Xây Dựng Phương Pháp Phát Hiện Thực Phẩm Biến Đổi Gen Có Nguồn Gốc Thực Vật

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN CÓ NGUỒN GỐC THỰC VẬT DỰA TRÊN TRÌNH TỰ PROMOTER 34S-FMV Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH H

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN CÓ NGUỒN GỐC THỰC VẬT DỰA TRÊN TRÌNH TỰ PROMOTER

34S-FMV

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Vũ Việt Dũng Sinh viên thực hiện : Trần Quang Phát

MSSV: 1311100065 Lớp: 13DSH01

TP Hồ Chí Minh, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do bản thân thực hiện và không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào Các số liệu trong đề tài có nguồn gốc rõ ràng, tuân thủ đúng nguyên tắc Kết quả trình bày trong đề tài được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực và chưa từng được công bố trước đây

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung khoa học của đề tài nghiên cứu này

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017

Sinh viên,

Trần Quang Phát

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến quý thầy cô của trường Đại học Công nghệ TP.HCM nói chung, quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường nói riêng đã tận tình dạy dỗ, giúp em hoàn thiện kiến thức, các

kỹ năng chuyên môn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập Xin gửi đến TS Nguyễn Tiến Dũng, ThS Phạm Vũ Việt Dũng cùng với các anh chị của phòng kiểm nghiệm Sinh học, Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4 lời cảm ơn sâu sắc vì đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt em trong suốt thời gian qua

Xin ghi nhận công sức và những đóng góp quý báu, nhiệt tình của toàn thể các bạn trong lớp 13DSH01 đã đóng góp ý kiến, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Đặc biệt, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ đã nuôi dạy con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài

Vì chưa có nhiều kinh nghiệm, chỉ dựa vào kiến thức hạn hẹp cùng với thời gian ngắn ngủi nên chắc chắn không tránh khỏi những sai sót Kính mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để kiến thức của chúng em ngày càng hoàn thiện hơn, rút ra được những kinh nghiệm bổ ích cho quá trình học tập, làm việc sau này

Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô của trường Đại học Công nghệ TP.HCM dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý của mình Đồng kính chúc quý thầy cô, anh chị của phòng kiểm nghiệm Sinh học tại Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4 luôn dồi dào sức khỏe và đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong cuộc sống

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017

Sinh viên,

Trần Quang Phát

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu cây trồng biến đổi gen (GMO) 3

1.1.1 Khái niệm về cây trồng biến đổi gen (GMO) 3

1.1.2 Lịch sử hình thành cây trồng biến đổi gen 4

1.2 Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam hiện nay 5

1.2.1 Xu hướng nghiên cứu cây trồng biến đổi gen trên thế giới 5

1.2.2 Tình hình thương mại hóa cây trồng chuyển gen 7

1.2.3 Các yêu cầu về dán nhãn sản phẩm GMO trên thế giới và Việt Nam 11 1.2.4 Tình hình nghiên cứu thực phẩm biến đổi gen tại Việt Nam 12

1.3 Các phương pháp xác định cây trồng biến đổi gen 14

1.3.1 Phương pháp sử dụng protein như là đích phân tích 14

1.3.2 Phương pháp sử dụng DNA đích 14

1.3.3 Một số trình tự DNA đích được áp dụng phương pháp sàng lọc 15

1.3.4 Giới thiệu chung về phương pháp PCR 16

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 18

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 18

2.2 Vật liệu nghiên cứu 18

2.2.1 Nguồn mẫu 18

2.2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phương pháp thu mẫu 21

2.3.2 Phương pháp bảo quản mẫu 21

2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA 21

2.3.4 Phản ứng PCR 24

2.3.5 Kỹ thuật điện di trên gel 28

2.4 Xác nhận hiệu lực phương pháp phân tích GMO bằng kỹ thuật PCR 31

2.5 Bố trí thí nghiệm 32

2.5.1 Tách chiết DNA 32

2.5.2 Khảo sát tối ưu hóa phản ứng PCR 32

2.5.3 Đánh giá các thông số kĩ thuật phương pháp 34

2.6 Cải tiến phương pháp 36

2.7 Khảo sát mẫu thị trường 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 38

3.1 Sản phẩm tách chiết DNA 38

3.2 Tối ưu hóa phản ứng PCR 39

3.2.1 Khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi 39

3.2.2 Khảo sát tối ưu nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên phản ứng PCR 40

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA trong phản ứng PCR 42

3.3 Đánh giá hiệu lực phương pháp 44

3.4 Đề xuất quy trình khảo sát mẫu thực tế bằng kĩ thuật PCR 46

3.5 Cải tiến phương pháp bằng phản ứng Realtime – PCR 47

3.6 Kết quả khảo sát mẫu thực tế 49

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

EDTA : Ethylene diaminetetra acetic acid

Elisa : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

EU : European Union

FMV : Virus dạng mosaic

GM : Genetically Modified

GMC : Genetically Modified Crop

GMO : Genetically Modified Organism

ISAAA : Tổ chức quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học

trong nông nghiệp IRRI : Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế

LOD : Limit of detection

mM : milimol/lít

PCR : Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribonucleic acid

Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)

DANH SÁCH CÁC BẢNG SỬ DỤNG

Bảng 2.1 Trình tự mồi có sẵn sử dụng trong nghiên cứu [13] 18

Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật 19

Bảng 2.3 Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA 22

Bảng 2.4 Chương trình phản ứng PCR 27

Bảng 2.5 Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR 28

Bảng 2.6 Khảo sát đồng thời nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi tối ưu trong thành phần phản ứng PCR 33

Bảng 2.7 Chương trình chu kỳ nhiệt của phản ứng 33

Bảng 2.8 So sánh kết quả thử khẳng định 35

Bảng 2.9 Thành phần hóa chất phản ứng Realtime - PCR 36

Bảng 2.10.Chương trình phản ứng Realtime - PCR 37

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát 42

Bảng 3.2 Chương trình nhiệt chạy phản ứng PCR sau tối ưu 43

Bảng 3.3.Thành phần hóa chất sau khi tối ưu hóa 44

Bảng 3.4.Kết quả phân tích phát hiện promoter FMV trên mẫu chuẩn MON89788 5% 44

Bảng 3.5 Kết quả giá trị đánh giá các thông số của phương pháp 45

Bảng 3.6 Diễn giải kết quả điện di 46

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Gạo vàng, một loại thực phẩm biến đổi gen có nhiều ưu điểm 4

Hình 1.2 Bản đồ diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới 2016 theo ISAAA 9

Hình 1.3 Diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới sau 20 năm 10

Hình 1.4 Tình hình nhập khẩu đậu tương quý I năm 2017 [18] 11

Hình 2.1 Kích thước các vạch của thang 100bp DNA Ladder Plus 19

Hình 2.2 Quy trình tách chiết DNA bằng bộ Kit SureFood PREP Basic Art No S1052 23

