Nghiên Cứu Tạo Chế Phẩm Sinh Học Diệt Sâu Tơ Từ Vi Khuẩn Bacillus Thuringiensis Phân Lập

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------ TRẦN CHUNG DŨNG NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT SÂU TƠ TỪ VI

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

- -

TRẦN CHUNG DŨNG

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT

SÂU TƠ TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS

PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

- -

TRẦN CHUNG DŨNG

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT

SÂU TƠ TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS

PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Trương Phúc Hưng

Cơ quan: Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

THÁI NGUYÊN - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, cho phép tôi được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS

Trương Phúc Hưng giáo viên hướng dẫn khoa học, người đã tạo điều kiện

và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện các thí nghiệm trong phạm vi luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Di truyền vi sinh vật viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi trong quá trình tôi thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo, các đồng nghiệp, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và chỉ dẫn cho tôi để tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Học viên

Trần Chung Dũng

LỜI CAM ĐOAN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Tôi xin cam đoan đã thực hiện toàn bộ công trình này dưới sự hướng

dẫn của TS Trương Phúc Hưng Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn

là trung thực và chưa từng được công bố trong một luận văn nào khác Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những gì đã cam đoan ở trên

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Lời cảm ơn i

Lời cam đoan ii

Mục lục iii

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

2.1 Tuyển chọn được một số chủng Bacillus thurigiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao tại Thái Nguyên 2

2.2 Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình lên men chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 2

2.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

3.1 Phân lập và xác định đặc điểm hình thái của một số chủng vi khuẩn B thuringiensis từ các mẫu đất thu tại Thái Nguyên có khả năng diệt sâu 2

3.2 Sàng lọc các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao 2

3.3 Tối ưu điều kiện nuôi cấy và tạo chế phẩm sinh học từ loài vi khuẩn B thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

I Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) 3

1.1.Lược sử nghiên cứu và ứng dụng Bt 3

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt trên thế giới 3

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt tại Việt Nam 5

1.2 Đại cương về vi khuẩn Bt 6

1.2.1 Sự phân bố của Bt 6

1.2.2 Đặc điểm hình thái 7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

1.2.3 Phân biệt B.thuringiensis với các loài khác trong chi Bacillus 8

1.2.4 Đặc điểm sinh hóa 9

1.2.5 Phân loại Bt 10

1.2.6 Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var kurstaki 11

1.2.7 Tính chất nuôi cấy 12

1.3.1 Độc tố của Bt 13

1.3.2 Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng 15

II Tổng quan về sâu tơ (côn trùng thử nghiệm) 17

III Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B thuringiensis 19

3.1 Phương pháp lên men bề mặt 20

3.2 Lên men chìm 20

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1.Vật liệu 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis 24

2.2.2.Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch 25

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 25

2.2.4 Phương pháp lên men vi sinh vật 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Phân lập, tuyển chọn và phân loại các chủng Bacillus thuringiensis 28

3.1.1 Phân lập các chủng B thuringiensis 28

3.1.2 Sự đa dạng hình thái tinh thể các chủng B thuringiensis phân lập 29

3.1.3 Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh 30

3.2 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng Bacillus thiringiensis phân lập 31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

3.3 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bt trong phòng thí nghiệm 32

3.3.1 Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến sinh trưởng của chủng TC2.5 32

3.3.2 Lên men TC 2.5 tạo chế phẩm 34

3.3.3 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ của chế phẩm Bt – TC2.5 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus 8

Bảng 1.2 Phân loại độc tố Cry1 ở Bt var kurstaki và côn trùng đích 11

Bảng 3.1 Sự phân bố hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis 25

Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ sau 3 ngày thử nghiệm 27

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của chủng TC 2.5 28

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng TC 2.5 29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1A Chủng Bt mang bào tử và tinh thể 7

Hình 1.1B Hình dạng tế vào và tinh thể một số dưới loài Bt 7

Hình 1.2 Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên lông roi H 10

Hình 1.3 Cấu trúc không gian 3 chiều của protein Cry 2Aa 13

Hình 1.4 Cơ chế tác động của độc tố 15

Hình 1.5 Chu kỳ sống của sâu tơ Plutella xylostella 16

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus thuringiensi 24

Hình 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng, bào tử và tinh thể của vi khuẩn Bt quan sát dưới kính hiển vi quang học 26

