Bước Đầu Nghiên Cứu Phân Lập Tuyển Chọn Vi Khuẩn Bacillus Spp. Từ Phụ Phế Phẩm

Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm bằng phương pháp đồng nuôi cấy trên môi trường hỗn hợp .... Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm mốc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc

Sinh viên thực hiện luận văn

Trần Chi Phúc

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên, con xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cha mẹ và gia đình đã luôn bên cạnh, cổ vũ, động viên và giúp đỡ con mỗi khi gặp khó khăn trong suốt quá trình quá trình học tập và thực hiện Đồ án

Em xin cám ơn thầy, cô thuộc khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG, Trường Đại Học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt cho em đầy rất kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trường

Đặc biêt, em chân thành cám ơn cô Ts Nguyễn Hoài Hương đã tận tình giúp

đỡ, hướng dẫn và truyền đạt cho em rất nhiều kiến thức trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện đồ án

Em cũng xin cám ơn quý thầy, cô phụ trách Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯƠNG, Trường Đại Học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp cho em thực hiện và hoàn thành Đồ án tốt nghiệp của mình

Tôi xin cám ơn sự giúp đỡ rất nhiệt tình của các cộng sự và tất cả các bạn làm việc tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp của mình

TP Hồ Chi Minh, ngày … tháng … năm 2014

Trần Chí Phúc

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC VIẾT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Độc tố nấm mốc 3

1.2 Độc tố aflatoxin 3

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu 3

1.2.2 Tính chất vật lý và phân loại 4

1.2.3 Sự tạo thành aflatoxin do nấm mốc 5

1.2.4 Cơ chế gây độc của aflatoxin 7

1.2.5 Độc tính của aflatoxin 8

1.2.6 Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin 10

1.2.7 Tình hình nhiễm độc aflatoxin 11

1.2.8 Phương pháp phát hiện aflatoxin 12

1.3 Phương pháp khử nhiễm aflatoxin 15

1.3.1 Phương pháp vật lý học 15

1.3.2 Phương pháp hóa học 17

1.3.3 Phương pháp sinh học 18

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Thời gian – địa điểm nghiên cứu 20

2.2 Vật liệu - Thiết bị - Hóa chất 20

2.2.1 Vật liệu 20

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 20

2.2.3 Môi trường – Hóa chất 20

2.3.1 Phương pháp luận 22

2.3.2 Bố trí thí nghiệm 23

2.3.3 Một số phương pháp khảo sát sinh hóa vi khuẩn 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Phân lập các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ nhất 40

3.1.1 Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm bằng phương pháp đồng nuôi cấy trên môi trường hỗn hợp 40

3.1.2 Khảo sát khả năng đối kháng với nấm của dịch ly tâm canh trường nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường hỗn hợp 42

3.2 Phân lập các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ hai 43

3.2.1 Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm mốc trên môi trường PDA 47

3.2.2 Khảo sát khả năng ức chế khả năng sinh aflatoxin của các chủng khuẩn phân lập với nấm trên môi trường CCA 48

3.3 Khảo sát sinh hóa của chủng khuẩn phân lập được 50

3.3.1 Nhuộm bào tử 50

3.3.2 Thử nghiệm Simmon citrate 51

3.3.3 Thử nghiệm catalase 52

3.3.4 Thử nghiệm protease 52

3.3.5 Thử nghiệm chitinase 53

3.3.6 Thử nghiệm lên men carbohydrate 53

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 57

4.1 Kết luận 57

4.2 Đề nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC

DANH MỤC VIẾT TĂT

A.O.A.C: Association of Analytical Communities

CCA: coconut cream agar

Ctv: cộng tác viên

ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

FDA: Food and Drug Administration

HPTLC : high ferformane thin layer chromatography TLC

NA: Nutrient agar

NB: Nutrient broth

PDA: Potato dextrose agar

PDB: Potato dextrose broth

ppb: parts per billion

TFA: Tryfloacetic acid

TLC: Thin layer chromatographi

UV: Ultraviolet

DANH MỤC BẢNG

TRANG

Bảng 1.1 Tính chất hóa lý một số aflatoxin 5

Bảng 1.2 Một số loài nấm có khả năng sinh aflatoxin 6

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở vật nuôi 9

Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin ở 1 số nước theo tiêu chuẩn FDA 10

Bảng 1.5 Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam 11

Bảng 1.6 Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học 16

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái và nguồn gốc các chủng vi khuẩn phân lập 40

Bảng 3.2 Kết quả thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn CS1b 51

DANH MỤC HÌNH ẢNH

TRANG

Hình 1.1 Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan 7

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin 23

Hình 2.2 Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc theo cách tiếp cận thứ nhất 24

Hình 2.3 Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc theo cách tiếp cận thứ hai 29

Hình 3.1 Kết quả đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường hỗn hợp 41