Hình 2.3 Các giai đoạn trong phản ứng PCR [1] 27

Hình 2.4 Các bước trong kỹ thuật điện di [1] 29

Hình 3.1 Kết quả điện di tách chiết DNA từ mẫu thị trường 39

Hình 3.2 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi dùng để phát hiện dương tính GMO với các chủng vi sinh vật khác 40

Hình 3.3 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên phản ứng PCR phát hiện GMO 41

Hình 3.4 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên phản ứng PCR phát hiện GMO 41

Hình 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA 43

Hình 3.6 Sơ đồ quy trình phân tích khảo sát mẫu thực tế được đề xuất 46

Hình 3.7 Kết quả khuếch đại Realtime – PCR mẫu chuẩn 48

Hình 3.8 Đường xác định nhiệt độ nóng chảy của kết quả real-time PCR khoảng 80ºC 48

Hình 3.9 Kết quả chạy điện di của sản phẩm Realtime – PCR 49

Hình 3.10 Kết quả mẫu xét nghiệm GMO thị trường 50

LỜI MỞ ĐẦU

Công nghệ sinh học phát triển mở ra nhiều triển vọng cho cây trồng biến đổi gen Với những lợi ích mà cây trồng biến đổi gen mang lại (kháng sâu bệnh, tăng năng suất, tăng giá trị dinh dưỡng ), cùng với những yêu cầu của con người ngày càng tăng về vấn đề an ninh lương thực, nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng

và đặc biệt là đối phó với sự biến đổi của khí hậu Cây trồng biến đổi gen được dự báo sẽ tiếp tục tăng trong những năm tới [7] Ở Việt Nam, để tạo đà cho phát triển cây trồng biến đổi gen, nhiều cơ quan nghiên cứu như Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long… đã có những nghiên cứu cơ bản ban đầu như: sàng lọc các gen hữu ích, thiết kế vector chuyển gen Tới nay, đã có báo cáo kết quả ban đầu trong nghiên cứu cây chuyển gen đối với cây ngô, đậu tương, lúa, bông ở Việt Nam nhưng còn rất hạn chế Công tác nghiên cứu, phát triển cây trồng biến đổi gen ngày càng mạnh mẽ hơn, đặc biệt khi việc khảo nghiệm đánh giá rủi ro đối với đa dạng sinh học và môi trường của các cây chuyển gen: ngô, bông vải và đậu tương với mục đích làm giống đã được Chính phủ cho phép Tại thị trường Việt Nam, một số hạt giống ngô chuyển gen đã được cấp phép có nguồn gốc từ các công ty Syngenta, DEKALB, Pioneer Hi-bred đối với tính trạng kháng sâu và thuốc trừ cỏ, bao gồm Bt11, GA21, bt11xGA21, MON89034, NK603, MON89034xNK603, TC1507[28] Các giống ngô này được phép trồng khảo nghiệm trên diện rộng với mục đích làm thức ăn gia súc

Mặc dù vẫn chưa có một khẳng định hợp pháp nào chứng minh thực phẩm biến đổi gen có hại cho sức khỏe Người tiêu dùng chúng ta có quyền lựa chọn việc sử dụng hoặc không sử dụng thực phẩm biến đổi gen Trước những tranh cãi như vậy,

có thể chọn mua các thực phẩm được chứng nhận là không chứa biến đổi gen GMO) hoặc các thực phẩm hữu cơ - một loại thực phẩm hoàn toàn không chứa biến đổi gen GMO có chứng nhận hữu cơ, hoặc tìm hiểu các cách nhận biết, hay phòng tránh thực phẩm biến đổi gen trước khi có khẳng định chính thức từ loại thực phẩm này Sản phẩm GMO đã có mặt trên thị trường Việt Nam nhưng chưa được kiểm soát chặt chẽ Hiện nay GMO đã được quy định dán nhãn trên thị trường và được

(Non-phân tích phát hiện, định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau trong đó có phương pháp khuếch đại DNA (PCR)

Hiện nay, đa số các phương pháp sàng lọc GMO dựa trên trình tự promoter CaMV và terminator NOS Để mở rộng thêm các trình tự sàng lọc GMO, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp phát hiện Genetically Modified Organism

35S (GMO) dựa trên trình tự promoter 34S35S FMV” Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4

 Mục đích nghiên cứu:

Xây dựng hoàn chỉnh quy trình phát hiện GMO dựa trên trình tự promoter FMV với các thông số về giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu đạt yêu cầu sử dụng tại Phòng kiểm nghiệm Sinh học của Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4

34S- Mục tiêu nghiên cứu:

Để hoàn thiện phương pháp đáp ứng yêu cầu đưa vào áp dụng thực tế, đề tài bao gồm hai mục tiêu lớn:

- Tối ưu các thông số để thực hiện phản ứng PCR như nồng độ MgCl2, nồng

độ primer, nhiệt độ bắt cặp

- Xác định các thông số của phương pháp: LOD50, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác của phương pháp

 Nội dung nghiên cứu:

- Tách chiết DNA từ mẫu thực phẩm chứa đậu nành biến đổi gen và kiểm tra mức độ tinh sạch của sản phẩm tách chiết

- Khảo sát và tối ưu nồng độ primer, nồng độ MgCl2, nhiệt độ bắt cặp của mồi nhằm tối ưu hóa phản ứng PCR

- Đánh giá hiệu lực sử dụng của phương pháp thông qua các thông số: LOD,

độ nhạy, độ đặc hiệu

- Áp dụng quy trình để phân tích một số mẫu ngoài thị trường

- Một số đề xuất cải tiến phương pháp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu cây trồng biến đổi gen (GMO)

1.1.1 Khái niệm về cây trồng biến đổi gen (GMO)

GMO (Genetically Modified Organism): sinh vật biến đổi gen, là một sinh vật

mà vật liệu di truyền của nó đã bị biến đổi theo ý muốn chủ quan của con người Công nghệ này thường được gọi là “công nghệ sinh học hiện đại” hoặc “công nghệ gen”, đôi khi còn “công nghệ tái tổ hợp DNA” hoặc “kỹ thuật di truyền” Nó cho phép chuyển các gen riêng lẻ từ một loài này sang một loài khác, cũng như giữa các loài không liên quan [16] Ngoài ra cũng có thể có những sinh vật được tạo ra do quá trình lan truyền của gen trong tự nhiên Ví dụ quá trình lai xa giữa cỏ dại với cây trồng biến đổi gen có cùng họ hàng có thể tạo ra loài cỏ dại mang gen biến đổi Sinh vật biến đổi gen có nhiều loại khác nhau Nó có thể là các dòng lúa mỳ thương mại có gen bị biến đổi do tia điện từ hoặc tia phóng xạ từ những năm 1950

