên kết bao bọc làm cầu nối giữa 2 đầu xương, bao gồm bởi nhiều loại mô khác nhau như sụn khớp, bao khớp, dịch khớp, dây chằng (hình 2.6)

Sụn khớp là lớp mô bao lấy đầu xương để ngăn các xương tiếp xúc trực tiếp với nhau,

Hình 2.6: Mô phỏng cấu tạo khớp

structure of Proteoglycans

Hình 2.7: cấu trúc của proteoglycan

Proteoglycan là những polyanionic có chứa các chuỗi heteropolysaccharide liên kết với chuỗi polypeptide qua cầu nối Xyl-Gal-Gal-GlcA Các polysaccharide này gồm cs và hyaluronic acid chiếm 90% cấu trúc của proteoglycan [2]

Trong cơ thể, quá trình tổng hợp của proteoglycan tại các sụn khớp cần phải có mặt của cs, amino acid và hyaluronic acid dưới sự xúc tác của các enzyme và đặc hiệu trong cơ thể từng loài

Proteoglycan có khả hấp thụ nước vào các mô tạo ra áp suất thẩm thấu dẫn đến sự giãn nở của các mô sụn Khả năng chịu lực của sụn khớp và xương là do độ đàn hồi của các

mô sụn kết hợp với các mô bao khớp và dây chằng có thành phần chính là collagen tạo nên một hệ thống xương khớp bền vững Vì vậy, cs và hyaluronic acid đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc và chức năng của mô sụn

Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy cs đã được ứng dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh lý về xương khớp, đặc biệt là bệnh viêm khớp theo các cơ che:

- Có tác dụng ức chế enzyme elastase, collagenase, proteoglycanase, phospholipase A2 và N acetylglucosamindase; kích thích hoạt động các enzyme

10

xúc tác phản ứng tổng hợp hyaluronic acid giúp khớp hoạt động, kích thích quá trình tổng hợp proteoglycan

- Giảm đau, kháng viêm, giảm sưng khớp do làm giảm tạo ra tân dịch

- Tham gia vào cấu trúc tái tạo sụn khớp

- cs còn được tìm thấy trong hoạt dịch, chất lỏng bao quanh khớp, giúp bôi tron

và tăng sự mềm mại của khớp

Có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng: điều ưị cs với liều 600 mg/ngày ưong 3 tháng với liệu trình 2 đợt một năm có tác dụng giảm đau và cải thiện chức năng rõ rệt ở bệnh nhân bị viêm khớp

Các nghiên cứu dược lý tại châu Âu trong khoảng 10 năm gần đây cho thấy: cs được

sử dụng điều trị cho bệnh nhân đã không có một phản ứng phụ nào nghiêm họng xảy ra [30],

2.1.4.2 Khả năng kháng viêm nhiễm của cs

cs ức chế hoạt động của TNF-a làm giảm chứng mắc bệnh viêm ruột và bệnh vảy nến (M.T Osterman và G.R Lichtenstein, 2007) [17] TNF-a có thể liên kết với cs (E) nồng

độ cao làm giảm chứng viêm khớp Theo J.W Cho và các cộng sự, cs được thu nhận từ nguồn sụn khí quản làm giảm nồng độ serum TNF-a trong chuột [18]

cs cũng ức chế biểu hiện của những phân tử tiền viêm, làm giảm IL-ip tạo ra sự hoán

vị của NF-KB và TNF-a tạo ra NF-KB kháng viêm cho cơ thể theo ghi nhận của c Jomphe

