Khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao điều trị bằng isoniazid và đánh giá ảnh hưởng của gen nat2 của bệnh nhân lao đến tính kháng thuốc isoniazid b

Nghiên cứu tại Nam Phi cho thấy mặc dù > 98% bệnh nhân tuân thủ điều trị nhưng tình hình kháng thuốc vẫn xảy ra và một nghiên cứu khác cũng khẳng định kháng thuốc không phải chỉ do không

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Vũ Thị Thơm

TS Phạm Thế Hải

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hà

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ của các Thầy Cô, nhà trường, cơ quan, gia đình và bạn bè

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới TS Vũ Thị Thơm,

TS Phạm Thế Hải là những người Thầy đã tận tình hướng dẫn khoa học, tạo điều

kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Lê Thị Luyến - chủ nhiệm đề tài, ThS Lê Anh Tuấn

- nghiên cứu sinh của đề tài Nghị định thư hợp tác nghiên cứu giữa Đại học Quốc gia

Hà Nội và Đại học Liverpool - Vương quốc Anh (Mã số HNQT/SPĐP/01.06), đã tạo điều kiện để tôi được tham gia nghiên cứu, hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các nhà khoa học trong hội đồng chấm đề cương và luận văn tốt nghiệp đã đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn

Tôi xin gửi lời biết ơn tới Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo sau đại học, các Thầy Cô Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia

Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học tập, nghiên cứu tại trường

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Các cán bộ Bộ môn Y Dược học cơ sở, Ban lãnh đạo Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội; các bác sĩ và nhân viên Bệnh viện Phổi Trung ương đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình hoàn thành luận văn Sự biết ơn đối với gia đình và bạn bè đã luôn sát cánh động viên và khích lệ tôi

Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới những bệnh nhân đã tham gia vào nhóm nghiên cứu, sự đóng góp của các bệnh nhân đã giúp tôi có thành công này

Hà Nội, ngày tháng năm

Nguyễn Thị Thu Hà

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về vi khuẩn lao 3

1.1.1 Hình thể, cấu trúc 3

1.1.2 Khả năng gây bệnh 4

1.1.3 Nuôi cấy vi khuẩn lao 5

1.2 Thuốc điều trị lao và lao kháng thuốc 6

1.2.1 Thuốc điều trị lao và phân loại lao kháng thuốc 6

1.2.2 Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao 7

1.2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tính kháng thuốc của

vi khuẩn lao 9

1.3 Isoniazid trong điều trị lao 10

1.3.1 Dược lý và chuyển hóa của Isoniazid 10

1.3.2 Gen liên quan đến chuyển hóa Isoniazid ở bệnh nhân lao 12

1.4 Đặc điểm của gen NAT2 và đa hình gen NAT2 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu nghiên cứu 16

2.1.1 Dụng cụ, trang thiết bị 16

2.1.2 Hóa chất, môi trường 16

2.2 Đối tượng nghiên cứu 17

2.2.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu 17

2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Cỡ mẫu 17

2.3.2 Thu thập mẫu bệnh phẩm 18

2.3.3 Quy trình nuôi cấy đờm trên môi trường lỏng BACTEC MGIT 18

2.3.4 Phương pháp kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một 20

2.3.5 Phân tích kiểu gen NAT2 để xác định kiểu hình acetyl hóa isoniazid 26

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 27

2.3.7 Đạo đức nghiên cứu y học 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao đối với thuốc kháng lao hàng một 29

3.1.1 Đặc điểm chung của quần thể bệnh nhân nghiên cứu 29

3.1.2 Tình hình kháng thuốc chống lao hàng 1 ở các bệnh nhân lao phổi 32

3.2 Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên người bệnh lao và mối ảnh hưởng đến tính kháng thuốc Isoniazid 40

3.2.1 Kết quả tối ưu quy trình phân tích NAT2 40

3.2.2 Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên người bệnh lao 42

3.2.3 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen NAT2 và tình hình kháng INH 47

KẾT LUẬN 50

KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Nhận định kết quả nuôi cấy MGIT 19

Bảng 2.2: Nồng độ thuốc và ngưỡng kháng thuốc kháng lao hàng 1

trên môi trường đặc 22

Bảng 2.3: Hướng dẫn pha dung dịch thuốc (1) 23

Bảng 2.4: Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc dựa vào khuẩn lạc 25

Bảng 2.5: Đánh giá tính kháng thuốc của vi khuẩn lao 25

Bảng 2.6: Thành phần tối ưu cho phản ứng nhân dòng gen NAT2 27

Bảng 3.1: Thông tin chung của quần thể nghiên cứu 29

Bảng 3.2: Thời gian nuôi cấy và đơn vị sinh trưởng của vi khuẩn lao 32

Bảng 3.3: Tỷ lệ kháng thuốc ở nhóm lao mới và lao tái trị 34

Bảng 3.4: Kết quả kháng sinh đồ với từng thuốc chống lao hàng một 36

Bảng 3.5: Tần số phân bố allen NAT2 ở nhóm lao mới và lao tái trị 43

Bảng 3.6: Tần số phân bố kiểu gen NAT2 ở nhóm lao mới và lao tái trị 44

Bảng 3.7: Mối liên quan giữa kiểu hình chuyển hóa với thể lao 45

Bảng 3.8: Tần số kiểu hình acetyl hóa NAT2 ở các vùng trên thế giới 46

Bảng 3.9: Mối liên quan kiểu hình chuyển hóa với tính kháng INH 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: M tuberculosis nhuộm Ziehl - Neelsen, vật kính dầu 100x 3

Hình 1.2: Hình ảnh M.tuberculosis nuôi cấy trên môi trường đặc [23], [59] 5

Hình 1.3: Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao 9

Hình 1.4: Chuyển hóa Isoniazid ở gan [39] 11

Hình 1.5: Vị trí gen NAT2 trên NST số 8 14

Hình 2.1: Sơ đồ thu mẫu và luân chuyển mẫu tại 3 bệnh viện 18

Hình 2.2: Hệ thống BACTEC MGIT 960 19

Hình 2.3: Kháng sinh đồ PZA 21

Hình 2.4: Chuẩn bị huyền dịch làm kháng sinh đồ đặc 24

Hình 3.1: Biểu đồ dinh dưỡng theo BMI của hai nhóm bệnh nhân 31

Hình 3.2: Một số hình ảnh kết quả kháng sinh đồ trên môi trường đặc 33

Hình 3.3: Biểu đồ tỷ lệ số thuốc kháng mỗi loại 34

Hình 3.4: Kết quả DNA tổng số tách chiết điện di trên gel agarose 1,2% 41

Hình 3.5: Kết quả nhân dòng gen NAT2 của một số mẫu theo điều kiện tối ưu 41

Hình 3.6: Kết quả đọc kiểu gen NAT2 42

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFB Vi khuẩn kháng cồn kháng axit (Acid Fast Bacilli)

BMI Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index)

EMB Ethambutol

INH Isoniazid

LJ Lowenstein-Jensen

MTB Vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis)

MDR-TB Lao đa kháng thuốc (Multi Drug Resistant Tuberculosis) MDR/RR-TB Lao đa kháng hoặc Lao kháng Rifampicin

(Multi Drug Resistant - Rifampicin Resistant - Tuberculosis) MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube

WHO Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh lao là một bệnh truyền nhiễm có tính lây nhiễm cao, diễn biến lâm sàng phức tạp và thời gian điều trị kéo dài Theo thống kê của WHO (2018), với sự nỗ lực không ngừng của toàn thế giới, từ năm 2000 đến 2018 ước tính có khoảng 53 triệu người đã được phát hiện và điều trị lao giúp giảm tỷ lệ tử vong do lao xuống còn 37% Mặc dù đã được tập trung kiểm soát, bệnh lao vẫn là một trong 10 nguyên nhân tử vong hàng đầu và là nguyên nhân tử vong số 1 do bệnh truyền nhiễm (trên

cả HIV) Việt Nam là một trong những điểm nóng của bệnh lao, đứng thứ 14 trong

số 30 nước có gánh nặng cao do lao (WHO, 2018) Năm 2017, tổng số trường hợp mắc lao được báo cáo ở Việt Nam là 105.733 bệnh nhân trong số đó có khoảng 80%

là bệnh nhân lao phổi mới mắc và tái nhiễm Mặc dù trên toàn thế giới, tỷ lệ mắc lao đang giảm đi khoảng 2% mỗi năm nhưng đến nay bệnh lao vẫn còn là vấn đề thách thức do sự phát triển và lan rộng của lao kháng thuốc Bệnh nhân mang lao kháng thuốc thường có thời gian điều trị kéo dài, tốn kém Ở Việt Nam theo ước tính trung bình chi phí cho một bệnh nhân lao đa kháng thuốc khoảng gần 400 USD cao hơn nhiều so với chi phí hơn 150 USD cho bệnh nhân lao thông thường Theo thống kê mới nhất của WHO, trên toàn cầu 3,5% trường hợp lao mới và 18% trường hợp lao tái trị có kháng Rifampicin hoặc đa kháng Rifampicin và Isoniazid (MDR/RR-TB)