Nó cũng có thể là các động vật thí nghiệm chuyển gen như chuột bạch hoặc là các loại vi sinh vật bị biến đổi cho mục đích nghiên cứu di truyền Tuy nhiên hiện nay, thông thường khi nói đến GMO người ta thường đề cập đến các cơ thể sinh vật mang các gen của một loài khác để tạo ra một dạng chưa hề tồn tại trong tự nhiên GMC (Genetically Modified Crop) là loại cây trồng được lai tạo ra bằng cách sử dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện đại, hay còn gọi là kỹ thuật di truyền, công nghệ gene hay công nghệ DNA tái tổ hợp, để chuyển một hoặc một số gene chọn lọc để tạo ra cây trồng mang tính trạng mong muốn [16]

Về mặt bản chất, các giống lai từ trước đến nay (hay còn gọi là giống truyền thống) đều là kết quả của quá trình cải biến di truyền Điểm khác biệt duy nhất giữa giống lai truyền thống và giống chuyển gen là vật liệu di truyền (DNA) được chọn lọc một cách chính xác dựa trên khoa học công nghệ hiện đại và chuyển vào giống cây trồng để đem lại một tính trạng mong muốn một cách có kiểm soát Công nghệ gen có thể được sử dụng theo nhiều cách, ví dụ như kỹ thuật chống chịu stress(căng thẳng) phi sinh học như hạn hán, nhiệt độ cực đại hoặc độ mặn, và các stress sinh học, như côn trùng và mầm bệnh, thường có thể gây hại cho sự phát triển và tồn tại

của cây trồng Công nghệ này cũng có thể được sử dụng để cải thiện hàm lượng dinh dưỡng của cây, một ứng dụng có thể được sử dụng đặc biệt ở các nước đang phát triển

1.1.2 Lịch sử hình thành cây trồng biến đổi gen

Cây trồng biến đổi gen được tạo ra lần đầu tiên vào năm 1982 bằng việc sử dụng loại cây thuốc lá chống kháng sinh Những khu vực trồng thử nghiệm cây thuốc lá

có khả năng chống thuốc diệt cỏ đầu tiên là ở Pháp và Hoa Kỳ vào năm 1986

Năm 1987, Plant Genetic Systems (Ghent, Bỉ) là công ty đầu tiên phát triển cây trồng thiết kế gen di truyền (thuốc lá) có khả năng chống chịu côn trùng bằng cách

biểu hiện các gen mã hóa protein diệt côn trùng từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis

(Bt), được thành lập bởi Marc Van Montagu và Jeff Schell Trung Quốc là quốc gia đầu tiên chấp nhận cây công nghiệp chuyển đổi gen với cây thuốc lá kháng virus được giới thiệu lần đầu vào năm 1992, nhưng rút khỏi thị trường Trung Quốc vào năm 1997 [25]

Hình 1.1 Gạo vàng, một loại thực phẩm biến đổi gen có nhiều ưu điểm

Cây trồng biến đổi gen đầu tiên được phê chuẩn bán ở Mỹ vào năm 1994 là cà chua FlavrSavr, có thời gian bảo quản lâu hơn các loại cà chua thông thường Năm

1994, Liên minh châu Âu phê chuẩn cây thuốc lá có khả năng chống thuốc diệt cỏ bromoxynil Năm 1995, khoai tây Bt đã được phê duyệt an toàn bởi Cơ quan Bảo vệ Môi trường, trở thành cây nông sản kháng sâu đầu tiên được phê duyệt tại Hoa Kỳ

Các loại cây trồng chuyển đổi gen sau đó cũng được chấp thuận giao dịch ở Mỹ vào năm 1995: cải dầu với thành phần chuyển đổi (Calgene), ngô bắp có vi khuẩn

Bacillus thuringiensis (Bt) (Ciba-Geigy), bông kháng thuốc diệt cỏ bromoxynil

(Calgene), bông kháng côn trùng (Monsanto), đậu nành kháng thuốc diệt cỏ glyphosate (Monsanto), bí kháng virus (Asgrow) và cà chua chín chậm (DNAP, Zeneca/Peto và Monsanto) Tính đến giữa năm 1996 đã có tổng cộng 35 phê chuẩn được cấp cho 8 loại cây công nghiệp chuyển đổi gen và 1 loại hoa cẩm chướng, với

8 điểm khác nhau tại 6 quốc gia cộng thêm EU

Năm 2000, lần đầu tiên các nhà khoa học đã biến đổi gen thực phẩm để gia tăng giá trị dinh dưỡng bằng việc sản xuất ra hạt gạo vàng Đây là giống lúa chứa hàm lượng vitamin A cao hơn bình thường do Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) tạo

ra Đặc điểm của loại lúa này chứa hàm lượng beta-caroten rất lớn Mục đích của các nhà khoa học khi tạo ra giống lúa siêu vitamin A chống bệnh về mắt hay thiếu hụt vitamin A [12]

1.2 Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam hiện nay

1.2.1 Xu hướng nghiên cứu cây trồng biến đổi gen trên thế giới

1.2.1.1 Cây trồng chống chịu thuốc diệt cỏ

Nhiều loại cây trồng đã được biến đổi gen nhằm kháng lại thuốc diệt cỏ phổ rộng Các cây trồng chuyển gen này chứa các gen giúp chúng phân hủy các thành phần hoạt động trong thuốc diệt cỏ, khiến chúng trở thành vô hại Nông dân có thể

dễ dàng loại bỏ cỏ dại trong suốt vụ mùa và thoải mái chọn lựa thời điểm phun thuốc cây trồng kháng thuốc diệt cỏ không cần hoặc cần rất ít việc làm đất Những người phản đối cho rằng việc sử dụng cây trồng kháng thuốc diệt cỏ có thể dẫn đến tăng sử dụng thuốc diệt cỏ, kích thích sự kháng thuốc diệt cỏ ở cỏ dại và hủy hoại

đa dạng sinh học nông nghiệp

Gần đây, hai hệ thống cây trồng kháng thuốc diệt cỏ được phát triển đối với đậu nành, ngô, củ cải dầu và bông là: RoundupReady và Liberty Link Một số sản phẩm thương mại của nhóm này là:

- GA21 (Giống khảo nghiệm: giống ngô lai NK66 mang gen kháng thuốc trừ cỏ)

- Bt11xGA21 (Giống khảo nghiệm: giống ngô lai NK66 mang tổ hợp 2 gen: kháng sâu bộ cánh vảy và kháng thuốc trừ cỏ được tạo ra bằng phương pháp lai truyền thống) [28]

1.2.1.2 Cây trồng kháng bệnh

Các cây trồng có thể bị bệnh gây ta bởi các loài nấm, vi khuẩn, virus, giun tròn

và các tác nhân khác Nhiều các phương pháp công nghệ cao được đề xuất nhằm bảo vệ thực vật khỏi các tác hại này Đến nay, hầu hết các mối quan tâm tập trung vào các thực vật chuyển gen kháng virus, nhưng việc sử dụng công nghệ sinh học