Hình 3.2 Kết quả đối kháng nấm của các dịch tăng sinh trên môi trường PDA 44

Hình 3.3 Chủng vi khuẩn CS1a phân lập từ trái cà phê 45

Hình 3.4 Chủng vi khuẩn CS1b phân lập từ trái cà phê 46

Hình 3.5 Kết quả đối kháng nấm của các dịch ly tâm canh trường với nấm mốc trên môi trường PDA 48

Hình 3.6 Kết quả ức chế sự phát triển và khả năng tổng hợp aflatoxin của nấm mốc bởi dịch ly tâm canh trường vi khuẩn trên môi trường CCA 49

Hình 3.7 Kết quả nhuộm bào tử khuẩn CS1b 51

Hình 3.8 Thử nghiệm Simmon citrate CS1b cho kết quả dương tính 51

Hình 3.9 Thử nghiệm catalase CS1b cho kết quả dương tính 52

Hình 3.10 Thử nghiệm protease Chủng CS1b cho kết quả dương tính 52

Hình 3.11 Kết quả thí nghiệm chintinase Chủng CS1b cho kết quả âm tính 53

Hình 3.12 Kết quả lên men Glucose Chủng CS1b cho kết quả dương tính 54

Hình 3.13 Kết quả lên men Lactose Chủng CS1b cho kết quả âm tính 54

Hình 3.14 Kết quả lên men Sucrose Chủng CS1b cho kết quả âm tính 55

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

- Mycotoxin hay độc tố nấm mốc là nhóm độc chất tự nhiên do nấm mốc sản xuất ra trong quá trình phát triển Người ta đã phát hiện ra hàng ngàn loại

mycotoxin (được sinh ra chủ yếu bởi 3 nhóm nấm mốc chính là Aspergillus,

Penicillium và Fusarium), trong đó phải kể đến là aflatoxin Aflatoxin vừa gây độc

cấp tính (ở liều lượng lớn có thể gây chết một số loài gia súc, gia cầm) vừa gây độc mãn tính (ở liều lượng thấp tích tụ ở gan, gây rối loạn chức năng, suy giảm miễn dịch, thoái hóa gan thận…) Một số nghiên cứu cũng chứng minh rằng aflatonxin là nguyên nhân gây ung thư cho động vật thí nghiệm, do đó có thể rất nguy hiểm đối với con người Nhóm độc tố aflatoxin sinh ra chủ yếu bởi hai loài nấm mốc là

Aspergillus flavus và Aspergillus parisiticus Các loài nấm mốc này có mặt rất

nhiều ở một số loại lương thực như ngô, lạc… và một vài loại hạt có chứa dầu Trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm tương đối cao như nước ta, việc bảo quản nguồn lương thực sau thu hoạch cũng như các nguồn nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi là hết sức cần thiết Nếu không có điều kiện bảo quản thích hợp sẽ là điều kiện rất thuận lợi cho sự xâm nhập và phát triển của nấm mốc sinh aflatoxin Ngoài việc làm giảm chất lượng dinh dưỡng cho lương thực là nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi,

mà còn gây tích tụ độc tố trong chính các nguồn này Điều này sẽ gây ra những tổn thất rất lớn cho ngành chăn nuôi nói chung và cho người nông dân nói riêng Bên cạnh đó, việc sử dụng các nguồn lương thực và thực phẩm có tích tụ độc tố aflatoxin sẽ ảnh hưởng không nhỏ đến sức khỏe người tiêu dung

- Nhận ra được tình hình thực tế đó, các nhà khoa trong nước và thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm giải quyết vấn đề này Các tác nhân như vật lí, hóa học

đã được đưa ra thí nghiệm nhằm làm mất hiệu lực của aflatoxin Đặc biệt, xu hướng đang được chú trọng hiện nay là dựa vào các tác nhân vi sinh vật Các loài nấm mốc

(Rhizopus stolonifer, Rhizopus arrhizus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus

pulimus…) đã được thử nghiệm khả năng làm giảm aflatoxin và đã thu được những

kết quả khá khả quan

- Vì những lí do thực tiễn như trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “ Bước

đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp từ phụ phế phẩm

có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin.” Trong khóa luận tốt nghiệp này

- Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc sinh aflatoxin

- Sàng lọc và tuyển chọn vi khuẩn dựa trên hoạt tính đối kháng và hoạt tính ức

chế sinh tổng hợp aflatoxin của nấm mốc

- Định danh sơ bộ vi khuẩn và xác định cơ chế kháng nấm mốc sinh aflatoxin

bằng các thử nghiệm sinh hóa

- Chương III: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả

mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được

- Chương IV: Kết luận và đề nghị - nội dung chương tóm lại những kết quả mà

đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Độc tố nấm mốc:

- Độc tố nấm mốc hay còn gọi là mycotoxin là những hợp chất có phân tử nhỏ, khá bền trong các điều kiện, là sản phẩm của sự trao đổi chất thứ cấp trong quá trình phát triển của loài vi nấm Các mycotoxin dễ dàng xâm nhập và giữ được độc tính

trong các chuỗi thức ăn do cực kỳ khó khăn để loại bỏ hoặc tiêu diệt

- Độc tố nấm mốc được phát hiện lần đầu liên vào năm 1960, sau cái chết

hàng loạt của hàng trăm cá thể tại các trang trại gà tây ở Anh (T Asao và ctv,1963; F.Wu và P Khlangwiset, 2010)