Ở Việt Nam con số này ước tính tương ứng là 4,1% và 17% Tuy nhiên đây chỉ là con số ước tính vì chỉ có khoảng 32%-67% được thực hiện đánh giá tính kháng thuốc với Rifampicin (WHO, 2018) Trong các thuốc chống lao hàng một, ngoài Rifampicin và Isoniazid là hai thuốc quan trọng nhất trong các phác đồ điều trị lao còn có Streptomycin, Ethambutol, Pyrazinamid Trong những năm gần đây, tình hình kháng thuốc với 3 loại thuốc này ít được quan tâm, báo cáo Việc chỉ tập trung vào hai thuốc quan trọng nhất là Rifampicin và Isoniazid có thể bỏ qua các biến động đáng chú ý về tình hình kháng thuốc của ba thuốc này

Theo hướng dẫn của WHO cũng như của Bộ Y tế, Isoniazid được dùng trong hầu hết các đối tượng bệnh nhân lao theo tuổi, giới, trong các phác đồ điều trị bệnh nhân lao mới, lao tái trị và kể cả điều trị dự phòng lao Isoniazid được chuyển hóa bởi

enzyme NAT2 tại gan Đa hình di truyền gen NAT2 được biết đến có liên quan chặt

chẽ tới đáp ứng Isoniazid trên các bệnh nhân mắc lao Nghiên cứu tại Nam Phi cho thấy mặc dù > 98% bệnh nhân tuân thủ điều trị nhưng tình hình kháng thuốc vẫn xảy

ra và một nghiên cứu khác cũng khẳng định kháng thuốc không phải chỉ do không tuân thủ điều trị mà còn do sự khác biệt về dược động học của thuốc giữa các cá thể Mặt khác một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng yếu tố di truyền của bệnh nhân cũng có thể là một trong những yếu tố nguy cơ đối với việc việc lây nhiễm vi khuẩn lao

Tại Việt Nam, việc chẩn đoán lao kháng thuốc thật sự còn là vấn đề hết sức khó khăn tại các bệnh viện, kể cả những bệnh viện tuyến Trung ương Chỉ một số lượng nhất định bệnh nhân được chỉ định làm kháng sinh đồ và thời gian này mất khoảng 2-3 tháng mới có kết quả do vi khuẩn lao sinh trưởng tương đối chậm trong quá trình nuôi cấy Hiện nay một số các test phân tử được áp dụng để chẩn đoán nhanh lao kháng thuốc là Hain test hay Xpert MTB/RIF Tuy nhiên, các xét nghiệm này giá thành khá cao và không được chỉ định rộng rãi Hơn nữa các kit thương mại này mới chỉ đánh giá được lao kháng Rifampicin, Isoniazid chứ chưa đánh giá được với các thuốc khác trong thuốc kháng lao hàng một Từ thực tiễn chẩn đoán và điều trị lao, với mục tiêu xác định được tính kháng thuốc của các thuốc chống lao hàng một và tiên lượng nguy cơ mắc vi khuẩn lao kháng thuốc Isoniazid liên quan đến

yếu tố di truyền gen NAT2 ở bệnh nhân lao phổi, chúng tôi đề xuất đề tài “Khảo sát

tính kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao điều trị bằng

Isoniazid và đánh giá ảnh hưởng của gen NAT2 của bệnh nhân lao đến tính

kháng thuốc Isoniazid”

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được tính kháng thuốc của vi khuẩn lao với các thuốc chống lao hàng một trên bệnh nhân lao phổi;

Xác định được đa hình di truyền gen NAT2 và mối liên quan tới tính kháng thuốc Isoniazid của vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao phổi

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về vi khuẩn lao

1.1.1 Hình thể, cấu trúc

Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales,

phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, chi Mycobacterium, gồm hơn

169 loài, đa phần không gây bệnh cho người Nhóm vi khuẩn gây bệnh lao cho

người được gọi là nhóm Mycobacterium tuberculosis complex (MTBc) gồm có các loài chính như Mycobacterium tuberculosis (trực khuẩn lao người), Mycobacterium bovis (trực khuẩn lao bò), Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti Trong

đó quan trọng nhất là loài Mycobacterium tuberculosis[64]

Mycobacterium được gọi là trực khuẩn kháng cồn kháng acid, được Robert Koch phân lập năm 1882, gọi tắt là BK (Bacille de Koch) M tuberculosis là trực

khuẩn thanh mảnh, hơi cong, kích thước 0,5 x 2-6 µm Chúng không có vỏ, không

có lông và không có nha bào Trong bệnh phẩm chúng thường đứng thành từng đám

nối đầu vào nhau Thành tế bào của M tuberculosis chỉ chứa một lượng nhỏ

peptidoglycan, nhưng chứa nhiều lipid tạo nên tính kháng cồn - kháng acid, và làm cho vi khuẩn lao không nhuộm được bằng phương pháp thông thường mà phải nhuộm bằng phương pháp Ziehl - Neelsen (hình 1.1) [15]

Hình 1.1: M tuberculosis nhuộm Ziehl - Neelsen, vật kính dầu 100x

1.1.2 Khả năng gây bệnh

1.1.2.1 Độc lực và con đường lây truyền

Trực khuẩn lao không có ngoại độc tố và nội độc tố Độc lực của vi khuẩn

lao có thể liên quan đến yếu tố sợi và lớp sáp ở vách tế bào Các chủng lao độc lực

có chứa nhiều yếu tố sợi có bản chất hóa học là 6,6’-dimycoly trehalose Yếu tố sợi này làm vi khuẩn lao gắn với nhau thành bó và khi mất đi sẽ làm giảm độc lực Vi khuẩn lao có thể sống sót trong đại thực bào sau khi bị thực bào Vi khuẩn lao phát triển trong đại thực bào, phá vỡ tế bào và xâm nhập đại thực bào khác [15]

Bệnh lao lây chủ yếu qua đường hô hấp Người bị nhiễm lao do hít phải những giọt đờm (đường kính 1 - 5 μm) có chứa vi khuẩn lao từ bệnh nhân lao ho, hắt hơi vào không khí Các vi khuẩn khi qua được hàng rào thứ nhất của cơ thể sẽ ở lại phế nang và tiến triển thành viêm phế quản phổi với phần lớn các trường hợp có triệu chứng không rõ ràng Vi khuẩn cũng có thể lây nhiễm sang thai nhi bằng đường máu qua tĩnh mạch rốn nếu mẹ bị lao cấp tính hoặc qua nước ối khi chuyển

dạ nếu mẹ bị lao niêm mạc tử cung, âm đạo Đôi khi, đường lây khác có thể là

đường tiêu hóa khi uống sữa bò bị bệnh do M bovis Từ cơ quan bị lao ban đầu,

trực khuẩn lao theo đường máu và bạch huyết đến các cơ quan khác để gây bệnh (lao hạch, lao mang não lao xương) Tuy nhiên, con đường truyền bệnh quan trọng nhất với bệnh lao là đường hô hấp [11], [15]

1.1.2.2 Cơ chế gây bệnh

Bệnh lao là một loại bệnh nhiễm trùng bên trong tế bào và tiến triển mạn tính Vi khuẩn lao khi xâm nhập vào phế nang sẽ bị các đại thực bào tiêu diệt một phần Những tế tào không bị đại thực bào tiêu diệt sẽ tiếp tục nhân lên trong đại thực bào và dần thành nang lao Nếu các nang lao vỡ ra vi khuẩn lao lây nhiễm rộng, sinh sản và bệnh lao xuất hiện

