Phân Lập Và Định Danh Một Số Chủng Nấm Gây Bệnh Trên Lúa (Oryza Sativa)

Tuy nhiên do ảnh hưởng của quá trình thâm canh trong sản xuất nông nhiệp, tình hình dịch bệnh có nhiều biến đổi dẫn đến năng suất và chất lượng lúa đang bị suy giảm do sự tác động của nấ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM

GÂY BỆNH TRÊN LÚA (Oryza sativa)

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀNG DŨNG

ThS LÊ QUỲNH LOAN Sinh viên thực hiện :NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG MSSV: 1311100334 Lớp: 13DSH02

TP Hồ Chí Minh, 2017

i

CAM ĐOAN

Người thực hiện đề tài xin cam đoan: Đồ án này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Nguyễn Hoàng Dũng, ThS Lê Quỳnh Loan Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong

đề tài là trung thực, đề tài không trùng với bất kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào Những thông tin tham khảo đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thanh Hương

ii

LỜI CÁM ƠN

Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ Đức, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn thành tốt đồ án này Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

TS Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm

đề tài

TS Nguyễn Hoàng Dũng và ThS Lê Quỳnh Loan phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian thực hiện đồ án

Thầy Ngô Đức Duy, phòng Vi sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Em xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy, cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường của trường đại học HUTECH đã tận tình truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm trong suốt 4 năm qua

Các bạn lớp 13DSH02 đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Cuối cùng, con xin cám ơn Ba Mẹ, đã nuôi nấng, chăm sóc và tạo mọi điều kiện cho con ăn học thành người có ích cho xã hội, người đã luôn bên cạnh động viên, định hướng cho con những khi gặp khó khăn trong công việc

Xin trân trọng cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thanh Hương

iii

MỤC LỤC

CAM ĐOAN i

LỜI CÁM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Tình hình nghiên cứu 1

3 Mục đích nghiên cứu 2

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Kết quả đạt được 3

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Sơ lược về cây lúa 4

1.2 Một số bệnh thường gặp trên lúa 5

1.2.1 Bệnh đạo ôn (bệnh cháy lá lúa) 5

1.2.2 Bệnh đốm nâu trên lúa 11

1.2.3 Bệnh tiêm lửa hại lúa 13

1.2.4 Bệnh khô vằn 15

1.3 Định danh bằng sinh học phân tử 20

1.3.1 Phương pháp ly trích DNA 20

1.3.2 PCR trong định danh vi sinh vật 22

1.4 Tái nhiễm nhân tạo theo quy tắc Koch 25

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Vật liệu, thiết bị và hóa chất 27

iv

2.1.1 Dụng cụ và thiết bị 27

2.1.2 Nguồn mẫu 28

2.1.3 Hóa chất 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Thu mẫu 29

2.2.2 Phân lập và làm thuần nấm 29

2.2.3 Phương pháp phòng ẩm 29

2.2.4 Phương pháp bảo quản chủng nấm 30

2.2.5 Định danh bằng sinh học phân tử (kỹ thuật PCR) 31

2.2.6 Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 35

3.1 Kết quả phân lập và làm thuần nấm bệnh 35

3.1.1 Kết quả thu nhận mẫu lá bị bệnh 35

3.1.2 Kết quả phân lập, làm thuần và quan sát hình thái 36

3.2 Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS 44

3.3 Kết quả so sánh vùng gen ITS 45

3.4 Kết quả tái nhiễm theo quy tắc Koch 48

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường 1

PHỤ LỤC B: So sánh trình tự tương đồng của các đoạn gene trên NCBI 2

PHỤ LỤC C: Kết quả trình tự vùng gen bảo tồn ITS……….6

v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Bp Base Pair

CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA Deoxyribonucleotide Acid

EDTA Ethylene – Diamine – Tetraacetic – Acid

ITS Internal transcribed spacer

PCR Polymerase Chain Reation

PDA Potato Dextrose Agar

PDB Potato Dextrose Broth

TAE Tri – Acetic acid – Ethylenediamine – Tetraacetate

TE Tris – Ethylenediamine – Tetraacetate

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại nấm M oryzae 9

Bảng 1.2 Phân loại nấm C lunata 11

Bảng 1.3 Phân loại nấm B oryzae 14

Bảng 1.4 Phân loại nấm R solani 17

Bảng 1.5 Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS 24

Bảng 3.1 Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu tại đồng ruộng 35

vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Bản đồ mồi vùng gen ITS 24

Hình 3.1 Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu được trên đồng ruộng 36

Hình 3.2 Chủng nấm CG1 37

Hình 3.3 Chủng nấm CG2 38

Hình 3.4 Chủng nấm CG3 39

Hình 3.5 Chủng nấm BL1 40

Hình 3.6 Chủng nấm BL2 40

Hình 3.7 Chủng nấm BL3 41

Hình 3.8 Chủng nấm VL1 42

Hình 3.9 Chủng nấm VL2 42

Hình 3.10 Chủng nấm HM1 43

Hình 3.11 Chủng nấm HM2 44

Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm ly trích và PCR 45

Hình 3.13 Mẫu lúa đối chứng (phun nước cất) 49

Hình 3.14 Mẫu lúa thí nghiệm (phun dịch bào tử ở nồng độ 106 tế bào/ml) 49

Hình 3.15 Chủng nấm phân lập từ thí nghiệm tái nhiễm 50

1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Lúa (Oryza sativa) là loại lương thực quan trọng được trồng nhiều trên thế

giới đặc biệt là ở các nước châu Á, trong đó có Việt Nam Nó có vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp, là nguồn cung cấp lương thực chính Tuy nhiên do ảnh hưởng của quá trình thâm canh trong sản xuất nông nhiệp, tình hình dịch bệnh có nhiều biến đổi dẫn đến năng suất và chất lượng lúa đang bị suy giảm do sự tác động của nấm bệnh, đặc biệt là các bệnh như đạo ôn, bệnh đốm nâu,… gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa Triệu chứng ban đầu của các bệnh này trên lá khá giống nhau, vì vậy việc xác định các tác nhân gây bệnh này thường rất mất thời gian và khó khăn Do đó, việc phát hiện kịp thời và chính xác các tác nhân gây bệnh trên lúa sẽ giúp ích cho việc đưa ra các biện pháp phòng ngừa và điều trị sớm, kịp thời và hiệu quả

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ sinh học, nhiều kỹ thuật mới ra đời trong đó có kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được xem là một phương pháp phổ biến và thông dụng trong việc xác định các tác nhân gây bệnh cây trồng vì đáng tin cậy, tiết kiệm thời gian và tính chính xác cao, tìm ra được tác nhân gây bệnh ngay ở giai đoạn đầu khi mới nhiễm bệnh

Trên cơ sở đó, tôi đã thực hiện đề tài “Phân lập và định danh một số

chủng nấm gây bệnh trên lúa (Oryza sativa)” bằng kỹ thuật PCR sử dụng đoạn

mồi ITS1 – F và ITS4, nhằm phát hiện bệnh một cách chính xác và nhanh chóng, đưa ra cách phòng trừ hữu hiệu, giảm thiệt hại đến mức thấp nhất

2 Tình hình nghiên cứu

❖ Các nghiên cứu trong nước

– Luận văn thạc sĩ nông nghiệp “Nghiên cứu bệnh đạo ôn trên một số dòng,

giống lúa của viện cây lương thực và cây thực phẩm, vụ xuân 2010” Phạm

Tự Bắc (2010) Mục đích của đề tài này nhằm nắm được tác hại và đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh đạo ôn trên một số giống lúa tại Viện

