Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của Một Số Loại Cao Chiết Ethanol 70% Từ Một Số Loại Thực Vật

Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm vi sinh vậy gây bệnh ..... “Ở Việt Nam, các chủng Streptococcus pneumoniae ­ một trong những nguyên nhân t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT ETHANOL 70% TỪ MỘT SỐ LOẠI THỰC VẬT TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP NÚI BÀ,

TỈNH LÂM ĐỒNG

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Minh Nhựt

MSSV: 1211100332 Lớp: 12DSH02

TP Hồ Chí Minh, 2016

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan tất cả nội dung trong đồ án này đều do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS Phạm Minh Nhựt khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực vào chưa được công bố dưới bất kì hình thức nào Mọi tài liệu tham khảo dùng trong đồ án này đều được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm công bố Những số liệu của các bảng phân tích, biểu đồ, đánh giá được thu thập từ nhiều nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo và chú thích nguồn gốc

Tất cả nội dung, sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, không trung thực, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Gíam Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, cùng các thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học ­ Thực phẩm ­ Môi trường đã quan tâm và giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình học tập tại trường

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em chân thành gửi đến thầy Phạm Minh Nhựt

đã tận tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp cũng như những buổi nói chuyện, thảo luận về lĩnh vực sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, định hướng nghiên cứu Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy

Em cũng xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô khoa Công nghệ sinh học ­ Môi trường ­ Thực phẩm trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM đã tận tình truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cũng như niềm đam mê nghiên cứu khoa học cho em Điều này không chỉ giúp em thực hiện đồ án này tốt nhất có thể mà còn là nền tảng kiến thức cho công như việc sau này

Em cảm ơn các bạn, anh, chị đã hỗ trợ và giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm

Cuối cùng, em xin cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án Do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên đồ

án tốt nghiệp của em còn nhiều thiếu sót, mong các thầy cô chỉ dạy đề em hoàn thiện đồ án này tốt hơn cũng như thu nhận thêm được kiến thức Em xin gửi lời chúc sức khoẻ đế các thầy cô