để kháng nấm, vi khuẩn hay giun tròn cũng được quan tâm

Hai ví dụ về tăng trưởng cây GM thương mại trong lĩnh vực này là các cây

kháng côn trùng thể hiện gen Bt (từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis) và đu đủ GM

kháng virus [9]

1.2.1.3 Thực vật với thành phần thay đổi

Ngày càng nhiều giống cây trồng chuyển gen mới được khảo nghiệm với đặc tính tăng giá trị và chất lượng sản phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu công nghiệp và của người tiêu dùng

Các thực vật chuyển gen mới với thành phần biến đổi đem lại nhiều lợi ích cho công nghiệp và người tiêu dùng Chẳng hạn khoai tây với thành phần tinh bột biến đổi và các hạt dầu được dùng để thay thế các sản phẩm dầu mỏ là mối quan tâm của công nghiệp Người tiêu dùng có nhiều lợi ích từ thế hệ cây trồng biến đổi gen tiếp theo, thế hệ của gạo với mức độ tăng cường cao của sắt, vitamin A hay dầu thực vật

có thể làm giảm nguy cơ bệnh tim…

1.2.1.4 Cây trồng chống chịu áp lực

Các nhà sinh học thực vật sử dụng công nghệ sinh học để hoàn thiện cách thức khiến các thực vật có thể thích nghi hơn với các thách thức môi trường như hạn hán, mặn hay nhiệt độ thích hợp

- Chịu hạn: Một cách tạo ra thực vật chịu hạn là lấy gen từ thực vật có khả năng chịu hạn và chuyển vào cây trồng Các thực vật hồi sinh (Xerophyta viscosa), nguồn gốc từ vùng khô hạn phía nam châu Phi, chứa gen mã hóa duy nhất một protein trong thành tế bào Thực nghiệm chỉ ra rằng các thực vật nhận gen này có khả năng chịu áp lực của hạn hán và độ mặn cao [21]

- Chịu mặn: Các nhà nghiên cứu nhận ra rằng các thực vật có khả năng chịu mặn cao chứa nồng độ cao chất glycinebetaine Hơn nữa, thực vật có khả năng chịu mặn trung bình có nồng độ trung bình và thực vật với khả năng chịu mặn thấp có ít hay không chứa chất glycinebetaine Khoai tây chuyển gen với khả năng sản sinh nhiều glycinebetaine tăng khả năng chịu mặn

1.2.2 Tình hình thương mại hóa cây trồng chuyển gen

1.2.2.1 Tình hình thương mại hóa trên thế giới

Tỷ lệ canh tác cây trồng BĐG trong năm 2016 hồi phục lại mức cao với tổng diện tích 185,1 triệu ha trên toàn cầu

Năm 2016, sau hai thập kỷ thương mại hóa, 26 quốc gia đã trồng được 185,1 triệu ha cây trồng BĐG – tăng 5,4 triệu ha tương đương với 3% so với năm 2015 Ngoại trừ sự sụt giảm trong năm 2015, đây là lần tăng thứ 20 liên tiếp về tỷ lệ canh tác, trong đó đáng chú ý có 12 năm đạt mức tăng trưởng hai con số [11] Cây trồng BĐG cung cấp lựa chọn đa dạng hơn cho người tiêu dùng

Các cây trồng BĐG đã được mở rộng ngoài 4 loại cây chính (ngô, đậu nành, bông và cải dầu) nhằm mang tới nhiều lựa chọn hơn cho người tiêu dùng trên thế giới Những loại cây BĐG mới này gồm củ cải đường, đu đủ, bí, cà tím và khoai tây cùng với sự xuất hiện của táo vào năm 2017 Khoai tây là giống cây trồng quan trọng và chủ lực thứ tư trên thế giới; còn cà tím là loại rau được tiêu dùng số một tại châu Á Giống táo và khoai tây không thâm nâu có thể góp phần giảm lãng phí thực phẩm Thêm vào đó, nghiên cứu thực hiện bởi các tổ chức công cộng đã đưa các cây trồng như gạo, chuối, khoai tây, lúa mì, đậu hồi, đậu triều, mù tạt và mía đường vào các giai đoạn đánh giá nâng cao, có khả năng cung cấp nhiều lựa chọn cho người tiêu dùng, đặc biệt tại các nước đang phát triển

Các tính trạng và cây trồng BĐG mới đang được nghiên cứu và giới thiệu nhằm mang thêm lợi ích cho nông dân và người tiêu dùng

Đáng chú ý là các tính trạng và giống cây BĐG mới đang được thử nghiệm thực địa để cung cấp tới nông dân và người tiêu dùng Các loại cây này bao gồm các giống trọng yếu như giống gạo vàng giàu beta-carotene đang được thử nghiệm tại Philippines và Bangladesh; giống chuối BĐG kháng virus đầu buồng trồng tại Uganda; giống chuối BĐG chống rầy nâu và giống lúa mì BĐG kháng bệnh, chịu hạn, biến đổi lượng dầu và cấu thành hạt đang được thử nghiệm tại Úc; giống lúa

mỳ có sinh khối và sản lượng cao tại Anh; các giống khoai tây kháng bệnh mốc sương Desiree và Victoria tại Uganda, cùng giống khoai tây kháng giun tròn và bệnh mốc sương Maris Piper, giống khoai tây ít thâm và ít acrylamide canh tác tại châu Âu; đậu triều và đậu hồi kháng sâu bệnh cùng mù tạt BĐG, vốn là các loại rau

và nguồn dầu chủ lực, được thử nghiệm tại Ấn Độ; giống mía đường chịu hạn trồng tại Ấn Độ và Indonesia và cải camelina giàu omega-3 tại châu Âu [11]

Diện tích canh tác cây trồng BĐG toàn cầu tăng gần 110 lần, từ 1,7 triệu ha năm

1996 tới 185,1 triệu ha vào năm 2016 – khiến cây trồng BĐG trở thành công nghệ cây trồng được ứng dụng nhanh nhất tại thời điểm hiện tại Diện tích cộng dồn đạt 2,1 tỷ ha có được sau 21 năm (1996 – 2016) thương mại hóa cây trồng BĐG Diện tích canh tác cây BĐG tại các quốc gia đang phát triển chiếm 54% diện tích canh

tác toàn cầu (99,6 triệu ha); trong khi diện tích này tại các nước công nghiệp chiếm 46% (85,5 triệu ha) [11]

Hình 1.2 Bản đồ diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới 2016 theo

ISAAA

Bốn loại cây trồng BĐG chủ lực gồm: đậu nành, ngô, bông và cải dầu là các giống BĐG được ứng dụng nhiều nhất tại 26 quốc gia Diện tích canh tác đậu nành BĐG đạt mức cao nhất 91,4 triệu ha, tương đương 50% diện tích canh tác của tất cả các giống cây BĐG trên toàn cầu (185,1 triệu ha) Mặc dù có sự sụt giảm nhẹ tương đương mức biên 1% so với năm 2015 (92,7 triệu ha), khu vực canh tác đậu nành vẫn giữ mức bền vững 91,4 triệu ha Xét trên diện tích canh tác toàn cầu của từng

loại cây trồng riêng lẻ, trong năm 2016 có 78% đậu nành, 64% bông, 26% ngô và 24% cải dầu là giống cây BĐG [11]