Hình 3.3 Hình ảnh ngưng kết của chủng TC 2.5 (2) và chủng đối chứng 4D4(1) 27

Hình 3.4 Chế phẩm Bt dạng bột sau khi lên men 30

Hình 3.5 Thử hoạt tính diệt sâu tơ với chế phẩm Bt-TC2.5 31

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nhu cầu lương thực toàn cầu tăng nhanh trong những năm gần đây và được dự đoán tiếp tục tăng do sự gia tăng của dân số thế giới Một trong những giải pháp cho vấn đề lương thực toàn cầu là cải thiện năng suất mùa màng bằng cách cải tạo giống và tối ưu hoá các quy trình sản xuất trong nông nghiệp Tuy nhiên, sản lượng nông nghiệp hàng năm giảm mạnh do sự tàn phá của sâu hại với uớc tính khoảng 16-18% Thực tế thiệt hại có thể giảm bớt bằng cách kiểm soát côn trùng gây hại Trong các phương pháp kiểm soát dịch hại thì thuốc trừ sâu hoá học được sử dụng rộng rãi và phổ biến để bảo vệ mùa màng Tuy nhiên,

có rất nhiều vấn đề liên quan đến việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học trong nông nghiệp Thuốc trừ sâu hoá học không chỉ làm giảm hiệu quả đối với côn trùng đích do hình thành sự kháng thuốc mà còn tiêu diệt cả những loại côn trùng có ích, qua đó làm mất cân bằng sinh thái Hơn nữa, việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học trong thời gian dài dẫn đến chất độc tích lũy trong môi trường từ đó tác động xấu đến môi trường cũng như sức khỏe con người Do đó, vấn đề cấp thiết là tìm ra một loại thuốc trừ sâu mới thân thiện với môi trường và không

ảnh hưởng đến sức khỏe con người Thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus

thuringiensis được kỳ vọng có thể thay thế hoặc sử dụng bổ sung cho thuốc hoá

học bởi những ưu điểm của chúng như có tính đặc hiệu cao đối với côn trùng đích, an toàn và đặc biệt thân thiện với môi trường

Bacillus thuringiensis là vi khuẩn đất, hiếu khí gram dương, mang các

gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có hiệu quả tiêu diệt đối với nhiều loài côn trùng thuộc các bộ cánh vảy, cánh cứng và hai cánh

Thái Nguyên là một tỉnh miền núi trung du, nằm trong vùng trung du và

từ núi cao xuống núi thấp, trung du, đồng bằng theo hướng Bắc – Nam làm cho

khí hậu Thái Nguyên chia thành ba vùng rõ rệt trong mùa đông: vùng lạnh, vùng lạnh vừa, vùng ấm và hai mùa rõ rệt mùa mưa và mùa khô Do ảnh hưởng của địa hình, đất đai ở Thái Nguyên được phân hoá đa dạng Kết cấu của đất, điều kiện khí hậu và đặc điểm về địa hình đã tạo ra cho Thái Nguyên sự đa dạng

về thực vật, động vật, cũng như các loài vi sinh vật trong đó có vi khuẩn

tỉnh có sự phân bố của nhiều chủng Bt có hoạt tính diệt sâu cao Chính vì vậy, việc tìm kiếm, sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính cao tại Thái Nguyên từ đó sản xuất chế phẩm Bt là rất cần thiết Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi thực

hiện đề tài“ Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn

Bacillus thuringiensis phân lập tại Thái Nguyên”

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Tuyển chọn được một số chủng Bacillus thurigiensis có hoạt tính diệt sâu

tơ cao tại Thái Nguyên

2.2 Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình lên men chủng vi khuẩn

Bacillus thuringiensis

2.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus

thuringiensis phân lập

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập và xác định đặc điểm hình thái của một số chủng vi khuẩn B

thuringiensis từ các mẫu đất thu tại Thái Nguyên có khả năng diệt sâu

3.2 Sàng lọc các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao 3.3 Tối ưu điều kiện nuôi cấy và tạo chế phẩm sinh học từ loài vi khuẩn B

thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt)

