Nghiên Cứu Thu Nhận Anthocyanin Từ Phế Liệu Gạo Đen Và Xác Định Hoạt Tính Kháng Oxy Hóa

Các kết quả đạt được của đề tài Đã xác định được các thông số thích hợp cho quá trình trích ly chất màu anthocyanin nhằm tách chiết tối đa anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đíc

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ANTHOCYANIN TỪ PHẾ

LIỆU GẠO ĐEN VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH

KHÁNG OXY HÓA

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN LỆ HÀ

LỜI CAM ĐOAN

Là sinh viên năm năm cuối của Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh, nay được vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hoàn tất chương trình học của mình Tôi cam đoan đây là nghiên cứu do tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghê Sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh

Những số liệu trong bài hoàn toàn trung thực chưa từng có ai công bố

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Lê Trí Kiểng

LỜI CẢM ƠN

Tận đáy lòng con xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ đã gian lao nuôi dạy con thành người và là người thầy đầu đời của con Cha mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất của con, là người giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã, là nguồn động viên, động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống

Với lòng biết ơn sâu sắc Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Khoa Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, cùng toàn thể Thầy Cô Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báo về cơ sở ngành cũng như chuyên ngành từ ngày em bước chân vào giảng đường đại học

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS.Nguyễn Lệ Hà, người thầy đáng kính,

đã luôn tận tình chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành phần thực nghiệm của đồ án

Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh

Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH05 đã luôn khích lệ, động viên và giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trường và trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015

SVTH: Lê Trí Kiểng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG _vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH _ vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 71.1 Gạo đen _ 71.1.1 Khái niệm 71.1.2 Thành phần hóa học 71.2 Anthocyanin _ 81.2.1 Giới thiệu chung _ 81.2.2 Cấu trúc phân tử _ 81.2.3 Tính chất, đặc điểm _ 121.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và độ bền của anthocyanin 131.2.4.1 Cấu trúc _ 13a) Cấu trúc chuyển hóa trong môi trường lỏng _ 13b) Cấu trúc hóa học 151.2.4.2 pH _ 171.2.4.3 Nhiệt độ 181.2.4.4 Oxy 191.2.4.5 Enzyme _ 201.2.4.6 Ánh sáng 211.2.4.7 Đường và các sản phẩm biến tính của chúng _ 211.2.4.8 Các ion kim loại 22

1.2.4.9 Sulfurdioxide (SO2) 231.2.4.10 Acid ascorbic 241.2.5 Sự phân bố của anthocyanin 251.2.6 Các anthocyanin đã được thương mại hóa 271.2.7 Ứng dụng của anthocyanin _ 271.3 Các thành tựu đạt được 281.3.1 Phương pháp tách chiết anthocyanin _ 281.3.2 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ quả dâu Hội An _ 281.3.3 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím _ 291.3.4 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ gạo đen _ 30CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 312.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 312.1.1 Thời gian _ 312.1.2 Địa điểm _ 312.2 Nguyên liệu– thiết bị - hoá chất _ 312.2.1 Nguồn gạo đen _ 312.2.2 Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu _ 312.2.3 Một số dụng cụ và thiết bị chủ yếu dùng trong nghiên cứu 322.2.3.1 Dụng cụ. _ 322.2.3.2 Thiết bị _ 322.3 Phương pháp nghiên cứu 332.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu _ 342.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ mẫu gạo đen _ 34

2.3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu quả trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 352.3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen 372.3.5 Thí nghiệm 5: Xác định của tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 392.3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen 412.3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 432.3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin 452.3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc 462.4 Các phương pháp phân tích sử dụng trong nghiên cứu 472.5 Các phương pháp thống kê và xử lý số liệu _ 47CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN _ 483.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu 483.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ mẫu gạo đen 483.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu quả trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 493.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 503.5 Thí nghiệm 5: Xác định của tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin

từ gạo đen _ 523.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 533.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen _ 55

3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin 563.9 Thí nghiệm 9: Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc 58

KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ _ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC A PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CƯU

_ 1

PHỤ LỤC B SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM _ 11

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của gạo đen 7

Bảng 1.2 Các nhóm anthocyanin hiện có trong tự nhiên 10

Bảng 1.3 Một số anthocyanin phổ biến 11

Bảng 1.4 Bảng các anthocyanin có nguồn gốc thực vật 26

Bảng 3.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu 48

Bảng 3.2 So sánh giá trị IC50 của Ascorbic acid và anthocyanin 57

Bảng 3.3 Kết quả khả năng kháng DPPH của anthocyanin theo thời gian cô quay. 61

Bảng 3.4 Đánh giá sơ bộ cảm quan của dịch chiết anthocynin 67

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Gạo đen 7

Hình 1.2 Cation Flavylium (R1 và R2 là OH, H hoặc OCH3, R3 là glucosyl hoặc H, R4 là OH hoặc glucosyl) 9

Hình 1.3 Sự đổi màu của anthocyanin ở các pH khác nhau 12

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa trong nước 14

Hình 1.5 Sơ đồ sự biến tính của anthocyanin 3,5-diglucoside tại pH 3,7 18

Hình 1.6 Sự biến tính anthocyanin với phản ứng oxy hóa catechol 20

Hình 1.7 Phản ứng ngưng tụ của A: Cyanidin và furural; B: Cyanidin ketobase và furural 22

Hình 1.8 Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và anthocyanin 23

Hình 1.9 Sự chuyển hóa malvin thành malvone bởi H2O2 tạo thành từ sự oxy hóa Ascorbic acid 24

Hình 1.10 Fla-2-ene được tạo thành từ phản ứng giữa Ascorbic acid và anthocyanin. 25

Hình 1.11 Quy trình tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím 30

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm 33

Hình 2.2 Quy trình trích ly anthocyanin dự kiến 34

Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định kích thước nguyên liệu cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen 36

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm xác định chế độ xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu 38

Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen 40

Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen 42

Hình 2.7 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian trích ly anthocyanin từ gạo đen 44

Hình 3.1 Quét quang phổ mẫu anthocyanin từ bước sóng 400-700nm trong dung môi EtOH:0,1N HCl (85:15, v:v) 48

Hình 3.2 Ảnh hưởng của kích thước hạt nguyên liệu đến hàm lưởng anthocyanin từ

dịch chiết 49

Hình 3.3 Ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt cho nguyên liệu đến hàm lượng anthocyanin từ dịch chiết 50

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi EtOH:HCl 1% đến hàm lượng anthocyanin từ dịch chiết 52