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016

Trịnh Tuấn Anh

MU ̣C LU ̣C

MỞ ĐẦU 4

1 Đặt vấn đề 9

2 Mục tiêu nghiên cứu 10

3 Nội dung nghiên cứu 10

4 Phạm vi nghiên cứu 11

5 Nội dung Đồ án tốt nghiệp 11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 12

1.1.Giới thiệu 12

1.1.1.Vai trò của cây thuốc trong đời sống 12

1.1.2.Lợi ích sử dụng cây thuốc 13

1.1.3Tình hình sử dụng cây thuốc 13

1.2.Thành phần hóa học của thực vật 14

1.2.1 Carbohydrate 14

1.2.1.1 Khái niệm 14

1.2.1.2 Tính chất 14

1.2.1.3 Vai trò 15

1.2.2Amino acid 15

1.2.2.1 Khái niệm 15

1.2.2.2 Tính chất 16

1.2.2.3 Vai trò 16

1.2.3Alkaloid 16

1.2.3.1 Khái niệm 16

1.2.3.2 Tính chất 16

1.2.3.3 Vai trò 17

1.2.4Glycosides 17

1.2.4.1 Khái niệm 17

1.2.4.2 Tính chất 18

1.2.4.3 Vai trò 18

1.2.5Steroids 19

1.2.5.1 Khái niệm 19

1.2.5.2 Tính chất 19

1.2.5.3 Vai trò 19

1.2.6Tannin 19

1.2.6.1 Khái niệm 19

1.2.6.2 Đặc điểm 20

1.2.6.3 Vai trò 20

1.2.7Isoprenoid (Terpene) 20

1.2.7.1 Khái niệm 20

1.2.7.2 Tính chất 21

1.2.7.3 Vai trò 21

1.3 Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật 21

1.3.1Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn 21

1.3.2Cơ chế kháng khuẩn 22

1.3.3Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật 23

1.3.3.1 Alkaloids 23

1.3.3.2 Terpenoids và tinh dầu 25

1.3.3.3 Phenol đơn và acid phenolic 25

1.3.3.4 Lectin và polypeptide 27

1.3.3.5 Saponin 27

1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình 28

1.4.1Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 28

1.4.1.1 Escherichia coli 28

1.4.1.2 Shigella 29

1.4.1.3 Salmonella 30

1.4.1.4 Vibrio 31

1.4.1.5 Listeria 32

1.4.2Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 33

1.4.2.1 Pseudomonas aeruginosa 33

1.4.2.2 Staphylococcus aureus 34

1.4.2.3 Enterococcus feacalis 35

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Địa điểm và thời gian 36

2.1.1Địa diểm 36

2.1.2Thời gian 36

2.2 Vật liệu 36

2.2.1Nguồn mẫu phân tích 36

2.2.2Vi sinh vật chỉ thị 37

2.2.3Hóa chất, môi trường 37

2.3 Phương pháp nghiên cứu 38

2.3.1Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu 38

2.3.2Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị 38

2.3.3Phương pháp định lượng tế bào VSV bằng đo mật độ quang 39

2.3.4Phương pháp bảo quản và giữ giống 39

2.3.5Phương pháp tách chiết cao 40

2.3.6Chuẩn bị dung dịch cao thuốc kháng sinh 40

2.3.7Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) 40 2.3.8Phương pháp xác định thành phần hóa học 41

2.3.8.1 Carbohydrate 41

2.3.8.2 Alkaloid 42

2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam) 42

2.3.8.4 Cardiac glycosides 42

2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) 43

2.3.8.6 Flavonoid 43

2.3.8.7 Phenolic 44

2.3.8.8 Tannin 44

2.3.8.9 Steroid 44

2.3.8.10Amino acid 45

2.3.9Phương pháp xử lý số liệu 45

2.4 Bố trí thí nghiệm 46

2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% của các mẫu cây thuốc 47

2.4.3Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết ethanol 49

2.4.5Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học 50

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

3.1 Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi 52

3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây khảo sát 53

3.2.1Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 53

3.2.2Đối với nhóm vi khuẩn Listeria 54

3.2.3Đối với nhóm vi khuẩn Salmonella 55

3.2.4Đối với nhóm vi khuẩn Shigella 57

3.2.5Đối với nhóm vi khuẩn Vibrio 58

3.2.6Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác 59

3.3 Kết quả xác định thành phần hoá học 63

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65

1 Kết luận 65

2 Đề nghị 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MU ̣C HÌNH ẢNH

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của các loại Carbonhydrate 15

Hình 1.3.Alanine 15

Hình 1.4 Epherdin và Hyoscyamin 16

Hình 1.5 Cardenolic và Bufadiennolid 18

Hình 1.6 Steroid 19

Hình 1.7 Tannin 20

Hình 1.8 Limonene và Ocimene 21

Hình 1.9 Một số cơ chế kháng sinh 22

Hình 1.10 Solamargine 24

Hình 1.11 Berberine 24

Hình 1.12.Một số Terpenenes và Terpenoid 25

Hình 1.13.Một số Quinones thông thường 26

Hình 1.14 Gallotannin 26

Hình 1.15 Một số Flavonoid 27

Hình 1.16 Saponin 28

Hình 1.17 Hình ảnh Escherichia coli O15:H7 dưới kính hiển vi 28

Hình 1.18 Ảnh chụp của Shigella sp trong một mẫu phân 29

Hình 1.19 Hình ảnh của S typhii và S typhimurium 30

Hình 1.20 Hình ảnh Vibrio cholerae và Vibrio harvey i 31 Hình 1.21 Hình ảnh Listeria monocytogenes 32

Hình 1.22 Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa 33

Hình 1.24 Hình ảnh Enterococcus feacalis 35

Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu 38

Hình 3.1 Hiệu xuất tách chiết của ethanol 70% với các mẫu cây thuốc 52

Hình 3.2 Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Escherichia coli 53

Hình 3.3 Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Listeria 55

Hình 3.4 Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Salmonella 56

Hình 3.5 Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối

với nhóm Shigella 57

Hình 3.6 Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối

với nhóm Vibrio 58

Hình 3.7 Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối

với nhóm vi sinh vậy gây bệnh 59

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu

DANH MU ̣C BẢNG

Bảng 1.1 Mô ̣t số Glycosides phổ biến 17 Bảng 3.1 Kết quả kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% đối với 20 chủng

vi khuẩn 64 Bảng 3.2 Kết quả xác đi ̣nh thành phần hóa ho ̣c 67

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nhân loại đã có những bước phát triển vượt bậc, tạo điều kiện chăm sóc sức khoẻ cộng đồng, phòng chống bệnh lây nhiễm, nhất là các bệnh do vi khuẩn gây ra Tiếp nối sự thành công của một trong những phát hiện lớn nhất của y học trong trong thế kỉ 20 đó là việc tìm ra kháng sinh Penicillin vào năm 1928 của Alexander Fleming Đến nay đã có nhiều loại thuốc kháng sinh được tạo ra Hiện nay, ở Việt Nam, cũng như các nước trên thế giới việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh cũng trở nên phổ biến Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh chưa được quản lí chặt chẽ “Phần lớn kháng sinh được bán mà không có đơn, 88% thành thị và 91% nông thôn Mua kháng sinh để điều trị ho 31,6% thành thị và sốt 21,7% nông thôn