và các cộng sự (2007) [19],

2.1.4.3 Hỗ trợ điều trị các bệnh mắt

cs là chất sinh lý của giác mạc duy trì độ ttong suốt cho mắt, tạo độ nhớt thích hợp, tái tạo các lớp phím nước mắt trước giác mạc, tăng cường độ đàn hồi của thấu kính, chống tình ttạng khô mắt Do ức chế tạo sinh tân mạch, chondroitin sulfate còn được dùng trong điều ttị bệnh thoái hóa võng mạc mắt do tiểu đường (bệnh do tân mạch phát triển xâm nhập vào dưới võng mạc mắt gây tổn thương thành sẹo, có thể dẫn tới mù lòa), cs được dùng trong thuốc nhỏ mắt để phòng ngừa và điều trị các tình trạng khô mắt, mỏi mắt, thoái hoá võng mạc Công ty TNHH ROHTO-MENTHOLATUM (Việt Nam) sản xuất thuốc nhỏ mắt New V.Rohto có chứa cs chữa các bệnh: mỏi mắt, xung huyết kết mạc, bệnh mắt do tia cực tím hay các tia sáng khác, nhìn mờ do tiết dịch, mắt ngứa, viêm mi

Theo sách “Matindale, The complete drug reference” (34th, 2005) [20], cs được dùng rộng rãi ttong nhãn khoa nhằm tác dụng bôi trơn và bồi bổ nội mô giác mạc Bên cạnh đó,

11

cs cũng được dùng hỗ ửợ điều trị trong phẫu thuật mắt (điều trị mô cườm, đục thủy tinh thể), dùng làm dung dịch bảo quản giác mạc ttong phẫu thuật ghép giác mạc, đặc biệt làm thuốc nhỏ mắt để ừị chứng khô mắt [13], [21],

2.1.4.4 Ngăn ngừa ung thư

cs từ sụn cá mập tự nhiên có tác dụng ngừa ung thư Theo ghi nhận cá mập là loại

cá duy nhất rất hiếm bị mắc bệnh ung thư Tần suất bị bệnh ung thư ở cá mập là một phần triệu ừong khi các loại cá khác tần suất mắc bệnh là 2% hoặc 3%

Lý giải cho khả năng kỳ diệu này chính là chat chondroitin sulfate có trong sụn vi cá mập Các khối ung thư phát triển rất nhanh nên phải luôn luôn tạo ra các mạch máu mới nhằm đáp ứng nhu cầu cao về máu và chất bổ dưỡng cho nó phát triển, tăng trưởng mạnh

Do đó các khối ung thư luôn luôn sinh ra chat angiogenesis có tác dụng kích thích quá trình tạo sinh tân mạch Neu hoạt chat angiogenesis bị ức che, tân mạch sẽ không được tạo ra, khối u sẽ thiếu máu nuôi, các te bào ung thư không sinh sản được, khối u sẽ ngừng tăng trưởng, bệnh ung thư bị chặn lại Người ta thấy chính chat Chondroitin sulfate ưong sụn vi

cá mập đã ức chế được hoạt chat angiogenesis

Neu sử dụng cs thì quá trình tạo tân mạch bị ức chế, gây ra hiện tượng thiếu máu nuôi thì tế bào ung thư sẽ không sinh sản, khối u ung thư không phát sinh hoặc phát triển, chúng sẽ tự hoại [21],

2.1.4.5 Các ứng dụng khác

- cs còn có thể bổ sung để điều ưị và ngăn tắc nghẽn động mạch

- cs có tác động điều khiển tế bào, tăng quá trình tổng hợp mARN và deoxyribonucleic acid sinh tổng hợp DNA

- cs có tác dụng kháng đông, mỗi LMG chondroitin sulfate là tương đương với 0,45

u heparin thuốc chống đông

- Ngoài ra, cs có trong thành phần mỹ phẩm (tác nhân dưỡng tóc, kem dưỡng và chất giữ ẩm ) [17] cs còn có trong thành phần các chế phẩm chứa gelatin (thực phẩm,

mỹ phẩm, thuốc, nguyên liệu công nghiệp và làm ảnh)

2.1.5 Thu nhận và định lượng Chondroitin sulfate

Cấu trúc phân tử của cs rất phức tạp và đa dạng nên chưa thể tổng hợp bằng con đường hóa học, mà chỉ được thu nhận từ nguồn nguyên liệu tự nhiên thông qua quá trình chiết xuất mô, sụn động vật