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng anthocyanin từ dịch chiết 53

Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến nồng độ anhthocynin trong dịch chiết. 55

Hình 3.7 Mối tương quan tuyến tính giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với Log[nồng độ anthocyanin mg/ml] 56

Hình 3.8 Mối tương quan tuyến tính giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với Log[Ascorbic acid, µg/ml] 57

Hình 3.9 Sự thay đổi nồng độ của anthocyanin trong dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian cô quay 58

Hình 3.10 Hiệu suất thu hồi anthocyanin trong quá trình cô quay dịch trích ly theo thời gian 59

Hình 3.11 Sự thay đổi về khối lượng của dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian cô quay 59

Hình 3.12 Sự thay đổi về thể tích của dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian cô quay 60

Hình 3.13 Ảnh hưởng của thời gian cô quay đến khả năng bắt gốc tự do DPPH của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen 61

Hình 3.16 Sơ đồ quy trình trích ly anthocyanin từ gạo đen 64

Hình 3.14 Dịch chiết anthocyanin trước cô quay 67

Hình 3.15 Dịch chiết sau cô đặc 67

Trong đó, chất màu quan trọng và hiện diện ở hầu hết các loài thực vật là anthocyanin Mà gạo đen được xem là chứa anthocyanin với nồng độ tương đối cao Đây là nguồn cung cấp màu triển vọng, an toàn và sự tương tác với thực phẩm tạo ra nhiều màu sắc đẹp mắt

Những đặc tính quý báu của anthocyanin mà các chất màu hóa học, các chất màu khác hình thành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được, đã mở ra một hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất màu anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào trong

đời sống hằng ngày, đặc biệt trong công nghệ chế biên thực phẩm Điều đó hoàn toàn phù hợp với xu hướng hiện nay của các nước trên thế giới là nghiên cứu khai thác chất màu từ thiên nhiên sử dụng trong thực phẩm, bởi vì chúng có tính an toàn cao cho người sử dụng

Vì thế đề tài nghiên cứu thu nhận anthocyanin từ phế liệu gạo đen và hoạt tính chống oxy hóa có ý nghĩa quan trọng đối với việc phát triển kinh tế và xã hội nước

ta Và đó cũng là lý do nhóm nghiên cứu chọn đề tài này để nghiên cứu

2 Tình hình nghiên cứu

Trong nước

Huỳnh Thị Kim Cúc và cộng sự, Chiết tách anthocyanin từ quả dâu bằng nước

sunfured và một số đặc tính của chúng, tiến hành chiết anthocyanin thô với các dung

môi có nồng độ SO2 là 500ppm, 700ppm, 900ppm, 1100ppm và 1500ppm, bổ sung 1% HCl, nhiệt độ 30°C, thời gian chiết 30 phút Kết quả thu được hàm lượng anthocyanin khi nồng độ SO2 đạt 1100ppm là cao nhất

Nguyễn Thị Lan, Lê Thị Lạc Quyên, nghiên cứu ảnh hưởng của hệ dung môi

đến khả năng chiết tách chất màu anthocyanin có độ màu cao từ dâu tây Hội An,

trường Đại Học Bách Khoa, Đại Học Đà Nẳng Kết quả chọn được hệ dung môi tốt cho quá trình chiết tách chất màu anthocyanin có độ màu cao từ quả dâu là ethanol - nước - HC1, với tỷ lệ dung môi ethanol - nước là 1:1 (với 1 % HC1) để hàm lượng anthocyanin thu được nhiều nhất

Nguyễn Thị Phương Anh, Nguyễn Thị Lan, nghiên cứu ảnh hưởng của pH

đến màu anthocyanin từ bắp cải tím ứng dụng làm chất chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học và thực phẩm, tạp chí Khoa Học Đà Nẳng Kết quả khẳng định màu

anthocyanin thay đổi từ đỏ đến xanh khi môi trường thay đổi từ acid sang kiềm

Huỳnh Thị Kim Cúc và các cộng sự, xác định hàm lượng anthocyanin trong

một sổ nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai, tiến hành nghiên cứu xác

định được hàm lượng anthocyanin trong một số nguyên liệu rau quả thuộc khu vực

miền trung Việt Nam bằng phương pháp pH vi sai Kết quả cho thấy một số nguyên liệu có hàm lượng anthocyanin tương đối cao như: quả dâu ta 1,188 %; bắp cải tím 0,909%; lá tía tô 0,397%; trà đỏ 0,335%, vỏ nho 0,564%, vỏ cà tím 0,441%

Trên thế giới

Hàng năm theo ước tính tại các nước châu Âu khoảng 10000 tấn vỏ quả nho được trích để thu được khoảng 50 tấn anthocyanin Các phẩm màu gốc anthocyanin

có thể là dung dịch cô đặc hoặc dạng bột có chứa các phụ gia khác

Chất nhuộm màu nói chung và chất nhuộm màu thực phẩm nói riêng đã được người dân các nước trên thế giới sử dụng vào cuộc sống từ thời xa xưa Một chất màu được dùng cho thực phẩm nhất thiết phải hội đủ ba tiêu chuẩn về mặt y tế của chất phụ gia thực phẩm:

+ Nhuộm thực phẩm thành màu theo mục đích, phù hợp với công nghệ chế biến thực phẩm

+ Không có độc tính (gồm cả độc tính cấp, bán cấp và trường diễn)

+ Không là nguyên nhân hoặc tác nhân gây bệnh

Ngoài ra, do yêu cầu riêng của thực phẩm, các chất nhuộm màu dùng trong lĩnh vực này không gây mùi lạ và làm thay đổi chất lượng thực phẩm

Sử dụng các chất màu thực phẩm do có quan hệ trực tiếp đến sức khoẻ và tính mạng con người Vì vậy ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ đã ban hành luật về sử dụng chất màu trong thực phẩm Trong các Bộ luật về chất màu thực phẩm, các chất màu có nguồn gốc là sắc tố thực vật (chất màu tự nhiên) được quy định ưu tiên

Tóm lại, hiện nay nghiên cứu chất màu thực phẩm trên thế giới được quan tâm rất lớn ở nhiều quốc gia với nhiều hướng nghiên cứu mới Trong các hướng nghiên cứu đó, tìm kiếm và chiết tách chất màu từ thực vật vẫn được ưu tiên hàng đầu trong các nghiên cứu Trong đó bao gồm chất màu anthocyanin (E163) với những đặc tính sinh học quý báu và an toàn cao (Lưu Đàm Cư, 2005)