2

Cây lương thực – Cây thực phẩm trong vụ xuân 2010, xác định chủng sinh

lý nấm đạo ôn và nghiên cứu một số đặc tính của chúng

– Báo cáo khoa học “Xác định nấm gây bệnh lem lép hạt lúa tại Đồng bằng

sông Cửu Long” Trần Thị Thu Thủy (2011) Tạp chí khoa học 2011 17a

155 – 163, Trường Đại học Cần Thơ Đề tài này được thực hiện nhằm xác định nấm gây bệnh lem lép hạt tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, đã xác định được 11 chủng nấm

– Báo cáo khoa học “Ứng dụng phương pháp PCR trong việc xác định nấm

gây bệnh đạo ôn trên lúa, Magnaporthe oryzae” Đoàn Thị Hòa et al

(2016) Tạp chí khoa học Đại học mở TP.HCM, số 4 (49) 104 – 110 Xác định nấm đạo ôn bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt nhằm giúp giảm chi phí, thời gian và công sức

❖ Các nghiên cứu ngoài nước

– Hajano et al (2011) “Rice blast – mycoflora, symptomatology and

pathogencity” Nghiên cứu về đặc tính, triệu chứng của một số loại nấm

gây bệnh trên lúa được phân lập từ hạt và lá lúa

– Kamaluddeen et al (Dec 2013) “A new blight disease of rice caused by

Curvularia lunata from Uttar Pradesh” Nghiên cứu này mô tả về bệnh

đốm nâu do Curvularia lunata gây ra

3 Mục đích nghiên cứu

Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa thu thập ở 2 tỉnh đồng bằng sông Cửu Long (Long An, Vĩnh Long) và huyện Hóc Môn, từ những kết quả của nghiên cứu này, có thể dựa vào những đặc điểm và những nghiên cứu về nấm bệnh rồi đưa ra các biện pháp khắc phục kịp thời, nhanh chóng, tránh tổn thất

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

– Phân lập và làm thuần nấm bệnh

– Quan sát đặc điểm hình thái (khuẩn ty và bào tử)

– Định danh bằng sinh học phân tử

– Tái nhiễm nấm bệnh trên cây lúa

3

5 Phương pháp nghiên cứu

 Phương pháp phân lập và làm thuần nấm bệnh

 Phương pháp phòng ẩm (xem sợi khuẩn ty và bào tử)

 Phương pháp tách chiết và thu nhân bộ gen DNA (theo phương pháp CTAB)

 Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi ITS1 – F và ITS4

 Phương pháp tái nhiễm của Robert Koch

6 Kết quả đạt được

 Đề tài đã phân lập và làm thuần được 10 chủng nấm gây bệnh trên lúa

 Thu nhận bộ gen DNA của 3 chủng nấm

 Nhân bản thành công vùng gen ITS bằng phương pháp PCR

 Thực hiện tái nhiễm theo phương pháp Koch, kết quả có 1 loài có khả năng tái nhiễm trên lúa

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Nội dung của đồ án tốt nghiệp này gồm 4 chương:

 Chương 1 là tổng quan tài liệu: Giới thiệu sơ lược về cây lúa, một số bệnh thường gặp và chủng nấm gây bệnh trên lúa

 Chương 2 là vật liệu và phương pháp: Mô tả các phương pháp nghiên cứu được sử dụng

 Chương 3 là kết quả và biện luận: Đưa ra kết quả đạt được và nhận xét, biện luận các kết quả này

 Chương 4 là kết luận và kiến nghị: Kết luận về các kết quả thí nghiệm đã đạt được và kiến nghị tiếp tục hoàn thiện thêm các kết quả chưa đạt được

4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về cây lúa

Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo (Gramineae),

họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima Loài Oryza sativa là lúa trồng ở Châu Á và Oryza glaberrima là lúa trồng ở Châu Phi Năm 1753, Lineaeus là người đầu tiên đã mô tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi

Oryza Dựa vào mày hạt và dạng hạt tác giả đã phân chi Oryza thành bốn nhóm là sativa, granulata, coarctala, rhynchoryza và chi Oryza gồm tất cả 19 loài [8]

Morinaga là người đầu tiên đã sử dụng kỹ thuật phân tích genome để định danh các loài lúa dại Công trình nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học này đã giúp phân tích các loài lúa được chính xác hơn [8]

Hội nghị di truyền lúa Quốc tế đã tổ chức họp tại Viện nghiên cứu lúa Quốc

tế, Philippines năm 1967 khẳng định chi Oryza có 22 loài trong đó có 20 loài lúa dại

và hai loài lúa trồng [14]

Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New Ginea

là loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia thành bốn

nhóm genome [22]

Ngày nay, các nhà phân loại học đều nhất trí là chi Oryza có 23 loài, trong đó

21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza glaberrima thuộc loại nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây

và Trung Phi còn loài Oryza sativa được gieo trồng khắp thế giới và được chia thành hai loài phụ là Indica và Japonica Trong quá trình tiến hoá của cây lúa, ngoài hai loài phụ Indica và Japonica còn có nhiều loại hình trung gian như Javanica v.v

[7], [9]

Tang và ctv (2004), so sánh bộ gen lục lạp của giống lúa 93 – 11 (đại diện

loài phụ Indica) và giống lúa Peiai'64S (giống lúa lai thuộc loài phụ Indica, nhưng nguồn gốc mẹ thuộc loài phụ Japonica) cho thấy sự phân chia bộ gen lục lạp của hai loài phụ Indica và Japonica xảy ra cách đây khoảng 86.000 – 200.000 năm

trước [21]

5

Vitte và ctv (2004) cũng cho rằng hai loài phụ Indica và Japonica được phân

hoá độc lập với nhau, cách đây khoảng 200.000 năm Trong khi đó, tác giả Jianxin

phân tích ADN nhân tế bào và cho rằng lúa Indica và Japonica được tách ra từ một

tổ tiên chung, cách đây khoảng 440.000 năm [23], [18]

Jason và ctv (2006), nghiên cứu biến đổi trình tự ADN của ba vùng gen bằng phương pháp địa lý - thực vật để khảo sát quá trình thuần hoá lúa trồng Kết quả cho thấy, cây lúa trồng đã được thuần hóa ít nhất là hai lần từ các quần thể khác nhau

của loài Oryza rufipogon và sản phẩm của hai lần biến đổi này đã tạo ra hai loài phụ

là Indica và Japonica [17]

Zhu và ctv (2007), trên cơ sở giải mã trình tự ADN của 10 gen ở nhân tế bào của lúa cho rằng, quá trình thuần hoá liên quan chặt chẽ với quá trình giảm đa dạng

di truyền của các giống lúa dại Đa dạng di truyền của lúa Japonica thấp hơn 2 lần

so với đa dạng di truyền của lúa Indica [24]