12

cs trong mô động vật liên kết chặt chẽ với protein ưong dạng phức proteoglycan Cho nên việc đầu tiên là phải tách cs ra khỏi protein nhờ việc làm yếu mối liên kết giữa cs - Protein và phân hủy protein để giải phóng cs

2.1.5.1 Các phương pháp thu nhận Chondroitin sulfate thô

Chế phẩm cs thô từ sụn có thể được thu nhận bằng phương pháp hóa học, vật lý và phương pháp hóa sinh

- Theo phương pháp hoá học: mô sụn được xử lý bằng nước nóng, dung dịch muối, kiềm (NaOH) hoặc acid (HC1, CH3COOH ) để tách cs khỏi các phân tử khác (protein, hyaluronic acid ) Phương pháp này đã áp dụng để thu cs từ sụn gà [34], sụn bò [41], Tuy nhiên, đã xuất hiện việc phá vỡ các liên kết glycoside của cs, làm thay đổi cấu trúc cũng như hoạt tính cs [26]

- Theo phương pháp vật lý: Sử dụng sóng siêu âm để tạo hệ bong bóng và sủi bọt khí, phá vỡ cấu trúc của nguyên liệu, trích ly các hợp chất hòa tan Bên cạnh đó, nhiệt độ siêu âm có thể làm duỗi mạch và biến tính protein, dẫn đến giải phóng cs ra khỏi liên kết protein

- Theo phương pháp hóa sinh: dùng enzyme thuỷ phân mô sụn để thu nhận cs không

bị biến đổi về cấu trúc, giữ được hoạt tính sinh học của chúng và làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường do các hoá chất (muối, kiềm, acid ) gây ra Nhiều nghiên cứu đã

sử dụng các protease (papain, alcalase, flavourzyme ) để thuỷ phân sụn giải phóng

cs khỏi các protein liên kết [45] Sau khi loại bỏ protein thì cs được tách ra và tinh sạch Phương pháp này đã được dùng để thu nhận cs từ da cá Labeo rohita [51], sụn của mực [61], cá mập [44], cá sấu, cá đuối [10]

2.1.5.2 Các phương pháp tình sạch Chondroitin sulfate

Dung dịch cs thô thu được còn chứa một lượng tạp chất nào đó như collagen, protein, hyaluronic acid, muối khoáng cho nên phải tiến hành quá trình tinh sạch để loại bỏ các tạp chất trên Có thể tinh sạch bằng phương pháp hóa học hoặc sinh học

- Theo phương pháp hóa học: Đe thu cs có thể sử dụng muối ammonium như cetylpyridium chloride (CPC) hoặc cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) để tạo phức tủa với GAGs và các polysaccharide khác, các collagen phần lớn sẽ bị loại

13

trong giai đoạn này Các GAGs gốc sulfate thấp trong nhóm phức hợp CPC - GAGs

và CTAB - GAGs sẽ bị hòa tan trong một số muối NaCl hoặc KC1 nồng độ thấp (0,3

- 0,4 M) Sau khi loại bỏ các GAGs gốc sulfate thấp như hyaluronid acid, chỉ còn lại tủa CPC - GAGs hoặc CTAB - GAGs chứa gốc sulfate cao, chủ yếu là cs Tiếp tục hòa tan cs này trong dung dịch muối có nồng độ cao như 2M NaCl, IN MgCl2, 0,9 - 2M KC1, 0,7 - 1,5 N MgSO4 và tiếp tục được tinh chế bằng thẩm tích và kết tủa bằng dung môi để thu được cs tinh khiết [42], [47],

- Theo phương pháp lọc màng: Sử dụng các màng siêu lọc, màng nano để loại bỏ các ion muối, nước và các họp chất có khối lượng phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ của màng Do đó tùy vào KLPT cs thu nhận mong muốn, ta chọn các loại màng có kích thước lỗ phù hợp [40]

