Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Khuẩn Và Bước Đầu Xác Định Thành Phần Hóa Học

Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của một số cao chiết từ Podocarpus sp.”

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Hồng Vân MSSV: 1151110422 Lớp: 11DSH01

được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm công bố Mọi sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, hay gian trá, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng Vân

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy Phạm Minh Nhựt đã tận tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp cũng như những buổi nói chuyện, thảo luận về lĩnh vực sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, định hướng nghiên cứu Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy

Cuối cùng em xin cảm ơn thầy cô ở phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học- Thực phẩm- Môi trường, cùng bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để

em hoàn thành đồ án của mình

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng Vân

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN 2

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Phạm vi nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1. Giới thiệu Podocarpus sp 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 3

1.1.3 Đặc điểm sinh học và sinh thái học 3

1.1.4 Công dụng của Podocarpus sp 4

1.2 Thành phần hóa học của thực vật 5

1.2.1 Carbohydrate 5

1.2.2 Amino acid 5

1.2.3 Alkaloid 6

1.2.4 Glycoside 7

1.2.5 Steroid 8

1.2.6 Tannin 8

1.2.7 Isoprenoid (Terpene) 9

1.3 Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật 10

1.3.1 Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn 10

1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn 10

1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật 11

1.3.4 Khái niệm nồng độ ức chế tối thiểu MIC 13

1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình 14

1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 14

1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 19

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Địa điểm và thời gian 22

2.1.1 Địa diểm 22

2.1.2 Thời gian 22

2.2 Vật liệu 22

2.2.1 Nguồn mẫu 22

2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị 22

2.2.3 Hóa chất, môi trường 22

2.2.4 Dụng cụ, thiết bị 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu 24

2.3.2 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi khuẩn 24

2.3.3 Phương pháp bảo quản và giữ giống 25

2.3.4 Phương pháp ngâm mẫu 25

2.3.5 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) 26 2.3.6 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 26

2.3.7 Phương pháp xác định thành phần hóa học 27

2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 27

2.4 Bố trí thí nghiệm 28

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao 29

2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của Podocarpus sp với các dung môi khác nhau 33

2.4.3 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) 36

2.4.4 Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học Podocarpus sp 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao 46

3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Podocarpus sp với các dung môi khác nhau 47

3.3 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp 54

3.4. Kết quả xác định thành phần hóa học Podocarpus sp 56

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58

4.1 Kết luận 58

4.2 Đề nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ETEC: Enterotoxigenic Escherichia coli

TSB: Trypton Soya Broth

TSA: Trypticase Soya Agar

MIC: Minimal Inhibitory concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu DMSO: dimethysulfoside

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3 1 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các dung môi trên 20 chủng

vi sinh vật 52 Bảng 3 2 Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ

Podocarpus sp 54

Bảng 3 3 Thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp 56

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 1.Hình ảnh cây Podocarpus imbricatus 4

Hình 1 2 Hình ảnh Escherichia coli dưới kính hiển vi 14

Hình 1 3 Ảnh chụp của Shigella sp trong một mẫu phân 15

Hình 1 4 Hình ảnh của Salmonella 16

Hình 1 5 Hình ảnh Vibrio cholerae 17

Hình 1 6 Hình chụp Listeria monocytogenes bằng kính hiển vi điện tử 18

Hình 1 7 Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa 19

Hình 1 8 Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus 20

Hình 1 9 Hình ảnh Enterococcus feacalis 21

Hình 2 1 Quy trình xử lý mẫu 24

Hình 2 2.Quy trình chung 28

Hình 2 3 Quy trình khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao 29

Hình 2 4.Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 50o 30

Hình 2 5 Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 70o 31

Hình 2 6 Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 90o 31

Hình 2 7 Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn 33

Hình 2 8 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 35

Hình 2 9 Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp 36

Hình 2 10 Kết quả MIC của ETEC 38

Hình 2 11 Kết quả MIC của E.coli O157:H7 38

Hình 2 12 Quy trình xác định thành phần hóa học 39

Hình 2 13 Thử nghiệm carbohydrate và saponin 40

Hình 2 15 Thử nghiệm flavonoid 42

Hình 2 16 Thử nghiệm phenolic 43

Hình 2 17 Thử nghiệm tannin 44

Hình 2 18 Thử nghiệm steroid 45

Hình 3 1 Hiệu suất tách chiết từ Podocarpus sp của một số dung môi 46

Hình 3 2 Hoạt tính kháng khuẩn của Echerichia coli spp với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500g/ml 47