- Cho đến nay có trên 300 loại độc tố nấm mốc đã được phát hiện và nghiên

cứu Nhưng chỉ có 20 loại độc tố nấm mốc có độc tính gây hại

- Bệnh nấm mốc ở người và động vật đều không có khả năng lây lan vì chúng

do tác nhân độc tố (hóa học) gây ra.Tuy nhiên, hầu như tất các sản phẩm thực vật đều có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo,

và vì thế nó có khả năng nhiễm trực tiếp cho thực phẩm của con người Khi gia súc

ăn các thức ăn có nhiễm mycotoxin, chúng không chỉ chịu tác dụng trực tiếp mà còn

là nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt, và như vậy tạo sự nhiễm mycotoxin tiếp theo cho con người

1.2 Độc tố aflatoxin:

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu:

- Aflatoxin là mycotoxin được phát hiện sớm nhất vào năm 1961 bởi nhà khoa

học Butler Qua việc xác định được loài Aspergillus flavus tiết ra độc tố gây chết

hàng loạt gà tây ở Anh, ông đặt tên cho độc tố này là aflatoxin (độc tố sinh ra bởi

Aspergillus flavus) (W.H Butler, 1964)

- Các công trình nghiên cứu sau đó đã xác nhận rằng Aflatoxin được tạo bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây khối u ở gan động vât (Halver, 1969; Wales, 1970; New, 1987 trích dẫn bởi Chaver-Sanchelez, 1994)

1.2.2 Tính chất vật lý và phân loại:

- Aflatoxin là một nhóm khoảng 20 chất là sản phẩm trao đổi bởi nấm

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Bốn nhóm aflatoxin chính được tạo ra

trong tự nhiên là B1, B2, G1 và G2 Bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng B là chữ viết tắt của Blue (màu xanh nước biển), và G là chữ viết tắt của Green (màu xanh lá cây) Aflatoxin B1 và B2 trong sữa bò được chuyển hóa

và gọi là aflatoxin M1 và aflatoxin M2 (M là chữ viết tắt của Milk) (F Wu và P Khlangwiset, 2010)

- Trong bốn loại aflatoxin, aflatoxin, aflatoxin B1 được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, sau đó là G1, còn B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn chúng có công thức cấu tạo như sau:

- Các aflatoxin tan trong methanol, acetone và chloroform, không tan trong dung môi không phân cực Aflatoxin tương đối không ổn định khi tiếp xúc với ánh sáng, đặc biêt là khi tiếp xúc với tia cực tím, các tác nhân oxy hóa, trong các dung môi phân cực hay trong các dung dịch có pH nhỏ hơn 3 hay lớn hơn 10 Aflatoxin

có nhiệt độ nóng chảy từ 2370C (G1) đến 2990C (M1), nhưng không bị phá hủy trong điều kiện nấu ăn bình thường Có thể phân hủy hoàn toàn chúng bằng nồi hấp tiệt trùng có bổ sung thêm ammoniac hoặc xử lý bằng chất tẩy rữa

Bảng 1.1 Tính chất hóa lý của một số aflatoxin

Aflatoxin

Công thức phân

tử

Trọng lượng phân tử

Điểm nóng chảy ( 0 C) Huỳnh quang

- Sự tạo thành aflatoxin chủ yếu được tìm thấy ở hai chủng nấm mốc

Asp.flavus và Asp parasiticus Các chủng tạo aflatoxin của Asp flavus là rất phổ

biến và thường được phân lập từ các nguồn khác nhau như lạc, hạt bông, hạt gạo, lúa Theo số liệu của Schoroder và Boller (1976), có từ 20-98% các chủng phân

lập của Asp flavus có khả năng tạo aflatoxin

- Ngoài hai loài Asp flavus và Asp parasiticus còn có một số loài khác cũng

có khả năng sinh aflatoxin nhưng yếu hơn như Asp nominus (C.P Kurtzman và ctv, 1987) và Asp bombycis (S.W Peterson và ctv,2001)

Bảng 1.2 Một số loài nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin

B1 B2 G1 G2

Nguồn: Phạm Hoàng Thái, 2007

- Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh độc tố aflatoxin như chủng nấm mốc, nhiệt độ, hoạt độ của nước, các yếu tố môi trường…

- Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích, và cực đại cho sự tạo aflatoxin là 120C, 270C

và 40 – 420C theo thứ tự Một số chủng nấm mốc bị mất hoạt tính sau nhiều lần cấy chuyển liên tiếp trên môi trường không thích hợp, nhưng khả năng sinh độc tố cũng

có thể tăng khi chủng nấm mốc được cấy chuyển trên môi trường thích hợp

- Môi trường có bổ sung nấm men hoặc peptone hoặc là các axit amin cùng với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH=5 – 5,4; nhiệt độ 26 – 280C) là điều kiện tốt nhất cho sự tạo thành độc tố aflatoxin