- Ngoài ra, cs là một polyanion có điện tích âm rất cao, nên rất dễ liên kết và bám dính ừên các cột sắc kí, do đó còn có thể tinh sạch cs bằng sàng lọc phân tử nhờ sắc ký lọc gel (Sepharose CL - 6B, Sephacryl s - 300, ), sắc ký trao đổi ion (DEAE - Sephacel, D0WEX 50 )

2.1.5.3 Định lượng cs

Xác định hàm lượng cs theo sự thay đổi quang phổ hấp thụ của chất màu DMMB (1,9-dimethylmethylene blue) khi nó gắn với gốc sulfate

Hoà tan bột cs thô thu được vào nước cất đã loại ion để nhận dung dịch 8-12% (w/v)

và xác định hàm lượng cs của dung dịch theo Famdale và cộng sự Dùng CS4 và CS6 tinh khiết làm chất chuẩn, sau đó đo độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng 525nm ttên máy quang phổ [50]

2.1.6 Các nghiên cứu về cs

V c Hascall và các cộng sự (1988) [22] đã nghiên cứu về cấu trúc phân tử của cs tự nhiên, là một glycosaminoglycans (GAGs), một polyme mạch thẳng Đơn vị cấu trúc cơ bản của cs là disaccharide chứa nhóm GlcA và GalNAc liên kết với nhau bởi liên kết glucoside GlcA p (1 —>3) GalNAc tạo thành Chondroitin sulfate glycosaminoglycans (CS-GAGs) không phân nhánh Một chuỗi CS-GAGs có thể chứa 50 đơn vị disaccharide [23], [14]

M Bemfield và các cộng sự (1999) [24] đã chỉ ra rằng cs liên kết với các protein bởi liên kết glycoside tạo thành proteoglycan (PG)

14

w Gamjanagoonchom và các cộng sự (2007) đã sơ bộ đưa ra quy trình tách chiết

cs, sử dụng enzyme papain và từ đó so sánh khả năng trích ly cs từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như, sụn vi cá mập, sụn cá đuối, cá sấu và sụn ức gà và phân tích định lượng bằng phương hấp thu quang phổ FTIR, đã cho thấy có thể thu được hàm lượng cs từ 11,55% đến 14,84% [10],

A Im và cộng sự (2010) đã trích ly và tinh sạch cs từ sụn và xương sống cá tầm bằng enzyme alcalase; thu được CS-4 từ sụn chiếm khoảng 88,8% và CS-6 từ xương chiếm khoảng hơn 60% trên tổng lượng cs [43]

s c Shin và cộng sự (2006) đã trích ly cs từ sụn ức gà bằng hai phương pháp trích

ly bằng nước nóng và bằng enzyme Alcalase Kết quả thu được là: trích ly bằng nước nóng thu được hàm lượng cs là 28,46% với hiệu quả trích ly là 40,09% ; hàm lượng cs thu được

từ quá trình trích ly bằng enzyme là 26,61% với hiệu suất trích ly là 75,85% [27],

T Xhao và cộng sự (2012) đã trích ly cs từ sụn cá tầm bằng NaOH Hàm lượng cs

thô thu được là 26,51%, sau đó ông tiến hành tối ưu hóa điều kiện trích ly và hàm cs dự đoán từ phương trình hồi quy thực nhiệm là 26,54% [47]

Nakano và cộng sự (2012) cũng đã trích ly, tinh sạch và phân tích chế phẩm cs thu được từ nguồn sụn gà, hàm lượng cs thu được 30.08% (so với chất khô nguyên liệu) Bên cạnh đó M.Khan và các cộng sự (2013) cũng đã thu nhận GAGs từ nguồn sụn ức gà, hàm

ẩm 9,88%; protein 12,82%, lipid 0,69%, tro 11,12% và carbohydrate (chủ yếu GAGs) đạt 65,49% [53]

Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu khác trên thế giới đã chiết tách cs từ một số nguồn nguyên liệu như: da cá trôi Ân Độ (Labeo rohita) [25], sụn cá tầm [39], cá mập [10], sụn gà [41],[47], sụn bò [26], khí quản vịt [46]