Khi tiếp xúc lần đầu với vi khuẩn lao thì một phản ứng viêm cấp tính nhẹ ở phổi xuất hiện Sau khi vi khuẩn lao bị thực bào, ở người có đáp ứng miễn dịch tế bào đầy đủ, sau 4 - 6 tuần lymphokin được sản xuất, hoạt hóa đại thực bào giết

chết vi khuẩn lao Cơ thể sinh ra đáp ứng quá mẫn muộn với vi khuẩn lao, kết quả

là hình thành u hạt Tiếp theo là hoại tử ở trung tâm, bã đậu hoá, xơ hoá và hình thành sẹo Sau khi liền tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao vẫn không bị diệt hoàn toàn Chúng có thể tồn tại mãi trong cơ thể dưới dạng không hoạt động, những người nhiễm lao thường chỉ biểu hiện ở test tuberculin (+) và không có khả năng lây nhiễm Ở những người này có khoảng 10% vi khuẩn lao tái hoạt động trở thành người mắc lao Ngoài ra các yếu tố nguy cơ đối với việc mắc lao như: tuổi trẻ, bệnh đi kèm như đái tháo đường, bụi phổi, HIV, phụ nữ có thai, yếu tố cơ địa - yếu tố gen [11]

1.1.3 Nuôi cấy vi khuẩn lao

Để chuẩn đoán xác định có nhiều phương pháp cận lâm sàng như nhuộm Ziehl-Neelsen tìm AFB, Xpert MTB/RIF, nuôi cấy… trong đó xét nghiệm nuôi cấy

vi khuẩn lao là tiêu chuẩn vàng

Vi khuẩn lao thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37oC và dưới

áp suất của oxy là 100 mmHg Đây là một trong những lý do giải thích tại sao lao phổi là thể bệnh gặp nhiều nhất Vi khuẩn lao không nuôi được ở môi trường thông thường, phải nuôi ở môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng (hình 1.2)

a Khuẩn lạc được phóng đại b Khuẩn lạc trên LJ

Hình 1.2: Hình ảnh M.tuberculosis nuôi cấy trên môi trường đặc [24], [60]

Vi khuẩn lao mọc rất chậm, thời gian phân chia khoảng 20-24 giờ một lần trên môi trường thử nghiệm Trên môi trường Lowenstein- Jensen (LJ, gồm chủ yếu khoai tây, lòng đỏ trứng gà, asparagin, glycerin 0,75%), sau 4-6 tuần vi khuẩn lao mới hình thành khuẩn lạc điển hình Khuẩn lạc dạng R, sần sùi như hình hoa lơ Trên môi trường lỏng (canh thang Sauton, Middlebbrook 7H9, 7H12) vi khuẩn lao mọc thành váng, đám hoặc lắng cặn Hiện nay trên môi trường thương mại Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) dạng lỏng nuôi cấy vi khuẩn lao có thể cho kết quả dương tính sau 3-13 ngày[15]

1.2 Thuốc điều trị lao và lao kháng thuốc

1.2.1 Thuốc điều trị lao và phân loại lao kháng thuốc

Hiện nay, trong thực tế điều trị, người ta phân loại 2 nhóm thuốc trị bệnh lao, thường gọi là “thuốc kháng lao hàng 1” và “thuốc kháng lao hàng 2” [18]:

Kháng lao hàng 1 gồm: Bao gồm Streptomycin (viết tắt là SM hay S), Rifampicin (viết tắt RIF hay RMP hay R ), Isoniazid (INH hay H), Pyrazinamid (PZA hay Z) và Ethambutol (EMB hay E) Đây là các thuốc được lựa chọn đầu tiên

để điều trị cho bệnh nhân bị lao

Kháng lao hàng 2 gồm nhiều thuốc, chia làm 4 nhóm A, B, C, D: Nhóm A gồm các thuốc thuộc nhóm kháng sinh Fluoroquinolones như Levofloxacin, Moxifloxacin, Gatifloxacin Nhóm B là các thuốc tiêm hàng hai như Amikacin, Capreomycin, Kanamycin Nhóm C là các thuốc hàng hai chủ đạo khác như Ethionamide, Cycloserin, Clofazimine, Linezolid, Prothionamide Nhóm D là các thuốc bổ sung, không thuộc nhóm chủ đạo như: Isoniazid liều cao, Pyrazinamide, Ethambutol, Bedaquiline, Meropenem [18] Đây là các thuốc được dùng khi bệnh nhân bị kháng với thuốc lao hàng một, hay dùng trong một số trường hợp đặc biệt Các thuốc này thường có nhiều tác dụng phụ hơn và việc sử dụng thuốc cũng phức tạp hơn thuốc kháng lao hàng một Ngoài ra, giá thành của các thuốc kháng lao hàng hai cũng đắt hơn rất nhiều Nhận diện nhanh các chủng kháng thuốc, đặc biệt

là các chủng kháng RMP và INH, sẽ tạo điều kiện để áp dụng kịp thời các biện pháp điều trị thích hợp; và điều này là vô cùng quan trọng trong giảm sự lan truyền của các chủng kháng thuốc

Có thể phân loại lao kháng thuốc dựa vào tính kháng các loại thuốc chống lao hàng một như sau[18]: Nếu vi khuẩn kháng một loại trong các loại thuốc kháng lao hàng một mà không phải là Rifampicin thì được gọi là kháng một loại thuốc Nếu vi khuẩn lao kháng với trên một loại thuốc chống lao hàng một nhưng không kháng Rifampicin thì được gọi là kháng nhiều loại thuốc Nếu vi khuẩn kháng Rifampicin, có hoặc không kháng thêm các thuốc khác trừ Isoniazid thì được gọi là kháng Rifampicin Vi khuẩn kháng đồng thời với ít nhất hai thuốc chống lao là Isoniazid và Rifampicin thì được gọi là lao đa kháng thuốc (MDR-TB)

Dựa trên tính kháng thuốc với các thuốc chống lao hàng hai để phân loại lao siêu kháng thuốc Lao tiền siêu kháng: Lao đa kháng có kháng thêm với bất cứ thuốc nào thuộc nhóm Fluoroquinolone hoặc với ít nhất một trong ba thuốc tiêm hàng hai Capreomycin, Kanamycin, Amikacin Lao siêu kháng thuốc (XDR-TB): Lao đa kháng có kháng thêm với bất cứ thuốc nào thuộc nhóm Fluoroquinolone và bất cứ thuốc nào trong ba thuốc tiêm hàng hai (Capreomycin, Kanamycin, Amikacin)

Ngoài ra còn có phân loại bệnh nhân lao theo tiền sử điều trị:

- Lao mới là người bệnh lao chưa bao giờ dùng thuốc chống lao hoặc dùng thuốc dưới một tháng Lao phổi mới là bệnh nhân lao mới mắc thể lao phổi

- Lao tái trị là người bệnh lao đã dùng thuốc chống lao từ một tháng trở lên

có thể là người bệnh đã điều trị khỏi lao từ lần trước hoặc điều trị thất bại trước đây

do nhiều nguyên nhân Lao phổi tái trị là bệnh nhân lao tái trị mắc thể lao phổi

Trong lao tái trị người bệnh có thể tái nhiễm ngoại sinh (chủng vi khuẩn khác với chủng vi khuẩn ban đầu) hoặc do tái phát (chủng vi khuẩn giống với chủng

vi khuẩn ban đầu) [64], [21]

1.2.2 Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao

Kháng thuốc là hiện tượng giảm độ nhạy cảm của vi khuẩn lao với thuốc

điều trị lao in vitro với nồng độ vừa đủ hợp lý của một vài chủng kiểm tra so với chủng hoang dại chưa từng tiếp xúc với thuốc điều trị lao [53]