1.2 Một số bệnh thường gặp trên lúa

1.2.1 Bệnh đạo ôn (bệnh cháy lá lúa)

Bệnh chính thức được phát hiện ở Ý vào năm 1560 Sau đó bệnh được quan sát thấy ở các nước châu Á như: Trung Quốc 1637, Nhật Bản 1760, Ấn Độ 1913,… đây là bệnh phân bố rộng và có mặt trên 80 quốc gia trồng lúa trên thế giới Ở nước

ta, Vincens (người Pháp) đã phát hiện một số bệnh ở Nam bộ vào năm 1921 Năm

1951, Roger (người Pháp) đã xác định sự xuất hiện và gây hại của bệnh ở vùng Bắc

bộ Ở miền Bắc, các vùng Hải Phòng, Thái Nguyên, Ninh Bình, Bắc Giang, Hà Đông bị thiệt hại nặng Ở đồng bằng sông Cửu Long, hàng năm thường có hai cao điểm của bệnh là tháng 11 – 12 dương lịch và tháng 5 – 6 dương lịch Các huyện Châu Thành, Chợ Gạo, Cai Lậy, Chợ Mới (An Giang), Thạnh Trị (Cần Thơ) là những nơi thường có bệnh [10], [11]

6

tấn công mọi giai đoạn của cây lúa; bắt đầu từ giai đoạn mạ hoặc sau khi gieo xạ cho đến trước trổ thì gọi là bệnh cháy lá Bệnh có thể gây hại trên cổ lá gọi là thối

cổ lá, hoặc gây hại trên cổ bông được gọi là thối cổ bông làm lép hạt, đôi khi bệnh

có thể gây lem vỏ hạt lúa [10]

Trên mạ: vết bệnh lúc đầu hình bầu dục nhỏ sau tạo thành hình thoi nhỏ hoặc dạng tương tự hình thoi, màu nâu hoặc nâu vàng Khi bệnh nặng, từng đám vết bệnh

kế tiếp nhau làm cây mạ có thể héo khô hoặc chết

Trên lá: vết bệnh hình thoi màu nâu nhạt, rộng ở phần giữa và nhọn ở hai đầu, giữa vết bệnh có màu xám tro, xung quanh nâu đậm, vòng ngoài cũng có màu nâu nhạt Kích thước vết bệnh biến thiên từ một chấm nhỏ như mũi kim đến chiều dài 1,5 cm, khi bệnh nặng các vết bệnh nối với nhau tạo thành những vệt lớn làm cho lá

bị cháy

Trên cổ lá: vết bệnh hình khum theo chiều cong giữa cổ lá và phiến lá Từ cổ

lá bệnh lan ra bẹ lá và phiến lá làm lá lúa khô lụi và gãy gục

Trên đốt thân: lúc đầu là một đốm nhỏ màu nâu sau lớn rộng ra thành một vành tròn bao quanh đốt thân làm cho thân tóp lại, màu đen Khi gặp trời mưa ẩm thân mềm nhũn dễ bị gãy khi mưa giông, gió

Trên cổ bông và gié lúa: vết bệnh ban đầu là đốm nhỏ, sau lan ra theo chiều dài làm cả đoạn cổ bông có màu nâu xám, khô Nếu nhiễm bệnh sớm (ngay sau trổ) làm cho toàn bộ bông lúa bị lép trắng; nhiễm bệnh muộn (vào thời kỳ làm hạt – chín) gây ra hiện tượng bông lúa nhỏ, có nhiều hạt lép, dễ gãy, gié lúa dễ rụng dẫn đến làm giảm năng suất lúa

Trên hạt: vết bệnh gây trên hạt không đồng nhất về hình dạng như trên lá lúa

mà có dạng đốm tròn hoặc không định hình, có màu nâu đen hoặc xám Nấm ký sinh ở vỏ trấu và có thể ở bên trong hạt Hạt giống bị nhiễm bệnh là nguồn bệnh lây truyền từ vụ này sang vụ khác [10], [11]

1.2.1.2 Quy luật phát sinh phát triển của bệnh

Bệnh phát sinh thất thường, tùy thuộc vào yếu tố ngoại cảnh Bệnh có thể phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ thấp (20oC), ẩm độ không khí cao và gió

7

mạnh Khi không đủ ánh sáng do mây mù, lúa sẽ tập trung nhiều Glutamic và nhiều amino acid khác nên sẽ tăng tính nhiễm của cây [10]

❖ Ảnh hưởng của thời tiết khí hậu

Nấm đạo ôn ưa nhiệt độ tương đối thấp, điều kiện nhiệt độ 20 – 28oC, ẩm độ không khí bão hòa và thời tiết âm u trong vụ lúa đông xuân là rất thích hợp cho bệnh phát sinh gây hại nặng nhất

Độ ẩm không khí và độ ẩm đất có tác dụng lớn tới tính mẫn cảm của cây đối với sự phát triển của nấm bệnh Trong điều kiện khô hạn, ẩm độ đất thấp hoặc ở điều kiện ngập úng kéo dài cây lúa dễ bị nhiễm bệnh, ẩm độ không khí cao lại thuận lợi cho vết bệnh phát triển Ở các vùng nhiệt đới có mưa thường xuyên kéo dài tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh gây hại nghiêm trọng [10]

❖ Ảnh hưởng của đất đai, phân bón đến bệnh

Những chân ruộng nhiều mùn, trũng ẩm, khó thoát nước; những vùng đất mới vỡ hoang, đất nhẹ, giữ nước kém, khô hạn và những chân ruộng có lớp sét nông rất phù hợp cho nấm bệnh đạo ôn phát triển và gây hại

Phân bón giữ vai trò đặc biệt quan trọng đối với sự phát sinh phát triển của bệnh đạo ôn ngay cả khi thời tiết không thuận lợi cho nấm phát triển nhưng do bón phân không hợp lý tạo điều kiện thúc đẩy bệnh phát sinh và gây hại mạnh

Mức độ ảnh hưởng của phân đạm tới bệnh biến động tùy theo loại đát, phương pháp bón và diễn biến khí hậu khi bón phân cho cây Khi sử dụng dạng đạm tác dụng nhanh như amonium sunfat quá nhiều, qua muộn hoặc bón vào lúc nhiệt

độ không khí thấp và cây còn non đều làm tăng tỷ lệ bệnh và mức độ gây hại của bệnh

Phân lân ảnh hưởng ít đến mức độ nhiễm bệnh của cây Bón phân ở liều lượng nào đó đối với đất thiếu lân có thể làm giảm tỷ lệ bệnh nhưng nếu sử dụng lân không hợp lý thì bệnh vẫn có thể tăng

Nếu bón kali trên nền đạm cao sẽ làm bệnh tăng so với trên nền đạm thấp Trong đất giàu kali nếu tăng mức độ bón phân kali trên nền đạm cao cũng có thể làm tăng mức độ bệnh của cây

8

Phân silic có tác dụng làm giảm độ nhiễm bệnh của cây Mức độ nhiễm bệnh của cây tỷ lệ nghịch với hàm lượng silic trong cây, do đó bón nhiều silic sẽ làm giảm mức độ nhiễm bệnh của cây [10], [2]

❖ Ảnh hưởng của giống lúa

Ngoài các yếu tố khí hậu thời tiết, đất đai và phân bón, đặc tính của giống có nhr hưởng rất lớn tới mức độ phát triển của bệnh trên đồng ruộng Những giống nhiễm bệnh nặng (giống mẫn cảm) không không những là những điểm bệnh phát sinh ban đầu mà còn là điều kiện cho bệnh dễ dàng lây lan hàng loạt hình thành nên dịch bệnh trên đồng ruộng