1.1 Lược sử nghiên cứu và ứng dụng Bt

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt trên thế giới

Thuốc trừ sâu sinh học Bt có tiềm năng để thay thế thuốc trừ sâu hoá học

nhờ vào những đặc điểm ưu việt như thân thiện với môi trường và không gây

hại cho sức khoẻ con người Bt được sử dụng một cách có hiệu quả trong nông

nghiệp, quản lý rừng, kiểm soát muỗi và diệt sâu hại

Lịch sử của Bt bắt đầu từ khi Loius Pasteur phát hiện ra 1 loài vi khuẩn

có khả năng gây bệnh cho tằm ông đặt tên là Bacillus bombyces Năm 1901 nhà khoa học nhật bản Sigetane Ishiwata phát hiện ra Bt khi ông nghiên cứu bệnh dâu tằm, bệnh này gọi là bệnh “sotto” Ông quan sát thấy tằm chết trước khi vi

khuẩn này phát triển và cho rằng tằm chết là do độc tố chứ không phải do nhiễm khuẩn, đó là những quan sát sớm nhất về tính gây bệnh của loài vi khuẩn này

và đặt tên là Bacillus sotto Năm 1911, nhà khoa học Đức, E Berliner phân lập

được loài vi khuẩn tương tự từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải,

Anagasta kuehniella Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức được mang tên Bacillus thuringiensis do được phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringien của

Đức [3]

Chế phẩm Bt được sử dụng từ những năm 1950 [26] Một trong những ứng dụng thành công nhất của chế phẩm Bt kiểm soát Lepidoptera tại những khu rừng phía nam nước Mỹ sử dụng chủng HD-1, hoặc Bt subsp Kurstaki sản xuất độc tố Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac and Cry2A Qua đó, giảm rõ rệt sử dụng

thuốc trừ sâu hóa học [26], [27], [28], [29]

Chế phẩm Bt đã được thương mại bởi nhiều công ty để bảo vệ cây trồng trong nông nghiệp tiêu diệt một số sâu hại cây trồng như Lymantria dispar,

Choristoneura fumiferana Giữa những năm 1970 và 1990, B thuringiensis

subsp aizawai mà đặc hiệu đối với ấu trùng của một số loài sâu hại như

Spodoptera spp , và các dưới loài khác như tenebrionis and san-diego [30],

có tác dụng tiêu diệt bọ cánh cứng đã được thương mại hoá Sau đó các chủng

Bt với những độc tố khác nhau đã được giới thiệu Ví dụ: 4 chủng Bt mới có

tên LMG P-12592, LMG P-12593, LMG P-12594, and LMG P-13493 được chứng minh là có tác dụng tiêu diệt sâu hại thuộc bộ cánh vảy

Công nghệ sinh học đã phát hiện các chủng vi khuẩn mang gen tái tổ hợp

để biểu hiện gen mã hoá protein Cry Các thao tác về gen đã làm đơn giản hoá

và cải thiện kiểm soát sâu hại chính trong nông nghiệp Như đề cập ở trên, thuốc

trừ sâu Bt rất hữu dụng để tiêu diệt côn trùng gây hại Tuy nhiên nhiều nghiên cứu đã công bố sự phát triển của tính kháng độc tố Bt của Bacillus thuringiensis dẫn đến làm giảm hiệu quả của độc tố Bt đối với côn trùng gây hại Mặt khác chế phẩm Bt chỉ có tác dụng tiêu diệt sâu sinh sống trên bề mặt cây trồng mà không thể diệt được các loại sâu đục thân Hơn nữa, chế phẩm Bt dễ bị mất hoạt

tính dưới tác động của các yếu tố của môi trường như ánh sáng mặt trời Chính

vì vậy cây trồng chuyển gen đã được phát triển và được sử dụng rộng rãi trên thế giới Cây trồng chuyển gen đầu tiên là cây thuốc lá được sản suất trong năm

1983 sử dụng Agrobacterium tumefaciens [31] Vài năm sau, gen Cry mã hoá

protein có tác dụng bảo vệ cây cà chua, thuốc lá và bông được biểu hiện trong cây trồng [32]