1.2.4 Cơ chế gây độc của aflatoxin

- Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào Sự liên kết này gây ức chế enzym polymerase của RNA Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp RNA và ức chế polymerase t-RNA Đây là nguyên nhân gây hạn chế sự tổng hợp protein trong tế bào Người ta cũng đã chứng minh rằng vòng α,β -lacton không bão hòa có trong phân tử aflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung thư và cũng chính vòng lacton này gây ức chế tổng hợp DNA trong nhân tế bào,

do đó nó làm rối loạn tăng trưởng bình thường của tế bào (M.F.Nexterin và V.I.A Vixarinova, 1971, trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)

- Để có thể gây độc với tế bào gan cũng như tạo khối u, aflatoxin phải trải qua một quá trình biến đổi sinh học phức tạp, tạo thành dạng 2,3 – dihydrodiol (aflatoxin B1 – dhd) ở trong gan Theo Neal và cộng sự (1981), hợp chất này là nguyên nhân gây hủy hoại gan rất nhanh Nhóm dialdehyde phản ứng với nhóm amin của protein để tạo thành kiềm ship (Shiff’s base), gây ức chế sinh sinh tổng hợp DNA và gây nhiễm độc cấp tính (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan

(Cliford và Rces,1967 trích dẫn bởi bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003)

- Thận cũng bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó khăn Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng

- Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng trong thức ăn Đôi khi cũng thấy tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn

- Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể

Do đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thường, có thể gây tử vong cho thú

- Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản

- Làm giảm sự thèm ăn đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mất mùi thức ăn

- Làm thay đổi thành phần dinh dưỡng có trong thức ăn, giá trị dinh dưỡng bị

hạ thấp, làm vật nuôi chậm phát triển

- Làm giảm thấp sự sinh trưởng và giá trị kinh tế của vật nuôi Hậu quả cuối cùng là có thể gây chết cho vật nuôi

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý

ở vật nuôi (Allcroff, 1969 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003)

Loại gia súc

Lượng aflatoxin trong thức ăn hằng ngày (mg/kg)

Thời

kỳ nuôi dưỡng (tuần)

Tổn thương gan

Ảnh hưởng tới phát triển và hiệu quả thức ăn

Lợn

(20-70kg)

0.14 0.28 0.41

12

12

12

Trung bình Nhẹ Nhẹ

Bình thường Giảm sút Giảm sút Lợn

Gà thịt

(1 ngày tuổi)

0.2 0.42 0.5

7

7

7

Nhẹ Nhẹ Nặng

Giảm trọng lượng trong 3 tuần Vịt

Đặc điểm điển hình nhiễm aflatoxin

Giảm trọng lượng, chết 50%

1.2.6 Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin

- Trước thực trạng nhiễm aflatoxin trên lương thực, thực phẩm ở mức độ cao cũng như tính độc của aflatoxin đối với động vật kinh tế và ảnh hưởng của nó đối với sức khỏe con người, nhiều quốc gia trên thế giới đã có những quy định giới hạn aflatoxin nhiễm trong lương thực, thực phẩm

Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin ở một số nước theo tiêu chuẩn của FDA

Nước Giới han Aflatoxin

cho phép Loại thức ăn

Mỹ

20 ppb Bột ngô sử dụng làm thức ăn cho gia súc,

gia cầm ở tất cả các giai đoạn khác nhau

20 ppb

Hàm lượng tối đa cho phép trong thức ăn cho gia súc, gia cầm hoặc trong nguyên liệu bột ngô

Châu Âu 5 ppb Thực phẩm sử dụng cho người

Thực phẩm chế biến từ lạc bao gồm tổng số tất cả các loại độc tố aflatoxin B1, B2, G1,

G2

Úc 15 ppb Thực phẩm chế biến từ dầu đậu tương và

lạc

Nhật

10 ppb Cho tất cả các loại thực phẩm chứa B1

100 ppb Cho các loại nguyên liệu chế biến thức ăn

chăn nuôi

Châu Á 30 ppb Tất cả các loại lương thực, thực phẩm

120 ppb Trong các sản phẩm từ lạc

- Tại Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn cũng đã ra quy định

về hàm lượng tối đa aflatoxin B1 và hàm lượng tổng số các aflatoxin (B1+ B2 + G1+

G2) được tính bằng mg trong 1kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc, gia cầm

Bảng 1.5 Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên

liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam (Tài liệu của Vụ KHKT và CLSP Bộ Nông nghiệp và PTNT)

B1 tối đa (ppb)

Tổng số Aflatoxin

B1 + B2 + G1 +

G2 (ppb) Ngô hạt

Sắn khô

Đậu tương

Cám gạo

Bột cá

Thức ăn cho gà (1 – 21 ngày tuổi)

Thức ăn cho gà (nhóm còn lại)

Thức ăn cho vịt (1 – 21 ngày tuổi)

