Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của Cao Chiết Methanol Từ Cây Elephantopus Sp.

các thầy thuốc giỏi chữa được nhiều căn bệnh hiểm nghèo thường có một kiến thức rất uyên thâm về cây thuốc và các công dụng của chúng họ quan niệm rằng các cây thuốc và các vị thuốc luôn

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO

CHIẾT METHANOL TỪ CÂY ELEPHANTOPUS SP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

TP Hồ Chí Minh, 2015

Giảng viên hướng dẫn: Th S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện: Phạm Hữu Tuấn

MSSV: 1151110538 Lớp: 11DSH02

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên

cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS Phạm Minh Nhựt Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Tp Hồ Chí Minh, ngày …… tháng …… năm……

Sinh viên

Phạm Hữu Tuấn

LỜI CÁM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua

Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt

đề tài của mình

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống

Tp Hồ Chí Minh, ngày……tháng……2015

Sinh viên

Phạm Hữu Tuấn

MỤC LỤC

TRANG Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục i

Danh sách các chữ viết tắt iv

Danh sách các hình v

Danh sách các bảng vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích nghiên cứu 1

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Phạm vi nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây Elephantopus sp 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Đặc điểm của một số loài thuộc Elephantopus sp 3

1.1.4 Phân bố 5

1.1.5 Công dụng 5

1.2 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật 6

1.2.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật 6

1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật 6

1.2.3 Một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 8

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn ở thực vật trên thế giới và tại Việt Nam 12

1.3 Ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của thực vật 14 1.4 Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh 15

1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 15

1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 21

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Thời gian và địa điểm 27

2.1.1 Thời gian 27

2.1.2 Địa điểm 27

2.2 Vật liệu 27

2.2.1 Nguồn mẫu 27

2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị 27

2.2.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu 29

2.4.1 Phương pháp xử lý và tách chiết hợp chất kháng khuẩn 29

2.4.2 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị 29

2.4.3 Phương pháp pha loãng mẫu 30

2.4.4 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật chỉ thị 30

2.4.5 Phương pháp tách các phân đoạn từ cao tổng methanol 30

2.4.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 31

2.4.7 Phương pháp xác định chỉ số MIC 32

2.4.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học 33

2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 34

2.5 Bố trí thí nghiệm 34

2.5.1 Thí nghiệm 1: Thu nhận cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp 34

2.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol từ cây Elephantopus sp 36

2.5.3 Thí nghiệm 3: Tách chiết các phân đoạn từ cao tổng methanol 75% từ cây Elephantopus sp 37

2.5.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn của cao tổng methanol 38

2.5.5 Thí nghiệm 5: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao tổng methanol Elephantopus sp 39

2.5.6 Thí nghiệm 6: Định tính một số thành phần có trong cây Elephantopus sp 41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Hiệu suất thu hồi cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp 45

3.2 Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao tổng methanol từ cây Elephantopus sp 45

3.3 Nồng độ ức chế tối thiểu của cao tổng Elephantopus sp 49

3.4 Định tính sơ bộ thành phần hóa học cây Elephantopus sp 50

3.5 Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng Elephantopus sp qua từng phân đoạn 53

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58

4.1 Kết luận 58

4.2 Đề nghị 58

Tài liệu tham khảo 59

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BF: Butanol fraction

EF: Ethyl acetate fraction

EMB: Eosin Methylene Blue

HF: Hexan fraction

ME: dịch chiết methanol 75%

MIC: Minimum Inhibitory Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu PSMs: Plant Secondary Metabolites

TSA: Trypticase Soya Agar

TSB: Trypton Soya Broth

XLD: Xylose Lysine Deoxycholate

WF: Water fraction

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hình thái cây Elephantopus scaber 4

Hình 1.2 Hình thái cây Elephantopus mollis 4

Hình 1.3 Hình thái cây Elephantopus tomentosus 5

Hình 1.4 Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm 7

Hình 1.5 Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử 15

Hình 1.6 Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB 16

Hình 1.7 Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử 17

Hình 1.8 Khuẩn lạc Vibrio trên môi trường Chrom agar 17

Hình 1.9 Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử 18

Hình 1.10 Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD 19

Hình 1.11 Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử 20

Hình 1.12 Khuẩn lạc Shigella trên môi trường Macconkey 20

Hình 1.13 Hình thái Pseudomonas trên kính hiển vi điện tử 22

Hình 1.14 Khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa trên môi trường thạch thường22 Hính 1.15 Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử 23

Hình 1.16 Khuẩn lạc Enterococcus faecalis trên môi trường thạch máu BA 24

Hình 1.17 Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử 25

Hình 1.18 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường Baird Parker bổ sung egg yolk 25

Hình 2.1 Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết methanol 75% (100 mg/ml) đối với chủng Escheriachia coli (trái) và Shigella flexneri 37

Hình 2.2 Hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn hexan (20 mg/ml) và butanol (50

mg/ml) đối với chủng Escheriachia coli và Shigella flexneri 39

Hình 2.3 Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết methanol 75% (25 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogenes và Vibrio alginolyticus (phải) 40

Hình 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) đối với nhóm Escherichia spp 45

Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) đối với chủng Shigella flexneri, Salmonella typhii, Vibrio cholerae và Vibrio alginolyticus 46

Hình 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogen Pseudomonas aeruginosa 47

Hình 3.4 Thử nghiệm định tính tannin 52

Hình 3.5 Thử nghiệm định tính alkaloid 53

Hình 3.6 Thử nghiệm định tính flavonoid 53

Hình 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn đối với nhóm Escherichia54 Hình 3.8 Hoạt tính kháng khuẩn của của các phân đoạn đối với chủng Shigella flexneri, Salmonella typhii, Vibrio cholerae và Vibrio alginolyticus 54

Hình 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn lên chủng Listeria monocytogenes và chủng Pseudomonas aeruginosa 55

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang Bảng 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của dịch chiết methanol 75% từ cây