15

Ngoài ra cũng cố khá nhiều nghiên cứu về khả năng hấp thu cs vào cơ thể, nhu M Morrison và các cộng sự (1977) đã khảo sát sự hấp thu cs qua đường uống Kết quả cho thấy khả năng hấp thu phụ thuộc vào cấu trúc, tính chất sinh hóa, ttọng lượng phân tử cs cố trong chế phẩm Quá trinh thủ nghiệm lâm sàng trên chuột và chố, thì tất cả đều cho kết quả tỷ lệ hấp thu cao hơn 70% [14]

Tại Việt Nam, các nhà nghiên cứu Võ Hoài Bắc, Đỗ Ngọc Tú cùng các cộng sự (2010) [11] đã nghỉên cứu thủy phân sụn cá đuối và cá mập bằng enzyme protease ngoại bào của 3 chủng vi khuẩn B26, Bio2, MF34 Nhóm tác giả đã nghiên cứu điều kiện trích ly tối ưu cs bởi từng loại protease của 3 chùng vi khuẩn trên, cho kết quả protease của chủng B26 và MF 34 có hoạt tính cao nhất tại pH 8,5; nhiệt độ 50°C, của chủng Bio 2 tại pH 7,5;

ở 40°C Hàm lượng cs trong sụn cá nhám (Carcharhinus Sorrah) theo từng chủng vi khuẩn khác nhau đạt khoảng 8,6%, hàm lượng cs có ttong sụn cá đuối (Dasyatis Kuhỉỉỉ) đạt khoảng 6,02% trong điều kiên 40 - 50°C Đây là nghiên cứu duy nhất về cs trong sụn cá nhám và cá đuối của Việt Nam

Hình 2.8: Sụn ức gà: khỉ còn mô và mỡ (a) và sau khi được làm sạch (b)

Sụn ức gà là phần sụn được lấy từ phần chóp của bộ xương ức gà, được thu mua tại công ty Phạm Tôn, quận Gò vấp, thành phố Hồ Chí Minh

Sụn được tách khỏi bộ xương úc, thu mua ngay tại lò giết mổ ở điều kiện nhiệt độ lạnh, đóng vào các bao PE kín khoảng 5kg, sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm Tiến hành ngâm rửa sụn gà trong dung dịch muối NaCl 5%, đồng thời loại bỏ lớp lipid, bụi bẩn bám bên ngoài hoặc sụn không đạt chỉ tiêu Để ráo sụn và đóng bao bì PE lkg, cho vào tủ

16

đông bảo quản ở điều kiện -18°c

2.3 Chăn nuôi ở Việt Nam

2.3.1 Tình hình chăn nuôi

Tình hình chăn nuôi gia cầm ở nước ta ngày càng phát triển mạnh và rộng khắp cả nước vói số lượng đàn và tổng số lượng con ngày một gia tăng Các trang trại chăn nuôi gia cầm tập trung chủ yếu ở khu vực Bắc Trung Bộ và Duyên Hải Miền Trung, Đồng Bằng Sông Hồng và Trung Du Miền Núi Phía Bắc (ưên 20%), phân bố thấp ở Đông Nam Bộ (5%)

và Tây Nguyên (7%) Nguyên nhân là do điều kiện khí hậu và đặc trưng nền kinh tế mỗi vùng [69]

Theo số liệu thống kê của cục chăn nuôi, năm 2001 tổng đàn gia cầm là 158,03 triệu con, năm 2002 là 180 triệu con, năm 2003 là 185,22 triệu con Do dịch cúm gia cầm, năm

2004, đàn gia cầm giảm 159,23 triệu con bằng 86,2% so với năm 2003 Năm 2005, đàn gia cầm đạt 159,89 triệu con Từ năm 2005 đến 2015, đàn gia cầm tiếp tục tăng nhanh Năm