Tính trạng biến đổi gen đơn chống chịu thuốc trừ cỏ trên cây đậu nành, cải dầu, ngô, cỏ linh lăng và bông hiện vẫn giữ ngôi vị thống trị với 47% diện tích canh tác toàn cầu Tuy vậy, tỷ lệ này có xu hướng giảm đi, cùng với sự tăng lên của cây BĐG đa tính trạng (kết hợp tính trạng kháng sâu bệnh, chống cỏ dại và các tính trạng khác) Diện tích canh tác cây trồng với tính trạng kháng cỏ dại là 86,5 triệu ha năm 2016, chiếm 47% tổng diện tích canh tác toàn cầu (185,1 triệu ha) Mặt khác, diện tích canh tác cây trồng đa tính trạng đã tăng 29% trong năm 2016, đạt 75,4 triệu ha từ 58,4 triệu ha năm 2015 Theo đó, cây trồng đa tính trạng hiện chiếm 41% diện tích canh tác toàn cầu (185,1 triệu ha) Ví dụ ở Hoa Kỳ, ngô GM kháng côn trùng được trồng trên diện tích 10,6 triệu ha và bao gồm 35% ngô (GM và không GM) trồng ở cả nước [6]

Hình 1.3 Diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới sau 20 năm

1.2.2.2 Tình hình cây trồng biến đổi gen tại Việt Nam

Ở Việt Nam, các sản phẩm từ cây trồng biến đổi gen được nhập khẩu về có kiểm soát nhằm sử dụng chủ yếu trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

Theo thống kê của Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trong 9 tháng đầu năm

2015 nước ta nhập khẩu 2,59 tỷ USD thức ăn gia súc và nguyên liệu, trong đó thị trường nhập khẩu chính là Argentina (42% thị phần), Mỹ (14% thị phần), Brazil (7,8% thị phần) [22]

Hiện tại Việt Nam cho phép nhập khẩu những loại thực phẩm biến đổi gen và được kiểm soát chặt chẽ đó là NK66 Bt; NK66 GT và NK66 Bt/Gt và Bt11, các event MON89788, MON87705, 40-3-2, MON87705, MON87701, MON87708 của đậu nành (Tham khảo tại phụ lục B, Danh mục cấp Giấy xác nhận thực vật biến đổi gen)

Hình 1.4 Tình hình nhập khẩu đậu tương quý I năm 2017 [18]

Đối với đậu tương, trong quý I năm 2017 đã nhập khẩu 137,1 nghìn tấn, trị giá 61,9 triệu USD, giảm 57,4% về lượng và giảm 52,1% về trị giá so với quý I năm

2016, tính riêng tháng 3/2017, nhập khẩu đậu tương tăng 27,8% về lượng và 28%

về trị giá so với tháng 2/2017, đây cũng là tháng tăng đầu tiên sau hai tháng suy giảm liên tiếp đạt tương ứng 60,5 nghìn tấn, trị giá 27,3 triệu USD

1.2.3 Các yêu cầu về dán nhãn sản phẩm GMO trên thế giới và Việt Nam

Trên thế giới có nhiều quốc gia cho phép nhập khẩu và sử dụng thực phẩm biến đổi gen Mỗi quốc gia đều đặt ra những quy định dán nhãn riêng Mỹ là một trong những quốc gia có yêu cầu cao về việc dán nhãn thực phẩm biến đổi gen GMO Cụ thể, từ ngày 01/07/2016 tất cả các sản phẩm GMO bày bán tại bang Vermont (Mỹ) đều phải dán nhãn

Brazil hiện là nước sản xuất cây trồng GMO lớn thứ hai trên thế giới cũng yêu cầu dãn nhãn cho cả hai loại thực phẩm làm thức ăn cho người hoặc động vật nếu

có chứa hoặc được sản xuất từ GMO

Trong khi đó tại một số nước, việc quy định dán nhãn dựa trên tỷ lệ GMO trong một sản phẩm thực phẩm Cụ thể, những nơi như Liên minh châu Âu, Ả-rập Saudi, Thổ Nhĩ Kỳ và Úc tỷ lệ GMO ở ngưỡng 0,9% Các nước khác cho phép đưa GMO vào mức độ cao hơn như Hàn Quốc là 3% và Nhật Bản là 5% [27]

Theo thông tư liên tịch số 45 giữa Bộ Khoa học Công nghệ và Bộ Nông nghiệp

và Phát triển Nông thôn ban hành cuối tháng 11/2015 thì từ 08/01/2016, thực phẩm GMO được đóng gói sẵn bắt buộc phải dán nhãn bằng tiếng Việt có ghi rõ “biến đổi gen” Bên cạnh đó, với sản phẩm đóng gói sẵn có ít nhất một thành phần nguyên liệu GMO lớn hơn 5% tổng nguyên liệu được sử dụng đều phải ghi nhãn khi lưu thông tại thị trường Việt Nam Đối với những sản phẩm có diện tích để ghi nhãn nhỏ hơn 10cm2 thì trên nhãn bắt buộc phải có tên hàng hóa và cụm từ “biến đổi gen”; những nội dung bắt buộc còn lại không thể hiện trên nhãn thì phải được ghi trong tài liệu kèm theo hàng hóa

Theo thông tư 45, một số trường hợp được miễn ghi nhãn GMO bao gồm:

- Thực phẩm mang theo người nhập khẩu để tiêu dùng cá nhân trong định mức được miễn thuế nhập khẩu; thực phẩm trong túi ngoại giao, túi lãnh sự; thực phẩm tạm nhập tái xuất, thực phẩm quá cảnh, chuyển khẩu; thực phẩm gửi kho ngoại quan; thực phẩm là mẫu thử nghiệm hoặc nghiên cứu; thực phẩm là mẫu trưng bày hội chợ, triển lãm;

- Nguyên liệu, phụ gia thực phẩm, chất hỗ trợ chế biến thực phẩm, bao bì chứa đựng thực phẩm, nhập khẩu về để sản xuất nội bộ không bán ra thị trường, chỉ vận chuyển nội bộ giữa các kho từ tỉnh này qua tỉnh khác thuộc cùng một hệ thống trong doanh nghiệp [5]

1.2.4 Tình hình nghiên cứu thực phẩm biến đổi gen tại Việt Nam

Công nghệ sinh học là một lĩnh vực còn mới ở Việt Nam Do đó, việc nghiên cứu và ứng dụng GMO mới đang bước những bước đầu tiên trong quá trình phát triển Một vài nghiên cứu về GMO mới chỉ diễn ra trong quy mô phòng thí nghiệm

và tập trung ở một số viện nghiên cứu đầu ngành trong cả nước thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Trong đó,

tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các nghiên cứu tạo GMO chủ yếu trên đối tượng vi sinh vật, thực vật, động vật và được tiến hành ở các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới Tại Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, các nghiên cứu thường được tiến hành trên đối tượng thực vật tại Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng song Cửu Long