Kháng thuốc tiên phát là kháng thuốc xảy ra ở một bệnh nhân trước đó chưa

sử dụng một liệu pháp điều trị chống lao nào; kháng thuốc thứ phát là kháng thuốc sau khi bệnh nhân lao đã có tiếp xúc với thuốc Kháng thuốc tự nhiên là tính kháng

thuốc của chủng kiểu dại Ví dụ như M.tuberculosis kháng tự nhiên với penicilin

[43] Tỷ lệ vi khuẩn lao kháng thuốc tự nhiên khác nhau tùy từng loại loại thuốc đặc hiệu: Rifampicin là 1/108, Isoniazid là 1/106, Streptomycin và Ethambutol là 1/105 Trong quá trình nhân lên của vi khuẩn tính kháng thuốc sẽ được phát sinh do các đột biến ngẫu nhiên Khi không có mặt của thuốc, các chủng mẫn cảm sẽ phát triển lấn áp các chủng có đột biến khác Khi có mặt của thuốc sẽ tạo thành áp lực chọn lọc và chủng đột biến kháng thuốc sẽ trở nên ưu thế và và lây lan sang người khác làm cho người bị nhiễm vi khuẩn lao này sẽ kháng thuốc ngay từ đầu [43]

Cơ chế kháng thuốc ở vi khuẩn lao cũng giống như cơ chế kháng kháng sinh

ở các loại vi khuẩn khác do sự hạn chế xâm nhập của kháng sinh vào bên trong thành tế bào hoặc sản xuất ra các men (enzzyme) để phá hủy kháng sinh hoặc che chắn hay làm biến đổi đích tác động của kháng sinh và làm kháng sinh mất hiệu lực

Ở 70-80% vi khuẩn lao kháng INH người ta nhận thấy có sự biến đổi ở gen katG

làm giảm hoặc mất hoạt tính men catalase-peroxidase do đó sẽ làm giảm hoặc mất tác dụng của INH đối với vi khuẩn lao [5] INH sẽ mất khả năng ức chế sự tổng hợp axit mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao vì vậy mà vi khuẩn lao sẽ kháng

thuốc Đối với RMP, vi khuẩn lao kháng RMP có chứa đột biến gen rpoB làm cho

RMP mất khả năng ức chế men RNA-polymeraza của vi khuẩn lao Tùy từng loại thuốc với cơ chế tác động khác nhau sẽ có cơ chế kháng thuốc khác nhau Cơ chế kháng một số thuốc của vi khuẩn lao được trình bày trong hình 1.3

Hình 1.3: Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao

1.2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tính kháng thuốc của vi khuẩn lao

Theo WHO, năm 2014 số lượng ước tính của các ca nhiễm đa kháng thuốc (MDR/RR-TB) và siêu kháng thuốc (XDR-TB) trong số bệnh nhân nhiễm mới là 480.000, nhưng chỉ khoảng 25% trong số này được chẩn đoán và báo cáo Trong năm

2014, ước tính có 190.000 người chết vì MDR-TB Đến năm 2015, đã có báo cáo xuất hiện XDR-TB ở 105 quốc gia; khoảng 9,7% bệnh nhân nhiễm MDR-TB sẽ bị XDR-TB Và tính đến năm 2016 ước tính có khoảng 600.000 ca nhiễm MDR/RR-TB nhưng chỉ có 153.000 ca được báo cáo và 130.000 ca được điều trị [67]

Việt Nam nằm trong nhóm 30 quốc gia có gánh nặng lao đa kháng thuốc cao nhất thế giới, xếp thứ 14/27 quốc gia có số lượng bệnh nhân MDR-TB nhiều nhất, chiếm 1,7% toàn cầu (WHO, 2015) Bên cạnh đó, Việt Nam là 1 trong 20 quốc gia xảy ra 80% trường hợp nhiễm TB mới của thế giới Hiện tượng kháng thuốc đã được giám sát từ năm 1978, và tỉ lệ giảm dần đến năm 1998 Năm 1996-

1997 Việt Nam đã tham gia dự án nghiên cứu tình hình kháng thuốc lao trên toàn cầu của WHO cho thấy tỷ lệ kháng thuốc tiên phát khá cao 32,5% trong đó có cả

2,3% kháng đa thuốc Nghiên cứu năm 2005-2006 tỷ lệ kháng thuốc tiên phát có giảm nhưng không đáng kể 30,9%; kháng thuốc thứ phát ở bệnh nhân lao đã điều trị là 58,9% và đặc biệt là tỷ lệ đa kháng ở lao mới (kháng tiên phát) cũng không giảm 2,7% và ở bệnh nhân lao tái trị là 19.3% Vào năm 2006, tỉ lệ kháng thuốc lại tăng 12,52% so với năm 1978 (30,7% và 18,18%) Những nghiên cứu đơn lẻ của một số cá nhân quanh thời điểm này cũng cho thấy những kết quả kháng thuốc tương tự [3]

Lê Ngọc Hưng và cộng sự (2008) nghiên cứu 193 bệnh nhân lao phổi tái trị tại Bệnh viện Phổi trung ương cho thấy tỷ lệ kháng đa thuốc là 62,9% [8] Chu Thị Mão và cộng sự (2007) cũng tiến hành nghiên cứu trên bệnh nhân lao phổi mới cho thấy tỷ lệ lao đa kháng là 4% [9] Lê Thị Kim Hoa (2008) nghiên cứu trên bệnh nhân lao mới và lao tái trị cho thấy tỷ lệ đa kháng trên lao mới là 8,5% và trên lao tái trị là 40,3% [7] Trong các năm gần đây, tỉ lệ về tính kháng ít nhất 1 thuốc được báo cáo: ví dụ kháng INH là 16% - 25%, và tỉ lệ MDR-TB là 2%-4% đối với bệnh nhân điều trị lần đầu, 17%-18% với bệnh nhân điều trị tái trị Năm 2017, theo WHO, tại Việt Nam tỷ lệ ước tính lao kháng MDR/RR-TB ở thể lao mới là 4,1% và 17% ở thể lao tái trị Có thể thấy, tình hình kháng thuốc lao tại Việt Nam vẫn đang được theo dõi, tập trung nhiều vào nhóm vi khuẩn lao đa kháng thuốc

1.3 Isoniazid trong điều trị lao

1.3.1 Dược lý và chuyển hóa của Isoniazid

Isoniazid (viết tắt là INH), là một hydrazid của axit isonicotinic được tổng hợp lần đầu tiên ở Praha năm 1912 nhưng đến năm 1952 mới biết được tác dụng của INH với vi khuẩn lao Isoniazid có cấu trúc đơn giản chứa vòng pyridine và nhóm hydrazide có tác dụng kìm hãm sinh trưởng và diệt vi khuẩn lao trong và ngoài tế bào Cơ chế tác dụng của thuốc là thông qua sự ức chế hình thành axit mycolic có ở thành tế bào vi khuẩn lao [15] Tuy nhiên, INH cũng được phát hiện

là có thể bị kháng bởi M.tuberculosis liên quan tới các đột biến ở nhiều gen, bao gồm katG, ahpC, inhA, kasA, ndh INH là một tiền thuốc cần được hoạt hóa bởi

catalase/ peroxidase mã hóa bởi katG INH đã hoạt hóa sẽ can thiệp vào quá trình

tổng hợp một thành phần thiết yếu của vi khuẩn lao là mycolic acid bằng cách ức

chế NADH-dependent enoyl-ACP reductase được mã hóa bởi inhA Hai cơ chế

phân tử này chính là các nguyên nhân chính dẫn đến tính kháng Isoniazid: đột biến

trên katG và inhA

Sau khi uống, INH hấp thu qua ruột vào máu: 40% ở dạng tự do, một phần kết hợp với axit amin trong máu thành hydrazol; INH ở dạng tự do và hydrazol có tác dụng với vi khuẩn lao Phần còn lại sẽ được chuyển hóa ở gan tạo thành các hợp chất không có tác dụng với vi khuẩn lao Tại gan, 50% - 90% INH được acetyl hóa

bởi enzyme NAT2 như Hình 1.4 tạo thành acetyl Isoniazid, sản phẩm tiếp tục bị

thủy phân tạo thành acetyl hydrazine Một con đường khác là INH có thể bị thủy

phân trực tiếp tạo ra hydrazin Sau đó NAT2 xúc tác quá trình acetyl hóa của

hydrazin tạo acetyl hydrazin và diacetyl hydrazin INH, Acetyl hydrazine và hydrazin có thể bị oxi hóa bởi cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) tạo thành các hợp chất trung gian gây độc cho cơ thể Enzyme glutathione S-transferase (GST) có thể kết hợp với các chất trung gian này với glutathione và loại bỏ các chất chuyển hóa độc hại này Các chất chuyển hóa của INH được thải trừ ra khỏi cơ thể chủ yếu qua

hệ tiết niệu (chiếm 80%) Dưới 10% liều INH được đào thải qua phân [40]