3 Mục đích nghiên cứu

Xác định các thông số thích hợp cho quá trình trích ly chất màu anthocyanin nhằm tách chiết tối đa anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đích ứng dụng vào thực phẩm

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

Để thực hiện mục đích nghiên cứu, nhóm nghiên cứu thực hiện các thí nghiệm như sau:

- Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu

- Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ gạo đen

- Xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin

- Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích

ly anthocyanin

- Xác định tỷ lệ dung môi thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin

- Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin

- Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin

- Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin

- Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc

5 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp thu thập thông tin: Phương pháp nghiên cứu tài liệu làm cơ sở

bố trí thí nghiệm Sử dụng phần mềm Endnote để tìm tài liệu

- Thực hành trong phòng thí nghiệm

- Kết quả được xử lý bằng phần mềm thống kê Stagraphics Plus 4.0

- Vẽ đồ thị bằng phần mềm excel 2013, GraphPad Prism

6 Các kết quả đạt được của đề tài

Đã xác định được các thông số thích hợp cho quá trình trích ly chất màu anthocyanin nhằm tách chiết tối đa anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đích ứng dụng vào thực phẩm:

- Xác định được độ ẩm ban đầu của nguyên liệu là 11,26% ± 0,04

- Xác định được bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ gạo đen là λmax=535nm trong dung môi EtOH:HCl 1N

- Kích thước nguyên liệu là 0,0098 inches cho hiệu quả trích ly anthocyanin với hàm lượng cao nhất

- Nguyên liệu ở điều kiện nhiệt độ phòng cho hiệu quả trích ly anthocyanin với hàm lượng cao nhất

- Xác định được tỷ lệ dung môi thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin là EtOH:HCl 1% 95:5 (v:v)

- Xác định được nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin là 55oC

- Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin là 60 phút

- Xác định được hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin với giá trị IC50 =

7 Kết cấu của đồ án

Nội dung của báo cáo đồ án tốt nghiệp được sắp xếp theo thứ tự như sau: Nội dung báo cáo gồm có 3 chương :

- Chương 1 : Tổng quan

- Chương 2 : Vật liệu và phương pháp

- Chương 3 : Kết quả, thảo luận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Gạo đen

1.1.1 Khái niệm

Gạo sẫm màu có 2 loại là gạo nếp (nếp cẩm) và gạo lứt huyết rồng Gạo đen khác với gạo lứt (brown rice) và chứa lượng dưỡng chất lớn hơn Lớp cám bên ngoài chứa một lượng đáng kể vitamin E, có tác dụng tốt cho hệ thống miễn dịch và bảo vệ các tế bào thoát khỏi sự hủy hoại của gốc tự do Hơn nữa, theo nghiên cứu của Trung tâm Nông nghiệp Đại học bang Louisiana tại Baton Rouge, gạo đen chứa nhiều chất chống oxy hóa anthocyanin hơn các loại gạo khác

1.2 Anthocyanin

1.2.1 Giới thiệu chung

Các Anthocyanỉn hiện thuộc nhóm các chất màu tự nhiên tan trong nước lớn nhất trong thế giới thực vật Hiện diện hầu hết ở các thực vật bậc cao, chủ yếu ở lá, hoa, rễ thân Thường được tìm thấy ở các tế bào bên ngoài Thuật ngữ anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó Anthocyanin là sự kết hợp giữa Anthos - nghĩa

là hoa và Kysanesos - nghĩa là màu xanh Tuy nhiên, không chỉ có màu xanh, anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rực rỡ khác như hồng, đỏ, cam

và các gam màu trung gian Các anthocyanìn khi mất hết nhóm đường được gọi là anthocyanidin hay aglycon Mỗi anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa acylate bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau Vì thế lượng anthocyanin lớn hơn anthocyanidin từ 15-20 lần Chúng được sử dụng làm phụ gia thực phẩm với ký hiệu là E613

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực

Anthocyanin hòa tan tốt trong nước và trong dịch bão hòa Khi kết hợp với

Anthocyanin là những hợp chất glycoside của anthocyanidin hiện có trong thiên nhiên bao gồm các dẫn xuất polyhydro và polymethoxy của 2 - phenylbenzopyrylium hoặc muối flavylium

Sự khác nhau giữa các anthocyanin được xác định bởi sự khác nhau giữa số lượng và vị trí của nhóm hydroxyl trong phân tử; mức độ methyl hóa của nhóm hydroxyl; bản chất, vị trí của các nhóm đường gắn vào phân tử; bản chất số nhóm acid mạch thắng hay mạch vòng gắn vào phân tử

Hình 1.2 Cation Flavylium (R1 và R2 là OH, H hoặc OCH3, R3 là glucosyl

hoặc H, R4 là OH hoặc glucosyl) Các aglucon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí

R1 và R2, thường là H, OH hoặc OCH3

Các anthocyanin khi bị mất hết các nhóm đường được gọi là anthocyanidin hay aglycone, mỗi anthocyanindin có thể bị glycosyl hóa và acyl hóa bởi các loại đường và các acid khác nhau tại những vị trí khác nhau nên số lượng anthocyanin lớn hơn 10-20 lần so với số lượng anthocyaninidin

Sự glycosyl hóa các anthocyanin có thể xảy ra ở vị trí 7, 3’, 4’, 5’ đối với nhóm hydroxyl Tuy nhiên, do án ngữ không gian nên sự glycosyl hóa không thể xảy ra ở

vị trí 3’ và 4’

Căn cứ vào vị trí và số nhóm đường gắn vào anthocyanidin mà người ta phân loại anthocyanin thành 18 nhóm trong đó có dạng thông dụng nhất là 3-monoside, 3-bioside, 3,5-diglycoside và 3,7-diglycoside

Các loại đường thông thường nhất liên kết với anthocyanidin là glucose, các mono saccharide (rhamnose, galactose, xylose, arabinose), các disaccharide

(rutinose, sabubiose, sophorose, ít thông dụng hơn là lathyrose, gentiobiose hoặc laminariobiose) Ngoài ra, các trisacchride cũng có thể liên kết với anthocyaninidin

Bảng 1.2 Các nhóm anthocyanin hiện có trong tự nhiên.