Nhìn chung, trong quy trình nghiên cứu tạo các sinh vật biến đổi gen, bước quan trọng đầu tiên được thực hiện nhiều ở Việt Nam là phân lập, tuyển chọn các gen quý

có giá trị ứng dụng cao tiến tới sử dụng để chuyển vào sinh vật nhận nhằm tạo nên những giống lý tưởng Một số gen có giá trị nông nghiệp đã được tuyển chọn bao

gồm gen chịu hạn, lạnh, kháng bệnh ở lúa; gen cry và vip mã hóa các protein độc tố

có hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gen mã hóa

protein bất hoạt hóa ribosome ở cây mướp đắng và gen mã hóa α-amylase của cây đậu cô ve có hoạt tính diệt côn trùng; gen mã hóa protein vỏ của virus gây bệnh đốm vòng ở cây đu đủ; gen mã hóa kháng nguyên vỏ của các chủng virus dại… Các gen có giá trị y dược phải kể đến các gen mã hóa cho một số kháng nguyên của

virus và vi khuẩn như gen mã hóa kháng nguyên E của virus Dengue typ I và typ II

sử dụng trong chuẩn đoán sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue [23] Song song với

những nghiên cứu trên, hướng nghiên cứu thiết kế các vector mang gen có giá trị chủ yếu để biểu hiện trong vi khuẩn và trong thực vật được thực hiện ở nhiều phòng thí nghiệm trên cả nước Trên đối tượng thực vật, hướng nghiên cứu hoàn thiện các phương pháp chuyển gen và các quy trình tái sinh cây khởi đầu cho những nghiên cứu chuyển gen có giá trị vào các đối tượng cây trồng cũng nhận được sự quan tâm của nhiều nhóm tác giả Gần đây, hướng nghiên cứu nuôi cấy tế bào động vật nhằm hoàn thiện quy trình tiến tới sử dụng để biểu hiện gen trên tế bào động vật nuôi cấy cũng bắt đầu được tiếp cận nghiên cứu

1.3 Các phương pháp xác định cây trồng biến đổi gen

1.3.1 Phương pháp sử dụng protein như là đích phân tích

Protein có thể phát hiện được bằng cách ứng dụng các kháng thể đặc thù Trong trường hợp này, một kháng thể đặc thù thường được tạo ra để phát hiện một protein Mức độ ái lực của các kháng thể đối với protein sẽ phụ thuộc vào cấu hình protein sau khi tách chiết Tính đặc trưng của kháng thể được sử dụng cần được chứng minh (ví dụ: không có khả năng phản ứng chéo) Việc phát hiện sinh vật biến đổi gen qua phân tích dòng đặc hiệu bằng định lượng protein không thể thực hiện được chính xác nếu có nhiều hơn một sinh vật biến đổi gen có biểu hiện cùng một protein

Các phương pháp sàng lọc có thể có lợi cho việc đánh giá sản phẩm có chứa hay không chứa các vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen dựa trên sự có mặt các protein biểu hiện Các ví dụ về phương pháp sàng lọc là dạng mẫu que thử và ELISA định tính Việc định lượng sinh vật biến đổi gen trong một loại chất nền nhất định có thể được thực hiện bằng các phương pháp dựa vào protein, chẳng hạn như phương pháp dùng ELISA Phương pháp này có thể phù hợp với chất nền cần phân tích và các chất chuẩn có thể được sử dụng để xây dựng đồ thị chuẩn để từ đó tính được hàm lượng protein trong mẫu thử nghiệm

1.3.2 Phương pháp sử dụng DNA đích

Đặc trưng của các phương pháp phân tích sử dụng DNA đích là để xác định sự

có mặt của các vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen, phụ thuộc vào các tính chất cụ thể của trình tự DNA đích Ứng dụng và phân loại khác của tính đặc hiệu như sau:

Phương pháp dựa vào taxon đích: Tìm thấy các trình tự DNA trong một taxon đích, thường là một loài nhưng có thể là cấp phân loại nhỏ hơn hoặc cao hơn Các phương pháp dựa vào taxon đích có thể dùng để đánh giá sự có mặt, chất lượng và

số lượng DNA có nguồn gốc từ taxon và đôi khi được sử dụng như là một điểm chuẩn để định lượng tương đối vật liệu có nguồn gốc biến đổi gen Tính đặc hiệu cần được xây dựng bằng các số liệu thực nghiệm

Phương pháp sàng lọc tìm thấy: Các trình tự DNA đích trong một vài loài nhưng không nhất thiết trong toàn bộ các dòng biến nạp Các trình tự này cũng được tìm thấy trong nguyên liệu không biến đổi gen, chẳng hạn do sự có mặt của virus và vi khuẩn tự nhiên Các phương pháp sàng lọc giúp cho việc đánh giá sự có mặt hay không có mặt sản phẩm có chứa nguyên liệu có nguồn gốc biến đổi gen Ví dụ, phương pháp sàng lọc là định tính PCR để phát hiện đoạn khởi động 35S-CaMV [3]

1.3.3 Một số trình tự DNA đích được áp dụng phương pháp sàng lọc

Phát hiện trình tự DNA có nguồn gốc từ đoạn khởi động (promoter) 35S của virus khảm súp lơ (CaMV): Do promoter 35S-CaMV có mặt trong một số thực vật biến đổi gen Đoạn DNA 195bp trong promoter 35S-CaMV được khuếch đại bằng PCR và được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza sau khi tách (Phụ lục B, TCVN 7605:2005)

Phát hiện trình tự kết thúc (terminator) trên gen nopalin synthaza (NOS) có

nguồn gốc từ Agrobacterium tumefaciens: Do nhiều thực vật biến đổi gen có chứa

trình tự NOS-terminator nên phương pháp này có thể được sử dụng để sàng lọc sự

có mặt của thành phần từ thực vật biến đổi gen Đoạn DNA có kích thước 118bp nằm trong trình tự kết thúc (terminator) của NOS được khuếch đại bằng PCR và được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza (Phụ lục B, TCVN 7605:2005)

Phát hiện trình tự DNA có nguồn gốc từ đoạn khởi động (promoter) FMV 34S ở cây cải dầu GM RT73 Do promoter 34S-FMV có mặt trong một số thực vật biến đổi gen Virus dạng mosaic (FMV) là một phân đoạn, virus RNA sợi đơn (mạch