CYP2E1: cytochrome P450 2E1; NAT2: N-Acetyltransferase 2

Hình 1.4: Chuyển hóa Isoniazid ở gan [40]

Nồng độ ức chế tối thiểu trong huyết thanh của INH với vi khuẩn lao là 0,04 µg/mL, hệ số vượt là 20 ở người có kiểu hình acetyl hóa nhanh và 62 ở người

có kiểu hình acetyl hóa chậm Nồng độ của INH trong huyết thanh của mỗi người khác nhau phụ thuộc vào kiểu hình acetyl hóa của cá thể Khi uống INH liều 5 mg/kg sau 1-2 giờ sẽ đạt nồng độ tối đa trong huyết tương là 3-5 µg/mL [15], [18]

Liều dùng hàng ngày của INH là 5 mg (4-6 mg)/kg thể trọng cho cả trẻ em

và người lớn, liều hàng ngày tối đa là 300 mg, nên uống một lần lúc đói Liều cách quãng 3 lần/tuần là 10 mg/kg thể trọng (8-12 mg), liều cách quãng 2 lần/tuần là 15 mg/kg thể trọng (13-17 mg) [10]

INH có thể gây các tác dụng phụ trên hệ thần kinh và gan Trên hệ thần kinh, INH có thể gây ra viêm dây thần kinh, co giật, viêm dây thần kinh thị giác, rối loạn tâm thần Tại gan, INH có thể gây viêm gan với các triệu chứng chán ăn, buồn nôn, nôn, mệt mỏi 10 – 20% bệnh nhân sử dụng INH có thể có nồng độ transaminase huyết thanh (AST, ALT), bilirubin máu, bilirubin nước tiểu tăng bất kì trong đợt điều trị, nhưng thường tăng trong 1 đến 3 tháng đầu và sau đó trở lại bình thường Ngoài ra bệnh nhân có thể gặp một số tác dụng phụ khác như: buồn nôn, nôn, đau thượng vị, viêm tụy; thiếu máu, giảm hoặc mất bạch cầu hạt, giảm bạch cầu ưa axit giảm tiểu cầu, sốt, viêm da [55]

1.3.2 Gen liên quan đến chuyển hóa Isoniazid ở bệnh nhân lao

Tổn thương gan do thuốc chống lao là một tác dụng phụ phổ biến, đa phần

do INH gây ra Quá trình chuyển hóa INH đóng vai trò quan trọng trong tổn thương gan [59] Sự khác biệt về độc tính của INH gây ra là do sự biến đồi về di truyền ở

một số gen như: N - acetyltransferase 2 (NAT2), Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1), glutathione S - transferase M1 (GSTM1), glutathione S - transferase T1 (GSTT1) [45]

CYP2E1 là gen mã hóa cho enzyme CYP2E1 có tác dụng chuyển hóa thuốc

ở gan CYP2E1 xúc tác quá trình oxy hóa AcHz và Hz tạo ra các chất trung gian

gây độc cho cơ thể [42] Sự đa hình của gen CYP2E1 quyết định khả năng hoạt

động của gen, hoạt tính cao hơn của enzyme này có thể làm tăng sự tổng hợp của các độc tố gan [61]

Các enzyme thuộc họ Glutathione S - transferase (GST) tham gia vào khả năng giải độc cho cơ thể, chúng chuyển các chất trung gian gây độc hoặc các sản phẩm oxy hóa thành chất ít hoặc không gây độc và giúp cơ thể đào thải ra ngoài GST tham gia quá trình chuyển hóa của thuốc điều trị lao thông qua các phản ứng liên hợp các chất chuyển hóa trung gian gây độc ở dạng tiềm ẩn [40] Sự thiếu hụt

hoạt tính GST do sự đồng hợp tử tại locus GSTM1 và GSTT1 có thể ảnh hưởng

đến tính nhạy cảm với độc tính gan do INH gây ra Nguy cơ nhiễm độc gan do

INH ở bệnh nhân Ấn Độ có GSTM1 đồng hợp tử đột biến đã tăng so với nhóm

còn lại [34] Tuy nhiên ở một số nghiên cứu khác lại chỉ ra không chỉ ra được tính

liên quan giữa sự đa hình của gen GST và nguy cơ tổn thương gan Ngoài ra còn có một số gen khác cũng ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa INH như HLA- DQA1/DQB1 [54]

So với các enzyme trên, N-acetyltransferase 2 (NAT2) là enzyme được

chứng minh có vai trò quan trọng nhất liên quan tới chuyển hóa Isoniazid Đa hình

gen NAT2 ảnh hưởng đến tốc độ acetyl hóa, tạo ra các kiểu hình acetyl hóa chậm

làm tăng nồng độ INH trong huyết thanh, giảm tốc độ thanh thải của INH và tăng các sản phẩm chuyển hóa trung gian gây độc cho cơ thể [45], [36]

1.4 Đặc điểm của gen NAT2 và đa hình gen NAT2

NAT là một loại enzyme xúc tác quá trình acetyl hóa arylamine từ

acetyl-CoA Nó được tìm thấy ở nhiều loài khác nhau NAT1 và NAT2 là các gen chính của NAT nằm gần nhau trên nhiễm sắc số 8, vị trí 8p22 Biểu hiện của 2 gen này khác nhau ở các mô riêng biệt và các enzyme có các ưu tiên khác nhau NAT1 biểu

hiện ở hầu hết các mô như mô thần kinh, gan, đường tiêu hóa, tế bào máu, trong khi

NAT2 chỉ giới hạn tại gan và đường tiêu hóa [32] Gen NAT2 gồm hai exon, exon 2

là một khung đọc mở dài 870 bp (tức là các vùng mã hóa protein) không có intron

Đa hình gen NAT2 gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm làm tăng nồng độ INH trong

huyết thanh, giảm tốc độ thanh thải của INH, tăng các sản phẩm chuyển hóa trung gian gây độc cho cơ thể [48], [44]

Hình 1.5: Vị trí gen NAT2 trên NST số 8

Sự đa hình của gen NAT2 có vai trò quan trọng trong việc biểu hiện các vai trò của gen ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng thuốc cũng như gia tăng tỷ lệ mắc một

số bệnh khi tiếp xúc với các yếu tố phơi nhiễm Dựa vào kiểu gen của NAT2, các nhà khoa học đã chia kiểu hình của enzyme NAT2 thành 3 dạng: kiểu hình acetyl

hóa nhanh (RA), acetyl hóa chậm (SA), acetyl hóa trung gian (IA) Các nghiên cứu

đều chỉ ra rằng kiểu hình acetyl hóa nhanh khi mang 2 alen kiểu dại (NAT2*4*4), acetyl hóa trung bình khi có 1 alen kiểu dại (NAT2*4/*5, NAT2*4/*6 và NAT2*4/*7) và acetyl hóa chậm khi có 2 đa hình alen (NAT2*5/*5, NAT2*5/*6, NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7 và NAT2*7/*7) [44] Hiện nay, các nhà di truyền học đã xác định được alen kiểu dại (được qui ước là NAT2*4) và 88 biến thể trên gen NAT2 [30] Trong các đa hình gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm, 3 alen NAT2*5, *6, *7 được nghiên cứu nhiều nhất Alen NAT2*5 có axit amin thay thế là I1e114Thr; alen NAT2*6 có axit amin thay thế là Arg197Gln, alen NAT2*7 có axit

amin thay thế là Gly286Glu Thường gặp nhất là nhóm cá thể có kiểu hình acetyl

hóa nhanh, kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại (NAT2*4) ở cả 3 vị trí SNP (T341C,