Trong năm 1995, Cây cà chua sản xuất protein Cry3A để kiểm soát sâu hại lần đầu tiên được thương mại hóa ở Mỹ Ngô và bông sản xuất Cry 1A có

tác dụng tiêu diệt côn trùng cánh vảy cũng được trồng trong những năm tiếp theo Sau đó, nhiều loại cây trồng như lúa, ngô, bông, cà chua đã được chuyển

gen Cry từ vi khuẩn Bt có tác dụng tiêu diệt nhiều loại côn trùng gây hại quan trọng [32], [33], [34] Ví dụ, gen của vi khuẩn Bt (Cry1Ac, Cry1Ab, Cry2Ab, and Cry1F) của cây bông được biểu hiện và thương mại hoá tại 11 quốc gia trong năm 2009 [35] Năm 2009, ngô Bt biểu hiện nhiều gen (Cry1Ab, Cry1F,

Cry3Bb1, VIP3A, ry34Ab1/Cry35Ab, Cry2Ab) được thương mại hoá tại nhiều

quốc gia

Trong năm 2010, diện tích trồng bông chuyển gen Bt toàn cầu là 19,6

triệu hecta tăng 4,6 triệu hecta so với năm 2009 Bốn quốc gia là Mỹ, Argentina,

Ấn Độ và Canada có diện tích trồng cây chuyển gen Bt chiếm 90% diện tích cây trồng chuyển gen Bt toàn cầu [35]

Cuối năm 2013, cây trồng chuyển gen được trồng trên 28,8 triệu hecta

Từ năm 1996 đến 2012, giá trị của cây trồng chuyển gen Bt ước tính đạt 68,9

tỷ USD, chiếm 60% giá trị của cây trồng chuyển gen toàn cầu Tính riêng năm

2012, giá trị cây trồng chuyển gen đạt khoảng 12 tỷ USD so với 18,7 tỷ USD của giá trị cây trồng chuyển gen toàn cầu [36]

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt tại Việt Nam

Ở Việt Nam thuốc trừ sâu vi sinh Bt đã được ứng dụng đầu tiên tại Viện

Bảo vệ Thực vật năm 1971 Nguyễn Công Bình, Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính

là những người đầu tiên mở đường nghiên cứu Bt tại Việt Nam Năm 1973, Viện Sinh vật đã tiến hành sản xuất Bt bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm Năm 1973-1976, Bt đã được sản xuất chủ yếu

trên môi trường đặc với giá thể là agar tự chế tạo từ rong câu và các nguyên liệu khác như: bã khô lạc, bột đậu tương, bột cá Các chế phẩm này đã được

sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết quả tốt đẹp

Năm 1975, chế phẩm Bt đã được sản xuất theo phương pháp lên men chìm

trong nồi lên men tự tạo tại Phòng Sinh học thực nghiệm thuộc phân viện Viện Khoa học đóng tại thành phố Hồ Chí Minh Năm 1982, Viện Công nghệ thực

phẩm cũng sản xuất chế phẩm Bt theo phương pháp lên men chìm với dung tích

công chế phẩm Bt đã khiến cho các nghiên cứu Bt mở đầu khá thuận lợi và tốt

đẹp [ 3]

Trong những năm trở lại đây, việc ứng dụng Bt được mở rộng hơn Hiện

đã có rất nhiều cơ quan đi sâu vào nghiên cứu Bt như: Viện Công nghệ Sinh

học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ Sau Thu hoạch, Viện Công nghiệp Thực phẩm Tuy vậy cho tới nay ở nước ta vẫn chưa có cơ sở sản xuất thuốc

trừ sâu Bt trên quy mô công nghiệp

Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng

Bt phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cộng sự đã tách dòng và biểu hiện

gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E coli từ các chủng Bt aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh, các

protein tái tổ hợp thu được đã cho hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng Năm 2000, Võ Thị Thứ và cộng sự đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa

protein cry4A diệt ấu trùng muỗi Năm 2003, Lê Thị Thu Hiền đã thiết kế thành công vectơ chuyển gen cry1A vào cây bông [1]

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ cuối thế kỷ 20 Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gen

cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

để tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông [ 9], [10] Năm 2003, Phan Đình Pháp và cộng sự đã chuyển gen

cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn gen, đến năm

2005, gen kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens [11]