Bảng 3.4 Kết quả tổng hợp của hoạt tính kháng khuẩn cao tổng methanol 75% và 4

phân đoạn hexan, ethyl acetate, butanol và nước từ cây Elephantopus sp 56

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong những năm đầu thế kỉ XIX khi người ta tìm cách chữa trị các vết thương, nhiễm trùng do các tác sinh học cụ thể là vi khuẩn thì kháng sinh là sự lựa chọn được ưu tiên hàng đầu Các loại kháng sinh thời điểm đó chủ yếu được phân lập

từ nấm ví dụ như penicillin được phân lập từ nấm Penicillium nhưng cho tới nay do

sự hiện tượng kháng thuốc đã xuất hiện và trở nên mạnh mẽ và lan rộng hơn thì việc

sử dụng các hợp chất có nguồn gốc thực vật nên được quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn Thật vậy khi dân số ngày càng tăng nhanh ở các nước đang phát triển, tỷ lệ dịch bệnh ngày càng tăng và đa dạng cùng với đó sự gia tăng của các loại thuốc hóa học cũng mang tới những hệ quả không mong muốn thì việc tạo ra loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên vừa rẻ tiền vừa gần gũi với cuộc sống luôn được mọi người đón nhận

Đã từ rất lâu, khi cuộc sống con người vẫn chưa có nhiều tiện nghi, các phương tiện cũng như các loại thuốc tân thời, việc con người sử dung các loại thuốc có nguồn gốc

tự nhiên rất được con người ưa chuộng các thầy thuốc giỏi chữa được nhiều căn bệnh hiểm nghèo thường có một kiến thức rất uyên thâm về cây thuốc và các công dụng của chúng họ quan niệm rằng các cây thuốc và các vị thuốc luôn ở quanh ta, cây thuốc sau khi được đem về sẽ được phơi khô và chủ yếu ngâm với nước sắc làm thuốc uống, thuốc này trị được nhiều bệnh và như một bài thuốc dân gian nó vẫn tồn tại cho tới ngày nay

Để tìm hiểu một cách cặn kẽ và chi tiết hơn về tác dụng trị các bệnh có nguồn gốc sinh học cũng như kiểm chứng khả năng thay thế những loại thuốc tân thời chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol

từ cây elephantopus sp.” Đề tài nghiên cứu này dựa tên một loài cây được dân gian dùng như một vị thuốc, hy vọng sẽ làm sáng tỏ một số công dụng được dân gian truyền tụng dưới ánh nhìn khoa học và thuyết phục hơn

2 Mục đích

Xác định khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây Elephantopus sp

Bước đầu xác định thành phần hóa học có trong cây Elephantopus sp

3 Nội dung nghiên cứu

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol và các phân đoạn từ

Giới hạn khảo sát chỉ trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị

Chỉ khảo sát cây thuốc ở mức độ chi

Elephantopus scaber cao 30-60 cm Lá mọc thành hoa thị ở gốc, thuôn thon

hay thành cuống ôm thân, tù ở đầu, dài 6 -12cm, rộng 3-5 cm, có răng, có lông ráp ở

cả hai mặt, với lông trắng, cứng, áp sát Hoa tím hay hồng, xếp 4 cái thành đầu; các đầu này lại tập hợp thành ngù bao bởi hai lá bắc hình tam giác, dài 10-15mm, rộng ở gốc Quả bế có 10 cạnh, hình thoi, có lông, cụt ở đỉnh; mào lông cứng xếp một dãy, thường ra hoa vào mùa thu giữa tháng 6 tới tháng 12, (Wang và ctv 2004)

1.1.3.2 Elephantopus mollis

Elephantopus mollis cao 0,5-1m, phủ đầy lông Lá mọc dài theo thân, không

cuống; phiến thon dạng bay, dài 10-15cm, gốc ôm thân, mép khía lượn, có lông mềm ngắn ở mặt dưới; các lá trên rất tiêu giảm Cụm hoa dài theo thân, nhánh mang nhiều hoa đầu kép trong một bao chung; các hoa đầu phụ cao 8 mm, mang 4 tới 5 hoa trắng, quả bế cao 3mm, có rãnh; mào lông có 5 tơ và thường ra hoa vào tháng 6 và 7 (Alyokhin và ctv 2002)

1.1.3.3 Elephantopus tomentosus

Hình 1.2 Hình thái cây Elephantopus mollis Hình 1.1 Hình thái cây Elephantopus scaber

Elephantopus tomentosus cao từ 60 tới 120 cm, thân cây thẳng đứng nhiều

nhánh, góc cạnh có lông tơ trắng, phần thân rễ khỏe mạnh hình sợi hướng thẳng lên,

lá thường bị úa khi cây bắt đầu nở hoa, hầu như không có cuốn lá hoặc cuốn lá rất nhỏ, lá nằm bên dưới có hình chữ nhật hay oval diện tích khoảng 8-22 × 3-7 cm, một gân chính, lá nằm trên có hình elip hay hình chữ nhật có diện tích vào khoảng 7-8 × 1,5-2 cm, hướng trục có lằn xếp và nổi cộm lên lông tơ thưa thớt hoặc dày đặc, cụm hoa vào khoảng 12 tới 20 cụm, cuốn thon dài (Wang và ctv, 2012)

1.1.4 Phân bố

Elephantopus sp thường mọc nhiều ở châu Phi, Nam Á, Úc và Châu Mỹ, một vài loài thuộc Đông Nam Mỹ và số ít ở Ấn Độ và Himalaya Loài Elephantopus mollis được tìm thấy ở dọc các bờ biển Philippines, ngoài ra còn có thể tìm thấy ở

Mexico, Đài Loan và Borneo Tại Việt Nam có thể gặp một trong hai loài là

Elephantopus scaber hay Elephantopus tomentosus

1.1.5 Công dụng

Elephantopus sp được dân gian sử dụng như một loại thuốc cổ truyền để

điều trị các bệnh như viêm thận, phù nề, sốt tức ngực, lở loét, đau khớp do thương

Hình 1.3 Hình thái cây Elephantopus tomentosus

tích, ho do viêm phổi chúng cũng còn được dùng như một loại thuốc bổ tăng cường sức khỏe, làm thuốc hạ sốt, viêm cuống phổi và hen suyễn Người Thái Lan đã dùng