G590A, G857A) Các cá thể có kiểu hình acetyl hóa trung bình thường có kiểu gen

dị hợp tử về alen biến đổi ở một locus đơn, tức là một trong 3 vị trí NAT2*5, *6 hoặc *7 Những người acetyl hóa chậm là những người có nhiều hơn một đa hình

alen Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh, những bệnh nhân có kiểu hình acetyl hóa chậm có nguy cơ tổn thương gan, gặp các tác dụng phụ và tỉ lệ thất bại điều trị cao hơn 2 kiểu hình còn lại Đa hình gen cho thấy có sự khác biệt ở các chủng tộc, gần 50% người da trắng Châu Âu cho kiểu hình acetyl hoá chậm, trong khi đó ở người Nhật chỉ có 10% có kiểu hình acetyl hoá chậm Trên quần thể bệnh nhân Nhật và Đài Loan, bệnh nhân có kiểu hình chuyển hóa INH chậm có thể bị nhiễm độc gan cao hơn 28 lần so với những bệnh nhân có kiểu hình chuyển hóa nhanh [50] Một nghiên cứu của Hàn Quốc cũng chỉ ra rằng kiểu hình acetyl hóa chậm có nguy cơ nhiễm độc gan cao gấp 3 - 8 lần khi điều trị bằng INH so với kiểu chuyển hóa nhanh Wang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp 14 nghiên cứu khác trên 474 trường hợp và 1446 nhóm chứng đã cho thấy mối liên quan đáng

kể giữa các chất acetyl hóa chậm và nguy cơ nhiễm độc gan do INH [57] Tại Việt

Nam, nghiên cứu gần đây của Phạm Thị Hồng Nhung và cộng sự (2011) trên 100

người Việt Nam khỏe mạnh bằng phân tích đa hình gen của NAT2 cho thấy người

Việt Nam có loại hình acetyl hóa nhanh chiếm tỷ lệ lớn [46]

Enzyme NAT2 có vai trò quan trọng trong việc giúp cơ thể tránh khỏi các phản ứng quá khích với thuốc và môi trường NAT2 có khả năng hoạt hóa sinh học,

giải độc nhiều thuốc và các hóa chất độc hại, bao gồm cả các hợp chất gây ung thư Các nghiên cứu trong hơn 50 năm trở lại đây đã chứng minh được tầm quan trọng của việc xác định kiểu hình acetyl hóa ở các cá thể mắc lao hoặc một số cá thể phơi nhiễm với các tác nhân ung thư Việt Nam hiện đang đứng thứ 14/30 nước có gánh nặng bệnh lao cao nhất thế giới, chính vì vậy việc xác định kiểu hình acetyl hóa không chỉ có thể giúp các nhà lâm sàng định hướng trong xác định liều Isoniazid cho mỗi cá thể khi điều trị lao mà còn cung cấp nguồn dữ liệu về yếu tố di truyền để

có thể đánh giá những yếu tố nguy cơ đối với người mắc bệnh lao, đặc biệt là mắc lao kháng Isoniazid

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Dụng cụ, trang thiết bị

Thiết bị chính: Hệ thống cấy nhanh BACTEC MGIT 960 hoặc 320

(BD,Mỹ), Tủ an toàn sinh học cấp II (Telstar), Máy ly tâm lạnh đủ tiêu chuẩn an toàn sinh học, đủ lực ly tâm > 3000g (Mỹ), Máy lắc (Scientifica, Châu Âu), tủ lạnh

âm, tủ lạnh mát (Panasonic, Nhật), cân (Shinko, Nhật), Tủ ấm hoặc buồng ấm (Memmert, Đức), Kính hiển vi (Olympus, Nhật), Nồi hấp ướt (Tomy, Nhật), Máy soi chụp ảnh gel (Gel Doc It, Mỹ), Hệ thống điện di (Cleaver Scientific, Anh), Máy PCR (Prime Thermal Cycler, Anh), Tủ an toàn sinh học (ESCO, Singapore), Máy li tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen, Đức), Máy quang phổ NP80 (Nanophotometer,

Đức), Máy làm đá vảy (Fiocchetti, Ý)

Dụng cụ, vật tư: Lam kính trứng, ống thủy tinh vô trùng, lọ nhựa chia vạch

vô trùng, pipet nhựa chia vạch, pipet tự động loại 2-100µL và 1000µl và đầu côn vô

trùng, ăng nhựa vô trùng, ống bi vô trùng, găng tay, khẩu trang N95

2.1.2 Hóa chất, môi trường

Các hóa chất chính dùng cho phân lập, nuôi cấy và kháng sinh đồ lao:

Dung dịch khử nhiễm và dung dịch đệm photphat, Bộ nhuộm Ziehl-Neelsen, Bộ sinh phẩm nuôi cấy lỏng MGIT bao gồm: tube BBL MGIT 7mL; BACTEC MGIT Growth Supplement 15ml; BBL MGIT PANTA; BD MGITTM TBcID test nhanh định danh MTB, Sinh phẩm làm kháng sinh đồ lỏng PZA: Tube MGIT960 PZA, BACTEC MGIT 960 PZA Supplement, Giá code AST, Lọ kháng sinh PZA 8000 µg/ml, Độ đục chuẩn 0.5 McFarland, Độ đục chuẩn 1.0 McFarland, Nước cất vô

trùng, Môi trường LJ có và không có kháng sinh

Các hóa chất chính cho phân tích đa hình di truyền gen NAT2: E.Z.N.A

blood DNA Mini kit (hãng Omega-Biotek), Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid,

(EDTA) Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix), TAE 1X, 5X DNA loading dye (hãng ThermoScientific), Gene Ruler Ladder DNA marker (hãng

ThermoScientific), Lambda DNA/HindIII Ladder (hãng ThermoScientific), Tris base (hãng Bio basic), axit acetic (hãng Merck), Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT, nước khử ion (hãng Omega Biotek), Kapa2GTM

Robust HotStart ReadyMix (2X) (hãng Kapabiosystems)

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân được lựa chọn vào nghiên cứu tại 03 bệnh viện: Bệnh viện Bệnh

phổi Trung ương, Bệnh viện Lao phổi Hà Nội, Bệnh viện 74 Trung ương từ tháng 3/2017 đến 6/2018 đáp ứng các tiêu chuẩn sau:

Tuổi >= 16

Chẩn đoán ban đầu: lao phổi mới hoặc lao phổi tái trị

Kết quả Genxpert MTB+/RIF-

Chỉ định điều trị phác đồ có INH

Điều trị nội trú tại bệnh viện

Chấp thuận tình nguyện tham gia nghiên cứu

Chuẩn đoán xác định: lao phổi có bằng chứng vi khuẩn - nuôi cấy dương tính

và định danh Mycobacteria tuberculosis;

2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS

- Phụ nữ có thai hoặc đang cho con bú

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Cỡ mẫu

Nghiên cứu tiến cứu kết hợp hồi cứu, sử dụng phương pháp lấy mẫu thuận tiện Đối tượng nghiên cứu được lựa chọn theo tiêu chuẩn mục 2.2.1 và đối tượng tự nguyện đồng ý tham gia nghiên cứu Thu nhận mẫu từ tháng 3/2017 đến tháng 6/2018 cho tới khi cỡ mẫu đạt 125

2.3.2 Thu thập mẫu bệnh phẩm

Những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đáp ứng 5 tiêu chuẩn đầu tiên trong mục 2.2.1 sẽ được lấy đờm (3-5ml) theo đúng hướng dẫn của Chương trình chống lao quốc gia (2017) để nuôi cấy và theo dõi kết quả nuôi cấy và định danh Kết quả định danh là MTB thì sẽ được gửi mẫu đến Khoa Vi sinh và Labo tham chiếu Quốc gia của Bệnh viện Phổi trung ương để lưu mẫu tại -700C chờ làm kháng sinh

đồ đặc và lỏng

Hình 2.1: Sơ đồ thu mẫu và luân chuyển mẫu tại 3 bệnh viện

2.3.3 Quy trình nuôi cấy đờm trên môi trường lỏng BACTEC MGIT

Nguyên lý: Một lớp huỳnh quang được đưa vào bên trong lớp silicon nằm ở

đáy ống có đường kính 16x100 mm Chất huỳnh quang nhạy với sự hiện diện của Oxy hòa tan trong môi trường Nồng độ oxy ban đầu có trong ống làm bất hoạt huỳnh quang Sau đó khi vi sinh vật hô hấp tiêu thụ oxy làm giảm lượng oxy dẫn đến sự phát quang Ống môi trường được đưa vào hệ thống BACTEC MGIT 960/320 được ủ liên tục ở 370C và tín hiệu huỳnh quang được giám sát 60 phút/lần Máy báo dương bằng tín hiệu đèn và âm thanh khi trong ống chứa từ khoảng 105