1.2 Đại cương về vi khuẩn Bt

1.2.1 Sự phân bố của Bt

Bacillus thuringiensis tồn tại ở khắp mọi nơi trong đất và trên bề mặt lá,

ở đất rừng, thảo nguyên, sa mạc hay ở môi trường có điều kiện thuận lợi cho sâu bọ phát triển như bụi hạt từ các nhà máy xay lúa mì, trong các kho bảo quản

ngũ cốc…Sự phân bố của Bt là không liên quan đến sự phân bố của côn trùng đích Tuy nhiên, Bt thường có xu hướng tồn tại nhiều trong môi trường có nhiều sâu bọ phát triển và giàu dinh dưỡng Bt được xem như là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong rất nhiều môi trường khác nhau Meadows phân chia ra 3 ổ sinh

thái phổ biến của Bt trong môi trường tự nhiên là côn trùng, thực vật và đất [13] Bt dễ dàng phát triển trong môi trường thí nghiệm chỉ với một lượng tối thiểu chất dinh dưỡng Mặc dù bào tử Bt tồn tại trong nhiều năm, nhưng chúng

không nảy mầm và nhân lên như các tế bào sinh dưỡng trong đất tự nhiên

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Bt là thành viên của nhóm 1, chi Bacillus, là khuẩn gram dương, tế bào

dạng hình que, kích thước 3-6μm, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi

Vi khuẩn hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng di động nhờ

có tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào

Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi như thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao, khô hạn Bt có khả năng sinh nội bào tử để

chống lại những điều kiện bất lợi

Quá trình sống của Bt chia thành 3 giai đoạn:

* Thể dinh dưỡng: Hình que, 2 đầu tù, thường đứng riêng hoặc có thể tạo thành chuỗi Sinh sản bằng cách phân chia theo chiều ngang

* Nang bào tử: Tế bào trưởng thành, dạng hình trứng dài, to hơn thể dinh dưỡng, một đầu hình thành bào tử hình tròn (bầu dục), đầu kia hình thành tinh thể

* Bào tử và tinh thể: Nang bào tử phát triển, vỡ ra giải phóng bào tử và tinh thể

Bào tử là dạng sống tiềm ẩn của vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, hóa chất, áp suất thẩm thấu cao Màng ngoài là phần sót lại cuả tế bào mẹ, chiếm khoảng 2-10% khối lượng khô của bào tử Lớp áo bào tử có cấu tạo bởi

3-15 lớp, chủ yếu là protein sừng Áo bào tử có sức đề kháng cao với lizozim,

proteinaza, các chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm thấu kém với các cation

Dưới áo bào tử là lớp vỏ bào tử.Vỏ bào tử chứa một lượng lớn peptidoglycan đặc biệt, ít liên kết chéo, ngoài ra còn có 7-10 % dipicolinat canxi không chứa

axit teicoic Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ bào tử cao tới 20 atm, lượng chưa

nước là 70 % Dưới lớp vỏ bào tử là lõi bào tử còn gọi là thể chất nguyên sinh cấu tạo bởi 4 thành phần: thành bào tử, nang bào tử, bào tử chất và vùng nhân

Tinh thể là một loại protein có kích thước khoảng 0,6 x 0,02 µm chiếm

khoảng 25% khối lượng khô của tế bào và có hình dạng rất đa dạng: hình tháp, ovan, lập phương hoặc hình dạng không xác định… Khi ở trong tế bào sinh dưỡng thì bào tử và tinh thể thường nằm kề nhau, khi tế bào tan thì bào tử và tinh thể cùng thoát ra ngoài [3],[13]

1.2.3 Phân biệt B.thuringiensis với các loài khác trong chi Bacillus

Các loài thuộc chi B cereus gồm B cereus, B thuringiensis, B

anthracis, B mycoides, B megaterium Gần đây có phát hiện thêm 2 loài B

Việc sinh ra protein tinh thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus

thuringiensis, tuy nhiên đó chỉ là một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại

bào tử tinh thể

Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus

Nhuộm Gram + (a) + + + +

1.2.4 Đặc điểm sinh hóa

Bt không lên men trên môi trường arrabinoza, xylose, manitol nhưng tạo axit

trong môi trường có chứa glucose, có khả năng thủy phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa 0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà Không sử dụng axit citric, không khử muối

sunphat

Bt có khả năng sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ dao động từ 15 –

45ºC Nhiệt độ tối ưu là 20-30°C

Bt không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của là

pH = 7 Bt có khả năng oxy hóa hydrocacbon đến axit hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden – Meyerhoff – Panas [3]