Hình 3 3 Hoạt tính kháng khuẩn của Salmonella spp với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml 48

Hình 3 4 Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Shigella spp với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml 49

Hình 3 5 Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Vibrio spp với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 8 g/ml 50

Hình 3 6 Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Listeria spp và nhóm vi sinh vật gây bệnh khác với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml 51

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Từ ngày xưa, con người đã biết tận dụng các loại cây cỏ trong tự nhiên để phục vụ vào cuộc sống hằng ngày như làm thực phẩm,… và đặc biệt là trong chữa bệnh Tài nguyên cây thuốc là một trong số những tài sản vô giá mà thiên nhiên ban tặng cho con người Những thầy thuốc giỏi chữa được nhiều căn bệnh hiểm nghèo thường có một kiến thức rất uyên thâm về cây thuốc và các công dụng của chúng, cây thuốc sau khi được đem về sẽ được phơi khô và chủ yếu ngâm với nước sắc làm thuốc uống, thuốc này trị được nhiều bệnh và như một bài thuốc dân gian nó vẫn tồn tại cho tới ngày nay

Xã hội ngày càng phát triển thì tỷ lệ dịch bệnh ngày càng tăng và đa dạng thì việc tạo ra loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên có hiệu quả cao đồng thời không có tác dụng phụ là điều hết sức cần thiết Trên thế giới cũng như ở Việt Nam có nhiều nhà khoa học nghiên cứu về cây thuốc, đi sâu tìm hiểu từng hoạt chất có trong cây cỏ có trong các bài thuốc dân gian Bên cạnh đó, các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trở nên rất phổ biến và phương pháp chữa trị chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng sinh Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh sẽ dẫn đến rủi ro do hiện tượng kháng thuốc Do đó, việc tìm ra một nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn giúp ta tạo ra một phương pháp điều trị một cách hiệu quả đối với đối với một số bệnh thông thường

Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của

một số cao chiết từ Podocarpus sp.”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây Podocarpus sp với nhiều dung môi

khác nhau

Xác định thành phần hóa học của cây Podocarpus sp với nhiều dung môi

khác nhau

3 Nội dung nghiên cứu

Đánh giá ảnh hưởng của một số dung môi đến hiệu suất thu hồi từ

Chỉ khảo sát cây thuốc với mức độ chi Podocarpus sp

Giới hạn khảo sát chỉ trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị

1.1.3 Đặc điểm sinh học và sinh thái học

Chi này có 2 phân chi là Podocarpus và Foliolatus

Phân chi Podocarpus thường thấy ở các khu rừng thuộc Tasmania, New

Zealand, nam Chile, một vài loài (nhưng hiếm thấy) ở vùng cao nguyên nhiệt đới

châu Phi và châu Mỹ Phân chi Foliolatus thường thấy phân bố tự nhiên ở châu Á

và châu Úc Ở Việt Nam, cây mọc ở rừng nhiệt đới ẩm thường xanh, giữa các độ cao 300 - 2400 m Phân bố rải rác ở một số nơi, như đã gặp ở vùng Quảng Ninh (Hoành Bồ), Lào Cai (Sa Pa), Nghệ An (Pù Mát), Quảng Bình, Quảng Trị, Khánh Hoà và Lâm Đồng Cây còn mọc ở một số nơi vùng Tây Nguyên như Gia Lai, Kon Tum và Đắc Lắc Phân bố của loài rất thưa thớt, không tìm thấy cây mọc thành quần thụ hoặc thành đám, tái sinh tự nhiên chủ yếu ở chỗ trống, ven đường đi Gây trồng khó và sinh trưởng chậm Bạch tùng đã được trồng thử tại Đà Lạt, song sắc lá màu vàng chứng tỏ sinh trưởng kém Một số cây con cũng đã được trồng thử tại Mang Linh trong những năm vừa qua Cây mọc chậm, sống lâu, ưa sáng, lúc nhỏ cần che bóng (Vũ Văn Dũng, 1996)