-

106 CFU/mL Sau 42-56 ngày nếu không có tín hiệu huỳnh quang được thu nhận thì máy sẽ báo âm tính

Mẫu đờm nuôi cấy, định danh MTB tại Bệnh viện Phổi Hà Nội

Mẫu đờm nuôi cấy, định danh MTB tại Bệnh viện K74

Gữi mẫu MGIT dương

Nuôi cấy, định danh

và phân lập làm kháng sinh đồ tại khoa Vi sinh và Labo Lao chuẩn Quốc Gia - Bệnh viện Phổi Trung

ương

Hình 2.2: Hệ thống BACTEC MGIT 960 Các bước tiến hành: 3-5 ml đờm có nhày mủ được thu thập trong ống

falcon 50ml Mẫu đờm của bệnh nhân được khử tạp bằng dung dịch NaCl-NaOH

với thể tích pha là 1:1, voltex, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút sau đó thêm dung dịch

NaCl-NaOH cho đến khi đầy 40 ml rồi ly tâm 3000 rpm/15 phút ở 100C, gạn dịch

nổi và bổ sung 0,5 ml dung dịch đệm nuôi cấy để thu huyền dịch Huyền dịch sau

đó được đưa vào ống MGIT đã bổ sung thêm các yếu tố tăng trưởng (PANTA

supplement), kháng sinh, kháng nấm và nuôi cấy trong hệ thống BACTEC MGIT

960/320 Kết quả cấy được theo dõi trong vòng 42 ngày, mẫu bệnh phẩm sẽ được

máy tự động ghi nhận kết quả Cách nhận định kết quả được tóm tắt ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Nhận định kết quả nuôi cấy MGIT

Dương Vi khuẩn khác, nấm Ngoại nhiễm

AFB cuộn thừng, AFB Dương tính M.tuberculosis

complex

Âm tính NTM*

Âm tính Không thấy cặn vụn Âm tính

Có cặn vụn hoặc nhuộm soi dương tính làm theo quy trình ống dương

* NTM: Non-tuberculosis Mycobacteria (Mycobacteria ngoài lao)

2.3.4 Phương pháp kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một

Việc thực hiện kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một được thực hiện bằng 02 phương pháp: kháng sinh đồ trên môi trường lỏng được thực hiện cho Pyrazinamid (PZA), kháng sinh đồ trên môi trường đặc được thực hiện cho 4 thuốc chống lao còn lại là Rifampicin (RMP), Isoniazid (INH), Ethambutol (EMB), Streptomycin (SM) Quá trình làm kháng sinh đồ được thực hiện trong phòng an toàn sinh học có áp lực âm và tủ an toàn sinh học cấp độ II, theo quy trình chuẩn của Labo

Lao chuẩn quốc gia tại Bệnh viện Phổi Trung ương

2.3.4.1 Phương pháp xác định tính kháng Pyrazinamide (PZA) trên môi trường lỏng

Nguyên lý: Hệ thống BACTEC MGIT 960 được dùng làm thử nghiệm

kháng sinh đồ PZA Dựa trên chỉ số growth unit (GU), hệ thống tự động so sánh lượng vi khuẩn mọc ở ống chứa thuốc kháng sinh với ống chứng không chứa thuốc kháng sinh, máy tự động phân tích kết quả Chủng vi khuẩn thử nghiệm được pha theo tỷ lệ quy định, cấy vào môi trường lỏng MGIT không có và có PZA và đưa vào

hệ thống nuôi cấy Hệ thống sẽ giám sát liên tục sự phát phát quang của ống cấy dựa trên đơn vị sinh trưởng GU Kết quả kháng sinh đồ được báo cáo trong vòng 4-

21 ngày khi ống chứng đạt 400 GU, dựa trên so sánh định lượng sự phát triển của vi khuẩn lao trong ống chứng và ống có thuốc PZA Ống có thuốc PZA GU < 100 là nhạy cảm; GU > 100 là kháng thuốc Mỗi mẻ kháng sinh đồ trong ngày với cùng lô hóa chất được kiểm tra chất lượng bằng chủng chuẩn H37RV 100 và được thực hiện

như chủng thử nghiệm

Các bước tiến hành

Chuẩn bị môi trường: Chuẩn bị 02 ống (ống chứng và ống thử nghiệm)

chứa MGIT960 PZA có bổ sung 0,8ml yếu tố sinh trưởng, ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và ngày xét nghiệm lên ống Pha PZA 8000µg/ml trong 2.5 ml nước cất

vô trùng Lấy 100 µl PZA bổ sung vào ống MGIT thử nghiệm

Chuẩn bị chủng làm kháng sinh đồ: Các chủng làm kháng sinh đồ được

kiểm tra là chủng thuần Huyền dịch vi khuẩn được chuẩn bị bằng cách gặt chủng cho vào ống có bi thủy tinh vô trùng và vài giọt nước cất, voltex trong 2-3 phút để chủng được hòa tan hoàn toàn, ủ 15 phút sau đó thêm nước cất trộn đều, điều

chỉnh huyền dịch có độ đục hơn chuẩn Mac Farland 1.0 Sau 20 phút, chuyển phần

nước nổi sang ống vô trùng khác Thêm nước cất, điều chỉnh huyền dịch có độ đục

tương đương độ đục chuẩn Mc Farland 0.5 Pha tiếp huyền dịch với nước cất tỷ lệ 1:5, dùng huyền dịch này làm kháng sinh đồ Lấy 1ml huyền dịch đã pha loãng 1:5

ở bước trên tiếp tục pha loãng với nước cất tỷ lệ 1:10 để được huyền dịch cấy vào

ống MGIT960 PZA làm ống chứng GC

Cấy huyền dịch vi khuẩn vào môi trường kháng sinh đồ: Dùng Pipet tự động hút 0,5ml huyền dịch chuẩn bị cho ống GC vào ống chứng GC Dùng Pipet tự động húy 0,5ml huyền dịch pha loãng tỷ lệ 1:5 vào ống thử nghiệm PZA Vặn chặt nắp mỗi ống và đảo ngược ống 3-4 lần để đồng nhất dung dịch Xếp 2 ống vào giá code AST theo đúng thứ tự: GC-PZA Đưa giá code AST vào máy BACTEC MGIT960 và ghi các thông tin vào sổ kháng sinh đồ

Đọc kết quả kháng sinh đồ: Máy báo kết quả kháng sinh đồ tại thời điểm

ống chứng GC đạt 400GU trong vòng 4-21 ngày Ngưỡng kháng là 100GU Kết quả

kháng sinh đồ có thể được thông báo một trong ba trường hợp:

+ Kết quả nhạy (S): ống thử nghiệm PZA có mức GU < 100

+ Kết quả kháng (R): ống thử nghiệm PZA có mức GU > 100

+ Kết quả không kết luận được (X) báo lỗi: ống thử nghiệm GU >400 và thời gian máy báo < 4 ngày có thể do pha huyền dịch đặc hoặc chủng nhiễm trùng; lỗi GU<200 có thể do một số chủng kháng thuốc đặc hiệu mọc chậm hoặc huyền dịch

vi khuẩn quá loãng Trong trường hợp này kiểm tra lại các bước và thực hiện lại kháng sinh đồ

Hình 2.3: Kháng sinh đồ PZA

2.3.4.2 Phương pháp xác định tính kháng INH; RMP; SM; EMB trên môi trường đặc

Nguyên lý phương pháp kháng sinh đồ tỷ lệ: Xác định tỷ lệ phần trăm số

lượng khuẩn lạc vi khuẩn lao mọc trên môi trường có chứa các loại thuốc chống lao