2015, đàn gia cầm nước ta có 341,96 triệu con trong đó đàn gà có 273,9 triệu con, chiếm 80,1% so vói tổng đàn gia cầm Năm 2016, đàn gia cầm cả nước đạt 356,72 triệu con và cuối năm 2017 có 385,46 triệu con Theo như kế hoạch phát triển của cục chăn nuôi, đến năm 2020, số lượng đàn gia cầm ước tính khoảng 397,9 triệu con

Hình 2.9: Biểu đồ ước tính sản lượng chăn nuôi gia cầm qua các năm

(Nguồn: http://hoichannuoi mard gov vn)

Qua biểu đồ ước tính sản lượng chăn nuôi gia cầm hình 2.9, ta thấy được tình hình chăn nuôi gia cầm nói chung, đàn gà nói riêng đang phát triển nhanh chóng

2.3.2 Tình hình tiêu thụ thịt gà ở Việt Nam

Lượng tiêu thụ thịt gia cầm trong nước cũng tăng mạnh qua các năm Qua đó ta thấy được nhu cầu của người tiêu dùng ngày càng tăng Năm 2005 lượng tiêu thụ là 322 ngàn tấn đến năm 2015 tiêu thụ 862 ngàn tấn, sau 10 năm lượng tiêu thụ tăng đến 267,7% [69]

17

Hình 2.10: Tình hình tiêu thụ thịt gà (năm 1997 - 2015) Bảng 2.2: Lượng thịt gà nhập khẩu vào Việt Nam năm 2012 - 2015 [69]

Lượng thịt gà (Đơn vị: Ngàn tấn) 39,5 49,6 80,3 124,4

Từ năm 2005 trở về trước, nguồn thịt gia cầm tiêu thụ ở Việt Nam hầu hết trong nước, lượng nhập khẩu tăng mạnh vào năm 2008, lên khoảng trên 80 ngàn tấn Từ đó đến nay dao động trong khoảng 35 - 50 ngàn tấn/năm

Trong 6 tháng đầu năm 2015, theo bài viết “Nhập khẩu gần 42 ngàn tấn thịt gà từ Mỹ” đãng trên “baohaiquan.vn”, tổng lượng thịt gà nhập khẩu là 69,8 ngàn tấn, chủ yếu từ

Mỹ, Brazil và Hàn Quốc (gần 100% gà nguyên con được nhập từ Hàn Quốc, trong khi 98% đùi gà được nhập từ Mỹ; còn 70% cánh gà được nhập từ Brazil), ba quốc gia này chiếm trên 80% tổng lượng thịt gà nhập khẩu cả nước [70]

Qua đó ta thấy được xu hướng chọn thịt gà để cung cấp đạm động vật cho bữa ăn hàng ngày vì nhiều chất dinh dưỡng, giá thành rẻ, tiết kiệm chi phí đã mở ra một thị trường đầy tiềm năng Thêm vào đó, lợi nhuận từ chăn nuôi gà trong những năm qua đã thu hút và tạo sự cạnh tranh gay gắt giữa nhiều doanh nghiệp trong và ngoài nước

18

Hình 2.11: Bột thịt xương (a) và bột lông vũ (b)

Bên cạnh đó, nguồn phụ phẩm từ gà đặc biệt là ống khí quản hoặc sụn ức gà có chứa những hợp chất hữu cơ bổ sung vào thực phẩm chức năng như: Chondroitin sulfate, Hyaluronic acid, Glucosaminoglycans tăng cường hỗ trợ và điều trị bệnh khớp, giúp nâng cao giá ừị sử dụng

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào nguồn phế phẩm sụn ức gà, nguồn nguyên liệu chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều tại Việt Nam mà chỉ được xem như

là chất độn để tăng giá thành sản phẩm trên thị trường

2.4 Tổng quan về phương pháp thu nhận cs thô

2.4.1 ứng dụng của sóng siêu âm thu nhận cs thô

2.4.1.1 Tác động sinh học của sóng siêu âm

Sóng siêu âm sử dụng trong quá tình trích ly rắn - lỏng có 3 tác động sinh học chính lên nguyên liệu như sau:

- Tạo rung: Chuyển động của sóng siêu âm tạo ra rất là nhanh, tác động lên các mô tế bào

Hình 2.12: Nguyên lý tạo và vỡ bọt khí

Hình 2.12 cho thấy cơ chế sự hình thành, lớn lên và nổ vỡ các bong bóng khí trong pha lỏng: Khỉ sống âm gặp chất lỏng, sẽ tạo ra những chu kì gồm 2 pha giãn và nén liên tục, làm xuất hiện bong bóng khí trong pha lỏng [67]

- Trong pha giãn: khí bên ngoài bong bóng được khuếch tán vào bên ưong

- Trong pha nén: bong bóng co lại và khí bị hấp thụ ngược ttở lại

Mặt khác các phân tử khí lại tiệp tục bị hấp thụ vào chất lỏng nên kích thước của bong bóng lớn dần qua các chu kì giãn và nén Khi đạt kích thước tối đa, bong bóng nổ vỡ, nhiệt độ có thể đạt 5000°C và áp suất 2000ats

Hiện tượng tạo bong bóng làm tầng quá trình truyền nhiệt và truyền khối trong pha lỏng, tăng cường sự tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi, đồng thời tăng sự khuếch tán các chất hòa tan từ nguyên liệu vào dung môi, làm gia tăng hiệu quả trích ly Mặt khác ở bề mặt pha lỏng - rắn xuất hiện sủi bọt khí, tạo ra các vi tia chất lỏng; nếu các vi tia này hướng đến bề mặt nguyên liệu rắn, có thể tạo ra vết rạn nứt và vỡ nguyên liệu, gây ra sự khuấy trộn lớn, làm các hạt pha rắn va chạm mạnh với nhau, gây bào mòn bề mặt hạt nguyên liệu [67]

Tóm lại, quá trình siêu âm gây ra hiện tượng xâm thực khí, sẽ làm cho nguyên liệu

bị rạn nứt hoặc giảm kích thước, gia tăng sự tiếp xúc nguyên liệu với dung môi, tăng khuếch

Lũiili tliãiili

5000 - c

2000 a»s

bọi kĩú húi dẫu

20

tán các chất hòa tan dẫn đến tăng động lực của quá trình trích ly

2.4.1.2 Các yếu tô ảnh hưởng đến khả nâng hình thành vã bóng

Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình và hiệu quả trích ly bằng sóng siêu âm Chúng bao gồm các thông số liên quan đến:

- Âm trường: tần số sóng âm, cường độ âm, mật độ năng lượng âm

- Nguyên liệu thô: cấu trúc, mức phá vỡ, loại và số lượng các chất trích ly

- Đặc tính vật lý dung môi cũng như điều kiện khảo sát các yếu tố: thời gian, nhiệt độ,

pH đệm

2.4.2 ứng dụng của hệ enzyme protease để thu nhận cs thô

2.4.2.1 Khái quát về protease

Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide (- co - NH -) của các peptide hoặc protein Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết ester và vận chuyển amino acid

Các protease có nguồn gốc động vật cũng đã được nghiên cứu nhiều như trypsin, chymoừypsin, pepsin và rennin từ tuyến tuỵ, dạ dày Nhiều protease thực vật như Papain từ nhựa của thân, lá, quả đu đủ (Carica papaya); Bromelain từ quả, đọt và chồi dứa

(Ananas sativa); đã được nghiên cứu và thu nhận So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt, là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách

ra dưới dạng tinh thể đồng nhất nên chúng thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng [37], [38]

2.4.2.2 Phân loại protease

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.c.3.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzyme

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase Các endoprotease cắt các liên kết peptide bên trong các chuồi polypeptide, trong khi các exopeptidase cắt tùng amino acid ở cuối mạch [37]

21

Hình 2.13: Sơ đồ phân loại protease

- Dựa vào vị trí tác động trên mạch polỉpeptỉde, exopeptidase được phân chia thành

2 loại:

+ Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acỉd amin, một dỉpeptide hoặc tripepti.de

+ Carboxypeptide: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu c cùa chuỗi polypeptide

và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide

- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhổm [37]:

+ Serin proteinase: Gồm các loại protease có các acid amin như acid asparaginic, histidine và serine trong trung tâm hoạt động Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: Chymotrypsin và subtilisin Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính

và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và protein kí sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspatic proteinase: Hầu hết thuộc nhóm pepsin, bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl ttong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: trung tâm hoạt động chứa ion kim loại và trực tiếp tham gia quá trình xúc tác Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

24.2.3 Cor chẽ xúc tác của protease

Hình 2.14: Cơ chế xúc tác của protease

Cơ chế xúc tác của enzyme protease có thể chia làm 3 giai đoạn [37]:

- Giai đoạn đầu: enzyme protease sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức họp ES Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng (v) phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất

- Giai đoạn 2: Phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất

- Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do Hiện tượng này được xem xét trên cơ sở phàn ứng chỉ có một cơ chất duy nhất Nếu nồng độ cơ chất vượt quá ngưỡng cực đại của tốc độ phản ứng thì tốc độ phàn ứng không có khả năng tầng lên Ở gỉaỉ đoạn này các enzyme đã bão hòa cơ chất do đó nó không thể cố tốc độ phản ứng cao hơn được nữa

2.4.2A ứng dụng của enzyme protease

Enzyme Protease được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực [37]:

- Công nghiệp thực phẩm: đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng

23

chất lượng sản phẩm ttong sản xuất bia, nước mắm

- Y học: Protease thủy phân protein thành các acid amin, có lọi cho tiêu hóa, làm chất giảm đau nhanh sau khi phẫu thuật, giảm đau đối với trường hợp viêm khớp, viêm

đa khớp, giảm thời gian tan các vết bầm và chống viêm Dung dịch papain cysteine salicilate có công dụng chữa bỏng, giảm độc tố, trị bệnh bạch cầu và viêm họng Sản xuất chất tẩy rửa: protease bổ sung vào chất tẩy rửa ừên thị trường đều là serine protease, có tính đặc hiệu cơ chất rộng và hoạt động tốt trong điều kiện pH và nhiệt độ

- Công nghiệp thuộc da: protease sẽ tách các chất nhờn và làm cắt ngắn phân tử collagen, loại bỏ khỏi da các chất nhớt, làm mềm da, rút ngắn thòi gian sản xuất

2.5 Tổng quan phương pháp tính sạch từ dung dịch cs thô

Modul: Một đơn nguyên trong đó được lắp các màng

Hình 2.15: Sơ đồ mô tả quá trình phân riêng bằng màng

Thành của tất cả các tế bào thực vật, động vật và tế bào của con người đều là những màng Những màng này giúp bảo vệ tế bào khỏi tác động bên ngoài, trao đổi chất của tế bào Chúng cho phép “chất” này thấm qua và giữ “chất khác” lại Chẳng hạn như da của con người và động vật cho phép oxy đi xuyên qua, thành ruột cho phép hấp thu các dinh dưỡng

và các tế bào thận có khả năng thải muối và các chất độc khác Quá trình truyền vận vật chất

24

qua thành tế bào là đặc biệt điển hình cho những quá trình truyền vận chọn lọc cao, chúng được xem như là màng tự nhiên [55]

Cũng tưorng tự như các màng tự nhiên, người ta cũng đã tổng hợp ra nhiều loại màng

từ nhiều loại vật liệu khác nhau, có cấu trúc khác nhau, sắp xếp và vận hành khác nhau tùy theo yêu cầu sử dụng chúng

trong đó gồm hàng ngàn sọi rỗng được ghép song song vói nhau [55], [56]

4- Độ chọn lọc

- Độ chọn lọc của màng, nghĩa là khả năng “phân riêng” các cấu tử khác nhau trong hỗn hợp ví dụ như rượu với nước, ion muối và nước,., của màng