Đặc tính chống bệnh của cây lúa tăng khi tỷ lệ SiO2/N tăng Giống lúa chống bệnh chứa nhiều polyphenol hơn ở giống nhiễm bệnh Trong giống lúa chống bệnh

sẽ sản sinh ra hàm lượng lớn hợp chất Phytoalexin có tác dụng ngăn cản sự phát triển của nấm trong cây Tính chống bệnh của cây lúa do 23 gen kháng đạo ôn đã được phát hiện và đồng thời còn phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo của giống Nhìn chung, các giống đẻ nhánh tập trung, cứng cây, chịu phân, tỷ số khối lượng thân trên khối lượng 20 cm gốc nhỏ, ống rơm dày là những giống thể hiện khả năng chống chịu bệnh tốt

Nhiều giống lúa đã khảo nghiệm và đánh giá là những giống có năng suất cao và chống chịu đạo ôn như IR1820, IR17494, C70, C71, RSB13, Xuân số 2, Xuân số 5, X20, X21, V14, V15, v.v… và đã được gieo trồng rộng rãi ở miền Trung

và vùng đồng bằng sông Hồng

Một số giống lúa nếp hoặc NN8, CR203 là giống mẫn cảm bệnh đạo ôn [10], [7]

1.2.1.3 Nguyên nhân gây bệnh

❖ Nguồn gốc và phân loại

Bệnh do nấm Magnaporthe oryzae gây ra, thuộc họ Moniliales, lớp nấm Bất toàn Phân loại khoa học của nấm M oryzae được mô tả ở bảng 1.1 [10]

9

Bảng 1.1 Phân loại nấm M oryzae [27]

Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Ascomycota Lớp (Class) Sordariomycetes

Bộ (Order) Magnaporthales

Họ (Family) Magnaporthaceae Chi (Genus) Magnaporthe

Loài (Species) M oryzae

❖ Đặc điểm hình thái và sinh lý

Cành bào tử phân sinh hình trụ, đa bào không phân nhánh, đầu cành thon và hơi gấp khúc Nấm thường sinh ra các cụm cành từ 3 – 5 chiếc Bào tử phân sinh hình quả lê hoặc hình nụ sen, thường có từ 2 – 3 vách ngăn ngang, bào tử không màu, kích thước trung bình của bào tử nấm 19 – 23 x 10 – 12 µm Nhìn chung, kích thước của bào tử nấm biến động tùy thuộc vào các isolates, điều kiện ngoại cảnh khác nhau cũng như trên các giống lúa khác nhau

Nấm đạo ôn sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 24 – 28oC và ẩm độ không khí

là 93% trở lên Phạm vi nhiệt độ nấm sinh sản bào tử là 10 – 30oC Ở 28oC cường

độ sinh bào tử nhanh và mạnh nhưng sức sinh sản giảm dần sau 9 ngày, trong khi

đó ở 16oC, 20oC và 24oC sự sinh sản tăng và kéo dài tới 15 ngày sau đó mới giảm xuống Điều kiện ánh sáng âm u có tác động thúc đẩy quá trình sinh sản bào tử của nấm

Bào tử này nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 24 – 28oC và có giọt nước

Quá trình xâm nhập của nấm vào cây phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, ẩm

độ không khí và ánh sáng Ở điều kiện bóng tối, nhiệt độ 24oC và ẩm độ bão hòa là thuận lợi nhất cho nấm xâm nhập vào cây

Trong quá trình gây bệnh nấm tiết ra một số độc tố như acid α – pycolinic (C6H5NO2) và pyricularin (C18H14N2O3) có tác dụng kìm hãm hô hấp và phân hủy

10

các enzyme chứa kim loại của cây, kìm hãm sự sinh trưởng của cây lúa Nấm đạo

ôn có khả năng biến dị cao, tạo ra nhiều chủng, nhóm nòi sinh học Các vùng trồng lúa trên thế giới đã có tới 256 loài xuất hiện Ở nước ta xác định trên bộ giống chỉ thị nòi quốc tế đã thấy sự xuất hiện của nhiều nhóm nòi đạo ôn ký hiệu là IB, IC, ID,

IE và IG phân bố từ Quảng Nam – Đà Nẵng đến các tỉnh đồng bằng Bắc bộ Các nhóm nòi có sức gây bệnh cao ở các tỉnh miền Bắc là IB, IE, IG, IF và IC – 1, IA –

71 và IC – 23 Các nhóm IA, ID và IG có khả năng gây bệnh cao ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

Nguồn bệnh của nấm đạo ôn tồn tại ở dạng sợi nấm và bào tử trong rơm rạ

và hạt bị bệnh, ngoài ra nấm còn tồn tại trên một số cây cỏ dại khác Ở điều kiện khô ráo trong phòng bào tử có thể sống được hơn một năm và sợi nấm sống được gần 3 năm, nhưng trong điều kiện ẩm ướt chúng không sống sót được sang vụ sau Tuy nhiên, ở vùng nhiệt đới, bào tử nấm có thể tồn tại quanh năm đồng thời nấm có thể chuyển ký chủ từ cây lúa bị bệnh sang các cây ký chủ phụ sinh trưởng phát triển quanh năm [10]

1.2.1.4 Biện pháp phòng trừ

Theo dõi và phân tích các điều kiện liên quan đến sự phát sinh của bệnh như:

vị trí tồn tại của nguồn bệnh, khí hậu thời tiết, sự sinh trưởng của cây, điều kiện đất đai, phân bón và giống lúa

Dọn sạch tàn dư rơm rạ và cây cỏ dại mang bệnh ở trên đồng ruộng

Bón phân N, P, K hợp lý, đúng giai đoạn, không bón đạm tập trung vào thời

kỳ lúa dễ nhiễm bệnh Khi có bệnh xuất hiện phải tạm ngừng bón thúc đạm và tiến hành phun thuốc phòng trừ

Tăng cường sử dụng giống lúa chống chịu bệnh có nhiều gen kháng trong cơ cấu giống ở những vùng bệnh thường hay xảy ra và ở mức độ gây hại nặng

Kiểm tra hạt giống nếu nhiễm bệnh thì cần xử lý hạt giống tiêu diệt nguồn bệnh bằng nước nóng 54oC trong 10 phút hoặc xử lý bằng thuốc trừ đạo ôn

Khi phát hiện bệnh trên đồng ruộng cần tiến hành phun thuốc sớm và trừ nhanh Một số thuốc hóa học thường được sử dụng như: Fuji – one 40EC (1 l/ha);

11

New Hinosan 30EC (1 l/ha); Kitazin EC (1 – 1,5 l/ha); Kasai 21,2WP (1 – 1,5 kg/ha); Benomyl (Benlate) 50WP 1 kg/ha; Triozol 20WP (Beam 20WP) 1 kg/ha [10]

1.2.2 Bệnh đốm nâu trên lúa

Bệnh làm tăng số hạt lép, giảm khối lượng hạt ảnh hưởng tới năng suất, bệnh nặng kéo dài tới cuối kỳ sinh trưởng có thể làm cây lúa cằn lại, trỗ kém Hạt bị bệnh

tỷ lệ lép lên tới 60 – 70% [10]

1.2.2.1 Triệu chứng của bệnh

Bệnh có thể xuất hiện từ thời kỳ mạ cho đến lúc lúa chín, phá hoại chủ yếu lá

và hạt Vết bệnh trên lá hình tròn, sọc ngắn hoặc không định hình màu nâu Trên hạt lúa vết bệnh tròn nhỏ màu nâu Vết bệnh trên lá và trên hạt dễ lẫn với bệnh tiêm lửa Hạt bị bệnh thường biến màu [10]

1.2.2.2 Nguyên nhân gây bệnh

❖ Nguồn gốc và phân loại

Có khoảng 14 loài nấm Curvularia có liên quan đến bệnh nhưng phổ biến

nhất là Curvularia lunata (Walker) Boedjin và Curvularia geniculata Tracy and Early, thuộc lớp Nấm Bất toàn Giai đoạn hữu tính là Cochliobolus lunatus Nelson and Haasis và Cochliobolus genculata Nelson Phân loại khoa học của nấm C

lunata được mô tả ở bảng 1.2 [10], [20]

Bảng 1.2 Phân loại nấm C lunata [26]

Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Ascomycota Lớp (Class) Euascomycetes

Bộ (Order) Pleosporales

Họ (Family) Pleosporaceae Chi (Genus) Curvularia

Loài (Species) C lunata

❖ Đặc điểm hình thái và sinh lý

12

Trên lá và hạt bị nhiễm bệnh nấm mọc thành lớp mốc màu xám đến nâu xám Cành bào tử phân sinh màu nâu đậm, đa bào, không phân nhánh mọc đơn hoặc thành cụm, đỉnh hơi tròn, kích thước 70 – 210 x 2 – 8 µm Bào tử phân sinh mọc thành cụm ở đỉnh, cong, hình gù vai trâu, đa bào, có 2 – 5 vách ngăn ngang, đa số

có 3 ngăn ngang, đỉnh tròn hơn thắt ở gốc Nấm có thể kết hợp gây hại với nấm tiêm lửa và một số loài nấm khác

Nấm tồn tại chủ yếu trên bề mặt hạt giống hoặc dưới lớp vỏ trấu dưới dạng sợi nấm và bào tử phân sinh

Bệnh phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ 20 – 27oC, khi thời tiết biến động, cây lúa phát triển kém thiếu dinh dưỡng Trong suốt thời kỳ sinh trưởng của cây bệnh thường xuất hiện vào hai cáo điểm từ mạ đến lúa hồi xanh và từ thời

kỳ làm đòng đến lúa chín

Bệnh phát sinh mạnh ở những chân đất chua, mặn, đất bạc màu Bón đạm thấp, đặc biệt là các giống lúa dài ngày nếu thiếu đạm vào thời kỳ làm đòng bệnh phát triển mạnh Bón phân cân đối (phân chuồng, NPK) đầy đủ, bón tập trung vào giai đoạn đầu bệnh nặng hơn so với bón rải rác nhiều lần [10], [20]

1.2.2.3 Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh

Bệnh thường phát sinh và phá hoại vào vụ mùa và vụ chiêm xuân Bệnh chỉ phá hại trên các trà lúa cấy muộn (trỗ trung tuần tháng 5 – 6 và hạ tuần tháng 10 – 11), các chân ruộng thiếu phân Bệnh phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ

20 – 270C, khi thời tiết biến động, cây lúa phát triển kém thiếu dinh dưỡng Trong suốt thời kỳ sinh trưởng của cây bệnh thường xuất hiện vào hai cáo điểm từ mạ đến lúa hồi xanh và từ thời kỳ làm đòng đến lúa chín

Bệnh phát sinh mạnh ở những chân đất chua, mặn, đất bạc màu Bón đạm thấp, đặc biệt là các giống lúa dài ngày nếu thiếu đạm vào thời kỳ làm đòng bệnh phát triển mạnh Bón phân cân đối (phân chuồng, NPK) đầy đủ, bón tập trung vào giai đoạn đầu bệnh nặng hơn so với bón rải rác nhiều lần

13

Nguồn bệnh tồn tại chủ yếu trên các hạt giống và rơm rạ của các cây nhiễm

bệnh Ngoài ra, ở Mỹ người ta còn phát hiện thấy nấm C lunata gây bệnh cho quả

cà chua và ớt còn C geniculata gây bệnh cho cải bắp, đạu Hà Lan… [10]

1.2.2.4 Biện pháp phòng trừ

Dùng hạt giống sạch bệnh, sáng màu, mảy chắc Chăm sóc mạ tốt, cấy đúng thời vụ Bón đầy đủ các loại phân chuồng, N, P, K, bón phân cân đối, bón vào các giai đoạn lúa cần dinh dưỡng như đẻ nhánh, đón đòng Trên các chân đất chua cần bôi thêm vôi để cải tạo đất

Điều tiết nước hợp lý, nước sâu khoảng 5 – 10 cm, không để lúa bị hạn hoặc ngập úng quá Nếu bệnh phát triển có thể phun các loại thuốc sau: New Hinosan 30EC (1,2 l/ha); Kitazin 50EC (1 – 1,5 l/ha); Rovral 50WP (0,1 – 0,2 %); Zineb 80

WP (1kg/ha) [10], [11]

1.2.3 Bệnh tiêm lửa hại lúa

Bệnh được phát hiện năm 1901 ở Nhật Bản Bệnh có phạm vi phân bố rộng, phổ biến ở các nước trồng lúa thuộc châu Á, châu Mỹ và châu Phi Ở Philippines và miền Bắc Việt Nam trong những năm 60 bệnh gây hại nặng, mạ còi cọc, chết khô lá gây tình trạng thiếu mạ ở một số vùng trồng lúa [7]

1.2.3.1 Triệu chứng của bệnh

Bệnh có thể xuất hiện trên lá mầm, bẹ lá, lá và hạt Khi hạt nhiễm bệnh nảy mầm, vết bệnh là các đốm nhỏ màu nâu trên lá mầm và các rễ non cũng có thể bị bệnh dưới dạng các vết đen nhạt Vết bệnh ban đầu trên lá là các chấm nhỏ màu vàng, sau chuyển sang màu nâu nhạt và vết bệnh điển hình có hình bầu dục giống hạt vừng, có màu nâu non, xung quanh có vầng vàng Đôi khi bệnh phát triển mạnh làm lá khô vàng và chết Kích thước số lượng vết bệnh tùy thuộc vào thời tiết và giống Trên các giống mẫn cảm vết bệnh lớn và nhiều, ngược lại trên các giống lúa chịu hoặc kháng vết bệnh nhỏ và ít Vết bệnh trên bẹ lá đòng và trên vỏ hạt lúa có màu nâu không có hình dạng nhất định, khi bệnh nặng nấm có thể phát triển và bao phủ hoàn toàn bộ lớp vỏ hạt và xâm nhập vào nội nhũ [7]

14

1.2.3.2 Nguyên nhân gây bệnh

❖ Nguồn gốc và phân loại

Bệnh do nấm Bipolaris oryzae (Breda de Haan) Shoem gây ra tên khác là

Helminthosporium oryzae Breda de Haan thuộc nhóm Nấm Bất toàn, giai đoạn sinh

sản hữu tính thuộc lớp Nấm Túi Ascomycetes có tên là Ophiobolus miyabeanus Ito and Kuribayashi Phân loại khoa học của nấm B oryzae được mô tả ở bảng 1.3 [7]

Bảng 1.3 Phân loại nấm B oryzae [29]

Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Ascomycota Lớp (Class) Dothideomycetes

Bộ (Order) Pleosporales

Họ (Family) Pleosporaceae Chi (Genus) Bipolaris

Loài (Species) B oryzae

❖ Đặc điểm hình thái và sinh lý

Sợi nấm đa bào, phân nhánh, đường kính 4 – 8 µm màu nâu đến xám nhạt Cành bào tử phân sinh mọc thành cụm, đa bào, phần gốc lớn hơn phần đỉnh cành và hơi gãy khúc Bào tử phân sinh hình con nhộng thon dài thẳng hoặc hơi cong, hai đầu tròn có từ 3 – 11 ngăn ngang Kích thước bào tử biến động từ 15 – 170 x 7 – 26