Anthocyanidin R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 R 6 R 7 main

colour

number

E-Apigeninidin -H

-OH -H -H -OH -H -OH orange

-OH

OCH3

Luteolinidin -OH

-OH -H -H -OH -H -OH orange

-OH -OH -H -OH purple E163c

Petunidin -OH

-OH

OCH3

-OH -OH -H -OH purple E163f

Hình 1.2 cho thấy sự methyl hóa các anthocyanin và những hợp chất glycoside của chúng thường xảy ra ở vị trí C-3’ và C-5’, đôi khi cũng xảy ra ở vị trí C-5 và C-

7 Tuy nhiên thực tế cho thấy không có anthocyanin mà sự glycosyl hóa hoặc methoxyl hoa xảy ra đồng thời ở các vị trí C-3, -5,-7 và -4’ Nhóm hydroxyl ở một trong các vị trí C-5, C-7 hoặc C-4’ thì thích hợp cho việc hình thành cấu trúc quinonoidal (anhydro) base

Các anthocyanin thường bị acyl hóa bởi acid p-coumaric, cafeic, ferulic, hoặc những acid sinapic, đôi khi anthocyanin cũng bị acyl hóa bới các acid như : p-hydroxybenoic, malonic, hoặc acetic Sự thay thế nhóm acyl thường xảy ra ở vị trí C-

3 của nhóm hydroxyl đối với đường

Bảng 1.3 Một số anthocyanin phổ biến

Anthocyanin tính khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào pH (hình 2), các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác Tuy nhiên màu sắc của anthocyanin thay đổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH của môi trường Thông thường khi pH < 7 các anthocyanin có màu đỏ, khi pH > 7 thì có màu xanh Ở pH = 1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, ở pH 4 ± 5 chúng có thể chuyển về dạng base cacbinol hay base chalcon không màu, ở pH = 7 ± 8 lại về dạng base quinoidal anhydro màu xanh

Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510 ± 540 nm Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các anthocyanin Chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch và nồng độ anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh

Hình 1.3 Sự đổi màu của anthocyanin ở các pH khác nhau

Trong các chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên thì anthocyanin là họ phổ biến nhất tồn tại trong hầu hết các thực vật bậc cao và tìm thấy được trong một

số loại rau, hoa, quả, hạt có màu từ đỏ đến tìm như: gạo đen, quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, hoa hibiscus, đậu đen, quả cà tím…

1.2.3 Tính chất, đặc điểm

Màu của anthocyanin hoàn toàn thay đổi khi pH môi trường chuyển từ acid sang base và giống như các chất chỉ thị acid-base (phenolphtalein, methyl đỏ, methyl

da cam)

Trong dung dịch acid, anthocyanin tồn tại dạng ở cation flavylium có màu đỏ Khi pH tăng dần, có sự tấn công của nước vào vòng pyran C, anthocyanin chuyển dần sang dạng base carbinol và chalcone không màu Đây chính là quá trình hydrat hóa, yếu tố chính tạo nên sự bạc màu của dung dịch màu-nước trong dung dịch base,

có sự dịch chuyển của H+ từ -OH trên vòng B, anthocyanin chuyển sang dạng anion

có màu xanh Khi pH môi trường càng cao, ion H+ trogn nhóm –OH còn lại bị phân hủy và khi ấy điện tử không còn, màu xanh trở nên xanh hơn bởi vì ánh sáng hấp phụ trở thành đỏ hơn Trong môi trường trung tính, cả hai dạng cùng tồn tại nên dung dịch

có màu tím

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và độ bền của anthocyanin

So với đa số các chất màu thiên nhiên, anthocyanin là chất màu có độ bền kém hơn, nó chỉ thể hiện tính bền trong môi trường acid Ngoài ra, nó có thể phân hủy tạo thành dạng không màu và sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy có dạng màu nâu cộng với những sản phấm không tan

Sự phân hủy anthocyanin có thể xảy ra trong quá trình trích ly và tinh chế chúng, đồng thời sự phân hủy này còn xảy ra trong quá trình xử lý và bảo quản các sản phấm thực phẩm

Độ bền của các anthocyanin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: cấu trúc hóa học của anthocyanin, pH, nhiệt độ, sự có mặt của copigment, ion kim loại, oxy, acid ascorbic, SO2, ánh sáng, enzyme, đường và các sản phấm biến tính của chúng Vì vậy, nghiên cứu các yếu tổ ảnh hưởng đến độ bền của anthocyanin là điều cần thiết trước khi ứng dụng nó như một chất màu thực phẩm

1.2.4.1 Cấu trúc

a) Cấu trúc chuyển hóa trong môi trường lỏng

Trong môi trường nước các anthocyanin tự nhiên giống như chất chỉ thị pH

Đỏ ở pH thấp, đỏ xanh ở pH trung tính, và không màu ở pH cao

Tại pH đã cho, tồn tại một cân bằng giữa 4 cấu trúc của anthocyanin và aglycone: quinonoidal (anhydro) bazo (A) màu xanh, cation flavylium (AH+) màu

đỏ, carbinol pseudobase (B), và chalcone (C) không màu

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa trong nước

Khi pH < 2.0, các anthocyanin tồn tại chủ yếu dạng cation flavylium màu đỏ (R3=0-đường) hoặc màu vàng (R3 = H).Khi pH tăng, sự mất proton xảy ra nhanh thành dạng quinononidal màu xanh dương hoặc màu đỏ Dạng quinonoidal thường tồn tại như một hỗn hợp vì pKa của nhóm OH ở vị trí 4’,7 và 5 (nếu có) là tương tự Khi để yên, sự chuyển hóa hơn nữa sẽ xảy ra đó là sự tách nước của cation flavylium cho dạng carbinol không màu hay pseudobase (hemiacetal), Dạng này cân bằng với dạng chalcone vòng mở không màu

Cis (CE) và trans-chalcone (Cz) được tạo thành từ carbinol pseudobase bởi phản ứng mở vòng nhanh và isomer hóa chậm Cả 2 chalcone bình thường bởi chung

có nhóm chức carbonyl ở cạnh vòng B, trong đó chalcone bình thường có nhóm carbonyl ớ kế cận vòng A