Ba loại kháng sinh được bán nhiều nhất là ampicillin/amoxicillin 29,1%, cephalexin 12,.2% và azithromycin 7,3% Người dân thường yêu cầu được bán kháng sinh mà

không có đơn 49,7% thành thị và 28,2% nông thôn.”(Khánh Linh, 2015) Đây là

một thực trạng đáng báo động không chỉ ở Việt Nam mà trên toàn thế giới

Việc sử dụng thuốc kháng sinh không theo đơn của bác sĩ gây hậu quả nghiêm trọng khi bệnh nhân không chữa khỏi hoàn được bệnh mà nghiêm trọng hơn, điều này dẫn đến việc kháng thuốc kháng sinh Hiện nay, đã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh “Kháng với thuốc kháng sinh cephalosporin thế hệ

ba, xảy ra ở Áo, Úc, Canada, Pháp, Nhật Bản, Na Uy, Slovenia, Nam Phi, Thụy Điển và Vương quốc Anh Thuốc kháng sinh cephalosporin không còn hiệu nghiệm trong việc điều trị bệnh lậu trong khi mỗi ngày trên thế giới có hơn 1 triệu người nhiễm bệnh lậu ;” ( Nguyễn Thị Hồng Mến, 2015) “Ở Việt Nam, các chủng Streptococcus pneumoniae ­ một trong những nguyên nhân thường gặp nhất gây nhiễm khuẩn hô hấp­ kháng penicillin (71.4%) và kháng erythromycin (92.1%) – có

tỉ lệ phổ biến cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP) năm 2000­2001.” ( TS Nguyễn Văn Kính, 2010) Điều này đặt ra gánh nặng về kinh tế trong điều trị bệnh khi thay thế bằng các loại

kháng sinh mới đắt tiền hơn hoặc không có kháng sinh thích hợp trong điều tri bệnh

Trước thực trạng kháng thuốc kháng sinh hiện nay đã có nhiều hướng nghiên cứu được tiến hành Trong đó, bắt nguồn từ việc phát hiện ra các hợp chất kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên Cây thuốc từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong y học phương Đông và ở Việt Nam “Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc, mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn như: Hành, Tỏi, Hẹ, Kim ngân, Sâm đại hành, lá Móng tay,… được nhân dân ta dùng làm thuốc tiêu độc, tiêu viêm, sát khuẩn, chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, mụn nhọt, chốc lở, viêm họng, viêm phế quản và nhiều bệnh nhiễm khuẩn khác” (Liên Hồng,CTQ25,2016) Với khả năng kháng sinh, đặc biệt là ít gây ra các tai biến có hại như các loại thuốc kháng sinh tổng hợp trong qua trình điều trị và nhiều ưu điểm khác

Nắm được vấn đề đó, chúng tôi đã áp dụng tiến hành đề tài: “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết ethanol 70% từ mô ̣t số loa ̣i thực vật tại vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng”

2 Mục tiêu nghiên cứu

­ Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cây thuốc dân gian với dung môi là ethanol 70%

­ Xác định thành phần hoá học có trong một số loại cao chết ethanol 70% từ các cây thuốc dân gian

3 Nội dung nghiên cứu

­ Đánh giá ảnh hưởng của dung môi ethanol 70% đến hiệu suất thu hồi từ các

cây thuốc dân gian

­ Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% của các cây thuốc

dân gian

­ Xác định thành phần hoá học của cao chiết ethanol 70% của một số loại cây

thuốc dân gian

4 Phạm vi nghiên cứu

Tiến hành thử nghiệm và khảo sát trên một số cây thuốc dân gian

5 Nội dung Đồ án tốt nghiệp

Nội dung của Đồ án tốt nghiệp này gồm có 4 chương:

­ Chương 1: Tổng quan tài liệu

­ Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

­ Chương 3: Kết quả và thảo luận

­ Chương 4: Kết luận và đề nghị

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu

1.1.1 Vai trò của cây thuốc trong đời sống

Từ hơn 3000 năm trước, ông cha ta đã biết đến nguồn dược liệu phong phú,

từ động vật, thực vật đến khoáng vật trong khắp đất nước Trong đó, phải kể đến các loại dược liệu có nguồn gốc từ thực vật Qua thời gian, cây thuốc dần có vai trò quan trọng trong đời sống của nhân dân Từ các gia vị như gừng, tỏi, như một gia

vị trong bếp, đã được sử dụng để trị các chứng bệnh thường gặp như hạ sốt, đầy hơi khó tiêu, hay sử dụng lá tía tô kèm cháo trắng có tác dụng giải cảm…” Gừng tươi,

lá tía tô cùng một số thảo dược khác rất có ích cho người bị ảnh hưởng của khí phong hàn (gió và lạnh), mắc một số bệnh mùa lạnh như: Cảm lạnh, ho, lạnh bụng, tiêu chảy, hoặc đau nhức xương khớp do phong hàn thấp.” (Huỳnh Châu,2014).“Cây vẩy ốc chữa phong thấp, kiết lị, quả chín bổ thận; cây mảnh trấu chữa u xơ tiền liệt tuyến; cây hẹ có tác dụng cầm máu, ăn thay rau thơm có tác dụng