ở nồng độ tối thiểu so với số vi khuẩn lao mọc trên môi trường đối chứng không chứa thuốc Xác định sự kháng của vi khuẩn lao với từng loại thuốc bằng cách so sánh tỷ lệ trên với ngưỡng kháng Nếu trên hoặc bằng ngưỡng là vi khuẩn kháng; dưới ngưỡng là vi khuẩn nhạy cảm Nồng độ thuốc và ngưỡng kháng thuốc chống lao được trình bày ở bảng 2.2 Mỗi mẻ kháng sinh đồ trong ngày được làm cùng 03 chủng kiểm tra, cách thức làm giống như chủng thử nghiệm: Chủng chuẩn H37RV

100; chủng chứng kháng RS (kháng RMP và SM), chủng chứng kháng HE (INH và EMB)

Bảng 2.2: Nồng độ thuốc và ngưỡng kháng thuốc kháng lao hàng 1

Chuẩn bị môi trường: Chuẩn bị dung dịch Malachite green 2%, dung dịch

LJ cơ bản, dung dịch trứng Ở bảng 2.3, thuốc dạng bột được tính toán để pha trong nước cất vô trùng hoặc trong propylene tùy loại thuốc tạo thành dung dịch thuốc (1) Sau đó dung dịch thuốc (1) sẽ được pha tiếp với nước cất vô trùng để tạo thành những dung dịch có nồng độ thấp hơn rồi bổ sung vào môi trường LJ với thể tích phù hợp để đạt được nồng độ thuốc cuối cùng trong môi trường là 0,2 µg/ml cho INH; 40 µg/ml cho RMP; 4 µg/ml cho SM; 2 µg/ml cho EMB, 500 µg/ml cho PNB (Para nitrobenzoic acid) (ống đối chứng kiểm tra chủng xác định MTB)

Bảng 2.3: Hướng dẫn pha dung dịch thuốc (1)

Số mg thuốc mỗi loại tính

theo độ tinh khiết

(1)

10 ml nước cất vô trùng Dung dịch INH (1)

2 ml dung môi Propylen

 8 ml nước cất vô trùng

Dung dịch RMP (1)

10 ml nước cất vô trùng Dung dịch SM (1)

10 ml nước cất vô trùng Dung dịch EMB (1)

20 ml dung môi Propylen

Dung dịch PNB (1)

Mỗi chủng thử nghiệm chuẩn bị: 04 ống môi trường LJ (2 ống ghi 10-2; 2 ống ghi 10-4); 04 ống môi trường LJ có chứa kháng sinh (INH, RMP, SM, EMB) và ống PNB Ghi rõ các thông tin ký hiệu chủng, ngày thực hiện trên các ống

Các chủng làm kháng sinh đồ được kiểm tra là chủng thuần đã được định danh; chủng nguyên thủy 3-4 tuần tuổi có nhiều hơn 5 khuẩn lạc; chủng cấy truyền

2 tuần tuổi

Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: Dùng ăng nhựa lấy vi khuẩn lao từ ống

nuôi cấy cho vào ống có bi thủy tinh vô trùng và vài giọt nước cất Voltex trong

2-3 phút để chủng được hòa tan hoàn toàn Chờ 15 phút Thêm 2-4 ml nước cất vô trùng trộn đều để 15 phút Dùng pipet vô trùng hút huyền dịch phía trên nhỏ dần vào ống chứa 10ml nước cất vô trùng, trộn đều, điều chỉnh huyền dịch độ đục tương đương Mac Farland 1.0 Ta được huyền dịch nồng độ 100

Pha 100 µl huyền dịch 100 và ống chứa 99ml nước cất vô trùng, trộn đều được nồng độ 10-2, tiếp tục pha loãng trong nước cất để thu được nồng độ 10-4

Huyền dịch 10-2 và 10-4 được

sử dụng để làm kháng sinh đồ

Cấy chủng làm kháng sinh đồ: Dùng pipet vô trùng cấy vào ống môi

trường có kháng sinh 0,1 ml huyền dịch vi khuẩn 10-4, nhẹ nhàng láng đều huyền dịch trên ống môi trường chứa kháng sinh Hai ống LJ không chứa kháng sinh cấy huyền dịch vi khuẩn 10-4; 2 ống LJ không chứa kháng sinh khác cấy huyền dịch vi khuẩn 10-2 Sau đó, vặn lỏng nắp ống môi trường, đặt ống cấy lên khay, mặt môi trường quay lên trên, đặt khay vào tủ ấm 370

C Kiểm tra ngoại nhiễm sau khi ủ ấm

24 giờ, 72 giờ, 1 tuần và vặn nắp ống khi mặt môi trường đã khô và tiếp tục cho vào tủ ấm

Hình 2.4: Chuẩn bị huyền dịch làm kháng sinh đồ đặc

Đọc kết quả kháng sinh đồ: Đánh giá kết quả ở 2 thời điểm là sau 28 ngày

và 42 ngày nuôi cấy Chủng chuẩn H37RV nhạy với các thuốc kháng lao; Chủng chứng kháng RS: kháng với Rifampicin và Streptomycin; Chủng chứng kháng HE: Kháng với Isoniazid và Ethamtanol; Các ống môi trường LJ 10-2 phải có số khuẩn lạc > 200 khuẩn lạc; Các ống môi trường LJ 10-4 phải có khuẩn lạc; Ống PNB không có khuẩn lạc, nếu mẫu nào có khuẩn lạc thì cần phải kiểm tra lại định danh chủng thử nghiệm

Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc: Đánh giá trên tất cả 9 ống môi trường cụ

thể như sau:

Bảng 2.4: Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc dựa vào khuẩn lạc

Không thấy khuẩn lạc Âm tính

< 20 khuẩn lạc Dương tính: ghi cụ thể số khuẩn lạc

20 - 100 khuẩn lạc Dương tính: 1+

100 - 200 khuẩn lạc Dương tính: 2+

200 - 500 khuẩn lạc Dương tính: 3+

>500 khuẩn lạc Dương tính: 4+

Nhiễm trùng hoặc nấm Ngoại nhiễm

Nhận định kết quả kháng thuốc: So sánh số lượng khuẩn lạc trên ống môi

trường LJ có thuốc và ống môi trường không có thuốc LJ 10-4 Tỷ lệ 1% được gọi là ngưỡng kháng

Khuẩn lạc không mọc trên

môi trường chứa thuốc

Kết quả sơ bộ: nhạy cảm

Ủ ấm tiếp Nhạy cảm Nhạy cảm

Ủ ấm tiếp Nhạy cảm Nhạy cảm

Kháng Kháng

Làm lại kháng sinh đồ sớm nhất có thể trong các trường hợp: vi khuẩn không mọc trên ống chứng; số lượng khuẩn lạc trên ống môi trường LJ 10-2 < 200 khuẩn lạc; tỷ lệ kháng xấp xỉ ngưỡng kháng; ngoại nhiễm Các trường hợp ngoại nhiễm hoặc lẫn vi khuẩn ngoài lao sẽ được phát hiện trong khoảng thời gian một tuần sau khi thực hiện cấy kháng sinh đồ

2.3.5 Phân tích kiểu gen NAT2 để xác định kiểu hình acetyl hóa isoniazid

Thu thập, vận chuyển và bảo quản mẫu máu

Những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đáp ứng 5 tiêu chuẩn đầu tiên trong mục 2.2.1 sẽ được lấy mẫu máu cho phân tích gen NAT2 vào ngày điều trị thứ 10 -14 Mỗi bệnh nhân được lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống có chất chống đông EDTA ghi đầy đủ thông tin gồm mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu Mẫu được vận chuyển bằng hộp giữ lạnh đựng mẫu chuyên dụng về phòng thí nghiệm Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội bảo quản ở -300

C cho đến khi thực hiện các bước tiếp theo

Tách chiết, kiểm tra và định lƣợng ADN

ADN được tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sử dụng kit E.Z.N.A blood DNA Mini (Mỹ) Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết được định lượng bằng máy đo Nano Photometer-implen NP80: đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (A260) và 280 nm (A280) DNA được cho là có độ tinh sạch cao khi giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 Chất lượng DNA còn được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2%

Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR

Gen NAT2 sẽ được xác định các SNP (NAT2*5, NAT2*6, NAT2*7) bằng phương pháp PCR- giải trình tự gen Đầu tiên, DNA tổng số được sử dụng để nhân dòng đoạn gen NAT2 có độ dài 1093 bp sử dụng cặp mồi 5'-GGA ACA AAT TGG ACT TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC-3’ [56] Các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.6