Dạng quinonoidal base được tạo thành thông thường ở pH > 3 Cation flavylium tương đối bền ở môi trường acid (như pH < 3) Trong môi trường trung

tính hay acid yếu, anthocyanin tồn tại chủ yếu ớ các dạng không màu Vì vậy, sự ổn định của các dạng mang màu, đặc biệt là dạng quinonoidal base, một phần là do sự xuất hiện của các gốc acid gắn vào phân tử đường, hay còn gọi là sự co-pigment hóa nội phân tử Sở dĩ sự co-pigment hóa nội phân tử giúp tăng độ bền của phân tử anthocyanin là do sự xếp chồng của vòng thơm trong gốc acid với vòng pyrylium của phân tử anthocyanin, giảm bớt khả năng bị các phân tử nước tấn công hình thành các hợp chất carbinol, chalcone không màu Ngoài ra, hiệu ứng copiment hóa ngoại phân

tử cũng có thể giúp làm bền các cấu trúc quinoldal base hay ion flavylium do sự có mặt của những phức chất không màu, như các flavone, flavonol Trong quá trình xử

lý nhiệt và ánh sáng, quá trình co-pịgment hóa ngoại phân tử giữ vai trò quan trọng, ngăn chặn sự mất màu có thể xảy ra Cơ chế phân hủy do nhiệt nói chung do chuyển hóa thuận nghịch của các ion flavylium thành các dạng chalcone Chalcone là chất trung gian trong cả hai quá trình phân hủy do nhiệt và ánh sáng của anthocyanin Theo các nghiên cứu gần đây (Davis và cộng sự, 1983; Mazza và Brouiỉìard,1990) hiệu ứng co-pigment hóa chính là cơ chế làm bền màu chính của anthocyanin trong thực vât do nó làm giảm tỉ lệ giữa dạng không mang màu (chalcone) và dạng mang màu thông qua việc tạo phức với dạng mang màu, ngăn chặn quá trình chuyển hóa từ dạng mang màu sang dạng không mang màu

Trong dung dịch, anthocyanin dạng không acyl hóa hay acyl hóa một đơn vị đóng vai trò như một chất chỉ thị pH, tồn tại ở dạng acid hay base tùy thuộc vào giá trị pH Ở pH acid (pH < 3), dung dịch anthocyanin cho màu đỏ đậm Khi pH tăng, màu sắc của dung dịch sẽ nhạt dần và chuyển sang không màu và cuối cùng có màu tím hay xanh dương ở pH cao (pH > 6)

b) Cấu trúc hóa học

Các pigment anthocyanin thường có độ bền thấp trong tế bào sống của chúng Như đã trình bày ở trên, độ bền của các anthocyanin phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: Cấu trúc hóa học của anthocyaninm, pH, nhiệt độ, sự có mặt của co-pigment, ion kim loại, oxy, acid ascorbic, S02, ánh sáng, enzyme, đường và các sản phẩm biến tính của chúng

Độ bền màu và cường độ màu của các anthocyanin phụ thuộc vào vị trí và số lượng của các nhóm hydroxyl, methoxyl, đường và các đường được acyl hóa Khi số nhóm hydroxyl trong vòng B tăng, cực đại hấp thụ ở vùng thấy được dịch chuyển về phía có bước sóng dài hơn và màu thay đổi từ cam đến xanh dương

Ví dụ: bước sóng hấp thụ cực đại trong dung dịch HCL 0,01% MeOH là 535

nm (cam) đối với pelgonidin, 535 nm (đỏ cam) đối với cyaniding, 545 nm (đỏ xanh) đối với dephinidin.các nhóm methoxyl thay thế các nhóm hydroxyl cho kết quả ngược lại Nhóm hydroxyl tại vị trí C-3 đặc biệt có ý nghĩa quan trọng vì nó dịch chuyển từ màu cam vàng đến màu đỏ nhưng 3 - deoxyanthocyanin : luteolinidin và tricetinidin

có màu vàng; 3 - deoxyanthocyanidin bền hơn các anthocyanidin khác (Mazza và Brouillard, 1987; Iacobucci và Sueny, 1983)

Sự có mặt của nhóm hydroxyl tại vị trí C-5 và nhóm thế ở vị trí C-4, cả 2 bền hóa dạng có màu thông qua sự ngăn cản các phản ứng hydrat hóa dẫn đến dạng không màu

Khi mức độ hydroxyl hóa các aglycone tăng, tính bền của các anthocyanin sẽ giảm Tuy nhiên khi tăng sự methoxyl hóa,sẽ thu được kết quả ngược lại

Ví dụ: sự có mặt của nhóm OH ở vị trí 4’ và 7 trong phân tử làm bền hóa đáng

kể các pigment, trong khi đó, sự methoxyl hóa có nhóm hydroxyl này làm giảm độ bền

Các anthocyanin được glycosyl hóa và acyl hóa sẽ cho dạng màu xanh Sự glycol hóa những nhóm OH tự do làm tăng tính bền của anthocyanin Vì vậy, các diglucoside bền hơn các monoglusidc của cùng một anthocyanin

Ví dụ: thời gian bán sống (giảm 50% độ hấp thu tại bước sóng hấp thu cực đại) của các cianidin 3 - utinoside là 65 ngày tại nhiệt độ phòng trong dung dịch acid citric 0,01M, pH = 2,8 Trong khi đó anthocyanidin tự do trong cùng điều kiện có thời gian bán sống chỉ có 12h

Anthocianin có chứa 2 hay nhiều nhóm acyl (như tematin, platyconin, cinerarrin, gntiodenphin và zebrrinin) là bền trong môi trường trung tính hoặc acid yếu do lien kết hydro giữa các nhóm hydroxyl của các nhân phenolic trong anthocyanin và acid vòng thơm Brouillard (1981-1982) và Goto cùng với cộng viên(1982-1983) khảo sát rằng các anthocianin diacylate hóa được bền hóa bởi sự liên kết chặt nhờ sự tương tác giữa vòng anthocyanin và 2 nhóm acyl vòng thơm

1.2.4.2 pH

Trong môi trường nước, pH có ảnh hưởng đáng kể lên màu sắc của anthocyanin (Brouillard 1984,Mzza và Brouillard 1987) Cấu trúc, độ bền màu, màu sắc của anthocyanin thay đổi theo sự thay đối của pH Sự thay đổi cấu trúc của anthocyanin khi pH thay đổi đã được đề cập trong phần cấu trúc chuyển hóa

Ở pH < 2.0, dung dịch anthocyanin có màu hầu như đỏ (R3 = O-đường) hoặc vàng (R3 = H) Khi tăng pH của dung dịch, màu của các anthocyanin nhạt dần Khi

pH trong khoảng 4.0-6.0, hầu hết các anthocyanin đều có dạng không màu Nếu tiếp tục tăng pH, dung dịch sẽ có màu tím hoặc xanh dương và màu này có thể chuyển sang màu vàng nếu để yên hoặc xử lý nhiệt