Elephantopus scaber để chữa chứng ho, làm thuốc bổ (Inta và ctv, 2008) Ở Malaysia nước sắc rễ cây Elephantopus scaber giúp ngăn chặn viêm nhiễm sau khi sinh con, ngoài ra toàn bộ cây Elephantopus scaber được nấu cùng với đậu đỏ có thể trị chứng đầy hơi (Hammer và Johns, 1993), Elephantopus scaber ở Brazil được sử dụng như

một phương thuốc truyền thống giúp hạ sốt, lợi tiểu, loại sỏi thận (Poli và ctv, 1992) Trong nghiên cứu hiện tại chúng cũng được kiểm tra khá kỹ lưỡng về tính độc, khả

năng hạ sốt, khả năng giảm đau, kháng viêm, lợi tiểu và gây táo bón Elephantopus mollis có công dụng lợi tiểu, hạ sốt, trị thương, kháng khuẩn và virus, rễ cây Elephantopus mollis có công dụng chống nôn mửa còn lá cây có công dụng trong

việc chữa các vết loét và bệnh chàm, cả rễ và lá có công dụng làm mềm vết thương, trị tiêu chảy và các chứng đau lỗ tiểu và đau dạ dày (Muthiumani và ctv, 2010) Ở

Malaysia người ta sử dụng Elephantopus tomentosus như một vị thuốc lợi tiểu, hạ

sốt, giảm đau và trị giun, ngoài ra chúng còn được dùng làm thuốc bôi ngoài da

(Jaganath, 2000) Trong báo cáo của Yam và ctv (2009) thì Elephantopus tomentosus

được sử dụng để điều trị kháng viêm

1.2 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật

1.2.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật

Chất kháng khuẩn thực vật là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có tác dụng tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở nồng độ thường rất nhỏ (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010)

1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật

Cơ chế chung của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật bao gồm việc phá vỡ màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng hợp cùng chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào, gây đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin

Hình 1.4 Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm

của tế bào Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant secondary metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi tác động tương tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạt động tế bào (Radulovíc và ctv 2013)

Các hợp chất từ thực vật có tác động kháng khuẩn không chỉ là đối với vi khuẩn Gram dương và Gram âm mà còn với cả nấm, trong đó các chủng Gram âm là nhạy cảm dễ bị các hợp chất thực vật tác động lên nhất, có tới 5 hướng mà các hợp chất thực vật có thể tác động tới các chủng Gram âm Trường hợp điển hình là của thymol, hợp chất này có tác động tới cả màng tế bào của tế bào chất bên ngoài và bên trong bằng cách tích hợp vào nhóm đầu cực của lớp đôi lipid dẫn tới sự chênh lệch, làm tăng tính bán thấm của màng tế bào và gây chết, tuy nhiên thymol cũng có thể tham gia vào việc quy định các gen tham gia vào tổng hợp protein màng ngoài, ức chế enzym liên quan đến bảo vệ chống lại stress nhiệt, tổng hợp ATP, các con đường trao đổi chất citric Tiềm năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của PSMs có thể

bị ảnh hưởng và phụ thuộc bởi rất nhiều yếu tố như tính năng của tế bào đích (vi khuẩn, nấm, Gram dương, Gram âm), điều kiện môi trường, khả năng hòa tan, nồng

độ, nhiệt độ, độ pH ảnh hưởng quan trọng tới tác động kháng khuẩn của PSMs cũng như các hỗn hợp của chúng (Radulovíc và ctv, 2013) (Hình 1.4)

Wagner, thử nghiệm Hager, thử nghiệm Mayer, thử nghiệm Dragendroff

Vai trò của alkaloid chủ yếu là tác động diệt khuẩn, ảnh hưởng lên hệ thần kinh, hạ huyết áp, chống ung thư

Một số alkaloid có tính kháng khuẩn: Solamargine là một glycoalkaloid có

trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasinum), và các loại alkaloid khác trong

loài cây này có tác dụng chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải HIV Kháng khuẩn

tốt nhất dối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp tới việc

kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy Ngoài solamargine thì berbein

cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với shigella, Staphylococcus Những năm gần đây

một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine có tinh kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn Gram dương, Gram âm ngoài ra berberine còn chống lại nấm men gây bệnh

và một số động vật nguyên sinh Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với khuẩn gây sốt rét Cơ chế kháng khuẩn berberine là khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn gây bệnh số rét, chính vì thế mà tác dụng kháng khuẩn của berberine đối với loài này khá mạnh Đặc biệt khi dùng berberine điều trị các bệnh nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự phất triển bình thường của hệ vi sinh vật có lợi ở ruột Vì vậy berberine đang được chú ý phát triển ơ nhiều nước (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010)

1.2.3.2 Saponin

Saponin thuộc nhóm glycosides, dưới tác dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (gọi là sapogenin) và phần glucid thường ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan, hòa tan vào nước từ đó làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch

và tạo bọt phát hiện trong mẫu có Saponin bằng thử nghiệm lắc tạo bọt

Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng), một số saponin có tác dụng chống viêm, một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus, kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, theo Hoàng Sầm

và Hứa Văn Thao (2012)

1.2.3.3 Anthraquinone glycoside

Anthraquinone glycosides là hợp chất thường có màu từ vàng, cam tới đỏ, gắn vào nhân thường có các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH , tuỳ theo vị trí các nhóm chức gắn vào nhân mà có các dẫn chất khác nhau Anthraquinone glycosides được định tính bằng thử nghiệm Borntrager

Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất anthraquinon có tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thư Thành phần ức chế vi khuẩn trong cây Đại Hoàng chủ yếu

là dẫn chất của anthraquinone, có tác dụng kháng khuẩn rộng chủ yếu đối với tụ cầu, liên cầu, song cầu khuẩn lậu, trực khuẩn bạch hầu, thương hàn, phó thương hàn, kiết

lị, theo Mạnh Hùng (2015)