âm) được xác định là tác nhân gây bệnh rêu mồi (Ficus carica) trên cây cải dầu

FMV có thể gây ra một loạt các triệu chứng khác nhau ở mức độ nghiêm trọng, trong đó có lá úa biến dạng và khảm hoặc đổi màu hoa văn, cũng như khảm trên hoa quả non Promoter FMV có chiều dài 196bp thường được chuyển các gen ở cây cải dầu, đậu nành Sự hiện diện của promoter 34S-FMV có trong nhiều cây biến đổi gen, đặc biệt là trong hạt cải dầu, khoai tây, đậu nành, bông, cà chua, củ cải Một số event được phát hiện bởi promoter 34S-FMV RT73 cải dầu, MON1445, MON1698

và MON88913 của vải, MON89788 ở đậu nành, H7-1 ở củ cải đường Một số event không phát hiện được như đậu nành 40-3-3 và MON810, MON863, TC1507, giống ngô Bt11, GA21, NK603, Bt176 (Phụ lục B, ISO 21569:2005/2013)

1.3.4 Giới thiệu chung về phương pháp PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới

 Nguyên tắc:

Đây là phương pháp invitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, đó

là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh

Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

 Giai đoạn biến tính: tách chuỗi DNA từ mạch đôi thành dạng mạch đơn

 Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung

 Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc Phương pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và sử dụng máy giải trình tự tự động

Phương pháp này được phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR được đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang Phương pháp này có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến trên các phòng thí nghiệm thế giới

Hiện nay có nhiều phương pháp PCR cải tiến như nested PCR, PCR đẳng nhiệt, Realtime PCR

Định nghĩa kỹ thuật Realtime PCR là một phương pháp khuếch đại gene và đọc kết quả được thực hiện đồng thời trong cùng một ống hay một giếng mẫu Phương pháp này đòi hỏi phải có một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ giếng mẫu và được trang bị chương trình vi tính cho phép xử lý kết quả, xác định sự biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại Nguyên tắc thực chất hệ thống Realtime PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính Realtime PCR cho biết kết quả lượng DNA hình thành ở từng thời điểm trong suốt tiến trình phản ứng Realtime PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo

độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành

Multiplex PCR bao gồm nhiều cặp mồi trong một hỗn hợp PCR duy nhất để tạo

ra bản sao kích thước khác nhau đặc trưng cho các trình tự DNA khác nhau Với nhiều gen đích được khuếch đại cùng một lúc, nhiều thông tin thu được từ một lần chạy mà không đòi hỏi nhiều hóa chất và thời gian thực hiện Nhiệt độ gắn mồi phải được tối ưu hóa cho từng cặp mồi để chúng có thể thực hiện chính xác trong một cặp bazo phải khác nhau để tạo ra các băng có thể phân biệt bằng mắt thường khi điện di [24]

Nested PCR làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR bằng cách giảm độ nhiễu

do sự khuếch đại DNA không đặc hiệu Sử dụng hai cặp mồi trong hai phản ứng PCR liên tiếp Trong phản ứng đầu tiên, một cặp mồi được sử dụng để tạo ra các sản phẩm DNA, bên cạnh đoạn DNA đích mà phản ứng hướng đến vẫn có thể bao gồm các đoạn DNA khuếch đại không đặc hiệu Các sản phẩm sau đó được sử dụng tiếp phản ứng PCR thứ hại với cặp mồi mà vị trí gắn khác hoàn toàn hoặc khác một phần từ vị trí 3 của mỗi mồi ở phản ứng đầu tiên PCR lồng thường thành công hơn phản ứng PCR thông thường, đặc biệt trong trường hợp khuếch đại các đoạn DNA dài, nhưng nó cũng đòi hỏi thông tin chi tiết hơn về các trình tự đích [24]

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại phòng Kiểm nghiệm Sinh học, Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4

Địa chỉ: 30 Hàm Nghi, Quận 1, TP Hồ Chí Minh

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ tháng 03/2017 đến tháng 07/2017

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Nguồn mẫu

2.2.1.1 Nguồn mẫu xét nghiệm

Mẫu đối chứng dương do phòng Kiểm nghiệm Sinh học cung cấp được thực hiện để đánh giá phương pháp

Mẫu được thu bên ngoài với 10 nguồn mẫu ngẫu nhiên để phân tích thực nghiệm bằng phương pháp

2.2.1.2 Mồi phản ứng PCR

Kích thước sản phẩm khuếch đại là 196bp

Mồi xuôi FMV-F: 5-AAG CCT CAA CAA GGT CAG-3

Mồi ngược FMV-R: 5-CTG CTC GAT GTT GAC AAG-3

Bảng 2.1 Trình tự mồi có sẵn sử dụng trong nghiên cứu [13]

Kích thước khuếch đại (bp) FMV AR016589

5-AAG CCT CAA CAA GGT CAG-3

5-CTG CTC GAT GTT GAC AAG-3 52 - 65 196bp

2.2.1.3 Thang DNA

Để ước lượng kích thước các đoạn DNA được khuếch đại, trong nghiên cứu này

sử dụng loại thang 100bp Ladder Plus (Promega) bao gồm 11 vạch với kích thước như:

Hình 2.1 Kích thước các vạch của thang 100bp DNA Ladder Plus

2.2.1.4 Mẫu chuẩn GMO, chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu

Mẫu sử dụng chính cho nghiên cứu và dùng làm đối chứng dương là các mẫu chuẩn dương GMO Các vi sinh vật gây bệnh lan truyền qua đường thực phẩm khác cũng được sử dụng trong phần đánh giá hiệu lực sơ cấp của phương pháp và khẳng định độ đặc hiệu, tính chọn lọc của cặp mồi đã chọn

Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật

STT Tính thuần

Số lượng Ký hiệu

7 Vibrio parahaemotilycus ATCC 17802 01 V.para

8 Eschechiria coli ATCC 25922 01 E.coli

9 Salmonella Typhymurium ATCC 14028 01 S.typhi

10 Staphylococcus aureus ATCC 6538 01 S.aureus

*ATCC là chủng vi sinh vật chuẩn

*Kit IQ2000 là bộ kit dùng để phát hiện các virus gây bệnh trên tôm, cá và đƣợc cung cấp bởi hãng GeneReach Biotecnology Corp (Đài Loan) bao gồm: virus gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus-WSSV); virus gây bệnh đầu vàng (Yellow head virus-YHV)

- Nuclease - Free Water

- Buffer phản ứng (5X Colorless GoTaq Flexi Buffer)

- MgCl2 25mM

- dNTP thành phần (PCR Nucleotide Mix)

- Mồi xuôi (Upstream primer)

- Mồi ngược (Downstream primer)

- Gotaq G2 Hot Start Polymerase

- Đệm TAE 1X (4,48g Tris; 2ml Na2EDTA 0,5M pH 8; 1,14ml glacial acetic acid; nước cất đủ 1000ml)

- Agarose phân tích sản phẩm sau phản ứng PCR

- Dung dịch nạp mẫu Blue/Orange Loading Dye 6X, thuốc nhuộm Dynamid Nucleotid Dye 6X