Sự biến tính của các anthocyanin tăng mãnh liệt với sự tăng của pH trong môi trường có oxy

Chẳng hạn : rubrobraxinin cloma là các anthocyanin của bắp cải tím là một triglucozit của xianidin

Khi: pH = 2,4 - 4,0 có màu đỏ thắm

pH = 4 - 6 thì có màu tím

pH = 6 thì có màu xanh lam

pH là kiềm thì có màu xanh lá cây

1.2.4.3 Nhiệt độ

Hầu hết, các phản ứng hóa học liên quan đến độ bền anthocyanin và tốc độ phân hủy chúng đều phụ thuộc vào nhiệt độ Sự tăng theo hàm số logarit của các anthocyanin ứng với sự phân hủy anthocyanin ứng với sự tăng đại số của nhiệt độ Tính bền nhiệt của các anthocyanin phụ thuộc vào cấu trúc của chúng, pH, sự có mặt của oxy và sự tác động qua lại giữa các thành phần

Hình 1.5 Sơ đồ sự biến tính của anthocyanin 3,5-diglucoside tại pH 3,7

Khi một cấu trúc của anthocyanin bền với sự gia tăng của pH thì nó cũng bền với sự gia tăng của nhiệt độ Sự hydroxyl hóa các aglycone làm giảm tính bền của anthocyanin, trong khi sự methoxyl hóa, glycosyl hóa, acyl hóa sẽ cho kết quả ngược lại

Ví dụ: anthocyanin 3-glycoside có độ bền nhiệt lớn nhất tại pH = 1.8 - 2.0 với

sự có mặt của oxy trong khi anthocyanidin 3,5-diglycoside có độ bền nhiệt lớn nhất tại pH = 4.0 - 5.0

Cơ chế của sự phân hủy nhiệt xảy ra không những phụ thuộc vào nhiệt độ mà còn phụ thuộc vào bản thân anthocyanin đó

Drazdina cho rằng coumarin glycoside là sản phẩm phân hủy phổ biến của anthocyanin 3,5 - diglycoside và cơ chế của sự phân hủy là: đầu tiên, cation flavylium chuyển thành dạng quinonidal base, tiếp theo là hình thành nhiều dạng sản phẩm trung gian và cuối cùng thu được dẫn xuất coumarin và thành phần tương ứng với vòng B

của anthocyanidin Sự biến tính này không những được xúc tiến bởi nhiệt độ mà còn

bị ảnh hưởng bởi oxy

Anthocyanidin 3-glycoside thì không hình thành những dẫn xuất coumrin mà bước đầu tiên của sự phân hủy bao gồm sự chuyển hóa của dạng carbinol pseudobase không màu, sau đó là sự mở vòng pyrylium để hình thành dạng chalcone trước khi thủy phân liên kết glycoside

Adams cho rằng, các anthocyanidin 3-glycoside khi được nung nóng ở pH = 2.0-4.0 đầu tiên sẽ bị thủy phân liên kết glycoside (ở 100°C) sau đó là sự biến đổi aglycone thành chalcone Sự biến tính hơn nữa dẫn đến hình thành dạng sản phấm màu nâu đặc biệt là với sự có mặt của oxy

Khi đun nóng lâu dài các anthocyanin có thể bị phân huỷ và mất màu, đặc biệt

là các anthocyanin của dây tây, anh đào, củ cải Ngược lại các anthocyanin của phúc bồn tử đen cũng trong điều kiện đó lại không bị thay đổi Nhìn chung khi gia nhiệt, các chất màu đỏ dễ dàng bị phân huỷ, còn các chất màu vàng thì khó hơn

1.2.4.4 Oxy

Oxy và nhiệt độ được xem là những tác nhân đặc trưng xúc tiến sự phân hủy của anthocyanin, từ đó sinh ra những dạng sản phẩm không màu hoặc màu nâu Sự kết tủa và đóng váng trong nước trái cây có thể gây ra từ sự oxy hóa trực tiếp dạng carbinol pseudobase

Oxy hóa mãnh liệt các anthocyanin khi nung nóng Oxy và nhiệt độ là những tác nhân xúc tiến đăc biệt nhất trong nước ép của blueberry, cherry (anh đào), currant, nho, raspberry và dâu

Lượng anthocyanin còn lại của dâu sẽ lớn hơn khi đóng chai dưới điều kiện chân không hoặc nitrogen (Baravingas và Cain, 1965) Độ bền của các pigment của nho, được sử dụng như là chất màu ở nước giải khát được tăng lên khi đóng hộp với nitrogen

1.2.4.5 Enzyme

Nhiều enzyme nội sinh trong tế bào của cây có khả năng làm mất màu anthocyanin Những enzyme này được gọi chung là anthocyanase Dựa vào đặc tính của các enzyme mà người ta phân làm 2 nhóm: Glycosidase và polyphenol oxidase (PPO) Các enzyme này thu được từ nấm (fugal)

+Glycosidase: là enzyme thủy phân liên kết glycoside của anthocyanin tạo ra đường tự do và aglycone này kém bền hơn rất nhiều và mất màu rất nhanh khi có mặt của catecol (Huang 1955)

+Polyphenol oxidase (PPO): tác dụng lên anthocyanin với sự có mặt của diphenol thông qua cơ chế oxy hóa kết hợp (h 6-6) Theo Gromeck và Markakis, sự thêm vào glycosidase và PPO xúc tác cho quá trình peroxide hóa phân hủy anthocyanin

o-Hình 1.6 Sự biến tính anthocyanin với phản ứng oxy hóa catechol

Peng và Markakis đã đề nghị một cơ chế mà trong đó o-quinine được tạo thành bởi sự oxy hóa anthocyanin (H-17) Blom phân lập được enzyme anthocyanin -

glycosidase từ Aspergillus niger và chỉ ra ảnh hưởng của nó trong quá trình thủy phân

liên kết glycoside của anthocyanin PPO là enzyme có ảnh hưởng yếu lên anthocyanin dạng quinonoidal base dễ bị thủy phân bởi PPO hơn dạng cation flavylium Tốc độ

phân hủy bởi PPO phụ thuộc vào sự thay thế mô hình của vòng B và mức độ glycosyl hóa

1.2.4.6 Ánh sáng

Các anthocyanin thường không bền khi tiếp xúc với tia tử ngoại, ánh sáng thấy được và các nguồn phóng xạ khác Ánh sáng có 2 ảnh hưởng đến anthocyanin:

- tăng cường cho quá trình sinh tổng hợp

- xúc tiến sự biến tính của chúng

Những quả táo giống đỏ sẽ không chín đỏ mà xanh trong bóng tối (Siegenman,

1964 ) Vanburen và cộng sự (1948) tường trình rằng các diglycoside được acyl hóa

và methyl hóa là các diglycoside không bị acyl hóa là ít bền hơn và monoglycoside

là kém bền nhất, Palamidis và Markakis (1975) đã tìm thấy rằng ánh sáng thúc đẩy quá trình phân hủy anthocyanin trong nước giải khát có C02 được phối màu với anthocyanin từ xác nho Macccarone và cộng sự đã nghiên cứu sự quang hóa của anthocyanin và chỉ ra rằng, anthocyanin diglycosyl hóa tại vị trí C-3 và C-5 là bền hơn các anthocyanin mono glycoyl hóa tại vị trí C-3 đồng thời chúng bền hơn so với các aglycone tương ứng

1.2.4.7 Đường và các sản phẩm biến tính của chúng

Ở nồng độ 100 ppm, đường và các sản phẩm phân hủy của chúng có tác dụng thúc đẩy sự phân hủy các anthocyanin Fructose, arabinose, lactose và sorbose có khả năng phân hủy anthocyanin mạnh hơn glucose, sucrose,và maltose Tốc độ phân hủy của anthocyanin liên quan đến tốc độ phân hủy của đường Các sản phẩm phân hủy của đường gồm có: furfural, 5-hydroxymethyl furfural và acctaldehydc thude từ phản ứng Mailard hoặc từ sự oxy hóa của acid ascorbic, polyuronic hoặc ở bản thân các anthocyanin Những sản phẩm phân hủy này dễ dàng ngưng tụ với các anthocyanin hình thành những hợp chất phức tạp có màu nâu sẫm Sự phân hủy anthocyanin với

sự có mặt của furfural và HMF trực tiếp phụ thuộc vào nhiệt độ và rõ nét nhất là trong

nước trái cây sự có mặt của oxy làm tăng thêm hiệu quả phân hủy của tất cả các loại đường và các dẫn xuất của chúng

Hình 1.7 Phản ứng ngưng tụ của A: Cyanidin và furural; B: Cyanidin

ketobase và furural

1.2.4.8 Các ion kim loại

Một số ion kim loại đa hóa trị có thể tương tác với các anthocyanin có nhóm

OH ở vị trí ortho gây ra hiệu ứng sâu màu (bathocromic) Hiện tượng này xảy ra khi kim loại tiếp xúc với anthocyanin trong quá trình chế biến rau quả hoặc sự cho thêm các muối kim loại vào trong thực phẩm

Sistrunk và Cash đã chứng minh rằng có thể bền hóa màu của dịch trích dâu bằng cách thêm vào đó muối thiếc Francis (1977) công bố rằng, các ion Ca, Fe, Al tạo thêm sự bảo vệ cho anthocyanin của nước ép trái việt quất (cranberry ), nhưng sự biến đổi màu xảy ra là do sự tạo phức giữa ion kim loại và tannin, kết quả sau cùng

là không có lợi

Trong công nghiệp đồ hộp, sự mất màu của những trái cây có chứa anthocyanin là do có phản ứng với thiếc của đổ hộp (Culpepper và Caldwell, 1972) Trong phản ứng với thiếc, anthocyanin đóng vai trò như chất khử cực catod hoặc

anod Chất khử cực catod có thể bị khử bởi hydro mới sinh từ phản ứng giữa kim loại

và acid, còn chất khử cực anod thường là các anthocyanin có ít nhất 2 nhóm hydroxyl

ở vị trí ortho

1.2.4.9 Sulfurdioxide (SO 2 )

Các anthocyanin thường bị mất màu khi có mặt của SO2 Hiện tượng này thường xảy ra trong quá trình xử lý các sản phẩm thựcphẩm có chứa anthocyanin bằng SO2 Quá trình khử này có thể là thuận nghịch hoặc bất thuận nghịch Trái cây

và nước quả được xử lý bằng một lượng trung bình SO2 (500-2000 ppm), làm mất màu các anthocyanin của chúng trước khi chế biến, hơn nữa, chúng được desulfit hóa

và màu anthocyanin được phục hồi Jurd đã đề nghị sơ đồ phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và anthocyanin trong đó, dạng có màu flavylium phản ứng với ion bisulphate tạo thành chromene - 2 - (hoặc 4 ) - sulphonic acid

Hình 1.8 Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và

anthocyanin

SO2 ở nồng độ rất thấp (khoảng 30 ppm) có thể ức chế sự biến tính do enzyme của anthocyanin trong quả anh đào nhưng không làm mất màu chúng (Goodman và Markakis, 1965 ) Sự tẩy màu bất thuận nghịch xảy ra trong quá trình tẩy quả với lượng lớn SO2 (0.8 - 1.5% ) và soda (0.4 - 1.0%) được dùng trong quá trình tẩy quả Phản ứng bất thuận nghịch này chưa được biết hoàn toàn

1.2.4.10 Acid ascorbic

Nhiều nhà khảo sát (Beatic và cộng sự 1943; Pederson và cộng sự 1947; Kertesz 1952; Meschter 1953; Markakis và cộng sự 1957; Starr và Francis 1968) quan sát sự biến mất đồng thời của acid ascorbic và anthocyanin trong nước trái cây tồn trữ và đề nghị một tương tác có thế có giữa 2 hợp chất này Acid ascorbic hiện diện trong hầu hết các sản phẩm trái cây, vitamin này bị oxy hóa tạo thành H2O2 và chính

H2O2 làm mất màu anthocyanin

Hình 1.9 Sự chuyển hóa malvin thành malvone bởi H2O2 tạo thành từ sự

oxy hóa Ascorbic acid Shrikhande và Francis đã tìm thấy rằng các ion đồng xúc tiến và các flavonoid làm giảm sự phân hủy của cả hai acid ascorbic và anthocyanin Những sản phẩm không màu ( hình 1.10 ) Acid dehyroascorbic cũng có thể làm mất màu anthocyanin nhưng tại tốc độ thấp hơn acid ascorbic

Hình 1.10 Fla-2-ene được tạo thành từ phản ứng giữa Ascorbic acid và

anthocyanin

1.2.5 Sự phân bố của anthocyanin

Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn nằm

ở hoa và quả, ngoài ra cũng có ở lá và rễ Trong những loại thưc vật này, anthocyanỉn được tìm thấy chủ yếu ở các lóp tế bào nằm bên ngoài như biểu bì