Hình 1 1.Hình ảnh cây Podocarpus imbricatus

1.1.4 Công dụng của Podocarpus sp

Một số loài Podocarpus được sử dụng trong y học cổ truyền cho các bệnh

như sốt, ho, viêm khớp, các bệnh lây truyền qua đường tình dục Một loại thuốc hóa

trị liệu được sử dụng trong điều trị bệnh bạch cầu được làm từ Podocarpus Một số loài Podocarpus được trồng làm cây vườn, hoặc hàng rào,thường cho tán lá xanh,

bao gồm P.macrophyllus, dương xỉ, hoặc P.kusamaki, P salignus từ Chile,

và P nivalis, cây bụi đỏ cho trái nhỏ hơn Gỗ bạch tùng đẹp, màu vàng nhạt hay

màu nghệ, thớ mịn, có giá trị, dễ gia công chế biến, được khai thác mạnh ở khắp nơi

để dùng làm gỗ xây dựng và trần nhà, sàn nhà Tỷ trọng đạt 0,56 Không thuộc loại

gỗ bền, tốt nhưng đẹp và hiếm nên vẫn được ưa dùng

1.2.1.2 Tính chất

Carbohydrate có thể chia thành 3 nhóm:

- Monosaccharide: glucose, fructose

- Disaccharide: saccharose, lactose, maltose

- Polysaccharide: tinh bột, cellulose

Chúng có đặc tính chung là dễ hoà tan trong nước, đồng hoá và sử dụng nhanh để tạo glycogen Các carbohydrate đơn giản đều có vị ngọt, khi vào cơ thể xuất hiện tương đối nhanh trong máu

1.2.1.3 Vai trò

- Cung cấp năng lượng cho tế bào và cơ thể thực vật

- Vai trò cấu trúc, tạo hình (Cellulose,…)

Các amino acid là những chất rắn ở dạng tinh thể không màu, vị hơi ngọt, dễ tan trong nước (do tồn tại kiểu muối nội phân tử) Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ

200 – 3000C

1.2.2.3 Vai trò

Amino acid thiên nhiên (hầu hết là α-amino acid) là cơ sở để kiến tạo nên các loại protein của cơ thể sống

Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất ở thực vật

Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật

Tăng khả năng ra hoa và quả (Trumbo P, 2013)

Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alcaloid ra khỏi muối của nó bằng những kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH… khi định lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa chọn chỉ thị màu cho thích hợp

Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng

Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt…) tạo ra muối phức

1.2.3.3 Vai trò

- Alkaloid co tác dụng diệt khuẩn

Glycoside là những sản phẩm ngưng tụ của đường

1.2.4.2 Tính chất

Glycoside là dạng tinh thể không màu

Phần đường và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycoside dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme (men) có chứa trong cây Phần đường trong glycoside chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccarid, thường là glucose, rhamnose, galactose Trong thành phần của một số glycoside có đường đặc biệt không có trong các glycoside khác (ví dụ trong glycoside tim) Phần aglycon của các glycoside có thể thuộc các nhóm chất hữu cơ khác nhau ví dụ cồn, andehyd, acid, phenol, dẫn chất anthracen…đôi khi có các aglycon có chứa nitơ, lưu huỳnh song thường chứa cacbon, hydro, oxy Do đặc tính

dễ bị phân huỷ, khó thu được ở dạng tinh khiết nên việc nghiên cứu cấu trúc thường gặp nhiều khó khăn

Tác dụng phụ thuộc vào phần aglycon, phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng

khác nhau (Có thể dựa vào tủa với muối sắt để xác định tannin trên vi phẫu - nhỏ muối sắt III, kalibicromat 10%, tạo thành tủa nâu trên tế bào chứa tannin)

Terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ thông và trong tinh dầu thảo mộc như tinh dầu xả, quế, cam, chanh

các hương liệu được sử dụng trong nước hoa và hương vị được sử dụng trong các chất phụ gia thực phẩm Vitamin A là một terpene (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.3 Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật

1.3.1 Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn

Hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật

có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi khuẩn, bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của

vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa của chúng, thường có tác dụng đặc hiệu với một nồng độ rất nhỏ