1.2.3.4 Flavonoids

Flavonoids là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa, giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa Bộ khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon, có độ tan không giống nhau Flavonoid glycosides, flavonoid sulfat không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước, cồn, aglycon flavonoid tan trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước flavonoids được phân loại dựa trên vị trí của gốc aryl đính vào flavonoids được xác định bằng các thử nghiệm chì acetate, thử nghiệm acid clohidric

và thử nghiệm Benidict

Flavonoids có vai trò là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cản 1 số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng…), tham gia quá trình lọc tia cực tím (UV), cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa

Một số hợp chất Flavonoids có hoạt tính kháng khuẩn có thể kể đến như

catechin Chúng là một trong những hợp chất flavonoid có khả năng ức chế Vibrio cholera, Streptococcus mutans, Shigella và một số vi sinh vật khác Catechin hoạt động bằng cách vô hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio, ức chế enzyme glucosyltransferase của Streptococcus mutans, cơ chế hoạt động là do khả năng tạo

phức không thuận nghịch với các amino acid ái nhân trong protein từ đó làm bất hoạt chức năng gây bệnh của protein trong vi sinh vật Galangin có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram dương cũng như nấm sợi và virus, đặc biệt là HSV-1 và Coxsackie B type I (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010)

1.2.3.5 Phenolic

Phenolic là những hợp chất hóa học được tìm thấy ở khắp các chất màu của hoa quả được cấu tạo từ các tiểu đơn phân phenol, đa số được tổng hợp từ phenylalanine, ở thực vật nhóm phenolic chủ yếu được tìm thấy là caffeic acid (Một trong những hợp chất đơn giản có độc tinh sinh học được cấu tạo từ dẫn xuất thế vòng phenolic) Phenolic chủ yếu được phân thành 2 loại chính là phenolic acid và flavonoid polyphenol Chủ yếu người ta dùng các loại thuốc thử Folin để xác định sự

có mặt của phenolic

Phenolic có vai trò bảo vệ thực vật chống lại mầm bệnh và các động vật ăn

cỏ, chất chống oxi hóa tự nhiên và tìm thấy trong táo, trà xanh, chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tim và kháng viêm, một hợp chất phenolic khác là chlorogenic acid được biết như là chất gây ra viêm da dị ứng ở người

Một số hợp chất phenolic có hoạt tinh kháng khuẩn như eugenol là hợp chất phenolic có chứa 1 nhánh thế mà có carbon ở trạng thái oxy hóa thấp không chứa oxy được xem là chất kìm hãm đồng thời chống lại cả nấm sợi và vi khuẩn Catechol và pyrogallol là hai hợp chất hydroxyl hóa của phenol cho thấy là có độc tính đối với vi

sinh vật Catechol có 2 nhóm OH và pyrogallol có 3 nhóm OH Vị trí và số lượng các nhóm hydroxyl trên vòng phenol được xem như là có liên quan tới độc tính của chúng lên vi sinh vật, cụ thể là tăng sự hydroxyl hóa thì độc tính của chúng sẽ tăng lên Ngoài ra, người ta còn nhận thấy rằng phenol ở trạng thái oxy hóa càng cao thì khả năng ức chế vi sinh vật càng tăng Cơ chấ này được cho là nguyên nhân dẫn tới độc tính của các hợp chất phenolic này đối với vi sinh vật bao gồm sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxi hóa, có thể thông qua các phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự tương tác không đặc hiệu của các chất này đối với protein (Nguyễn Thị Hiền

và ctv 2010)

1.2.3.6 Tannin

Tannin là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino axit và alkaloid), có vị chát, tan trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, đa số không tan trong các dung môi hữu cơ, tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt) Có thể chia tannin làm hai loại tannin thủy phân được (Tannin pyrogalic)

và tannin không thủy phân được (Tannin pyrocatechic) Tannin thủy phân được thì được thuỷ phân bằng acid (hoặc enzyme tanaza) tạo thành phần đường (glucose) và phần không đường (các acid), nối với nhau theo dây nối este, tủa xanh đen với muối sắt III, dễ tan trong nước, ví dụ: Ðại hoàng, Ðinh hương, lá cây Bạch đàn Tannin không thủy phân được thì dễ tạo thành chất phlobaphen không tan, thường là chất trùng hợp từ catechin (hoặc từ leucoanthoxyanidin), (hoặc là những chất đồng trùng hợp của hai loại), tủa xanh với muối sắt III, ví dụ: Vỏ Quế, Canhkina, Ðại hoàng Tannin thường được định tính bằng thử nghiệm Gelatin mặn, thử nghiệm chì acetate, thử nghiệm FeCl3, thử nghiệm KMnO4

Tannin có vai trò bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu, tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng, công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy

Cơ chế kháng khuẩn của tannin chủ yếu là là tạo phức với các protein gây bất hoạt chúng giống như ở flavonoid Condensed tannin đã được xác định có thể liên kết với thành tế bào vi khuẩn có trong hệt tiêu hóa của động vật nhai lại, ngăn chặn sự sinh trưởng và ức chế hoạt tính của protease Tính kháng khuẩn của tannin được tăng cường bởi tia UV ở bước sóng 320 tới 400 nm (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010)

1.2.3.7 Terpene

Terpene là một nhóm chất lớn và đa dạng Bộ khung carbon của terpene được tạo thành từ đơn vị cơ bản isoprene-C5H8, terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài

họ thông, theo Nguyễn Tiến Thắng (2011)

Terpenenes có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus và các động vật nguyên sinh

Cơ chế kháng khuẩn của terpenenes được cho là liên quan tới sự phá vỡ màng

tế bào bởi các hợp chất lipophilic Các terpenoid hiện diện trong các loại tinh dầu

thực vật có khả năng kiểm soát được Listeria monocytogenes

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn ở thực vật trên thế giới và tại Việt Nam:

Trong nghiên cứu của Anees và ctv (2009) thì 6 hợp chất có được từ cây

Elephantopus.scaber trong quá trình cô đặc từ 2 loại dung môi n-hexane và methanol

từ 3 phần khác nhau của cây gồm rễ, thân và lá thu được hợp chất stigmasterol, lupeol, stearic acid, đồng phân deoxyelephantopin, đồng đẳng 1 và 2 của deoxyelephantopin