µm, phần gốc bào tử thon tròn Trên môi trường nhân tạo bào tử nấm có màu xám đến hơn đen Bào tử hữu tính ít gặp, bào tử hình sợi dài có từ 6 – 15 ngăn ngang, túi nằm trong quả thể và mỗi túi có 8 bào tử Quả thể hình nậm màu vàng nhạt, có thể tìm thấy trong rơm rạ

Trên hạt giống mầm tồn tại trên vỏ hạt, ở mày hạt, giữa lớp mày và vỏ hạt đôi khi ở nội nhũ

Nấm sinh trưởng trong phạm vi nhiệt độ khá rộng Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm sinh trưởng là 27 – 30oC, cho bào tử nảy mầm là 25 – 30oC trong điều kiện

độ ẩm 60 – 100% Bào tử hình thành từ 5 – 38oC, pH 4 – 10 Bào tử chết ở nhiệt độ

15

50 – 51oC, sợi nấm chết ở nhiệt độ 48 – 50oC trong 10 phút Trong điều kiện thuận lợi nấm xâm nhập vào cây trong 4 giờ [7]

1.2.3.3 Đặc điểm phát sinh, phát triển

Nấm có thể tồn tại trên rơm rạ trong đất và sống sót trên hạt giống trong bảo quản dưới dạng bào tử hoặc sợi nấm tiềm sinh trong khoảng thời gian từ 2 – 3 năm Nguồn bệnh đầu tiên thường từ hạt giống nhiễm bệnh, nấm gây bệnh trên chồi non

và rễ làm giảm tỷ lệ nảy mầm khoảng 11 – 29% và giảm sức sống của cây con Tỷ

lệ bệnh truyền qua hạt giống trên các lô giống bị nhiễm bệnh có thể lên đến 59,4% Trên đồng ruộng, bệnh lan truyền nhờ gió Nấm có thể gây hại trên 23 loài cỏ dại một lá mầm

Bệnh gây hại chủ yếu trên các giống lúa dài ngày, thiếu dinh dưỡng và vào các thời kỳ khủng hoảng dinh dưỡng trong giai đoạn sinh trưởng của cây lúa (cuối

mạ, lúa bị hạn, sau đẻ nhánh, đòn non) Mức độ thâm canh càng cao bệnh càng ít gây hại [10]

1.2.3.4 Biện pháp phòng trừ

Chủ yếu dùng biện pháp canh tác bao gồm các khâu: vệ sinh đồng ruộng, dọn sạch cỏ dại và tàn dư rơm rạ, cấy đúng thời vụ, bón phân đúng kỹ thuật, đảm bảo đủ nước cho lúa, luân canh và cải tạo đất Đảm bảo cung cấp dầy đủ dinh dưỡng cho lúa là quan trọng nhất

Có thể dùng biện pháp xử lý giống bằng nước nóng 54oC trong 10 phút hoặc

xử lý bằng thuốc diệt nấm Trong trường hợp cần thiết có thể phun thuốc trừ nấm như: New Hinosan 30EC (1,2 l/ha); Kitazin 50EC (1 – 1,5 l/ha); Rovral 50WP (0,1 – 0,2%); Zineb 80 WP (1kg/ha) [10], [11]

1.2.4 Bệnh khô vằn

Bệnh khô vằn được phát hiện ở Nhật Bản (Miyake, 1910; Sawada, 1912) và một số nước khác (Reiking, 1918 và Palo, 1926) Là bệnh nghiêm trọng thứ hai sau bệnh đạo ôn và là loài bệnh gây hại chủ yếu trên lúa hè thu và lúa mùa [10], [11]

16

1.2.4.1 Triệu chứng của bệnh

Bệnh khô vằn gây hại chủ yếu ở một số bộ phận cây như bẹ lá, phiến lá và cổ bông Các bẹ lá sát mặt nước hoặc bẹ lá già ở dưới gốc thường là nơi phát sinh bệnh đầu tiên

Vết bệnh ở bẹ lá lúc đầu là vết đốm hình bầu dục màu lục tối hoặc xám nhạt, sau lan rộng thành vết vằn da hổ, dạng đám mây Khi bệnh nặng, cả bẹ và phần lá phía trên bị chết lụi

Vết bệnh ở lá tương tự như bẹ lá, thường vết lan rộng ra rất nhanh chiếm hết

cả bề rộng phiến lá tạo ra từng mảng vân mây hoặc dạng vết vằn da hổ Các lá già ở dưới hoặc lá sát mặt nước là nơi bệnh phát sinh trước sau đó lan lên các lá ở trên

Vết bệnh ở cổ bông thường là vết kéo dài bao quanh cổ bông, hai đầu vết bệnh có màu xám loang ra, phần giữa vết bệnh màu lục sẫm co tóp lại

Trên vết bệnh ở các vị trí gây hại đều xuất hiện hạch nấm màu nâu, hình tròn dẹt hoặc hình bầu dục nằm rải rác hoặc thành từng đám nhỏ trên vết bệnh Hạch nấm rất dễ dàng rơi ra khỏi vết bệnh và nổi trên mặt nước ruộng [11]

1.2.4.2 Nguyên nhân gây bệnh

❖ Nguồn gốc và phân loại

Do nấm Rhizoctonia solani gây ra, thuộc bộ nấm trơ Mycelia sterilia, lớp

nấm bất toàn Fungi imperfecti Giai đoạn sinh sản hữu tính được gọi là

Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk, thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes, là

nấm ký sinh không chuyên tính, có phổ ký chủ rộng Phân loại khoa học của nấm R

solani được mô tả ở bảng 1.4 [11]

17

Bảng 1.4 Phân loại nấm R solani [28]

Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Basidiomycota Lớp (Class) Agaricomycetes

Bộ (Order) Cantharellales

Họ (Family) Ceratobasidiaceae Chi (Genus) Rhizoctonia

Loài (Species) R solani

❖ Đặc điểm hình thái và sinh lý

Ở giai đoạn vô tính, nấm phát triển ở dạng sợi, tạo hạch Sợi nấm khi còn non không màu, khi già chuyển sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu Sợi nấm đa bào, có đường kính từ 8 – 13µm, phân nhánh tương đối thẳng góc, chỗ phân nhánh hơi thắt lại, và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh (Vũ Triệu Mân và Lê

Lương Tề, 1998) R solani có 3 loại sợi nấm: sợi nấm bò (runner hyphae), sợi nấm

phân nhánh (lobate hyphae) và các tế bào dạng chuỗi (moniloid cells) (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) [6], [11]

Lúc già, các tế bào tách ra và biến thành hạch Đặc điểm của hạch rất hay thay đổi Hạch nấm khi còn non có màu trắng nhưng khi về già có thể có màu nâu, nâu đen, nâu xám và trên vỏ có lông Hạch nấm có hình dạng phức tạp, đôi khi hình cầu, đáy phẳng, bề mặt hạch không trơn mà lồi lõm (Đường Hồng Dật, 1976) Đường kính hạch nấm từ 1 – 6 mm Từng hạch nấm có thể liên kết lại với nhau tạo thành hạch nấm to Hạch nấm khi còn non có thể chìm dưới nước nhưng khi già nổi lên do tế bào phía ngoài hạch trở nên rỗng (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) [2], [6]

Sợi nấm của R solani có nhiều nhân (thông thường từ 4 đến 8 nhân) trong một tế bào Điều này khác biệt với các nấm Rhizoctonia khác có đặc tính của sợi nấm tương tự Rhizoctonia solani, nhưng chỉ với 2 nhân trong tế bào và được gọi là binucleate Rhizoctonia

Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), nấm sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 28 – 32oC, ở nhiệt độ dưới 10oC và cao hơn 38oC nấm ngừng sinh trưởng Hạch nấm hình thành nhiều ở nhiệt độ 30 – 32oC Khi nhiệt độ quá thấp (12oC) và quá cao (40oC), nấm không hình thành hạch Nấm có thể phát triển được trong phạm vi pH rộng từ 3,4 – 9,2; thích hợp nhất ở độ pH 6 – 7 [11]

Hạch nấm hình thành nhiều nhất ở ngoài ánh sáng và khi nhiệt độ môi trường giảm đột ngột Các hạch nấm này nảy mầm ở nhiệt độ 16 – 30oC, nhiệt độ tối ưu

28 – 30oC Ẩm độ tương đối 95 – 96% thích hợp cho hạch nấm nảy nầm Hạch nấm

có kích thước càng lớn, số lượng hạch càng nhiều thì độc tính càng cao Hạch nấm

có thể sống được 4 – 5 tháng trong đất khô, 7 tháng trong điều kiện ngập nước (Đường Hồng Dật, 1976) [2]

R solani có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng (20 – 30oC) từ 6 – 12 tháng trong ống nghiệm chứa môi trường PDA (potato dextrose agar), PDYA (potato dextrose yeast extract agar) hoặc các vật liệu cây trồng tự nhiên Nấm có thể tồn trữ trên môi trường hạt đậu khô đến 9 năm mà không làm mất tính độc Tính độc của chúng bị mất trong vòng 2 – 3 tháng khi tồn trữ ở nhiệt độ từ 0 – 70oC

Nấm R solani không đòi hỏi nhu cầu dinh dưỡng chuyên biệt, nó có thể phát

triển tốt trên nhiều loại môi trường khác nhau Hạch nấm thường hình thành sau 3 –

4 ngày nuôi cấy Hạch nấm hình thành nhiều hay ít, có hình thành hay không phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy, điều kiện ngoại cảnh cũng như phụ thuộc vào các nhóm nấm khác nhau Hạch nấm thường mọc rải rác khắp đĩa, có loài mọc rời, cũng

có loài mọc thành từng mảng liên kết với nhau Tuy nhiên cũng có loài không hình

19

thành hạch (Nguyễn Minh Nguyệt, 2003) Hạch nấm mọc trên môi trường nuôi cấy

có kích thước lớn hơn so với hạch nấm mọc trên cây kí chủ tự nhiên Nhìn chung,

tốc độ phát triển của R solani rất nhanh, tản nấm của chúng có thể phát triển trên

toàn bộ đĩa petri 90 mm trong vòng 3 ngày [5]

1.2.4.3 Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh

Bệnh khô vằn phát sinh mạnh trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ cao Nhiệt

độ khoảng 24 – 32oC và ẩm độ bão hòa hoặc lượng mưa cao thì bệnh phát sinh phát triển mạnh, tốc độ lây lan nhanh Bệnh thường phát sinh trước tiên ở các bẹ lá và lá già sát mặt nước hoặc ở dưới gốc Tốc độ lây lan lên các lá phía trên phụ thuộc rất nhiều vào thời tiết mưa nhiều, lượng nước trên đồng ruộng quá cao, đặc biệt ở các vùng nước cấy quá dày

Sự phát triển của bệnh khô vằn ở thời kỳ đầu cây mạ đến đẻ nhánh có mức

độ bệnh ít Giai đoạn đòng trỗ đến chín sáp là thời kỳ nhiễm bệnh nặng Ở miền Bắc nước ta, bệnh khô vằn gây hại trong vụ mùa lớn hơn ở vụ chiêm xuân

Sự phát sinh phát triển của bệnh có liên quan nhiều tới chế độ nước trên đồng ruộng và chế độ phân bón Bón phân đạm nhiều, bón phân đạm tập trung thúc đòng bệnh sẽ phát sinh phát triển mạnh hơn Bón nhiều lần cũng làm cho mức độ bị bệnh cao Bón kali có tác dụng làm giảm mức độ nhiễm bệnh của cây

Nguồn bệnh chủ yếu là hạch nấm tồn tại ở trên đất ruộng, sợi nấm ở gốc rạ

và lá bị bệnh còn sót lại sau khi thu hoạch Hạch nấm có thể sống một thời gian dài sau thu hoạch lúa, thậm chí trong điều kiện ngập nước vẫn còn tới 30% số hạch giữ được sức sống, nảy mầm thành sợi và xâm nhiễm gây bệnh cho vụ sau Quá trình xâm nhiễm lặp lại thường xảy ra qua tiếp xúc giữa hạch và bẹ lá lúa

Chỉ số của đợt gây bệnh lần đầu có liên quan mật thiết với số lượng tiếp xúc với cây, nhưng sự phát triển của bệnh sau khi tiếp xúc với ký chủ lại chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ, độ ẩm và tính mẫn cảm của cây ký chủ

Phản ứng của các giống lúa đều nằm trong phạm vi từ nhiễm nặng đến tương đối chống chịu Chưa có giống lúa nào thể hiện đặc tính chống bệnh cao Giống lúa Indica chống chịu bệnh tốt hơn giống lúa Japonica

20

Ở nước ta, hầu hết các giống lúa đại phương và giống nhập nội đều có mức

độ nhiễm bệnh khô vằn từ trung bình đến nhiễm nặng Một số ít các giống như KV10, JR9965, IF50, IR17494, OM80 có mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn so với các giống khác [11]

1.2.4.4 Biện pháp phòng trừ

Phòng trừ bệnh khô vằn chủ yếu là áp dụng các biện pháp tiêu diệt nguồn bệnh ở trong đất và quản lý kỹ thuật trồng trọt thâm canh thích hợp Tiêu diệt nguồn bệnh ở trong đất tiến hành ngay sau khi thu hoạch, cày sâu để vùi lấp hạch nấm, phối hợp với các biện pháp gieo cấy đúng thời vụ, đảm bảo mật độ hợp lý, bón phân đúng tỷ lệ tránh bón tập trung đạm đón đòng, có thể phối hợp thêm kali với tro bếp

để tăng cường tính chống bệnh của cây Hệ thống tưới tiêu chủ động và không để mức nước quá cao trong trường hợp bệnh lây lan mạnh

Ngoài ra có thể dùng thuốc hóa học như Vida 3SC (Wida 5WP) = Validamycin A5% (1 l/ha); Bonanza 100 DD (0,4 l/ha); Tilt 250ND (0,3 – 0,5 l/ha); Anvil 5SC (50 – 100g a.i/ha); Roval 50WP (0,1 – 0,2 l/ha); Monceren 25WP (1 kg/ha) để phối hợp với các biện pháp canh tác kỹ thuật phòng trừ bệnh Sử dụng thuốc hóa học phòng trừ bệnh chỉ đưa lại hiệu quả khi bệnh mới phát sinh ở những

bẹ lá già và thuốc hóa học phải được phun tiếp xúc với tầng lá dưới của cây kết hợp với rút cạn nước trên đồng ruộng

Biện pháp sinh học như sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma để ức chế sự

phát triển sợi nấm và hạch nấm khô vằn cũng có tác dụng phòng trừ bệnh, đảm bảo

an toàn môi trường [10], [11]

1.3 Định danh bằng sinh học phân tử

1.3.1 Phương pháp ly trích DNA

Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải

21

bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ) Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (deoxyribonuclease – DNase và ribonuclease – RNase)

Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi theo từng môi trường Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc là những quần thể vi sinh vật Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ gen hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá Do đó, việc tách chiết DNA vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết Quá trình ly trích DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc

để có thể thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo Có rất nhiều phương pháp

ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp [4]

Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên thường được sử dụng:

 Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): được xem là phương pháp thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo Phương pháp ly trích sử dụng nồng độ muối cao (1,5 M NaCl) và ủ mẫu trong

2 – 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyltrimethylammonium bromide và proteinase K

 Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là phương pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB

là một dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic Ly trích DNA cần phải có cả hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết

 Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương đối hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia

ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gen

PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình

tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer

sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược [3]

23

Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:

– Gây biến tính (denaturation) ở 90 – 95oC Trong giai đoạn biến tính phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands)

– Gắn primer (annealing) ở 40 – 65oC Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu Các liên kết ion tạo thành một đoạn nhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu

– Kéo dài phân tử (extension) ở 70 – 72oC Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’3’ [3]

1.3.2.2 Vùng trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer)

Internal Transcribed Spacer (ITS) là vùng phiên mã bên trong, có rất nhiều

sự biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của

vi sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong cùng loài [16]

Các mồi vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5,8S

và 28S ITS1 là trình tự bổ sung của NS8 Mồi ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng

lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8S của N crassa, Szchiosaccharomyces prombe

và S cerevisiae, Viciafaba và chuột Vùng bảo tồn trên rDNA 28S của S prombe, S

cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4 Mồi ITS5 có trình tự

giống với rDNA 18S của N crassa, có đầu 5’ chỉ cách mồi ITS1 25bp Trình tự

đoạn mồi và bản đồ đoạn mồi vùng gen ITS được mô tả ở bảng 1.5 và hình 1.1

24

Bảng 1.5 Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS [33]

ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G White và ctv, 1990

ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A Gardes và Bruns, 1993 ITS2 GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC White và ctv, 1990

ITS3 GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC White và ctv, 1990

ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC White và ctv, 1990

ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG Gardes và Bruns, 1993 ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G White và ctv, 1990

Hình 1.1 Bản đồ mồi vùng gen ITS [33]

Đề tài này sử dụng cặp mồi ITS – F và ITS4 để phân tích di truyền và định danh các loài nấm đã phân lập

1.3.2.3 Các ứng dụng của kỹ thuật PCR

Kể từ khi ra đời, phương pháp PCR ảnh hưởng sâu sắc tới các nghiên cứu về sinh học phân tử các ứng dụng tiêu biểu của PCR gồm: sản xuất mẫu dò dùng trong phương pháp lai phân tử, xác định trình tự nucleic acid, tạo đột biến điểm định hướng ngoài ra, PCR còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như:

 Y học: chẩn đoán nhanh các bệnh có nguyên nhân là vi sinh vật mà không có khả năng mọc trên môi trường nuôi cấy hoặc chậm phát triển thông qua việc khuếch đại và phát hiện đoạn DNA đặc hiệu

 Pháp y: dùng để thiết lập dấu vân tay DNA

25

 Và gần đây nhất là sự đóng góp thiết thực trong việc giải mã bộ gen con người bằng kỹ thuật PCR

1.4 Tái nhiễm nhân tạo theo quy tắc Koch

Năm 1884, R Koch đưa ra 4 nguyên tắc về tác nhân gây bệnh mà cho đến ngày nay vẫn còn được áp dụng là nguyên tắc chuẩn để chứng minh khả năng gây bệnh đặc trưng của một loài vi sinh vật nào đó Các nguyên tắc đó là:

– Tác nhân gây bệnh phải luôn được tìm thấy trên sinh vật bị nhiễm bệnh nhưng không có ở sinh vật khỏe

– Tác nhân gây bệnh phải được nuôi trong điều kiện thực nghiệm bên ngoài cơ thể sinh vật

– Tác nhân gây bệnh phải có khả năng gây bệnh khi gây nhiễm vào con vật mẫn cảm

– Tác nhân gây bệnh phải được xác định từ kết quả tái phân lập [32]

Để thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo, các loài cây mẫn cảm được trồng trong các điều kiện có kiểm soát và được cấy vi sinh vật nghi là gây bệnh Việc lây bệnh nhân tạo có thể cung cấp thông tin để:

 Khẳng định một sinh vật được phân lập là tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch

 Xác định phổ ký chủ của tác nhân gây bệnh

 Đo độc tính các mẫu cấy khác nhau của tác nhân gây bệnh

Khi chọn lựa những cây khỏe mạnh để lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch, nên lưu ý dùng cùng một giống với cây bị bệnh mà từ đó tác nhân gây bệnh được phân lập Như vậy các triệu chứng biểu hiện khi lây bệnh nhân tạo sẽ rất gần với các triệu chứng bệnh ban đầu ngoài tự nhiên – các giống cây trồng có thể có độ mẫn cảm khác nhau đáng kể đối với một tác nhân gây bệnh [1]

❖ Các bước thực hiện quy tắc Koch

– Mô tả các triệu chứng biểu hiện ở cây trồng bị bệnh

– Phân lập vi sinh vật có thể là tác nhân gây bệnh – các mẫu cấy giống nhau được phân lập từ các cây có triệu chứng giống nhau

26

– Dùng một mẫu cấy sạch đã được làm thuần để lây lên cây khỏe mạnh

– Quan sát các triệu chứng biểu hiện ở các cây đã được lây bệnh – triệu chứng phải giống như đã quan sát ban đầu trên cây trồng bị bệnh

– Phân lập lại tác nhân gây bệnh từ các bộ phận cây mới bị bệnh – mẫu cấy phải giống như mẫu cấy được làm thuần ban đầu

Các yếu tố cần được cân nhắc trong quá trình lây bệnh nhân tạo bao gồm:

 Nhiệt độ

 Quá ít hoặc quá nhiều nước

 Độ độc hoặc thiếu hụt chất dinh dưỡng

 Lượng nguồn bệnh trộn vào đất không thực tiễn (quá ít hoặc quá nhiều)

 Các điều kiện trồng nói chung

Luôn luôn bố trí công thức đối chứng (bao gồm các cây không được lây bệnh) trong các thí nghiệm lây bệnh nhân tạo

Độ ẩm cao tạo điều kiện cho việc xâm nhiễm và lan truyền của nhiều bệnh Phun sương hoặc để ẩm (bằng túi ny lông che phủ chậu trồng cây) có thể tạo một môi trường ẩm và làm tăng đáng tỷ lệ thành công của thí nghiệm lây bệnh nhân tạo Không nên đặt các chậu trong tủ ẩm hoặc có ny lông che phủ trực tiếp dưới ánh nắng [1]

– Bể ổn nhiệt (Cole Parmer BT – 15)

– Máy ly tâm thường (Hettich Mikro 20), máy ly tâm lạnh (Hettich Mikro 220R)

– Kính hiển vi quang học

– Máy PCR (Sprint Thermo Cycler)

– Máy điện di