Các chất kháng khuẩn thực vật thường là các hợp chất như alkaloid, flavonoid, tannin và một số loại tinh dầu (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2010)

1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn

Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn: tác động lên quá trình tổng hợp vách tế bào làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu

Ức chế chức năng của màng tế bào (tổn thương màng tế bào): cơ chế làm mất chức năng của màng, các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài

Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide

Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: bất hoạt RNA, DNA: Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin) Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình

nhân đôi của DNA Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm

ức chế quá trình tạo acid nucleic (Amoros và ctv, 1992)

Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên

quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy

b Berberine

Berberine cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với Shigella, tụ cầu khuẩn,

nhiều vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn axit Ngoài ra có còn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với trùng gây bệnh sốt rét Cơ chế kháng khuẩn Berberine là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn Đặc biệt khi dùng berberin điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột Các nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột

1.3.3.2 Terpenoid và tinh dầu

Các loại terpenoid tinh dầu cũng có khả năng kháng khuẩn nhờ các khả năng hòa tan lipid trong màng tế bào vi khuẩn bởi các hợp chất lipophilic Phá vỡ vách tế bào Terpenene và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus và động vật nguyên sinh Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu

có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế được vi khuẩn Các acid betulinic triterpenoid chỉ là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức chế được HIV Gần đây các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện

diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria

monocytogenes

1.3.3.3 Phenol đơn và acid phenolic

Phenolic được xem là nguyên nhân dẫn đến sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự tương tác không đặc hiệu của các chất này với protein

a Quinone

Quinone có thể tạo phức không thay đổi được với các amino acid ái nhân trong protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein Vì lí do đó khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn

Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng

b Tannin

Tannin có khả năng liên kết với protein làm mất hoạt tính của các protein chức năng, ức chế enzyme được xem là cơ chế chung của các hợp chất tannin (Hisanori Akiyama và ctv, 2001)

c Flavonoid

Flavonoid có khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào và tạo phức với thành tế bào vi khuẩn Các flavonoid càng ưa béo có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật Chúng có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucose Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được, ức chế tổng hợp axit nucleic của vi khuẩn, tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của

vi khuẩn (Cushnie T P và Lamb A J, 2006)

1.3.3.4 Lectin và polypeptide

Cơ chế kháng khuẩn là do có sự hình thành của các ion trên màng vi sinh vật, hoặc do sự cạnh tranh và ức chế sự bám dính protein trên cơ quan nhận cảm vật chủ ở vi sinh vật Bên cạnh đó chúng còn phá vỡ màng tế bào, cản trở sự trao đổi chất và ảnh hưởng tới các thành phần tế bào chất

1.3.3.5 Saponin

Nhóm saponin, chủ yếu là asiaticosid có tác dụng lên Mycobacterium leprae

Tác dụng được giải thích do asiaticosid làm tan màng sáp của vi khuẩn (Michał Arabski và ctv, 2012)

1.3.4 Khái niệm nồng độ ức chế tối thiểu MIC

- Agar well diffusion method

- Disc diffusion method

Ta có thể xác định MIC là nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng của vi khuẩn, quan sát được bằng mắt trần

1.3.4.3 Ý nghĩa

Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng)

Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, và bằng mắt thường đã có thể xác định được điều này

1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình

1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy

1.4.1.1 Escherichia coli

a Đặc điểm

Escherichia coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống

ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính

Hình 1 2 Hình ảnh Escherichia coli dưới kính hiển vi

b Khả năng gây bệnh của một số Escherichia coli

EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): gây xuất huyết ở ruột

EPEC (Enteropathogenic E.coli): gây bệnh đường ruột, chủ yếu gây bệnh ở

trẻ em, cơ chế gây bệnh chưa rõ

ETEC (Enterotoxigenic E.coli): sinh độc tố ruột

EIEC (Enteroinvasive E.coli ): gây bệnh do xâm lấn tế bào

EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli kết tập ở ruột (Cao

Minh Nga, 2014)

1.4.1.2 Shigella

a Đặc điểm

Shigella là trực khuẩn Gram âm,hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh

ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính

Hình 1 3 Ảnh chụp của Shigella sp trong một mẫu phân

b Khả năng gây bệnh của một số Shigella

Gây bệnh lỵ trực trùng, có 4 nhóm:

Nhóm A: S dysenteriae: tiết độc tố shiga

Nhóm B: S flexneri: tiết độc tố giống shiga (shiga- like- toxin)

Nhóm C: S boydii: không tiết độc tố

Nhóm D: S sonnei: tiết độc tố giống shiga (Cao Minh Nga, 2014)

1.4.1.3 Salmonella

a Đặc điểm

Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh ở đường

tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính

Hình 1 4 Hình ảnh của Salmonella

b Khả năng gây bệnh của một số Salmonella

S typhi: gây sốt thương hàn

S choleraesuis: gây nhiễm trùng máu và áp- xe khu trú ở các cơ quan nội

tạng

S.enteridis: gây viêm ruột (Cao Minh Nga, 2014)

1.4.1.4 Vibrio

a Đặc điểm

Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và

catalase dương tính, là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, tạo nitrite từ nitrate

Hình 1 5 Hình ảnh Vibrio cholerae

b Khả năng gây bệnh của một số Vibrio

Một số loài vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh Hầu hết các chủng gây

bệnh có liên quan với viêm dạ dày ruột, nhưng cũng có thể lây nhiễm các vết

thương hở và gây nhiễm trùng huyết Tiếu biểu như Vibrio alginolyticu gây nhiễm trùng vết thương, chúng cũng có mặt trong các cơ quan của động vật như cá nóc V

cholera là tác nhân gây bệnh tả V harveyi là một tác nhân gây bệnh của một số loài

động vật thủy sinh Vibrio parahaemolyticus ăn phải vi khuẩn có trong hải sản sống

hoặc nấu chưa chín, thường là hàu, là nguyên nhân chủ yếu là viêm dạ dày cấp tính, nhiễm trùng vết thương cũng xảy ra, nhưng ít phổ biến hơn so với bệnh thủy sản gây ra

1.4.1.5 Listeria

a Đặc điểm

Listeria là một vi khuẩn Gram dương, kị khí tùy nghi, không sinh bào tử Có

thể được tìm thấy trong đất, nước, trong các loại thịt chưa nấu chín, rau sống, trái cây,thực phẩm làm từ sữa, và thực phẩm chế biến

Hình 1 6 Hình chụp Listeria monocytogenes bằng kính hiển vi điện tử

b Khả năng gây bệnh

Các bệnh của người trong chi Listeria thường do Listeria monocytogenes gây

ra Đây là loại vi khuẩn gây độc, với 20% đến 30% số ca nhiễm lâm sàng gây nên

bệnh Listeriosis dẫn đến tử vong Một số triệu chứng liên quan với bệnh listeriosis bao gồm sốt, đau cơ, tiêu chảy, nôn và buồn nôn Phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh, người già và những người có hệ miễn dịch kém là dễ bị bệnh listeriosis

1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da

1.4.2.1 Pseudomonas aeruginosa

a Đặc điểm

Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường Sự

biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật Trong số

những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong

công nghệ sinh học

Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không

có bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen

Hình 1 7 Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa

b Khả năng gây bệnh

Pseudomonas làmột trong những vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con người Vi khuẩn này phát triển bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; trong cơ

người bị suy giảm hệ miễn dịch Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các

cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu và thận sẽ gây ra những tử vong cao; bởi vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt niêm mạc bên trong cơ thể Bên cậnh đó, vi khuẩn này cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa bao gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch Đây cũng là nguyên nhân gây ra viêm chân lông

1.4.2.2 Staphylococcus aureus

a Đặc điểm

Staphylococcus aureus là một loài tụ cầu khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi

Hình 1 8 Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus

b Khả năng gây bệnh

Staphylococcus aureus là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm

khuẩn trong các loài tụ cầu Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi và da (Ogston A, 1984)

1.4.2.3 Enterococcus feacalis

a Đặc điểm

Enterococcus feacalis: Gram dương,lên men glucose, sinh acid làm giảm pH

môi trường Không tạo độc tố, và không tạo ra một phản ứng catalase với hydrogen peroxide Nó có thể tạo ra một phản ứng pseudocatalase nếu trên môi trường thạch máu