Thành phần hóa học chính của cây Elephantopus mollis là elephantopin,

triterpenes, stigmasterol epifriedelinol và lupeol (Consolacion, 2009) Cũng trong nghiên cứu này thì phần tan dichloromethane của lá E.mollis đã đưa ra phương pháp NMR quang phổ và theo đó đã tìm ra được các hợp chất sau: 2-deethoxy-2-hydroxyphantomolin, ester của acid béo và α amyrin, ester của acid béo và lupeol, stigmasterol

Kết quả của Chaghaby (2011) ghi nhận các dịch chiết khác nhau từ lá cây

Annona Squamosa đều có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram dương

mạnh hơn Gram âm Kết quả của của Chaghaby dựa trên nghiên cứu của Chopra và Greenwood cho rằng vi khuẩn Gram âm ít bị ảnh hưởng nhiều bởi những chất có chiết xuất từ thực vật hơn so với vi khuẩn Gram dương là do chúng có một lớp màng ngoài bao gồm các lipoprotein và lipopolysaccharide cho phép chúng có khả năng điều hòa, vận chuyển các chất ra vào bên trong cơ cấu nội bào Mỗi một dịch chiết đều thể hiện khả năng kháng ít nhất 6/27 chủng vi khuẩn chỉ thị, tuy nhiên những bất đồng được quan sát thấy ở những dịch chiết lên các chủng vi sinh vật là khác nhau

Sự khác nhau đó là do sự khác biệt giữa các hợp chất hóa học có trong mỗi loại dịch chiết, theo nghiên cứu của Doriane (2013)

Trong nghiên cứu của Ibtisam (2011) đã thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

của dịch chiết ethanol trên 6 loại cây gồm có Ginger (Zingiber officinale), Cinnamon (Cinnamomum verum), black cumin (Nigella sativa), Clove (Syzygium aromaticum) black pepper (Piper nigrum) và chamomile (Anthemis nobilis) để chống lại các chủng

vi khuẩn Gram dương thông thường bao gồm Staphylococus aureus và Bacillus subtilis, các chủng vi khuẩn Gram âm Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và nấm men Candida albicans, kết quả ghi nhận dịch chiết của cây Syzygium aromaticum có khả năng ức chế mạnh đến sự phát triển của Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa và Candida albicans, dịch chiết cây Cinnamomum verum

có khả năng ức chế mạnh đến sự phát triển của Bacillus subtilis và Candida albicans,

còn dịch chiết của những cây còn lại ở mức trung bình

Nghiên cứu của Lê Thị Bích Uyên (2007) trên cây Aloe vera và Mirabilis jalapa L cho thấy dịch chiết ethanol của cây lô hội Aloe vera ngoài tự nhiên có khả năng kháng được các chủng vi khuẩn E.coli, Pseudomonas aeruginosa và không có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Staphylococcus và nấm Candida albicans, tuy nhiên dịch chiết của Aloe vera ngoài tự nhiên cho khả năng kháng rất yếu chủ yếu

là ức chế cho vòng kháng mờ và nhỏ, dịch chiết trong ethanol của cây lô hội invitro

có khả năng kháng được chủng vi khuẩn E.coli, Pseudomonas aeruginosa và

Staphylococcus, với khả năng kháng cao hơn Cũng trong nghiên cứu trên thì dịch chiết ethanol của mô sẹo cây hoa phấn tự nhiên Mirabilis jalapa L và cây hoa phấn invitro có khả năng kháng chủng vi khuẩn E.coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus

1.3 Ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của thực vật:

Theo kết quả nghiên cứu của Antara Sen (2012) thì dịch chiết của cây Melia azedarach L trên tất cả các hệ dung môi ethanol, methanol, petroleum ether và nước

đều có khả năng kháng lại các chủng vi khuẩn gây bệnh cho người đã được phân lập

trước đó bao gồm Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, và Pseudomonas aeruginosa

Nghiên cứu trên chỉ ra rằng dịch chiết của cây thu được nhờ hệ dung môi Petroleum ether cho kết quả dối kháng tốt với tất cả các chủng Cùng với đó trong

một nghiên cứu khác của Murugesan (2011) trên cây Memecylon umbellatum thì dịch

chiết của cây này trong dung môi Petroleum ether có hoạt tính tốt lên các chủng vi sinh vật chỉ thị Từ dịch chiết trên ông thu nhận sự có mặt của amino acid, carbonhydrate, flavonoid, protein, nhóm hợp chất phenolic, saponin và steroid Ngoài

ra, dịch chiết nước từ lá của cây Pterospermum acerifolium trong nghiên cứu của

Thatoi (2008) còn có hoạt tính kháng khuẩn nổi bật chống lại một số chủng vi khuẩn gây bệnh Gram dương và Gram âm

Dịch chiết của lá cây Bryophyllum pinnatum và Kalanchoe crenata trong

nghiên cứu của Aibinu (2007) sử dụng bào gồm 5 loại dịch chiết: nước, methanol và các loại dịch chiết địa phương bao gồm rượu dừa, gin và “omi ekan-ogi”, các loại dịch chiết của 2 loại cây trên được thử hoạt tính chống lại một số chủng vi sinh vật

Gram âm Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Salmonella paratyphii, Citrobacter spp, các chủng Gram dương Staphylococcus aureus ATCC 25213, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis và nấm Candida albicans, trong nghiên cứu

này phương pháp đục lỗ thạch và phương pháp pha loãng ống nghiệm dùng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu từ nồng độ 4mg/ml tới

512 mg/ml, dịch chiết của cây Kalanchoe crenata cho kết quả kháng tốt nhất với chủng Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis tại nồng