1.2.5 Phân loại Bt

Bt được chia làm nhiều loại phụ dựa trên các đặc điểm sau:

ứng

Cho đến nay, khoá phân loại vi khuẩn Bt theo phương pháp huyết

thanh được De Barjac và Bonnefoi đề nghị vào năm 1962, sau đó được Lauren và Thyery cải tiến năm 1996, được sử dụng phổ biến và là phương

pháp đáng tin cậy được trung tâm quốc tế Bt đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu Bt trên thế

giới từ năm 1982 [2], [3]

Nguyên lí: Khi kháng nguyên lông roi kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết Kết quả của phản ứng là tạo cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường Dưới kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được Đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao

gồm 82 thứ huyết thanh khác của Bt [3], [13]

Tuy nhiên việc phân loại chỉ dựa trên typ huyết thanh vẫn chưa phản ánh được mối liên hệ giữa chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng Việc phân lập và

tuyển chọn các chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó khăn Chính vì vậy, gần đây

một số nhà khoa học đã đề nghị đưa ra phương pháp phân loại mới dựa trên kết quả xác định typ huyết thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen

Cry và thành phần protein tinh thể, hình dạng tinh thể và hoạt lực diệt côn trùng

1.2.6 Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var kurstaki

Bacillus thuringiensis var kurstaki được phát hiện lần đầu tiên năm

1901, Tuy vậy tiềm năng thương mại của nó đã bị lãng quên cho đến mãi năm

1951

Trong các thập kỷ gần đây, Bt var kurstaki đã trở thành phương tiện chủ

yếu để kiểm soát sâu hại cây vân sam tại Canada Đến năm 1986, việc sử dụng

Bt var kurstaki tăng một cách đáng kể, khoảng 74% rừng được phun đối với

sâu hại cây vân sam

Ở các nước khác, Bt var kurstaki được sử dụng để trừ sâu bướm, bướm

đêm, sâu thuốc lá và đặc biệt là sâu tơ hại bắp cải, sinh sản nhanh, thời gian

sống ngắn nhưng mức độ phá hoại cao Bacillus thuringiensis var kurstaki là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn B thuringiensis và chiếm tỉ lệ cao

nhất Theo các tài liệu công bố, thì trong số 83,5% số chủng kiểm tra ngưng kết

với các typ huyết thanh đã có thì Bacillus thuringiensis var kurstaki ngưng kết với typ H3a,3b,3c chiếm 27,6%, sau là B thuringiensis var azawai ngưng kết với typ H7 chiếm 15%, B thuringiensis var morrisoni ngưng

Tế bào vi khuẩn với

kháng nguyên bề mặt

Phân tử kháng thể với 2 vị trí liên kết đặc hiệu

Phản ứng ngưng kết

Hình 1.2 Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên lông roi H

kết với typ H8a,8b chiếm 13,8%,…Bacillus thuringiensis var kurstaki sinh tinh

thể hình lưỡng tháp, hình lập phương và hình cầu trong đó hình lưỡng tháp là

chủ yếu cà có hoạt tính với côn trùng bộ cánh vẩy (Lepidoptera), và một số côn trùng bộ hai cánh (Diptera) Các tinh thể có trọng lương phân tử 130 – 140kDa được mã hóa bởi 130 gen cry1 khác nhau từ cry1A – cry1F Dưới đây là bảng phân loại độc tố Cry1 ở Bacillus thuringiensis var kurstaki và côn trùng [3]

Bảng1.2: Phân loại độc tố Cry1 ở Bt var kurstaki và côn trùng đích

xylostella, Ostri nianubilalis

virescens, Manduca sexta, Pieris brassiace

exigua, Mamestra brassicae

exgua

1.2.7 Tính chất nuôi cấy

Tính chất nuôi cấy của các loài Bt khác nhau là khác nhau, đồng thời

phụ thuộc vào thành phần môi trường, thời gian và nhiệt độ nuôi cấy

Khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường MPA của dưới loài Bt var kurstaki

ở 30ºC trong 72 giờ có đa số có hình tròn, màu trắng sữa có mép nhăn Đường kính có thể đạt tới 8 -10 mm [3], [4]

1.3 Độc tố của Bt và cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng 1.3.1 Độc tố của Bt

Bt có 4 loại độc tố: ba ngoại độc tố và một nội độc tố

1.3.1.1 Ngoại độc tố α

Ngoại độc tố α có bản chất là một enzym gọi là photpholipase hoặc

leucithinase có hoạt tính với một vài loài ong cắn lá Được tiết ra trước khi tinh thể và bào tử hình thành Độc tố này có khối lượng phân tử thấp, không bền với nhiệt, tan trong nước và được giải phóng ra ngoài khi tế bào tan rã Gây độc ở những côn trùng có pH ở ruột từ 6,6-7,2 Tác dụng độc của ngoại độc tố có liên quan tới sự phân hủy photpholipit ở mô ruột, gây nên những tổn thương đường

ruột cho côn trùng Nghiên cứu này được phát hiện bởi Toumanoff năm 1953

ăn phải độc dưới ngưỡng gây chết Qua nghiên cứu Brian Federici và Dongwu

cũng nhận thấy rằng chế phẩm Bt nếu chỉ sử dụng ngoại độc tố β thì hiệu quả diệt côn trùng chỉ đạt 20% trong khi đó nếu bổ sung độc tố γ thì hiệu quả diệt

côn trùng sẽ tăng lên tới 75%

1.3.1.3 Ngoại độc tố γ

Ngoại độc tố có γ trọng lượng phân tử thấp, mẫn cảm với nhiệt độ, ánh

sáng và không khí, có khả năng tan trong nước Độc tố này thuộc nhóm photpholipase, có tác dụng lên photpholipit và giải phóng ra axit béo, rất mẫn

vô hoạt

1.3.1.4 Nội độc tố δ

Khả năng diệt côn trùng một cách đặc hiệu của Bt là do protein tinh thể

độc của nó tạo ra

Nội độc tố δ (chính là tinh thể độc) có tác dụng diệt côn trùng mạnh nhất

Nó có bản chất là một protein gồm 1180 axit amin, các axit amin chủ yếu là glutamic, asparaginic, chiếm trên 20% tổng số axit amin trong phân tử protein, đây cũng là một nguyên nhân gây ra điểm đẳng điện thấp Lượng xistin nhỏ hơn 20% tổng số axit amin quy định sự không hòa tan của tinh thể, ngoài ra

còn có các axit amin: acginic, treonin, Lơxin, izolơxin

Ngoài protein tinh thể còn chứa các thành phần khác như: hydratcacbon, tuy nhiên cũng có thể hydrat cacbon chỉ là thành phần phụ được pha tạp trong quá trình hình thành bào tử Xét về thành phần hóa học thì nội độc tố chứa chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một lượng nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn Tuy nhiên, nguyên tố P hầu như không có

Nội độc tố δ có đặc điểm không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ

tan trong môi trường có pH kiềm (pH< 11,5), không tan trong nước, rất bền nhiệt Khi đun nóng ở 65˚C trong một giờ không bị mất hoạt tính, chỉ khi đun

ở 100˚C trong 30 – 40 phút thì tinh thể bị mất tính độc Ở pH quá cao hay quá thấp tinh thể bị mất hoạt tính và mất năng lực phản ứng với tính chất là một kháng nguyên

Hình 1.3 Cấu trúc không gian 3 chiều của protein Cry 2Aa

(Morse et al., 2001)

a Cấu trúc của protein Cry2Aa với vùng I (màu tía), vùng II (màu xanh),

vùng III (màu lục lam)

b,c: Vùng kỵ nước màu lục lam, màu xanh và màu tía, vùng kỵ nước màu trắng và đuôi N màu đỏ

d-f: 3 vùng của Cry 2Aa

1.3.2 Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng

Các chủng Bt khác nhau có hoạt tính diệt côn trùng khác nhau Khả năng diệt côn trùng của các loài Bt chỉ thể hiện khi tinh thể độc được côn trùng tiêu

hoá

Khi côn trùng ăn phải tinh thể độc và nuốt vào ruột, tinh thể sẽ được hoà tan và thuỷ phân các tiền độc tố 130kDa và 70kDa thành δ – endotoxin nhờ pH kiềm cao và hệ enzym protease ở trong ruột ấu trùng Độc tố này bám dính lên

tế bào thượng bì của ruột tạo nên lỗ thủng để cho ion và nước chảy vào làm cho