Với kinh nghiệm, kiến thức thu thập được qua nhiều thế hệ Các bài thuốc từ cây thuốc ngày càng trở nên đa dạng và phong phú, góp phần vào kho tàng y học to lớn của dân tộc

1.1.2 Lợi ích sử dụng cây thuốc

Ngày nay, các cây thuốc có giá trị to lớn đối y học dân tộc cũng như đời sống nhân dân Các cây thuốc thường là những cây dễ trồng, phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam Việc chữa bệnh bằng các cây thuốc tuy chậm hơn các loại thuốc kháng sinh tổng hợp nhưng mang lại hiệu quả tốt hơn, không xuất hiện các tác dụng phụ Bên cạnh đó, có thể sử dụng lâu dài các loại cây thuốc như một thực phẩm hỗ trợ và không gây hại cho cơ thể con người Có thể sử dụng như nước giải khát: nước trà gừng, nước lô hội, nước lá vối… “Lá vối có tác dụng kiện tỳ, giúp ăn ngon, tiêu hoá tốt Mỗi khi ăn một bữa có nhiều thịt, mỡ, người ta thường nấu một nồi nước vối thật đặc để uống cả ngày Chất đắng trong vối sẽ kích thích tiết nhiều dịch tiêu hóa, chất tanin bảo vệ niêm mạc ruột, còn chất tinh dầu có tính kháng khuẩn nhưng không hại vi khuẩn có ích trong ruột.” (Trần Thị Hải, 2015)

1.1.3 Tình hình sử dụng cây thuốc

Việt Nam là một nước nhiệt đới, có diện tích rừng bao phủ trải dài khắp cả nước Điều này tạo điều kiện cho thuận lợi cho các cây thuốc phát triển đa dạng và phong phú.”Ở nước ta có 3.948 loài cây thuốc thuộc 307 họ của 9 ngành thực vật bậc cao cũng như bậc thấp (kể cả nấm), cũng theo kết quả điều ta này, trong số 3.948 loài cây thuốc đã biết ở trên, phần lớn loài là được ghi nhận từ kinh nghiệm

sử dụng cảu cồng đồng các dân tộc khắp các địa phương”.(Viện Dược Liệu­Bộ Y

tế, 2004) “Việt Namcóhơn 12.000 loài thực vật thì có gần 4.000 loài thức vật cho công dụng làm thuốc, vùng phân bố rộng khắp cả nước, có nhiều loài dược liệu được xếp vào loài quý và hiếm trên thế giới, như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang, Bách hợp, Thông đỏ, Vàng đắng, Hoàng liên ô rô, Hoàng liên gai, Thanh thiên quỳ, Ba gạc Vĩnh Phú…” (Nguồn: Minh Tuấn, 2014.) Tuy nhiên việc chặt phá rừng bừa bãi và khai thác tràn lan đang làm cho nhiều loại cây thuốc tuyệt chủng.” Việc khai thác dược liệu quá mức mà không đi đôi với việc tái tạo, bảo tồn

dược liệu đã dẫn đến số lượng loài cây dược liệu có khả năng khai thác tự nhiên còn rất ít (trên cả nước hiện chỉ còn khoảng 206 loài cây dược liệu có giá trị có thể khai thác tự nhiên), nhiều loài cây dược liệu quý hiếm trong nước đang đứng trước nguy

cơ cạn kiệt” (Minh Tuấn 2014) Để không lãng phí nguồn tài nguyên quý báu đó, chúng ta cần phải nhanh chóng có những biện pháp nghiên cứu để bảo tồn và phát triển giá trị của các cây thuốc Đưa cây thuốc, kinh nghiệm dân gian vào nghiên cứu, áp dụng với khoa học công nghệ hiện đại để phục vụ sức khoẻ và đời sống con người

ở thành tế bào, mô nâng đỡ và mô dự trữ

Một số trường hợp ngoại lệ tồn tại, ví dụ: deoxyribose, một thành phần đường DNA, có công thức C5H10O4 (John M Coulter, C R Barrnes, H C Cowles, 1930) Carbohydrate có thể chia thành 4 nhóm:

­ Monosaccharide: glucose, fructose

­ Disaccharide: saccharose, lactose, maltose

­ Oligosaccharide: rafinose, kestose, stachyose

­ Polysaccharide: tinh bột, cellulose

1.2.1.2 Tính chất

Chúng có đặc tính chung là dễ hoà tan trong nước, đồng hoá và sử dụng nhanh để tạo glycogen Các carbohydrate đơn giản đều có vị ngọt Ở thực vật, carbohydrate chiếm khoảng 75% khối lượng, nằm trong hầu hết các bộ phận như:

củ, quả, lá, thân, cành

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của các loại Carbonhydrate

1.2.1.3 Vai trò

­ Cung cấp năng lượng cho tế bào và cơ thể thực vật

­ Vai trò cấu trúc, tạo hình (Cellulose,…)

­ Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất ở thực vật

­ Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật

­ Tăng khả năng ra hoa và quả (Trumbo P, 2013)

1.2.3 Alkaloid

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino acid, đa số có nhân dị vòng

Alkaloid thường được tìm thấy trong thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong

cơ thể đông vật Một số dược liệu chứa akaloid: cà độc dược, cà phê, chè, trinh nữ hoàng cung

Hình 1.4 Epherdin và Hyoscyamin

Đa số các alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có chất tính base rất

yếu như caffein, piperin… vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromine và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu như arecaidin, guvacin

Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng những kiềm trung bình và mạnh như: NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH

Khi định lượng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng

Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt ) tạo ra muối phức

­ Alkaloid có tác dụng diệt khuẩn

­ Tác động lên hệ thần kinh trung ương: morphin, codein, strychnin, cafein

­ Hạ huyết áp: ajmalin, quinidlin

­ Chống ung thư (Ngô Văn Thu, 2011)

1.2.4 Glycosides

Glycoside là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên, cấu trúc của các hợp chất này gồm hai thành phần – phần đường và phần không đường Phần đường của glycosid gọi là glycon, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin

Glycosides là những sản phẩm ngưng tụ của đường

Vị đắng Khi vào cơ thể bị thuỷ phân tạo HCN rất độc

Amygdadin

(C20H27O11)

Hạt mơ, hạt hạnh nhân đắng, mận

Vị đắng Trong cơ thể người bị thuỷ phân tạo HCN rất độc

Manihotin Vỏ, cùi củ sắn Thuỷ phân tạo HCN rất độc

1.2.4.2 Tính chất

Glycoside là dạng tinh thể không màu

Phần đường và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycosid dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme (men)

có chứa trong cây

Phần đường trong glycoside chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccarid, thường là glucose, rhamnose, galactose Trong thành phần của một số glycoside có đường đặc biệt không có trong các glycoside khác (ví dụ trong glycosid tim) Phần aglycon của các glycoside có thể thuộc các nhóm chất hữu cơ khác nhau

ví dụ cồn, andehyd, acid, phenol, dẫn chất anthracen…đôi khi có các aglycon có chứa nitơ, lưu huỳnh song thường chứa cacbon, hydro, oxy

Do đặc tính dễ bị phân huỷ, khó thu được ở dạng tinh khiết nên việc nghiên cứu cấu trúc thường gặp nhiều khó khăn

Tác dụng phụ thuộc vào phần aglycon, phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng

­ Tannin bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu

­ Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng

­ Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy (Katie E Ferrell và Thorington và Richard W, 2006)

1.2.7 Isoprenoid (Terpene)

Isoprenoid là một nhóm chất lớn và đa dạng Bộ khung carbon được tạo thành từ đơn vị cơ bản isoprene­C5H8 Ngoài các hydrocacbon không no, các dẫn xuất của chúng như ancol, andehyd, ceton, cacboxylic acid cũng được gọi là tecpen

Tuỳ theo số nguyên tử cacbon trong mạch hydrocacbon, người ta phân chúng thành các nhóm: monoterpen, secpuiterpen, diterpen, triterpen, tetraterpen, polyterpen Trong đó monoterpen là quan trọng nhất trong terpenoid Nó có cấu trúc mạch hở, mạch vòng

Terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ thông và trong tinh dầu thảo mộc như tinh dầu xả, quế, cam, chanh

Biến thể tổng hợp và các dẫn xuất của tecpen thiên nhiên và terpenoids đa dạng của các hương liệu được sử dụng trong nước hoa và hương vị được sử dụng trong các chất phụ gia thực phẩm Vitamin A là một terpene (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.3 Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật

1.3.2 Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn

Hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có

khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi khuẩn, bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của vi

khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa của chúng, thường có tác dụng đặc hiệu với một nồng độ rất nhỏ

Các chất kháng khuẩn thực vật thường là các hợp chất như alkaloid, flavonoid, tanin và một số loại tinh dầu

1.3.3 Cơ chế kháng khuẩn

Hình 1.9 Một số cơ chế kháng sinh

Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn: vách tế bào của vi

khuẩn (đặc biệt là các vi khuẩn Gram dương) được cấu tạo bởi các phức hợp peptidoglycan, phức hợp này được trùng hợp bởi các enzyme transpeptidases Các

kháng sinh nhóm b – actamin gắn chọn lọc vào các transpeptidases này làm cho

vách tế bào của vi khuẩn bị tan rã khiến chúng bị tiêu diệt

Ức chế chức năng của màng tế bào (tổn thương màng tế bào): kháng sinh

gắn lên màng tế bào, làm thay đổi tính thấm chọn lọc khiến một số chất cần thiết cho vi khuẩn (nucleotid, pyrimidin, purin ) lọt ra ngoài, làm tổn hại và chết vị khuẩn Các kháng sinh nhóm Polymycin, aminosid

Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với

receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme

peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide

Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: bất hoạt RNA, DNA: Nhóm

refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin) Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm

ức chế quá trình tạo acid nucleic (Amoros, M., F Sauvager, L Girre và M Cormier, 1992)

Cạnh tranh đối kháng: đây là kiểu tác dụng của các sunfonamit Acid folic

giữ vai trò cần thiết trong quá trình tổng hợp acid nucleic Để tổng hợp ra acid folic, một số vi khuẩn phải sử dụng acid paraminobenzoic (PAB) có trong môi trường Sunfonamit có cấu trúc hoá học tương tự PAB nên đã cạnh tranh thay thế PAB, dẫn đến ngừng tổng hợp acid nucleic của vi khuẩn

Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên

quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy

Hình 1.10 Solamargine

 Berberine

Berberine cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với Shigella spp, tụ cầu khuẩn,

nhiều vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn axit Ngoài ra có còn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với trùng gây bệnh sốt rét Cơ chế kháng khuẩn Berberine là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn Đặc biệt khi dùng berberin điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột Các nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột

Hình 1.11 Berberine

1.3.4.2 Terpenoids và tinh dầu

Các loại terpenoids tinh dầu cũng có khả năng kháng khuẩn nhờ các khả năng hòa tan lipid trong màng tế bào vi khuẩn bởi các hợp chất lipophilic Phá vỡ vách tế bào Terpenenes và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus

và động vật nguyên sinh

Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế được vi khuẩn Các acid betulinic triterpenoid chỉ là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức chế được HIV

Gần đây các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện

diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria

monocytogenes

Hình 1.12 Một số Terpenenes và Terpenoid

Phenolics được xem là nguyên nhân dẫn đến sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự tương tác không đặc hiệu của các chất này với protein

 Quinones

Quinones có thể tạo phức không thay đổi được với các amino acid ái nhân trong protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein Vì lí do

đó, khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn

Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng

Hình 1.13 Một số Quinones thông thường

 Tannin

Tannin có khả năng liên kết với protein làm mất hoạt tính của các protein chức năng, ức chế enzyme được xem là cơ chế chung của các hợp chất tannin

Hình 1.14 Gallotannin

 Flavonoid

Flavonoid có khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào và tạo phức với thành tế bào vi khuẩn Các flavonoid càng ưa béo có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật Chúng có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucose Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được, ức chế tổng hợp axit nucleic của vi khuẩn, tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của

ở vi sinh vật Bên cạnh đó chúng còn phá vỡ màng tế bào, cản trở sự trao đổi chất

và ảnh hưởng tới các thành phần tế bào chất

Nhóm saponin, chủ yếu là asiaticosid có tác dụng lên Mycobacterium leprae

Tác dụng được giải thích do asiaticosid làm tan màng sáp của vi khuẩn

Hình 1.16 Saponin 1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình

1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy

1.4.2.1 Escherichia coli

 Đặc điểm

Escherichia coli là một trong những loài vi khuẩn chính kí sinh trong đường

ruột của động vật máu nóng E.coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ

nghi, sống ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính

Phần lớn các vi khuẩn E.coli không ảnh hưởng đáng kể dến sức khoẻ trừ một

số có thể gây bệnh tiêu chảy và tuỳ và từng địa phương, tuỳ và độ tuổi mà ảnh hưởng của vi khuẩn này cũng khác nhau

Hình 1.17 Hình ảnh Escherichia coli O15:H7 dưới kính hiển vi

 Khả năng gây bệnh của một số Escherichia coli

bệnh tiểu chảy ra máu

­ EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): gây xuất huyết ở ruột

­ EPEC (Enteropathogenic E.coli): gây bệnh đường ruột, chủ yếu gây bệnh ở

trẻ em, cơ chế gây bệnh chưa rõ

­ ETEC (Enterotoxigenic E.coli): sinh độc tố ruột

­ EIEC (Enteroinvasive E.coli ): gây bệnh do xâm lấn tế bào

­ EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli kết tập ở ruột (Cao

Minh Nga, 2014)

 Đặc điểm

Shigella spp là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống ký

sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính

Shigella spp gây bệnh ở động vật sinh trưởng, nhưng không gây bệnh ở động

vật có vú khác Nó chỉ được tìm thấy tự nhiên trong cơ thể người và khỉ đột

Shigella spp là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy do vi

khuẩn Ước tính mỗi năm có từ 80­165,000,000 trường hợp nhiễm bệnh và 600,000

ca tử vong

Hình 1.18 Ảnh chụp của Shigella sp trong một mẫu phân

 Khả năng gây bệnh của một số Shigella spp.:Gây bệnh lỵ trực trùng, có

4 nhóm:

­ Nhóm A: S dysenteriae: tiết độc tố shiga, là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh

kiết lị ở những nơi tập trung các trại tị nạn trên thế giới

­ Nhóm B: S flexneri: tiết độc tố giống shiga (shiga­ like­ toxin), là chủng phổ

biến nhất thế giới, gây 60% ca bệnh ở các nước đang phát triển

­ Nhóm C: S boydii: không tiết độc tố

­ Nhóm D: S sonnei: tiết độc tố giống shiga, là nguyên nhân gây ra 77% số ca

bệnh kiết lị ở các nước đang phát triển

Nhóm A – C về mặt sinh lý tương tự nhau S.sonnei có thể khác biệt trên cơ sở

xét nghiệm chuyển hoá sinh hoá

 Đặc điểm

Salmonella spp là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, sống ký sinh ở

đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính

Salmonella spp, được tìm thấy trên toàn thế giới và có cả trong động vật máu

nóng , động vật máu lạnh và ngoài môi trường Các chủng vi khuản Salmonella spp

gây ra các bệnh như thương hàn, phó thương hàn, nhiễm trùng máu và ngộ độc thực phẩm

Hình 1.19 Hình ảnh của Salmonella typhii và Salmonella typhimurium

 Khả năng gây bệnh của một số Salmonella

tạng

 Đặc điểm

Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và

catalase dương tính, là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, tạo nitrite từ nitrate

Hình 1.20 Hình ảnh Vibrio cholerae và Vibrio harveyi

 Khả năng gây bệnh của một số Vibrio spp

Một số loài vi khuẩn Vibrio spp là tác nhân gây bệnh Hầu hết các chủng

gây bệnh có liên quan với viêm dạ dày ruột, nhưng cũng có thể lây nhiễm các vết

thương hở và gây nhiễm trùng huyết Tiêu biểu như Vibrio alginolyticus gây nhiễm trùng vết thương, chúng cũng có mặt trong các cơ quan của động vật như cá nóc V

cholera là tác nhân gây bệnh tả V harveyi là một tác nhân gây bệnh của một số loài

động vật thủy sinh Vibrio parahaemolyticus ăn phải vi khuẩn có trong hải sản sống

hoặc nấu chưa chín, thường là hàu, là nguyên nhân chủ yếu là viêm dạ dày cấp tính,

nhiễm trùng vết thương cũng xảy ra, nhưng ít phổ biến hơn so với bệnh thủy sản gây ra

1.4.2.5 Listeria spp

 Đặc điểm

Listeria spp là một vi khuẩn Gram dương, kị khí tùy nghi, không sinh bào tử

Có thể được tìm thấy trong đất, nước, trong các loại thịt chưa nấu chín, rau sống, trái cây,thực phẩm làm từ sữa, và thực phẩm chế biến

Hình 1.21 Hình ảnh Listeria monocytogenes

 Khả năng gây bệnh

Các bệnh của người trong chi Listeria spp thường do Listeria

monocytogenes gây ra Đây là loại vi khuẩn gây độc, với 20% đến 30% số ca

nhiễm lâm sàng gây nên bệnh Listeriosis dẫn đến tử vong Một số triệu chứng liên quan với bệnh Listeriosis bao gồm sốt, đau cơ, tiêu chảy, nôn và buồn nôn Phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh, người già và những người có hệ miễn dịch kém là dễ bị bệnh Listeriosis

1.4.3 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da

 Đặc điểm

Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường Sự

biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật Trong số

những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong

công nghệ sinh học

Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không

có bào tử Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen

Hình 1.22 Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa

 Khả năng gây bệnh

con người Vi khuẩn này phát triển bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; trong cơ thể, nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho nên nó lây nhiễm và phá hủy các mô của người bị suy giảm hệ miễn dịch Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các

cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu và thận sẽ gây ra những tử vong cao; bởi vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt niêm mạc bên trong cơ

thể Bên cạnh đó, vi khuẩn này cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa bao gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch Đây cũng là nguyên nhân gây ra viêm chân lông

 Đặc điểm

Staphylococcus aureus là một loài tụ cầu khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi

Hình 1.23 Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus

S.aureus có rải rác trong tự nhiên như đất, nước, không khí, đặc biệt người là

nguồn chứa chính của tụ cầu vàng, chủ yếu ở vùng mũi họng ( chiếm khoảng 30%), nách, mụn dưới da, các vùng da trầy xướt và tầng sinh môn Tỷ lệ mang vi khuẩn cao hơn ở các nhân viên y tế, bệnh nhân lọc máu, người bị bệnh tiểu đường type 1, người nhiễm HIV, mắc bệnh da mãn tính

 Khả năng gây bệnh

Trong đa số trường hợp, tụ cầu khuẩn không gây ra vấn đề gì, hoặc chỉ nhiễm khuẩn nhẹ như nổi mụn hay bóng nước, nhưng trong một số trường hợp, tụ

cầu khuẩn có thể nghiêm trọng hơn Staphylococcus aureus là nguyên nhân thông

thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các loài tụ cầu Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi và da (Ogston A, 1984)

1.4.3.3 Enterococcus feacalis

 Đặc điểm

Enterococcus feacalis: Gram dương, lên men glucose, sinh acid làm giảm pH

môi trường Không tạo độc tố, không tạo ra một phản ứng catalase với hydrogen peroxide Nó có thể tạo ra một phản ứng pseudocatalase nếu trên môi trường thạch máu

Hình 1.24 Hình ảnh Enterococcus feacalis

 Khả năng gây bệnh

E faecalis có thể gây ra viêm nội tâm mạc và nhiễm khuẩn huyết, nhiễm

trùng đường tiết niệu, viêm màng não và nhiễm trùng khác ở người

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian

2.1.1 Địa diểm

Thu mẫu: vườn quốc gia Bidoup ­ Núi Bà, địa bàn huyện Lạc Dương, Đam Rông, tỉnh Lâm Đồng Vườn quốc gia Bidoup­ Núi Bà nằm trên cao nguyên Lâm Viên có độ cao trung bình từ 1.500­ 1.800m, địa hình chia cắt mạnh được chắn bởi các dãy núi cao như đỉnh Hòn Giao (2.060m), Bidoup (2.287m), LangBiang (2.167m) Khí hậu nơi đây ôn hoà, nhiệt độ không khí trung bình năm 180C, lượng mưa trung bình năm 1800mm, tại các đai cao trên, lượng mưa có thể đạt 2800­3000mm/năm Thảm thực vật rừng ở đây được đặc trưng, phong phú

Thí nghiệm: phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học­ Thực phẩm­ Môi trường, trường Đại học Công nghệ TpHCM

2.1.2 Thời gian

Tháng 11/2015 đến tháng 6/2016

2.2 Vật liệu

2.2.1 Nguồn mẫu phân tích

Các mẫu cao chiết từ các mẫu cây được lựa chọn từ các đề tài khảo sát trước đây và từ kinh nghiệm dân gian Các mẫu cao chiết ethanol 70% được lựa từ mẫu cây thuốc dân gian thu tại vườn quốc gia Bidoup ­ Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng Đây là những mẫu cây thuốc có khả năng điều trị một số bệnh tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về các mẫu cây thuốc này Có 6 mẫu cây thuốc được lựa chọn trong thí nghiệm lần này, bao gồm :

2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị

­ 4 chủng Escherichia coli: E.coli, ETEC, E.coli 0571:H7, E 0208

­ 4 chủng Salmonella spp: S.typhii, S.typhimutium, S dublin, S.enteritidis

­ 4 chủng Vibrio : V.alginolytycus, V.cholera, V.harveyi, V.parahaemolyticus

­ 3 chủng Shigella spp: S.dysenteriae, S.flexneri, S.boydii, S.sonnei

­ 2 chủng Listeria spp: L.monocytogenens, L.innocua

­ Pseudomonas aeruginosa

­ Staphylococus aureus

­ Enterococus feacalis

2.2.3 Hóa chất, môi trường

­ Dung môi dimethysulfoside (DMSO)