- Bộ Kit TaKaRa EX Taq

2.2.2.2 Dụng cụ và thiết bị

- Cân kỹ thuật (d = 0,01gram)

- Cân phân tích (d = 0,0001gram)

- Máy PCR (Applied Biosystems ABI 2720 Thermal Cycler)

- Bộ điện di DNA liền nguồn Mupid-eXU

- Bộ chụp ảnh điện di (ATTO) và Video Graphic Printer

- Pipet, transferpipet các mức 1-10l; 10-100l; 100-1000l

- Máy đo OD

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu mẫu

Mẫu được thu và cắt đủ lượng tách chiết và đựng trong các ống falcon, lưu trữ trong tủ lạnh -30ºC

2.3.2 Phương pháp bảo quản mẫu

Mẫu dư sau khi phân tích được bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 4ºC hoặc bảo quản trong cồn

2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA

2.3.3.1 Hóa chất tách chiết

Tách chiết DNA bằng bộ Kit SureFood PREP Basic Art No S1052 tách chiết DNA: Proteinase K, đệm ly giải (Lysis buffer), đệm gắn kết (Binding buffer), đệm

rửa 1 (Pre-Wash buffer), đệm rửa 2 (Wash buffer), đệm ly giải DNA (Elution buffer)

Bảng 2.3 Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA

Đệm ly giải

(Lysis buffer) Dung dịch đệm phá vỡ cấu trúc tế bào

Proteinase K Thủy phân protein, đặc biệt là protein liên kết với DNA Đệm gắn kết

(Binding buffer) Thu acid nucleic

Bước 5: Thêm 550µl đệm rửa 1 rửa lần một, ly tâm 12000 vòng/phút

Bước 6: Thêm 550l đệm rửa 2 rửa lần hai, ly tâm 12000 vòng/phút loại bỏ nước

Bước 7: Ủ 100l đệm ly giải DNA ở 65ºC, giữ ở nhiệt độ này Cho vào cột lọc

ly tâm 10000 vòng/phút thu dịch DNA

2.3.3.3 Quy trình chung tách và tinh sạch DNA bằng Kit SureFood PREP Basic

Hình 2.2 Quy trình tách chiết DNA bằng bộ Kit SureFood PREP Basic

Art No S1052

 Lưu ý:

- Cần ủ 100µl đệm ly giải DNA ở nhiệt độ 65ºC trước khi tách chiết DNA

- Bật máy heat nhiệt (gia nhiệt) trước khi tách chiết

- Lấy Proteinase K trong tủ đông khi sử dụng, tránh để môi trường ngoài

2.3.3.4 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích

Mẫu DNA ly trích được điện di trên gel Agarose 1% trong dung dịch đệm TBE1X ở hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 400mA trong 30 phút

Sau khi chạy điện di xong, gel được đưa vào máy chụp ảnh DNA Dưới tia UV, Diamond Dye đã liên kết với sợi DNA sẽ phát quang và tạo thành các vạch trên gel

Để ước lượng độ tinh sạch của mẫu ly trích, có thể tiến hành tính tỷ lệ OD260nm/OD280nm Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 thì mẫu ly trích được xem là sạch Nếu tỷ lệ < 1,8 là mẫu nhiễm nhiều protein, tỷ lệ > 2,0 thì cần tiến hành pha loãng mẫu và thực hiện đo lại giá trị OD

2.3.4.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR

 Mẫu DNA:

Mẫu DNA sẽ được ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượng nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau Đối với DNA thực vật thường được ly trích từ mô lá, DNA động vật thường được ly trích từ máu, lông, mô…

Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao, tuy nhiên để thu được kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết

Số lượng DNA cần cho một phản ứng PCR vào khoảng 5 - 10ng Nồng độ DNA

có thể xác định được nhờ đo OD (mật độ quang) ở bước sóng 260nm Khi DNA tinh khiết, lượng DNA được tính theo công thức:

- 1 OD260nm = 50 ng/µl (đối với DNA sợi kép)

- 1 OD280nm = 40 ng/µl (đối với DNA sợi đơn)

 Primer (mồi):

Là một đoạn nucleotide có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F-primer (mồi xuôi)

và R-primer (mồi ngược)

Cặp primer sẽ quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR, nếu primer được thiết

kế đúng thì đoạn DNA đích mới được khuếch đại chính xác

 dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP):

Nồng độ dNTPs thường được sử dụng là 20 - 200µM Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự ức chế phản ứng Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTPs cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR Thông thường thì nồng độ của các dNTPs sẽ là như nhau Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTPs sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase

Nồng độ dNTPs thích hợp cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ

Mg2+, nồng độ primer, số chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm được khuếch đại Vì thế, nồng độ dNTPs tối ưu cho từng phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm

loại DNA polymerase bền với nhiệt, được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus

sống ở suối nước nóng Với enzyme này thì chỉ cần cho một lần Taq polymerase là được

Nồng độ Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0,1 - 0,5 đơn vị/100µl dung dịch phản ứng Nếu nồng độ quá cao, những sản phẩm không mong muốn có

thể xuất hiện làm sai lệch kết quả Nếu nồng độ quá thấp thì sẽ không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo lượng sản phẩm PCR theo ý muốn

Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một nucleotide loại A vào đầu tận cùng 3 của sản phẩm PCR, điều này rất quan trọng trong việc tạo dòng (TA - cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu tận cùng

là đầu bằng (blunt end ligation) Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu…

 Ion kim loại Mg2+

: Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động

2.3.4.3 Nguyên tắc của phản ứng PCR

Phản ứng PCR thường được thực hiện qua 35 - 40 chu kỳ Mỗi chu kỳ bao gồm các bước: denature (biến tính DNA), annealing (gắn mồi), extension (kéo dài) Giai đoạn denature (biến tính DNA): thường được tiến hành ở nhiệt độ từ 94 - 98ºC, trong 40 - 60 giây (thời gian có thể dài hoặc ngắn hơn tùy theo độ dài của DNA mẫu) Đây là bước làm biến tính DNA mẫu từ sợi kép thành sợi đơn dưới tác dụng của nhiệt độ bằng cách phá vỡ các liên kết hydro

Giai đoạn annealing (gắn mồi): 50 - 60ºC trong 30 giây Đây là bước primer gắn đặc hiệu vào sợi DNA đích (lúc này ở dạng sợi đơn) Nhiệt độ gắn mồi tùy thuộc vào độ dài của từng cặp primer

Giai đoạn extension (kéo dài): 72ºC, 30 - 90 giây tùy thuộc độ dài DNA đích Đây là bước kéo dài primer nhờ hoạt động của Taq polymerase Ở nhiệt độ 72ºC, hoạt động của Taq polymerase sẽ đạt hiệu quả tối ưu

Sau 25 - 35 chu kỳ, phản ứng tiếp tục giai đoạn ủ ở 72ºC trong 5 - 20 phút để hoàn thiện các sản phẩm PCR