độ 8 mg/ml, Shigella flexneri tại 32 mg/ml, 64 mg/ml với Escherichia coli và 128 mg/ml đối với Staphylococcus aureus trong khi kết quả MBC là 256 mg/ml đối với chủng Bacillus subtilis và Klebsiella pneumoniae, các chủng Gram dương thì khá nhạy cảm với dịch chiết methanol và dịch chiết địa phương gin của cây Bryophyllum pinnatum, còn lại những dịch chiết khác cho kết quả kháng khuẩn yếu hơn Qua các

nghiên cứu trên có thể nhận thấy dung môi có ảnh hưởng lên hoạt tính kháng khuẩn,

do khả năng lôi kéo các hợp chất có khả năng kháng khuẩn trong cùng mội loài cây

là khác nhau điều đó dẫn tới khả năng kháng khuẩn giữa chúng cũng khác nhau

1.4 Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh

1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy

1.4.1.1 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Escherichia

a) Đặc điểm

Escherichia là một loài vi khuẩn Gram âm hình que, kị khí tùy nghi, không

sinh bào tử Nhiệt độ thích hợp 370C, pH 7.2-7.4 Sống chủ yếu hội sinh trong đường ruột của người và động vật chúng được biết đến như là nguyên nhân chủ yếu gây

nhiễm trùng đường tiết niệu và các bệnh đường tiêu hóa Đơn cử là Escherichia coli

(Trần Văn Cường, 2009)

Hình 1.5 Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử

Escherichia phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy phổ thông Môi

trường thạch thường: hình thành khuẩn lạc tròn ướt, lồi, bóng láng, màu trắng xám hơn đục, đường kính 2-3mm Môi trường MacConkey khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn, lồi, không làm chuyển màu môi trường Môi trường thạch máu khuẩn lạc

Escherichia to, bóng, lồi, màu xám nhạt một số chủng có khả năng gây hiện tượng

tan máu Môi trường Simmon citrat khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục Môi trường Endo khuẩn lạc màu đỏ Môi trường EMB khuẩn lạc có ánh kim tím

Đặc điểm sinh hóa dòng Escherichia: do chúng có phản ứng lên men đường nên dòng Escherichia cụ thể là E coli lên men sinh hơi các loại đường lactose,

fructose, glucose, levulose, galactose, xylose, manitol; lên men không chắc chắn các loại đường duncitol, saccarose và salixin Ngoài ra chúng còn có một số phản ứng sinh hoá khác như phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứng H2S, VP, Urea âm tính (Trần Văn Cường, 2009)

b) Khả năng gây bệnh

Escherichia sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin, vertoxin, neurotoxin

Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra (Trần Văn Cường, 2009)

1.4.1.3 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Vibrio:

a) Đặc điểm

Vibrio là trực khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước

0.3-0.5 x 1.4-2.6 μm Chúng không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiên

Hình 1.6 Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB

mao hoặc nhiều tiên mao mảnh, kỵ khí tùy nghi Chúng phát triển tốt trong môi trường dinh dưỡng thường và môi trường kiềm (pH >7) vibrio có thể sống được vài ngày đến 2-3 tuần Dễ bị diệt bởi nhiệt độ (80°C/5 phút), bởi hoá chất thông thường và môi trường axit nhiệt độ thích hợp là 370C, có thể phát triển tốt trong môi trường kiềm (pH 8,5 - 9,5), có nồng độ NaCl cao (3%) (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2006)

Trong môi trường pepton kiềm mọc nhanh và tạo váng Trên môi trường thạch kiềm sau 18h có thể quan sát thấy khuẩn lạc tròn, lồi nhẵn và trong suốt Trên thạch MacConkey khuẩn lạc trong (không lên men đường lactose) Trên môi trường TCBS khuẩn lạc có màu vàng vì lên men đường sucrose, trên môi trường ChromAgar

khuẩn lạc V.parahaemolyticus có màu tím hoa cà V.vulnificus và V.cholerae có màu xanh lá cây chuyển sang màu xanh ngọc, V.alginolyticus không màu (Đặng Thị

Hoàng Oanh và ctv, 2006)

Hình 1.8 Khuẩn lạc Vibrio trên môi trường Chrom agar Hình 1.7 Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử

Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và catalase dương tính (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2006)

b) Khả năng gây bệnh:

Vibrio gây bệnh bằng độc tố ruột (choleragen) Đây là nội độc tố có cấu trúc

gồm hai đơn nguyên: đơn nguyên A (trọng lượng phân tử là 27 000 dalton, mang độc tính cao) và đơn nguyên B có tính kháng nguyên đặc hiệu và một cầu nối A2 có tác dụng kích thích tăng cAMP (Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat) Độc tố ruột gắn vào niêm mạc ruột non, hoạt hoá enzyme adenylcyclase dẫn đến tăng cAMP, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl- và nước gây tiêu chảy cấp tính theo Nguyễn Hoàng Tuấn và ctv (2012)

1.4.1.2 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Salmonella

a) Đặc điểm

Salmonella là trực khuẩn Gram âm kị khí chịu oxy, hình que, có khả năng di

động, kích thước 0.4 – 0.6 x 1 – 3 μm thích hợp phát triển tốt ở nhiệt độ 370C, pH 7.2-7.6 (Trần Văn Cường, 2009)

Salmonella được nuôi cấy trên các môi trường: Môi trường canh thịt: môi trường bị đục, sinh cặn ở đáy ống nghiệm, có mùi thối Môi trường SS (Salmonella – Shigella): Do không lên men đường lactose, khuẩn lạc ở dạng trong hoặc không màu

Môi trường Endo: khuẩn lạc có màu vàng Môi trường thạch EMB: khuẩn lạc có màu

Hình 1.9 Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử

đỏ Môi trường XLD khuẩn lạc tròn lồi trong suốt có tâm đen đôi khi tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ (Trần Văn Cường, 2009)

b) Khả năng gây bệnh

Salmonella cũng có khả năng sản sinh ra độc tố enterotoxin, ngoài việc phá

hủy lớp niêm mạc ruột, độc tố này cũng có tác động gây tiêu chảy, độc tố thẩm xuất chậm (DPF - Delayed Permeability Factor – Độc tố không chịu nhiệt) và độc tố thẩm xuất nhanh (RPF - Rapid Permeability Factor - Độc tố chịu nhiệt) (Trần Văn Cường, 2009)