Thức ăn cho vịt (nhóm còn lại)

Thức ăn cho lơn con (1 – 60 ngày tuổi)

Thức ăn cho lợn (nhóm còn lại)

Bò nuôi lấy sữa

chóng của Aspergillus flavus Trong điều kiện thuận lợi, Asp flavus có thể tăng

nhanh chỉ sau 3 – 7 ngày bảo quản

- Nhiễm độc aflatoxin ở lợn là một vấn đề quan trọng, gây thiệt hại khá lớn cho ngành chăn nuôi Tại miền Bắc Carolina – Mỹ, theo nghiên cứu của Smith (1976) trong số 94 trường hợp phát hiện aflatoxin có trong thức ăn chăn nuôi thì có đến 83 trường hợp gây ngộ độc ở lợn, 7 trường hợp ở bò và 4 trường hợp ở gia cầm Hàm lượng aflatoxin trung bình có trong thức ăn chăn nuôi là 389 ppb và ở ngô nguyên liệu làm thức ăn là 518 ppb (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003)

- Ở khu vực Đông Nam Á, theo nhận xét của Ginting (1985) và Widiastut (1988), ngô và thức ăn cho gia cầm nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên tới 200 ppb

Ở Úc, theo Barry J Balaney, trong 161 mẫu thức ăn cho gia cầm được phân tích thì

có 13 mẫu chứa aflatoxin, trong đó có 4 mẫu nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên đến

50 ppb (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003)

1.2.8 Phương pháp phát hiện aflatoxin:

1.2.8.1 Phương pháp pha ́ t quang sinh học:

- Dùng tia cực tím tạo ra huỳnh quang màu vàng xanh sáng từ acid kojic (acid này được tạo ra do cùng một loại nấm sản sinh aflatoxin, chỉ gián tiếp phát hiện sự

có mặt của aflatoxin) Phương pháp này không thông dụng vì ít chính xác

1.2.8.2 Phương pháp "ELISA test":

- Dựa trên nguyên tắc kháng thể kháng nguyên p hát hiện aflatoxin (và các độc

tố khác) thông qua những phương tiện phát hiện nhanh, rẻ, dễ thực hiện, sử dụng kháng thể để "bắt" (có lựa chọn) độc tố đặc biệt đã được tách chiết từ hạt hay các thành phần của thứ c ăn Sau khi chiết, sẽ sử dụng bộ kiểm tra và thêm chất chỉ thị màu Cường độ màu sắc sẽ chỉ thị có độc tố hay không

1.2.8.3 Phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí

 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromatographi-TLC )

- Phương pháp sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960 Người ta sử dụng các bản mỏng được tráng bởi silicagel để xác định aflatoxin

- Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là chloroforin: methnol và choloroform: aceton Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin

- Hệ dung môi gồm nước: aceton: chloroform (1.5:12:88 v/v) được đánh giá

có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất Các bản mỏng đã được chảy qua các dung môi chạy được đưa vào bởi đèn tử ngoại (UV) 365nm Các vết mẫu phân tích tạo màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây Và có độ dài Rf được so sánh với các vết của aflatoxin tiêu chuẩn Phương pháp này có thể được xác định lượng từ 0.3-0.4 mg

- Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc vào người phân tích Khi so sánh giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả từ 20-30%

- Hội hóa học phân tích (A.O.A.C-1980) đã lưu ý tới phương pháp phân tích định lượng sử dụng TLC Phương pháp này được mở rộng thành chương trình phân tích mẫu của tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới Các kết quả của chương trình phân tích trên đã chứng nhận sự chính xác của phân tích bằng TLC vì sai số rất cao

Khẳng định sự có mặt của aflatoxin:

- Một số chất được tách ra từ mẫu đôi khi dễ nhầm lẫn với aflatoxin, dẫn đến

sự khẳng định sai lệch Phương pháp khẳng định sự có mặt của aflatoxin trực tiếp thực hiện trên bản sắc kí Dựa vào sự biến đổi của aflatoxin thành các đồng phân có màu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban đầu, cả aflatoxin chuẩn và aflatoxin

có trong mẫu phân tích đều chuyển sang cùng một đồng phân

- Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin trong mẫu phân tích được phát hiện bởi Przybylski (1975) và Verhulsdonk (1977) và được hội phân tích hóa

học Hoa Kì (A.O.A.C) công nhận

- Aflatoxin B1 được được acid hóa để trở thành đồng phân aflatoxin B2a Đồng phân này có màu huỳnh quang màu xanh và có độ dài Rf thấp hơn so với độ dài Rf của aflatoxin B1 Theo phương pháp của Przybylski, aflatoxin Bi được chuyển thành aflatoxin B2a nhờ acid Tryfloacetic (TFA) phun trực tiếp lên các bản mỏng trước khi chạy trong dung môi

- Acid sufuric làm thay đổi màu huỳnh quang xanh da trời của aflatoxin B1 thành màu vàng Thử nghiệm này nhằm khẳng định sự không có mặt của aflatoxin nếu vết nghi ngờ không chuyển thành màu vàng

 Sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao (high ferformane thin layer

- Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (UV) và xác định cường độ huỳnh quang

- Mẫu phân tích được tách bằng chloroform: nước Ly tâm chất tác dụng làm sạch qua silicagel pha bình thường sử dụng cột nhồi silicagel 0.5m và pha động sử dụng benzen: acetonitrit: acid formic Giới hạn xác định là 0.5  m/kg

- Husst (1984) đã sử dụng pha phản kết hợp với TFA đồng phân để xác định được các Aflatoxin B1, B2, G1, G2 ở nồng độ 5pg

- Davis (1980) cũng sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang của đồng

phân iot của Aflatoxin B1

tử ngoại (uv) để xác định màu huỳnh quang xanh chỉ ra sự có mặt của aflatoxin

- Nhiều tác giả như Davis và cộng sự (1981), Holaday (1976), Holaday và Lansden(1975) đã cải tiến phương pháp này nhằm phát hiện nhanh aflatoxin trong mẫu Phương pháp cột mini của Romes (1975) đã được A.O.A.C (1980) công nhận Aflatoxin được tách bằng aceton và nước (85: 45), các chất tạp được loại trên gel cacbonat đồng và chloric sắt Sau đó, aflatoxin được tách ra bằng một pha nước với chloroform

- Chloroform tách được đưa vào cột có chứa một lớp bột nhôm trung tính, silicagel và florisil ở phía dưới, sunfat canxi khô ở cả trên và dưới Cột được chạy trong choloroform và aceton (9:1) để giữ aflatoxin trên đỉnh của lớp flosisil

1.3 Phương pháp khử nhiễm aflatoxin:

1.3.1 Phương pháp vật lý học:

- Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể Nếu nhiệt

độ không khí nóng đưa vào là 100 - 1450

C ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thể giảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb

- Nếu tăng nhiệt độ lên tới 1650C có thể làm cho lượng aflatoxin B1 giảm từ

66 - 67%.(Lee, 1969; Waltking, 1971; Elkady, 1981; Frank, 1974; trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

- Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: phương pháp hấp ướt ở nhiệt

độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn Quá trình này phá hủy nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin Theo Rehana (1979) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 400 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 1200C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68% Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 1200C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin (Rehana, 1979 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

- Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: các chất hấp phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: than hoạt tính, một số polymer hữu vô cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone) Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra ngoài (Charmley, 1994; trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

- Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: đây là phương pháp có thể áp dụng đối với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác có hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thành phần dinh dưỡng của thức ăn

- Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan – metanol, hexan – etanol, hexan – etanol - nước,

và hexan –aceton - nước Hệ thống bao gồm 54% aceton, 44% hexan và 2% nước

loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40μg/kg.

- Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím Ở bước sóng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại Okonkwo (1978) nhận thấy, lượng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30%

và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

1.3.2 Phương pháp hóa học:

- Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: các chất oxy hóa-khử như natrihypochloride (NaOCl), hydroperoxide (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính của aflatoxin Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin Khí ozon (O3) cũng được thử nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin

- Phương pháp sử dụng các chất kiềm: hydroxit amon (NH4OH) và hyroxit natri (NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vô hoạt afaltoxin Các chất này đều

có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin

- Phương pháp sử dụng khí NH3: nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâm ứng dụng hơn cả Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5% và nhiệt độ bên ngoài là 250C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200ppb có thể giảm xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp,

2003)

1.3.3 Phương pháp sinh học:

- Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh của các độc tố nấm mốc trực tiếp nhờ vi sinh vật

Bảng 1.6 Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học

Tên vi khuẩn Đối tượng Cơ chế khử nhiễm Tác giả

Bacillus pumilus Aspergillus

parasiticus

Sử dụng các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào, sinh ra trong quá

trình nuôi cấy B pumilus, ức chế

của nấm Asp parasiticus

M Ono và ctv ,1996

T Kondo và ctv, 2001

PS Yan và ctv, 2004

Tên vi khuẩn Đối tƣợng Cơ chế khử nhiễm Tác giả

Lactobacillus

casei

Aspergillus flavus

Sử dụng các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào, sinh ra trong quá

trình nuôi cấy L casei, ức chế

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian – địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: từ ngày 7 - 4 - 2014 đến ngày 30 - 6 - 2014

- Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM

2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất

2.1.1 Vật liệu

- Nguồn nấm đối kháng: là chủng nấm Aspergillus sp.X3 có khả năng tổng

hợp aflatoxin, do sinh viên Nguyễn Vân Hương phân lập được từ đậu phộng (Xem phụ lục B)

- Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn:

 Mẫu hạt đậu phộng được mua từ chợ

 Mẫu vỏ đậu phộng

 Mẫu hạt cà phê được lấy từ Đà Lạt

 Mẫu trái cà phê được lấy từ Đà Lạt

 Mẫu đât trồng rau tại Quận 12 TP Hồ Chí Minh

2.1.3 Môi trường - Hóa chất

- Môi trường Potato Dextrose Broth (PDB)

- Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)

- Môi trường tăng sinh Nutrient Broth 1 _ NB1 (bổ sung tơ nấm)

- Môi trường tăng sinh Nutrient Broth (NB)

- Môi trường Coconut Cream Agar (CCA)

- Môi trường Simmon Citrate

- Môi trường Phenol red carbohydrate broth

- Môi trường kiểm tra hoạt tính

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp luận

- Để thực hiện đề tài bước đầu phân lập vi khuẩn Bacillus spp có hoạt tính

kháng nấm, chúng tôi sử dụng hai cách tiếp cận

 Cách tiếp cận thứ nhất, vi khuẩn được phân lập từ nguồn mẫu là nông sản (hạt cà phê, đậu phộng) bị nhiễm nấm Sau đó khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn với nấm sinh aflatoxin bằng phương pháp đồng nuôi cấy

 Cách tiếp cận thứ hai, nguồn mẫu nông sản (trái cà phê, vỏ đậu phộng, đất trồng) bị nhiễm nấm, được tăng sinh trên môi trường có chứa chất cảm ứng là sinh khối nấm mốc và được sàng lọc dựa trên khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của từng mẫu tăng sinh Sau đó phân lập chủng thuần khiết và khảo sát khả năng đối kháng với nấm của dịch ly tâm canh trường của mỗi chủng thuần khiết

2.3.2 Bố trí thí nghiệm

2.3.2.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ nhất

 Pha loãng mẫu:

- Mục đích: Làm giảm mật độ vi khuẩn có mặt trong dịch tăng sinh mẫu, giúp cho việc phân lập riêng lẻ từng tế bào vi khuẩn dễ hàng hơn

- Chuẩn bị các ống nước muối sinh lý (nồng độ NaCl 0.85%) có thể tích 9ml được hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút

- Hút 1ml dịch tăng sinh cho vào ống thứ nhất chứa 9ml nước muối sinh lí, ta được dịch có nồng độ pha loãng 10-1

so với mẫu Tiếp tục hút 1ml từ ống thứ nhất cho vào ống thứ hai chứa 9ml nước muối sinh lí, ta được dịch có nồng độ pha loãng

10-2 so với mẫu Tiếp tục tiến hành tương tự cho đến nồng độ cần thiết

- Cấy mẫu phân tách khuẩn lạc riêng rẽ: tiến hành cấy trang mẫu ở các độ pha loãng 10-5,10-6,10-7 Mỗi nồng độ tiến hành cấy trang 3 đĩa, sau đó được ủ ở 370C trong 24 – 48h

- Quan sát hình thái khuẩn lạc sau thời gian ủ, ghi nhận kết quả Cấy ria làm thuần các chủng khuẩn cho hình thái khuẩn lạc khác nhau trên đĩa môi trường NA

- Khi các chủng khuẩn đã thuần tiến hành giữ giống trong ống thạch nghiêng môi trường NA hoặc giữ giống lạnh sâu trong eppendorf, phục vụ cho những thí

nghiệm tiếp theo

 Bảo quản giữ giống vi sinh vật

- Mục đích: lưu trữ và bảo quản các chủng phân lập được, đảm bảo nguồn giống để thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu có liên quan đến vi khuẩn Có thể giữ giống bằng hai cách, giữ giống ống thạch nghiêng hoặc giữ giống lạnh sâu

- Giữ giống ống thạch nghiêng: phương pháp giữ giống đơn giản, vi khuẩn được cấy trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm và đặt trong điều kiện thích hợp để phát triển Sau đó được bảo quản trong tủ mát (khoảng 3-50C) Quá trình này cần được lặp lại sau một thời gian bảo quản nhất định (tùy vào từng nhóm

vi khuẩn), đảm bảo vi khuẩn không bị chết do môi trường không còn dinh dưỡng hoặc bị già Trong nghiên cứu này, vi khuẩn được cấy lưu giữ trong ống thạch nghiêng môi trường NA (được hấp khử trùng và để nguội tạo bề mặt nghiêng) Ủ ở

370C trong 24 giờ, sau đó bảo quản trong tủ mát Tiến hành cấy chuyển định kì 1 lần mỗi tháng

- Giữ giống lạnh sâu (giữ giống eppendorf hoặc giữ giống glycerol): vi khuẩn được lưu dữ trong điều kiện lạnh sâu Trong điều kiên này, tê bào vi khuẩn có thể bị phá vỡ khi bi lạnh đông ở nhiệt độ rất thấp và khi làm rã đông, làm tan mẫu (do tế bào vi khuẩn bị hinh thành mạng tinh thể nước khi làm lạnh sâu) Để khắc phục điều này người ta bổ sung chất làm giảm tốc độ lanh đông và rã đông như glycerol