Hình 1 9 Hình ảnh Enterococcus feacalis

b Khả năng gây bệnh

E faecalis có thể gây ra viêm nội tâm mạc và nhiễm khuẩn huyết, nhiễm

trùng đường tiết niệu, viêm màng não và nhiễm trùng khác ở người

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian

2.2.3 Hóa chất, môi trường

Dung môi DMSO (dimethysulfoside) (Trung Quốc)

Methanol (Trung Quốc)

Ethanol (Trung Quốc)

Cồn (Việt Nam)

Nước cất (Việt Nam)

NaCl (Đức)

Môi trường TSA, TSB (Trung Quốc)

Agar (Việt Nam)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu

Hình 2 1 Quy trình xử lý mẫu

Lá, thân, cành của Podocarpus sp được thu thập từ vùng Lâm Đồng rửa sạch

và phơi khô trong không khí tới khi có trọng lượng không đổi Các mẫu phơi khô được cắt thành miếng nhỏ và sau đó nghiền thành bột Bột mẫu được đựng trong túi nhựa và được lưu trữ trong một nơi kín khí chuẩn bị cho công việc tiếp theo (Moses, A.G, 2013)

2.3.2 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi khuẩn

Mục đích: tăng sinh khối vi sinh vật chỉ thị đến số lượng cần thiết, giúp hoạt hóa vi khuẩn trở về trạng thái bình thường sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo quản

Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng thích hợp Môi trường dinh dưỡng phải chứa thành phần đa lượng và vi lượng để vi sinh vật phát triển, đảm bảo có đủ điều kiện lý hóa thích hợp để vi sinh vật trao đổi chất với môi trường

Tiến hành:

- Chuẩn bị chai chứa 10ml môi trường tăng sinh

- Lấy sinh khối vi sinh vật cho vào chai môi trường

- Lắc 150 vòng/phút, 18- 24h ở nhiệt độ phòng (sinh khối vi sinh vật tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy)

2.3.3 Phương pháp bảo quản và giữ giống

Hiện nay có 3 cách giữ giống:

- Giữ giống thạch nghiêng: lấy giống VSV cấy vào ống thạch nghiêng, ủ cho VSV phát triển, đem trữ lạnh ở nhiệt độ 40C Giống này thường được sử dụng cho sản xuất Thời gian sử dụng từ 7 – 10 ngày

- Giữ giống trong glycerol 20% ở nhiệt độ -40C: vi khuẩn sau khi tăng sinh, hút vào eppendorf và ly tâm 5000 v/p trong thời gian 15 phút Loại bỏ dịch

và giữ cặn Bổ sung 1 ml glycerol 20% và đồng nhất rồi bảo quản ở nhiệt độ -40C Giống này được sử dụng để cấy chuyển qua thạch nghiêng Thời gian

sử dụng từ 1 – 3 tháng

- Giữ giống trong glycerol 20% ở nhiệt độ - 180C: cách làm tương tự như trên nhưng bảo quản ở nhiệt độ - 180C Giống này khi sử dụng để chuyển về -40C trước khi cấy sang thạch nghiêng Thời gian sử dụng từ 6 tháng – 1 năm

2.3.4 Phương pháp ngâm mẫu

Mục đích: tách chiết hợp chất kháng khuẩn thực vật để nghiên cứu

Nguyên tắc: sử dụng dung môi để tách chiết các hợp chất trong thực vật nhờ lực liên kết hóa học

Tiến hành:

- Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi cho vào erlen, ngâm 24h, lọc, thu dịch lần 1

- Bã + 100ml dung môi ngâm 24h, lọc, thu dịch lần 2

- Ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần

2.3.5 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method)

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết dựa trên phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của (Aibinu và ctv, 2007) các hợp chất kháng khuẩn

có trong cao chiết khuếch tán vào trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn chỉ thị Nếu các hợp chất trong cây có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch

Phương pháp được thực hiện như sau: Hút dịch vi khuẩn chỉ thị có mật độ

106 cfu/ml để trang trên đĩa TSA Sau khi trang đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút đợi đĩa khô Sau đó dùng cây đục lỗ đã hấp khử trùng đục 3 lỗ mỗi đĩa thạch, dùng kim đã hấp tiệt trùng ghim các khối thạch ra bỏ

Dùng 100 µl dịch vi khuẩn cần khảo sát, nhỏ vào mỗi lỗ trên đĩa thạch vừa tráng vi khuẩn chỉ thị, tiến hành dán parafilm để tránh nhiễm

Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 37oC trong 24 giờ và đo đường kính vòng kháng khuẩn

2.3.6 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC

Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng)

Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, và bằng mắt thường đã có thể xác định được điều này

Phương pháp xác định chỉ số MIC của cao chiết dựa trên phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của (Aibinu và ctv, 2007) tại các nồng độ cao chiết khác nhau, các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết khuếch tán vào trong môi trường agar cũng khác nhau và cùng tác động lên vi khuẩn chỉ thị Nồng độ cao chiết thấp nhất mà tại đó chúng bắt đầu có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch gọi là nồng độ ức chế tối thiểu

Phương pháp được thực hiện như sau: Hút dịch vi khuẩn chỉ thị có mật độ

106 cfu/ml để trang trên đĩa TSA Sau khi trang đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút đợi đĩa khô Sau đó dùng cây đục lỗ đã hấp khử trùng đục 3 lỗ mỗi đĩa thạch, dùng kim đã hấp tiệt trùng ghim các khối thạch ra bỏ

Hút 100µl dịch cao chiết với nồng độ khác nhau, nhỏ vào các lỗ trên đĩa thạch vừa tráng vi khuẩn chỉ thị, tiến hành dán parafilm để tránh nhiễm

Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 37oC trong 24 giờ và đo đường kính vòng kháng khuẩn

2.3.7 Phương pháp xác định thành phần hóa học

Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ

Podocarpus sp bằng các phản ứng hóa học với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính

chất hóa học của chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm

đã được chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất

Phương pháp xác định thành phần hóa học dựa theo phương pháp của Moses A.G, 2013 và Phani Deepthi Yadav, 2013 bao gồm xác định thành phần hóa học nhóm Carbohydrate bằng các thử nghiệm Molisch, thử nghiệm Flehling, thử nghiệm Barfoed; định tính Alkaloid bằng thử nghiệm Mayer, thử nghiệm Dragendroff, thử nghiệm Hager, thử nghiệm Wagner; Saponin thử nghiệm Foam; Cardiac glycoside gồm thử nghiệm Legal, thử nghiệm Keller Killiani; Anthraquinone glycoside thử nghiệm Bontrager; Flavonoid gồm thử nghiệm alkaline, thử nghiệm Shinoda, thử nghiệm ferric chloride; Phenolic gồm thử nghiệm lead acetate, thử nghiệm gelatin; Tannin gồm thử nghiệm ferric chloride, thử nghiệm lead acetate; Steroid gồm thử nghiệm Salkowski, thử nghiệm Libermann Burchard; Amino acid thử nghiệm Ninhydrin

2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu

Sừ dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 và phần mềm Microsoft Excel 2007 để xử lý số liệu

Xác định chỉ số MIC

Đọc kết quả Xác định thành

phần hóa học

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao

Hình 2 3 Quy trình khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao

Cây Podocarpus sp thu thập từ Lâm Đồng được đem chọn lựa, rửa sạch,

phơi khô trong không khí đến khi trọng lượng không đổi Sau đó, mẫu cây được cắt nhỏ, xay nhuyễn thành bột mịn Bột cây tiếp tục được ngâm với các dung môi ethanol, nước, methanol

Đối với dung môi ethanol (50 %, 70 %, 90 %):

Mẫu Podocapus sp

Phơi khô, xay mịn

Ngâm trong các dung môi (tỉ lệ 1:20, w/v)

- Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi ethanol (tỉ lệ 1:20,w/v) cho vào erlen, ngâm 24h, lọc, thu dịch lần 1

- Bã + 100ml dung môi ngâm 24h, lọc, thu dịch lần 2

- Ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần

- Cô cách thủy ở 700C, thu cao

Đối với dung môi nước:

- Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi nước (tỉ lệ 1:20,w/v) cho vào erlen, ngâm 4h, lọc, thu dịch lần 1

- Bã + 100ml dung môi ngâm 4h, lọc, thu dịch lần 2

- Ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần

- Cô cách thủy ở 700C, thu cao

Hình 2 4.Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 50o

Hình 2 5 Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 70o

Hình 2 6 Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 90o