1.4.1.4 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Shigella:

a) Đặc điểm

Shigella là trực khuẩn Gram âm mảnh dài 1-3 micromet, rộng 0,5-0,6

micromet, không có tiên mao, vì vậy không có khả năng di động, không có vỏ không sinh bào tử,Shigella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện

hiếu khí, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 370C (Chang Tran, 2014)

Hình 1.10 Khuẩn lạc Salmonella trên môi

trường XLD

Hình 1.12 Khuẩn lạc Shigella trên môi trường Macconkey

Trong môi trường lỏng Shigella làm đục đều môi trường Trên môi trường đặc SS (Salmonella- Shigella) sau 24h khuẩn lạc có đường kính khoảng 2mm, tròn

lồi mặt nhẵn bờ đều (Chang Tran, 2014)

Shigella lên men glucose không sinh hơi, lên men manitol (trừ Shigella dysenteriae không lên men manitol), hầu hết Shigella không lên men lactose, chỉ có Shigella sonnei lên men lactose nhưng chậm Không sinh H2S, Urease âm tính phản

ứng Indol thay đổi, phản ứng đỏ metyl dương tính, phản ứng VP âm tính, phản ứng citrat âm tính (Chang Tran, 2014)

b) Khả năng gây bệnh:

Các shigella đều có độc ruột (enterotoxin) là ShET-1 và ShET-2 chúng làm

thay đổi sự vận chuyển điện giải ở các tế bào niêm mạc đại tràng, gây tăng tiết dịch

Hình 1.11 Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử

Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh nhưng tính

kháng nguyên yếu Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột Ngoại độc

tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae 01 và ETEC,

hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với

tế bào Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn ở người, đây là một bệnh truyền nhiễm có thể gây thành các vụ dịch địa phương và thương tổn đặc hiệu khu trú ở ruột già, trên lâm sàng biểu hiện bằng hội chứng lỵ với các triệu chứng như đau bụng quặn, đi ngoài

nhiều lần, phân có nhiều nhầy và thường có máu Shigella gây bệnh bằng cơ chế xâm

nhập vào tế bào biểu mô của niêm mạc ruột và nhân lên với số lượng lớn trong tổ

chức ruột Các Shigella đều có nội độc tố Riêng trực khuẩn Shiga còn có thêm ngoại độc tố bản chất là protein Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc

tính mạnh nhưng tính kháng nguyên yếu Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản

ứng tại ruột Ngoại độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae 01 và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với tế bào (Chang Tran, 2014)

1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da

1.4.2.1 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas

a) Đặc điểm

Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường Sự

biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật Đặc điểm hình

thái học chung của Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ

roi ở đầu và không có bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen (Trần Quang Cảnh, 2012)

Pseudomonas aeruginosa mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông

thường, hiếu khí Nhiệt độ thích hợp 370C nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5 - 420C,

pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0 Trên môi trường đặc: khuẩn lạc thường to giống như quả trứng ốp (fried eggs), nhẵn, dẹt, trung tâm lồi, có màu xanh ánh kim và có xu hướng mọc lan Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc mọc gây tan máu hoàn toàn (β) (Trần Quang Cảnh, 2012)

Một số đặc điểm sinh hóa chính của Pseudomonas aeruginosa như không lên

men glucose, có khả năng thủy giải gelatin, khử nitrate, oxidase dương tính, sản xuất hydrogensulphide từ thiosulphate, sản xuất 2-keto-D-gluconateacid từ D-gluconate,

sử dụng glycerol, succinate,L-arabinose, formate, acetate, lactose, xylose, mannitol, rhamnose, P-arabinose, trehalose, cellobiose, inositol, sucrose (Trần Quang Cảnh, 2012)

b) Khả năng gây bệnh

Hình 1.14 Khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa

trên môi trường thạch thường

Hình 1.13 Hình thái Pseudomonas trên kính hiển vi điện tử

Độc tính của chủ yếu là exotoxin của vi sinh vật bao gồm loài Pseudomonas

đuợc biết là gây độc trên ấu trùng của loài muỗi cũng như lòai sâu bọ cánh phấn

Pseudomonas fluorescens gây chết loài muỗi ở giai đọan ấu trùng, nhộng, và theo

nghiên cứu loài này cũng gây độc tố đối với họ nhà bay Mặc dù phuơng thức hoạt

động của độc tố này chưa đuợc hiểu rõ, những loại độc tố như của P aeruginosa đuợc

hấp thụ hấp thụ qua biểu bì của loài côn trùng và họat động trên protein tan huyết

Dịch formulation (VCRC B426) từ sự trao đổi chất của P fluorescens tiết ra như là

phuơng pháp đuợc sử dụng để chống lại loài muỗi (Nguyễn Thị Như Yến và ctv, 2011)

1.4.2.2 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus (E.faecalis)

a) Đặc điểm

Enterococcus faecalis là vi khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn phát

triển tốt hơn ở điều kiện khí trường có thêm 5-10% CO2 và thường đòi hỏi môi trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 370C, một số phát triển được ở 10 tới 400C (Dương Văn Sĩ, 2010)

Khuẩn lạc có màu hồng tới đỏ đậm khi nuôi cấy trong môi trường azide tetrazolium chứa triphenyl tetrazolium chloride (TTC), trên môi trường thạch máu thì khuẩn lạc tròn, lồi, bóng khô, có màu hơi xám trong Có phản ứng catalase và oxidase

âm tính, có khả năng lên men đường glucose, sinh acid làm giảm pH môi trường (Dương Văn Sĩ, 2010)

Hình 1.15 Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử

Hình 1.16 Khuẩn lạc Enterococcus faecalis trên môi trường

thạch máu BA b) Khả năng gây bệnh

Enterococcus faecalis là nguyên nhân dẫn tới viêm họng, viêm hạch có mủ,

viêm khớp, viêm thận cấp tính, viêm các van tim Gây đau dạ dày và mùi hôi ở cổ họng (Dương Văn Sĩ, 2010)