Vi khuẩn không thể tiến hành trao đổi chất như bình thường nhưng vẫn tồn tại trong chất bảo quản Thời gian lưu giữ của phương pháp này thường là khá dài (có thể từ 3-5 tháng) Trong nghiên cứu này, vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường NB trong 24 giờ, hút 2ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf Sau đó ly tâm (4000 vòng/ phút trong 15 phút), loại bỏ dich trong thu sinh khối còn lại trong eppendorf Bổ sung 0.9 ml nước muối sinh lí rồi trộn đều Bổ sung 0.6 ml glycerol rồi tiếp tục trộn đều Cuối cùng tiến hành bảo quản lạnh sâu ở nhiệt độ -15oC (Lưu ý: eppendorf,

 Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm bằng phương pháp đồng nuôi cấy trên môi trường hỗn hợp

- Mục đích: khảo sát khả năng ức chế nấm mốc của các chủng vi khuẩn phân

lập Từ đó chọn ra những chủng khuẩn có khả năng tiết ra hoạt chất kháng nấm

 Khi thạch đã đông, bơm 0.1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn vào đĩa Trang đều trên bề mặt thạch Đối chứng là đĩa môi trường chỉ cấy nấm và không bơm dịch tăng sinh vi khuẩn

 Cấy nấm mốc vào giữa đĩa môi trường đã trang dịch tăng sinh vi khuẩn Ủ 300C trong 4 ngày Đọc kết quả dựa vào sự phát triển của nấm mốc trong đĩa thí nghiệm và đĩa đối chứng chỉ cấy nấm

 Khảo sát khả năng đối kháng với nấm của dịch ly tâm canh trường nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường hỗn hợp

- Mục đích: khảo sát khả năng ức chế nấm mốc của sản phẩm trao đổi chất có mặt trong canh trường tăng sinh các chủng vi khuẩn phân lập Từ đó chọn ra những

chủng khuẩn có khả năng tiết ra hoạt chất kháng nấm

 Khi đĩa môi trường hỗn hợp đã đông, cấy nấm mốc vào tâm đĩa môi trường Đồng thời đục lỗ thạch ở 4 góc cách đều điểm cấy nấm Sau đó ủ đĩa ở 300C trong 24h

 Dịch tăng sinh vi khuẩn sau 24h được đem đi li tâm ở 10000 vòng/phút trong 15 phút Thu dịch trong và loại bỏ sinh khối Tiến hành bơm 0.1ml dịch sau li tâm vào 4 lỗ của đĩa thạch đã ủ nấm được 24h Đối chứng là đĩa nấm không thêm vào dịch li tâm ở 4 giếng thạch Sau đó đĩa được tiếp tục ủ 300C trong 72h Đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm mốc trong đĩa thí nghiệm

và đĩa đối chứng chỉ cấy nấm

2.3.2.2 Phân lập và tuyển chọn các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ hai

 Xử lí mẫu:

- Mục đích: Loại bỏ các tế bào vi khuẩn không có khả năng sinh bào tử, giữ lại những vi khuẩn có khả năng sinh bào tử tồn tại trong mẫu

- Cân chính xác 1 gam mẫu, sau đó tiến hành xử lý nhiệt 800C trong 10 phút

 Phương pháp nuôi cấy thu tơ nấm

- Mục đích: thu nhận tơ nấm để bổ sung vào môi trường, tạo nguồn cơ chất

cảm ứng cho các vi khuẩn có thể sử dụng được

- Tiến hành:

 Môi trường sử dụng là môi trường PDB, được phối vào mỗi bình tam giác 10ml, hấp khử trùng 1210C, 1atm trong 15 phút

 Dùng que cấy thu bào tử nấm từ ống thạch nghiêng, cấy vào các bình

môi trường PDB, lắc tăng sinh 150 vòng / phút trong 24 giờ

 Lọc dịch nuôi cấy, thu nhận tơ nấm Hòa trộn vào nước cất tạo huyền phù tơ nấm (10 g/l) Hấp khử trùng và bảo quản ở tủ mát (4-60

C)

 Tăng sinh:

- Mục đích: Phục hồi những vi khuẩn còn lại trong mẫu sau quá trình xử lý mẫu Đồng thời tăng lên số lượng các chủng khuẩn có khả năng đối kháng vói nấm mốc, do trong môi trường ta có bổ sung thêm tơ nấm mốc được xem là chất cảm ứng

- Môi trường sử dụng là môi trường NB1 được hấp khử trùng ở 1210

C, 1atm trong 15 phút

- Mẫu được xử lí xong cho vào bình tam giác chứa 9ml môi trường NB1 đã hấp khử trùng Tăng sinh lắc ở 150 vòng/phút trong 48h

 Ly tâm loại bỏ dịch trong:

- Mục đích: phá vỡ tế bào các chủng khuẩn có mặt trong dịch tăng sinh Chỉ thu nhận các hợp chất có khả năng kháng nấm sinh ra trong giai đoạn tăng sinh

- Hút 2ml dịch tăng sinh sau 48 giờ cho vào eppendoft, li tâm ở 10000

vòng/phút trong 15 phút Thu dịch trong và loại bỏ sinh khối (Lưu ý: eppendoft và