Các hợp chất anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73 loài và trong vô số giống thực vật sử dụng làm thực vật (Bridle và Timberỉake, 1996)

Các họ thực vật như vitaceae (nho) và rosaceae (cherry, dâu tây, mâm xôi, táo ) là

các nguồn anthocyanin chủ yếu Bên cạnh đó còn có các họ thực vật khác như

solanceae (cà tím), saxifragaceae (quả lý đỏ và đen), ericaceae (quả việt quốc) và

brassicaceae (bắp cải tím) Các loại anthocyanin phô biến nhất là các glucoside của cyanidin, kế đến là pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đó petuidin và maldivin số lượng các 3-glucoside nhiều gấp 2,5 lần các 3,5-glucoside Loại anthocyamn hay gặp nhất chính là Cyaidin-3-glucoside

oleraea

Bắp cải tím (red cabbage)

Cy-3-sophoroside-5-glucoside cacyl hóa với malonoyl, p-coumaroyl, di- p-coumarol,feruloyl, diferuloyl, sinapoyl và disinapoyl

Fragaria spp Dâu tây

Củ cải đỏ (rễ) Pg và Cy-3-sophoroside-5-glucoside acyl hóa với

p-coumaroyl, feruloyl, caffeoyl

Vitis spp Nho Cy, Pn, Dp, Pt và Mv mono và diglucoside; dạng tự

do và dạng acyl hóa

Cy = cyanidin, Pg= pelagorindin, Pn= peonidin, Dp= delphinidin, Pt = petunidin, Mv= malvidin.

1.2.6 Các anthocyanin đã được thương mại hóa

Encolor liqid DS (công ty Reggianna, Antociani, Italy) là dịch trích vỏ nho cô đặc

Redberry liqid 88-01 được sản xuất bởi công ty Gillette Food Inc, là dịch trích quả của alderberry, blackberry, blueberry, blackcurrant

Sambucus NR 54 được sản xuất bởi công ty Gilette Food Inc, là dịch trích anthocyanin từ elderberry

San Red Liqid RC-EX được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries ( Nhật) là dịch cô đặc từ bắp cải đỏ mà chúng chứa anthocyanin diacyl hóa Powdered San Red PC được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries

là bột sấy khô của dịch tr ích từ bắp cải đỏ

Powdered San Red PC được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries

là bột sấy khô của dịch trích từ bắp cải tím

ra tốt hơn

Do đặc tính thay đổi màu theo pH, anthocyanin có thể sử dụng như một chất chỉ thị:

Xác định hàn the

Mặc dù dung dịch mẫu có chứa hàn the (pH 9.5), nhưng khi cho anthocyanin vào dung dịch mẫu, dung dịch không chuyển sang màu xanh mà chuyển sang màu xám Nguyên nhân là do hàn the (Natri borate) phản ứng với nhóm ortho hydroxy trong vòng thơm của anthocyanin tạo thành muối borate (Nguyễn Thị Phương Anh, Nguyễn Thị Lan, 2007)

Ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên được sử dụng khá an toàn trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm, anthocyanin còn là hợp chất

có nhiều đặc tính sinh học quý như: khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng

để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng; có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư; tác dụng chống các tia phóng xạ

Những đặc tính quý báu của anthocyanin mà các chất màu hóa học, các chất màu khác hình thành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được đã mở ra một hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất màu anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào trong đời sống hằng ngày, đặc biệt trong công nghệ chế biên thực phẩm Điều đó hoàn toàn phù hợp với xu hướng hiện nay của các nước trên thế giới là nghiên cứu khai thác chất màu từ thiên nhiên sử dụng trong thực phẩm, bởi vì chúng có tính an toàn cao cho người sử dụng

1.3 Các thành tựu đạt được

1.3.1 Phương pháp tách chiết anthocyanin

1.3.2 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ quả dâu Hội An

Qua nhiều nghiên cứu cho rằng với mỗi dung môi khác nhau thì khả năng chiết tách không giống nhau, tuy có nhiều phương pháp chiết tách anthocyanin từ rau quả nhưng chưa có một kết luận cụ thể khẳng định loại dung môi nào là tốt nhất cho một quy trình chiết tách Trong quả dâu, anthocyanin được phân bố ở tế bào, với bản chất

là một hợp chất thiên nhiên khá phân cực, anthocyanin hòa tan trong dung môi phân

cực Dưới đây là 5 hệ dung môi thường dùng để tách chiết các hợp chất thiên nhiên khá phân cực:

+ Methanol - nước - HCl (tỷ lệ 1:1,1% HCl)

+ Ethanol - nước - HCl (tỷ lệ 1:1,1% HCl)

+ Nước - HCl (1%)

+ Nước - formic acid (5%)

+ Nước - acetic acid (5%)

Hệ dung môi ethanol - nước – HCl tỷ lệ 1:1 (với 1% HCl) cho hàm lượng anthocyanin lớn và độ màu tương đối cao Hơn nữa ethanol ít độc hơn so với methanol và là dung môi thông dụng, rẻ tiền, dễ kiếm Đó cũng là lý do nhóm nghiên cứu chọn hệ dung môi ethanol - nước - HCl trong quy trình công nghệ chiết tách và làm sạch anthocyanin thô Hệ dung môi này cũng có thể dùng để tách chất màu anthocyanin từ các loại rau quả tương tự (Nguyễn Thị Lan, 2010)

1.3.3 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím

Sắc tố chính được chiết xuất từ bắp cải tím đó là cyanidin 3,5-diglucoside của

hệ màu anthocyanin và có màu sắc thay đổi rõ rệt theo pH môi trường Trong môi trường acid nó có màu đó bền và khi môi trường chuyển sang base màu của nó chuyển sang xanh và ổn định trong thời gian dài đây là đặc tính rất khác so với các anthocyanin của một số nguyên liệu khác (màu thay đổi liên tục tại pH kiềm) như lá tía tô, quả dâu…

Bằng phương pháp tối ưu hoá thực nghiệm trong quá trình chiết tách, đã xác định được hàm lượng Anthocyanin trong bắp cải tím Đà Lạt chiếm khoảng 1,11%

Tuy nhiên, việc sản xuất bắp cải tím ở khu vực nhiệt đới và á nhiệt đới còn ở mức hạn chế vì bắp cải tím thích họp với những vùng núi cao hoặc nơi có mùa đông lạnh