1.4.2.3 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus

Staphylococcus là các cầu khuẩn Gram dương không tạo nha bào có đường

kính khoảng 1 μm, không di động và sắp xếp theo mọi hướng và thường tạo thành

cụm (tụ) trông giống như chùm nho Staphylococcus chủ yếu phân thành 2 nhóm: Staphylococcus có enzyme coagulase: Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius và Staphylococcus không có enzyme coagulase: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri

Trên môi trường thạch thường khuẩn lạc dạng S, đường kính 1 - 2mm, sau

24 giờ khuẩn lạc có màu vàng rơm (đối với Staphylococcus aureus) hoặc có màu trắng (đối với các loại Staphylococcus khác) (Trần Quang Cảnh, 2012)

Trên môi trường thạch máu Staphylococcus phát triển nhanh: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, tan máu hoàn toàn, có

màu vàng Khuẩn lạc tụ cầu khác: dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, có màu trắng

và thường không gây tan máu, khuẩn lạc S aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm,

có màu đen bóng,lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm

quanh khuẩn lạc Khuẩn lạc một số dòng S Aureus có thể không tạo các vòng sáng

quanh khuẩn lạc (Trần Quang Cảnh, 2012)

Hình 1.18 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường Baird

Parker bổ sung egg yolk

Hình 1.17 Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử

b) Khả năng gây bệnh

Gây bệnh nhờ yếu tố độc lực nội bào: Staphylococcus aureus còn sản xuất

nhiều yếu tố độc lực có liên quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn Vỏ polysaccharide:

một số chủng Staphylococcus có thể tạo vỏ polysaccharide Vỏ này cùng với protein

A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào Hầu hết các chủng

Staphylococcus aureus đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A)

có khả năng gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch Chính nhờ hiện tượng gắn độc đáo này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa: chúng là các receptor cho

các đại thực bào Quá trình gắn trên giúp Staphylococcus aureus tránh không bị thực

bào bởi đại thực bào Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu đều có khả năng sản xuất một chất kết dính gian bào Nhờ chất này, vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc (Trần Quang Cảnh, 2012)

Gây bệnh nhờ yếu tố độc lực ngoại bào: Ngoài coagulase và yếu tố kết cụm

thì Staphylococcus còn sản xuất một số enzyme quan trọng góp phần tạo nên độc lực

mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này, cụ thể như hyaluronidase là một enzyme có khả năng phá hủy mô liên kết của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong cơ thể Hemolysine và leukocidine: phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế bào bạch cầu hạt cũng như đại thực bào Exfoliatine: là các enzyme phá hủy lớp thượng bì Enzyme này gây tổn thương da tạo các bọng nước Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell

do tụ cầu Sáu độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc là nguyên nhân gây nên hội chứng sốc nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng Hầu hết các chủng

Staphylococcus đều sản xuất được men penicillinase (beta- lactamase) Enzyme này

phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng (Trần Quang Cảnh, 2012)

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm

và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II bao gồm:

Nhóm vi khuẩn Escherichia coli: Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli

0208, Escherichia coli và Enterotoxigenic E.coli-ETEC

Nhóm vi khuẩn Listeria: Listeria innocua và Listeria monocytogenes

Nhóm vi khuẩn Salmonella: Salmonella dublin, Salmonella enteritidis, Salmonella typhii và Salmonella typhimurium,

Nhóm vi khuẩn Shigella: Shigella boydii, Shigella flexneri và Shigella sonnei Nhóm vi khuẩn Vibrio: Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio harveyi

và Vibrio parahaemolyticus

Nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da khác: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Enterococcus feacalis

2.2.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.3.1 Hóa chất

- Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ)

- Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ)

- Ethanol (Việt Nam)

- DMSO (Dimethy lsulfoxide) (Trung Quốc)

- Ciprofloxacin (Việt Nam)

- Các loại thuốc thử : Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendroff, Hager, Wagner, Ninhydrin, NaOH, NaCl, chì acetate, acetic anhydride, gelatin, chloroform, ferric chlodride, H2SO4 đậm đặc

Cân phân tích (Orbital - Gemany), bếp từ (Billy - England), máy ly tâm (Tuttligen - Germany), tủ ấm (Memmert - Gemany), Autoclave (Huxky - Taiwan), máy cô quay chân không (Hahn shin - Korea), máy đông khô (Virtis - USA), máy tạo nước cất (Branstead - USA), máy lắc (IKA - Germany)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp xử lý và tách chiết hợp chất kháng khuẩn

Mục đích: Tách chiết các hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật nhằm phục vụ cho các nghiên cứu về sau

Nguyên tắc: Sử dụng các loại dụng môi để tách chiết các hợp chất có trong cây thuốc nhờ lực liên kết hóa học nhờ đó ta có thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi mẫu cây thuốc

Mẫu cây thuốc tươi được rửa sạch để lọai bỏ bụi bẩn sau đó đem đi phơi khô rồi nghiền thành dạng bột Bột cây thuốc sẽ được ngâm để trích ly hợp chất với methanol trong 24 giờ và lặp lại từ 3 đến 5 lần cho đến khi dịch chiết đã hoàn toàn trong suốt Dịch chiết sẽ được loại bỏ dung môi methanol để giữ lại phần cao chiết bằng cách cô quay chân không ở nhiệt độ nhỏ hơn 50oC Cao chiết thu được sẽ được chia vào trong chai và bảo quản ở nhiệt độ -4oC (Atta và Mouneir, 2004)

2.4.2 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị

Mục đích: giúp tăng nhanh sinh khối của vi sinh vật chỉ thị đến số lượng cần thiết để phục vụ cho thí nghiệm ngoài ra còn giúp hoạt hóa vi khuẩn trở về với trạng thái bình thường sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo quản

Nguyên tắc: sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng thích hợp Môi trường dinh dưỡng không những phải chứa đầy đủ các thành phần đa lượng và vi lượng để vi sinh vật phát triển mà phải đảm bảo có đủ các điều kiện lý hóa thích hợp để vi sinh vật thực hiện trao đối chất với môi trường

Đối với các giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật được chỉ thị giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy