Nghiên Cứu Trích Ly Và Định Lượng Charantin Từ Khổ Qua Rừng

Bên cạnh đó Charantin còn là một hợp chất từ tự nhiên có khả năng điều trị bệnh đái tháo đường căn bệnh được quan tâm nhiều hiện nay Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM

LỚP: 12DTP01

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 06 năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Thành công là thứ mà tất cả chúng ta đều muốn có Nhưng nó không đến dễ dàng và chỉ trong một sớm một chiều Nó đòi hỏi phải làm việc chăm chỉ, thời gian và sự kiên trì Không chỉ thế, để đạt được sự thành công không chỉ nhờ vào nỗ lực của riêng bản thân mình Mà còn có cả những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của những người khác Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè Em xin cám ơn trường đại học Công nghệ Tp.HCM, quý thầy cô ngành Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã giảng dạy và trang bị kiến thức cho em suốt 4 năm đại học.Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Bùi Đức Chí Thiện, người thầy đáng kính đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, tận tình quan tâm và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp Em cũng xin cảm ơn các thầy cô trong phòng thí nghiệm đã quan tâm giúp đỡ em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này Em xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè đã luôn nhiệt tình giúp

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

TPHCM, ngày 7 tháng 8 năm 2016

Bùi Đức Chí Thiện

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

TPHCM, ngày 7 tháng 8 năm 2016

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài: 1

2 Mục đích nghiên cứu 1

3 Đối tượng và khách thể nghiên cứu 1

4 Giả thuyết nghiên cứu 2

5 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

6 Phương pháp nghiên cứu 2

7 Phạm vi nghiên cứu 3

CHƯƠNG I : 4

TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU 4

1.1 Lịch sử nghiên cứu vấn đề 4

1.1.1 Công trình nghiên cứu trong nước: 4

1.1.2 Công trình nghiên cứu nước ngoài: 6

1.2 Đặc điểm cơ bản của đối tượng và khách thể nghiên cứu 7

1.2.1 Đối tượng nghiên cứu: 7

a Giới thiệu chung 7

b Phân loại khoa học 8

c Nguồn gốc và phân bố 9

e Đặc điểm thực vật học: 10

f Tính chất sinh vật học: 11

g Thành phần hóa học: 12

1.2.1.1 Công dụng của khổ qua: 13

1.2.1.2 Các mặt có hại 14

1.2.2 Khách thể nghiên cứu: 15

1.3 Cơ sở lý thuyết của các phương pháp 17

1.3.1 Phương pháp trích ly 17

1.3.1.1 Phạm vi sử dụng 18

Trong công nghệ thực phẩm nhằm các mục đích sau: 18

1.3.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly 18

a Loại dung môi : 18

b Nồng độ dung môi chiết xuất 19

c Kích thước vật liệu 19

d Nhiệt độ trích ly 19

e Tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi dùng trong trích ly 20

f Thời gian trích ly 20

1.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ( HPLC) 21

1.3.4.1 Định nghĩa 21

1.3.4.2 Hệ thống HPLC 22

1.3.4.3 Phân loại Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại: 22

1.3.4.4 Chuẩn bị mẫu đo 23

1.3.4.5 Nguyên tắc hoạt động: 23

CHƯƠNG II 25

PHƯƠNG PHÁP VÀ NGUYÊN LIỆU 25

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu: 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu: 27

2.4 Các thí nghiệm khảo sát 27

PHỤ LỤC 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Khổ qua rừng 7

Hình 2: Hoa mướp đắng 9

Hình 3: Quả mướp đắng 10

Hình 4: giây mướp đắng 10

Hình 5: Quả mướp đắng 11

Hình 6: β-Sitosterol-3-O-β-glycoside 11

Hình 7: 3-O-β-D-Glucosylstigmasta-5,25(27)-diene 11

Hình 13: Máy HPLC 24

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: thành phần hóa học trên 100g một trái mướp đắng 12

Bảng 2: Kết quả màu dịch chiết thay đổi theo thời gian 33

Bảng 3: Sự biến đổi màu sắc dịch trích ở những loại dung môi khác nhau 36

Bảng 4: Kết quả màu dịch trích 39

Bảng 5: Màu sắc của dịch trích biến đổi theo từng tỉ lệ 42

Bảng 6: Màu của dung dịch thay đổi theo nhiệt độ 45

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài:

Ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đã có rất nhiều loại thuốc kháng sinh được sản xuất để điều trị bệnh tiểu đường như Cadirogyn, Metformin, song những thuốc ấy đều có những mặt hạn chế nhất định đôi khi có ảnh hưởng không tốt đối với bệnh nhân như làm hạ đường huyết, dị ứng thuốc, gây rối loạn tiêu hóa, tác dụng phụ lên gan thận, giữ nước và có thể có tác động xấu đối với bệnh nhân bị bệnh tim Do vậy việc quay về sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên vừa có khả năng chữa bệnh vừa có khả năng cung cấp chất dinh dưỡng là vấn đề được quan tâm Trong đó khổ qua rừng hay còn gọi là Momordica L có chứa hoạt chất Charantin có khả năng hạ đường huyết đã được báo cáo trong động vật thực nghiệm (Grover và Yadav, 2004; Krawinkel và Keding, 2006)1 Bên cạnh đó Charantin còn là một hợp chất từ tự nhiên

có khả năng điều trị bệnh đái tháo đường căn bệnh được quan tâm nhiều hiện nay Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu trích ly charantin từ trái khổ qua rừng song vẫn còn nhiều mặt hạn chế về dung môi còn nhiều điểm chưa thích hợp Các công trình nghiên cứu trước đây sử dụng các loại dung môi trích ly là chloromethane

và chlorofom là 2 loại dung môi tách chiết Charantin tốt song đây là 2 loại dung môi độc hại không tốt đối với việc sử dụng để trích ly chất làm thuốc chữa bệnh Do đó đề tài của tôi nghiên cứu cải thiện nhược điểm này là sử dụng loại dung môi vừa lành tính không độc hại đối với cở thể người và vừa có khả năng trích ly Charantin tốt hơn 2

loại dung môi cũ, những điều ấy đã thúc đẩy tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu trích ly và

định lượng charantin từ khổ qua rừng (mướp đắng)”

2 Mục đích nghiên cứu

Với mục đích nghiên cứu nhằm giúp người bệnh đái tháo đường có thể sử dụng loại thuốc vừa có khả năng làm giảm đường huyết vừa không có tác dụng phụ,

3 Đối tượng và khách thể nghiên cứu

a Đối tượng nghiên cứu

Đề tài này tôi sẽ nghiên cứu về việc trích ly hợp chất Charantin từ khổ qua rừng là một hợp chất có khả năng làm giảm lượng đường huyết đối với người tiểu đường túyp

2

b Khách thể nghiên cứu

Những người bị bệnh đái tháo đường túyp 2 luôn phải ăn kiêng các loại thức ăn chứa nhiều tinh bột như cơm, vì khi tinh bột vào cơ thể enzyme amylase trong cơ thể sẽ thủy phân tinh bột tạo thành đường glucose hấp thụ vào máu và điều này là không tốt đối với người bị tiểu đường Việc nghiên cứu ra phương pháp giúp cơ thể giảm tốc

độ thủy phân tinh bột thành đường, nhằm giúp người bị bệnh đái tháo đường có thể sử dụng được tinh bột, ăn các sản phẩm có tinh bột một cách bình thường là hết sức cần thiết

4 Giả thuyết nghiên cứu

Việc nghiên cứu này sẽ có thể giúp cho việc trích ly Charantin từ khổ qua rừng trở nên dễ dàng hơn Ngoài ra còn có thể tạo điều kiện có lợi cho việc điều chế và tinh sạch charantin để chế tạo thành loại thuốc hạ đường huyết dành cho người tiểu đường

từ thiên nhiên thay thế cho isullin

5 Nhiệm vụ nghiên cứu

Nhằm nghiên cứu trích ly Charantin từ khổ qua rừng với dung môi lành tính không gây độc hại đối với sức khỏe con người và việc trích ly cho năng suất cao hơn với nhiệt độ và thời gian phù hợp để dung môi đạt được hiệu suất trích ly tốt nhất

Sử dụng loại dung môi lành tính hơn chloromethane và chlorofom đó là ethanol được đề xuất2 Sử dụng Ethanol là cách trích ly hiệu quả các hợp chất Việc sử dụng dung môi ethanol để trích ly bị ảnh hưởng nhiều bởi các yếu tố xung quanh như nhiệt

độ, thời gian, tỉ lệ dung môi trích ly Để có sự trích ly hợp chất Charantin tốt nhất cần phải làm các thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng nêu trên Bước trích ly này là quan trọng và có ảnh hưởng đến việc tinh sạch charantin sau này

6 Phương pháp nghiên cứu

Ở đây tôi sử dụng các phương pháp:

– Phương pháp nghiên cứu và tổng hợp tài liệu

– Phương pháp quan sát

2 Motonobu Goto, Mitsuru Sasaki, New approach for extraction of charantin from Momordica charantia with pressurized liquid extraction, January 2007

– Phương pháp trích ly

– Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ( HPLC) ( để định lượng)

– Phương pháp tổng kết kinh nghiệm ( đối với phần định tính charantin và dử dụng loại dung môi trích ly)

7 Phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là khổ qua rừng loại trái còn tươi Khảo sát các ảnh hưởng tới việc trích ly về dung môi , thời gian, nhiệt độ và tỷ lệ dung môi xác định để trích ly được charantin tốt nhất

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU 1.1 Lịch sử nghiên cứu vấn đề

1.1.1 Công trình nghiên cứu trong nước:

Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng khổ qua để làm giảm hàm lượng đường trong máu trên động vật và một số ở người Theo đó biểu hiện lượng đường máu giảm được ghi nhận sau khi uống 30 phút, đạt cực đại sau 4 giờ và kéo dài 12h Một thí nghiệm tiêm dịch chiết mướp đắng trên các bệnh nhân đái đường Type 1 (injections of bitter melon extract) Kết quả cho thấy sau tiêm 30-60 phút hàm lượng đường glucose trong máu

giảm 21,5%, 4-12 giờ giảm 28% so với hàm lượng đường cơ sở trong máu (Baldwa,

độ HbA1c ( phức hợp hemoglubin với đường glucose hay glycosylated hemoglobin) giảm từ 8,37 xuống đến 6,95 Đây là những kết quả đầy hứa hẹn đối với những bệnh

nhân đái đường (Srivastava,Y , và cs, 1993)

Nghiên cứu trong ống nghiệm cho thấy dịch chiết khổ qua gây ức chế sự xâm nhập

tế bào của virus HIV, giảm sự lây nhiễm của tế bào lympho T với virus này Đồng thời dịch chiết mướp đắng cũng gây ức chế sự phát triển của một số chủng loại virus khác,

(Wang, Y., và cs, 1999; Baby Josephvà D Jini , 2004)

Khổ qua có chứa một loạt hóa chất hoạt tính sinh học bao gồm triterpenes, protein,

và steroid Trong đó một số hoạt chất đã được kiễm chứng lâm sàng có khả năng ức

chế các menguanylate cyclase mà được cho là có liên quan đến nguyên nhân gây ra

bệnh vẩy nến và cũng cần thiết cho sự phát triển của bệnh bạch cầu và ung thư tế bào Ngoài ra, một loại protein được tìm thấy trong mướp đắng, cũng đã được kiễm chứng

lâm sàng có hoạt tính chống u lympho Hodgkin ở động vật

Các protein khác trong khổ qua như alpha và beta-momorcharin và cucurbitacin B được thử nghiệm và đều cho thấy có khả năng chống khối u Các protein của khổ qua

đã được chiết xuất và đặt tên là "MAP-30”, sản phẩm đã được cấp bằng sáng chế MAP-30 có thể ức chế sự phát triển khối u tuyến tiền liệt Hai trong số các protein alpha-và beta-momorcharin có khả năng ức chế virus HIV Nghiên cứu trong ống nghiệm với tế bào nhiễm HIV được điều trị bằng alpha và beta-momorcharin cho thấy kháng nguyên của virus bị bất hoạt hoàn toàn, trong khi các tế bào khỏe mạnh không

bị ảnh hưởng từ đó các nhà nghiên cứu đưa ra kết luận là sản phẩm MAP-30 hữu ích

cho việc điều trị khối u và nhiễm HIV (Fan, J., và cs, 2009; Jiratchariyakul, W., và

cs, 2001)

Tác giả Phạm Văn Thanh cùng cộng sự của viện Dược liệu đã thống kê và khảo sát

sơ bộ các nhóm hoạt chất chính của cây khổ qua Tuy nhiên, các tác giả này chưa cô lập được các hợp chất có hoạt tính dưới dạng chất tinh khiết cũng như chưa xác định được cấu trúc của các hợp chất này, mà chỉ định lượng theo chất G6, một aglycon của nhóm glycoside Các tác giả Nguyễn Minh Đức và Trần Thị Vy Cầm đã chiết tách và phân lập được 4 hợp chất Mc1, Mc2, Mc3, Mc4, từ cao MeOH của hạt mướp đắng Trong đó Mc1 được xác định là Momordicoside A (1) và Mc2 đã được sơ bộ dự kiến cấu trúc Các tác giả Nguyễn Ngọc Hạnh, Phùng Văn Trung ở Viện công nghệ hóa học

và Võ Hồng Thái – trường đại học Cần Thơ đã cô lập và nhận danh được hai chất từ hạt: Momordicoside A (1) và Momordicoside B (2) và bốn hợp chất từ trái: Momordicoside K (10), Momordicoside L (11), 3-O-glucopyranosylstigmasta- 5,25(27)-diene và 23-O-β-D-allopyranosyl 5β,19-epoxycucurbita-6,24-diene- 3β,22,23ξ-triol 3-O-β-D-allopyranoside

Theo tạp chí Dược liệu, tập 6, số 2 + 3/2001, nhóm tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, ðoàn Thị Nhu, Nguyễn Thượng Dong, Vũ Kim Thu, Nguyễn Kim Phượng,

Lê Minh Phương đã Nghiên cứu thành phần hóa học cây khổ qua Nhóm này chứng minh tác dụng hạ ñường huyết của cây khổ qua trên thỏ gây gây đái tháo ñường là do

sự hiện diện của các glucosid có trong trái khổ qua

Một số kết quả nghiên cứu bước đầu về mặt thực vật của cây khổ qua trồng ở Việt Nam của nhóm tác giả Phạm Văn Thanh, Nguyễn Tập

1.1.2 Công trình nghiên cứu nước ngoài:

Trên thế giới có nhiều cuộc nghiên cứu trích ly charantin từ khổ qua bằng nhiều loại dung môi khác nhau như: chloromethane , chlorofom ,ceton và ethanol

Charantin được Lotlikar và Rao trích ly lần đầu tiên vào năm 1962 với hàm lượng khoảng 0,01% Đến năm 1965, Sucrow đã xác định đây là một hỗn hợp của hai steroid glycoside có tỉ lệ khối lượng 1:1 là 3-O-[-D-glucopyranosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene

và -sitosterol-3-O D-glucoside Với trọng lượng phân tử 9,7kDa và khối lượng phân

tử là 578,494 Charantin trong được xem là thành phần chính trong khổ qua có khả năng ổn định đường huyết

Nghiên cứu trích ly charantin từ khổ qua sử dụng ethanol với nguyên liệu khô xem xét 2 yếu tố: Nhiệt độ (50 -150oC) Các điều kiện khai thác tối ưu được tìm thấy có nồng độ cồn ethanol 50% và nhiệt độ trích ly 150 ° C Theo các điều kiện tối ưu, giá trị năng suất glycoside steroid thực nghiệm là 10,23 mg / 50 g khổ qua, khá gần với giá trị dự đoán (12.03mg.50 g khô mướp đắng) 3

Nghiên cứu trích ly charantin từ khổ qua trái khô: Trộn bột nghiền từ trái khô với Pet.ether (bp "-80'C 60) và hồi lưu (6) giờ và sau đó được lọc Các bã được trộn lăp lại một lần nữa với Petether trong (6) giờ và lọc Các bã được trộn với 80% cồn và chiết xuất ở nhiệt độ hồi lưu bằng tháp chưng cất trong (6) giờ và sau đó được đem đi lọc Dịch lọc được bazo hóa với dung dịch KOH đến pHIO và giữ cho (48) giờ Dung dịch thu được pha loãng với nước và chiết xuất với diethyl ether Phần diethyl ether được rửa bằng nước, và sau đó pha loãng với axit hydrochloric pha loãng, và một lần nữa với nước Natri sulfat khan đã được thêm vào phần diethyl ether và giữ qua đêm Các ether được lọc và tập trung để có được cặn (dầu thô charantin) Dư lượng được hòa tan trong số tiền tối thiểu của rượu và giữ trong tủ lạnh Các tinh thể được lọc, và các tinh thể đã được kết tinh với rượu etylic.4

Người ta đã tìm thấy khoảng hơn 200 hợp chất có trong cây khổ qua và được thống

kê sơ bộ thành các nhóm chính như sau:

– Triterpene

3 Extraction of steroidal glycoside from small-typed bitter gourd (Momordica charantia L.)

4 Phytoehemical Studies OH Momordica spp Linn, and Extraction and Isolation of Charantin from the fruit of M.charantia L

Theo nhóm nghiên cứu của trường đại học Deakin ở Australia Phân tích thành phần hóa học của quả khổ qua cho thấy dịch chiết của quả khổ qua trong CHCl3 - Metanol có chứa lipid, axit béo, amino axit, protein, chất khoáng

Theo ông Hikaru Okabe và các cộng sự của ông đã Cô lập và nhận danh được một

số triterpen glycoside từ quả và hạt của cây khổ qua

1.2 Đặc điểm cơ bản của đối tượng và khách thể nghiên cứu

1.2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Hình 1: Khổ qua rừng

a Giới thiệu chung

Tên gọi khác: Ổ qua rừng, mướp đắng rừng, lương qua, cẩm lệ chi

Tên tiếng Anh: wild bitter melon, wild bitter gourd, wild bitter squash

Tên khoa học: Momordica charantia L.,1753

Mướp đắng tồn tại ở hai dạng quần thể: mọc hoang và được trồng trọt Loại trồng trọt rất phong phú về giống nhưng đều được xếp chung vào chi khổ qua Momordica charantia L

Khổ qua rừng có vị đắng hơn, trái, lá và hoa đều nhỏ hơn so vơi khổ qua đã được lai tạo và trồng phổ biến hiện nay Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng các chất được liệu có trong khổ qua rừng cao hơn Tuy nhiên ở Việt Nam thì cả mướp đắng thông thường và khổ qua rừng đều được sử dụng như là món rau ăn hàng ngày đặc biệt

là quả của chúng Chỉ một số ít người xem khổ qua rừng là một dược liệu thiên nhiên

có tác dụng rất lớn cho sức khỏe

So với khổ qua nhà thì mướp đắng rừng rất giàu khoáng chất bao gồm kali, canxi, kẽm, magiê, phốt pho và sắt, một lượng cao vitamin C, vitamin A, vitamin E, vitamin B1, B2 và B3, cũng như vitamin B9 và là một nguồn chất xơ (dưa đắng "chuyên khảo", 2008) Giá trị chữa bệnh của khổ qua rừng đã được xem là nhờ tính chống oxy hóa cao và một phần do phenol, flavonoid, isoflavones, tecpen, anthroquinones, và

glucosinolates, tất cả các chất đó tạo nên vị đắng đặc trưng cho khổ qua (Snee,LS., va

cs, 2010; Bakare, RI., và cs, 2010 )

Có nhiều hợp chất có dược tính tìm thấy trong khổ qua như: Alkaloid, charantin, charine, cryptoxanthin, cucurbitins, cucurbitacins, cucurbitanes, cycloartenols, diosgenin, axit elaeostearic, axit lauric, axit linoleicid acid linolenic,momordenol,momordicilin,momordicins,momordicinin,momordicosides,momordin, multiflorenol, acid myristic, nerolidol, acid oleanolic, axit oleic, axit oxalic, pentadecans, peptide, axit petroselinic, polypeptide, protein ribosome khử hoạt tính protein, acid rosmarinic, rubixanthin, spinasterol, glycosides steroid, stigmasta-diol, stigmasterol, taraxerol, trehalose, chất ức chế trypsin, uracil, vacine, v-insulin, verbascoside, vicine, zeatin, riboside zeatin, zeaxanthin, và zeinoxanthin Trong đó những hoạt chất làm giảm lượng đường trong máu bao gồm hỗn hợp các saponin steroid được biết đến như charantins, peptide insulin, và ancaloit

b Phân loại khoa học

– Bộ (ordor) : bầu bí ( cucurbitales)

– Họ (familia) : bầu bí ( cucurbitaceae)

– Chi ( genus) : mướp đắng (momordica)

– Loài ( species): momordica charantin

c Nguồn gốc và phân bố

Các nhà phân loại thực vật học cho rằng mướp đắng có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, các nước Đông nam Á Ngoài ra còn có thể từ vùng châu Phi và châu Mỹ

Khổ qua là loại rau rất phổ biến ở Việt Nam và nhiều nước Châu Á khác như Ấn

Độ, Philippin, Malaysia, Thái Lan, Lào, Campuchia, Trung Quốc, Úc, châu Phi, Tây

Á, Mỹ La Tinh và vùng Caribê Loại cây này được coi là đã được thuần hoá ở châu Á như ở Bắc Ấn Độ hoặc Nam Trung Quốc bởi vì ở những vùng giáp ranh người ta đã tìm thấy quần thể hoang dại hay quần thể tự nhiên của mướp đắng Sau này mướp đắng được giới thiệu sang Tân thế giới (Nam Mỹ) thông qua việc buôn bán nô lệ và do

sự phân tán hạt khổ qua của các loài chim, sau đó phát triển rộng rãi trên khắp các lục địa Ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới từ Braxil đến Đông Nam nước Mỹ mướp đắng cũng rất phát triển

Ở Việt Nam, khổ qua được trồng khắp các tỉnh từ Bắc vào Nam, chỉ ở một số vùng núi cao và lạnh như Sa Pa (Lào Cai), Phó Bảng (Hà Giang)…thì mới không thấy có mướp đắng

d Phân loại theo giống:

Hiện nay Cây khổ qua vẫn còn tồn tại ở hai quần thể: mọc hoang và được trồng trọt Loại trồng trọt rất phong phú về giống nhưng đều được xếp chung vào chi mướp đắng ( Momordica charantin L) Tuy nhiên căn cứ vào kích thước, hình dạng, màu sắc của quả mà chia khổ qua thành hai chủng loại:

– Momordica charantin L var charantin L, trái to ( đường kính > 5cm), màu xanh nhạt, gai tù, ít đắng

Hinh 2 : trái khổ qua

– Momordica charantin L var abbreviata, trái nhỏ ( đường kính < 5cm), màu xanh đậm, gai nhọn, vị rất đắng

Hình 3: trái khổ qua

Loại mọc hoang dại còn được gọi là mướp đắng rừng trái rất nhỏ ( đường kính

< 3cm), dài 2-5 cm màu xanh, gai nhọn, vị rất đắng

Hình 4: trái khổ qua

e Đặc điểm thực vật học:

Cây khổ qua là cây dây leo, có đời sống một năm Cây được trồng bằng hạt

Đường kính dây 5-10mm, dây bò dài 5-7m ,thân màu xanh nhạt có góc cạnh, leo được

do có nhiều tua cuốn, ở ngọn có lông tơ

Lá đơn nhám mọc so le, dài 5-10cm, rộng 4-8cm, phiến lá mỏng chia thành 5-7 thùy hình trứng, mép có răng cưa đều,mặt dưới lá có màu xanh nhạt hơn mặt trên lá, gân lá nổi rõ ở mặt dưới, phiến lá có lông ngắn

Hoa màu vàng Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá Hoa đực và hoa cái cùng gốc, có cuống dài Hoa đực có đài và ống rất ngắn, tràng gồm năm cánh mỏng hình bầu dục, nhụy 5 rời nhau Hoa cái có đài và tràng hoa giống hoa đực Tràng hoa màu vàng nhạt, đường kính khoảng 2 cm

Quả hình thoi , gốc và đầu thuôn nhọn, có u sần sùi, tùy theo giống mà quả có

chiều dài ngắn khác nhau, có vị đắng Khi quả chín quả có vị đắng hơn và khó ăn hơn

Quả khi chưa chín có màu xanh hoặc vàng xanh nhạt, khi chín có màu vàng hồng Vì

thế ở Trung Quốc, mướp đắng còn có tên là hồng dương, hồng cô nương Khi chín,

quả nứt ra dần từ đầu, tách ra làm ba phần để lộ chùm áo hạt màu đỏ bên trong Khi

quả chín để lộ hạt ra ngoài Hạt khi quả chín có màu đỏ, có vị ngọt có thể ăn sống

dùng trong món xà lách

Hình 5: Hoa khổ qua Hình 6: Quả khổ qua

Hình 7: giây khổ qua Hình 8: Quả khổ qua

f Tính chất sinh vật học:

Khổ qua rừng là cây ưa ấm thuộc họ bầu bí Cây khổ qua có biên độ sinh thái

tương đối rộng, nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng là từ 20oC tới 35oC Lượng mưa hàng năm 1500mm đến 2500mm, độ cao đến 1000mm Cây chịu đựng

được nhiều đều kiện khác nhau nhưng tốt nhất là trên đất thoáng thuỷ, giàu chất hữu

cơ

Cây khổ qua có thể trồng quanh năm Cây sinh trưởng mùa mưa ra hoa 7-8 tuần sau khi gieo trồng Hoa thụ phấn chủ yếu nhờ côn trùng Sau khi trái già cây sẽ tàn lụi

và kết thúc vòng đời sau 4-5 tháng tồn tại Cần cung cấp đủ nước cho cây trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, quan trọng nhất là giai đoạn ra hoa tạo quả, giai đoạn này quyết định tất cả năng suất

Độ ẩm đất phải từ 60-70% Tránh trường hợp để ruộng khô hạn trong mùa khô và ngập úng trong mùa mưa có thể làm cho cây bị vàng úa gây rụng lá và quả sớm Mướp đắng trồng được trên nhiều loại đất khác nhau nhưng kết cấu đất phải tơi xốp, thoáng

khí, sạch cỏ, tốt nhất là loại đất thịt pha cát và ít phèn, pH thích hợp là từ 5,5- 6,5

g Thành phần hóa học:

Trong thành phần của khổ qua tuyệt đại bộ phận là nước, hàm lượng dinh dưỡng tương đối thấp Ngoài ra khổ qua còn chứa nhiều Vitamin và chất khoáng với hàm lượng đáng kể

Sau đây là bảng thành phần dinh dưỡng của mướp đắng tính trên 100g vỏ

Bảng 1: thành phần hóa học trên 100g một trái khổ qua

51 mg (13%)

16 mg (5%) 0,086 mg (4%)

36 mg (5%)

319 mg (7%)

6 mg 0,77 mg (8%) 5mg

Các thành phần khác

1.2.1.1 Công dụng của khổ qua:

• Chống các gốc tự do - nguyên nhân gây lão hóa và phát sinh các bệnh tim mạch, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, tổn thương thần kinh, viêm đường tiết niệu, tiểu đường

• Tăng ôxy hóa glucose, ngăn chặn sự hấp thu glucose vào tế bào Ức chế hoạt tính các men tổng hợp glucose

• Có tác dụng sinh học giống insulin, giúp cơ thể tăng tiết insulin, rất tốt đối với bệnh nhân tiểu đường dạng 2

• Ở dạng nước sắc, quả khổ qua rừng tươi có tác dụng chữa ho, mụn trứng cá, chữa rôm sảy ở trẻ nhỏ

• Diệt vi khuẩn và virut, chống lại tế bào gây ung thư, hổ trợ đắc lực cho bệnh nhân ung thư đang chữa trị bằng tia xạ

1.2.1.2 Các mặt có hại

Mướp đắng chống thụ thai

Các nhà khoa học đã phát hiện ra một protein trong cây khổ qua có hoạt tính chống sinh sản ở chuột đực Uống cao quả khổ qua 1,7 gam/ngày làm tinh hoàn chó đực bị thương tổn và giảm khả năng sinh tinh trùng

Ở chuột cái, tác dụng chống khả năng thụ thai thuận nghịch Chuột và thỏ có thai bị xuất huyết tử cung khi uống nước khổ qua

Hôn mê do hạ đường huyết

Tình trạng hôn mê do hạ glucose huyết là một trong những tác dụng phụ phổ biến

do ăn nhiều khổ qua

Đây là một rối loạn bệnh lý xảy ra khi nồng độ glusoce huyết thanh giảm (mức đường huyết giảm nghiêm trọng), gây ra tình trạng thiếu hụt năng lượng, buộc các tế bào não phải tìm kiếm năng lượng từ nhiều nguồn khác nhau

Để loại trừ tình trạng này, bạn cần tập thể dục thường xuyên và kiêng ăn khổ qua

Thiếu máu tan huyết

Đây cũng là một trong những ảnh hưởng tiêu cực mà khổ qua có thể gây ra Những triệu chứng thường gặp của bệnh này bao gồm hôn mê, đau bụng, đau đầu và sốt do độc tố tên là vicine gây ra

Bệnh thiếu máu tán huyết là kết quả của việc thiếu hụt máu do các enzyme không hoạt động được như bình thường

Khi bạn tiêu thụ quá nhiều mướp đắng, lượng độc tố trong loại rau này sẽ tác động đến chức năng của các enzyme, gây hại cho sức khỏe

Tăng men gan

Khổ qua có thể độc hại cho tế bào gan ở thú vật, enzym gan tăng cao sau khi dùng mướp đắng Các chất trong khổ qua có khả năng thay đổi hình dáng tế bào gan

Hạt khổ qua chứa một chất tên vicine, là một độc tố có khả năng gây ngộ độc tầm đậu (favism), một hội chứng cấp tính gồm nhức đầu, đau thắt bụng và hôn mê

Ngay cả khi cây khổ qua trồng ở những vùng thổ nhưỡng khác nhau thì thành phần trong quả cũng có tỷ lệ và sự có mặt các vi chất khác nhau

Do đó nếu cây trồng trên vùng đất có nhiễm kim loại nặng rất có thể trong quả khổ qua trồng tại vùng này bị nhiễm kim loại nặng mà gây độc cho cơ thể khi chúng ta ăn

nó

Ảnh hưởng tới sức khỏe và sự phát triển của trẻ

Không chỉ gây khó tiêu, phần ruột và hạt bên trong trái khổ qua còn chứa nhiều thành phần độc tố gây hại cho sức khỏe của trẻ am Chính vì vậy, bạn không nên cho trẻ ăn những món được chế biến từ khổ qua

Nếu muốn thay đổi khẩu vị cho bữa cơm thường ngày, cần trụng (chần) khổ qua trong nước sôi trước khi chế biến, nấu nướng

1.2.2 Khách thể nghiên cứu:

Charantin

Định nghĩa

Là một chất điển hình của mướp đắng loại triterpenoid trong khổ qua và là một chất có tiềm năng với những đặc tính trị đái tháo đường Pitiphanpone et al chứng minh rằng charantin có thể được dùng để điều trị bệnh tiểu đường và có khả năng thay thế điều trị bằng isulin Nó là hỗn hợp của hai hợp chất cụ thể là glucoside sitosteryl và glucoside stigmasteryl

Công thức cấu tạo

Hình 9 β-Sitosterol-3-O-β-glycoside

β-Sitosterol-3-O-β-glycoside là một trong những phytosterol ( sterol thực vật ) với cấu trúc hóa học tương tự như cholesterol β-Sitosterol-3-O-β-glycoside có màu trắng, bột sáp với một mùi đặc trưng Thuộc họ kỵ nước và hòa tan trong rượu

Hình 10 3-O-β-D-Glucosylstigmasta-5,25(27)-diene

3OβDGlucosylstigmasta5,25(27)diene là một saponin steroid (3β, 22 E ) stigmasta-5,22-dien-3-ol gắn liền với một β- D dư lượng -glucopyranosyl ở vị trí 3 thông qua một liên kết glycosidic Nó được phân lập từ Symplocos lancifolia Hòa tan trong methanol, Pyridine, DMSO, nước nóng,

-Tính chất vật lý :

Charantin có dạng tinh thể màu trắng, không mùi, nóng chảy ở 266–268 °C Charantin tan ít trong nước, tan nhiều trong các dung môi hữu cơ như: ethanol, acetone, hexan, chloroform…

Trọng lượng phân tử 9,7kDa

Độ tan của charantin là sự hòa tan như phân tử của glycoside steroid bao gồm cả phần aglycone và phân nửa đường Sự hiện diện của steroid chính như phần aglycone làm tăng độ hòa tan của nó trong các dung môi không phân cực như chloroform và dichloromethane trong khi sự hiện diện glucose làm cho nó ít tan trong dung môi phân cực như ethanol hay methanol Charantin là chất hòa tan trong ether

Nhiệt độ nóng chảy : 266- 268oC

Tính chất hóa học

Với thử nghiệm Libermann - Burchard ,charantin cho màu tím thay đổi sang màu xanh, màu xanh lá cây và màu vàng Khi bị thủy phân bằng axit nó tạo ra glucose và sterol.Những chất ấy cho màu xanh tím - và màu hồng khi phun với thuốc thử axit sulfuric : anisaldehyde và thuốc thử axit tương ứng: vanillin sulfuric

Tính chất dược học

Charantin được phân lập từ khổ qua có khả năng hạ đường huyết, hạ huyết áp , tác dụng tốt đối với tim mạch làm ngưng hoạt động của acetylcholin

Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng đái tháo đường của charantin trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng Alloxan:

Chọn thỏ ở cả con đực và con cái với trọng lượng cơ thể vào khoảng 1.5 – 3kg, được gây đái tháo đường bằng cách tiêm Alloxan qua tĩnh mạch với liều lượng 200mg/kg Chỉ có 4 trong 20 con còn sống sau 5 ngày được tiếp tục đem đi khảo sát

Charantin hòa tan trong Tween 80 với nồng độ 0.3% Xử lý bằng cách cho uống hoặc tiêm qua tĩnh mạch 5ml dung dịch này Mức đường huyết giảm dần từ giờ thứ nhất đến giờ thứ tư sau khi xử lý, nhưng sau đó sẽ từ từ lấy lại mức ban đầu

Hoạt tính của charantin có hiệu lực hơn 5 giờ, cao nhất ở giờ thứ tư, được ghi nhận là

có tác động như nhau ngay cả khi xử lý bằng cách cho uống hoặc tiêm qua tĩnh mạch Với liều 50mg/kg cho uống làm giảm 42% lượng đường huyết ở giờ thứ tư và giảm còn 28% ở giờ thứ năm sau xử lý Tuy nhiên khi sử dụng với liều lượng 25mg/kg cho uống sẽ cho kết quả giảm đường huyết tương tự chỉ với liều dùng 15mg/kg tiêm qua tĩnh mạch

Charantin cho hoạt tính giảm đường huyết cao hơn Tolbutamide, một loại thuốc thông thường để chữa đái tháo đường, với cùng liều dùng Mặc dù cách thức thay đổi glucose huyết khi xử lý ở cả 2 trường hợp đều giống nhau

1.3 Cơ sở lý thuyết của các phương pháp

1.3.1 Phương pháp trích ly

Quá trình trích ly là quá trình rút chất hòa tan trong chất lỏng hay chất rắn bằng một chất hòa tan khác (gọi là dung môi) nhờ quá trình khuếch tán giữa các chất có nồng độ khác nhau

Thực chất quá trình trích ly là quá trình khuếch tán Trích ly ở nhiệt độ trong phòng, không có đảo trộn xảy ra do khuếch tán phân tử, khi đun nóng hoặc có khuấy trộn gọi là khuếch tán đối lưu

1.3.1.1 Phạm vi sử dụng

Trong công nghệ thực phẩm nhằm các mục đích sau:

Khai thác là mục đích chủ yếu Phổ biến là trích ly các nguyên liệu dạng rắn như hạt dầu, các nguyên liệu tinh dầu như lá, rễ, cây, hoa hoặc quả; trích ly các loại củ như

củ cải đường, trích ly mía (một phần)

Trích ly còn nhằm chuẩn bị cho các quá trình tiếp theo, ví dụ như ngâm các loại hạt (ngô, thóc, các loại hạt…) trước khi chế biến, ngâm các loại củ (sắn, khoai, …) làm yếu các liên kết trong vật liệu đồng thời trích ly một số phần tử trong vật liệu vào dung môi ngâm (ví dụ hòa tan HCN trong khi ngâm củ sắn …)

Với mục đích thu nhận sản phẩm như tách penicilin từ dung dịch lên men, sản xuất nước chấm bằng phương pháp ủ ẩm trích ly; hoặc trích ly trong quá trình sản xuất cà phê hòa tan, trích ly khi ngâm quả, ngâm tẩm các loại thuốc bổ và thuốc chữa bệnh …

1.3.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly

– Quá trình trích ly hoạt chất hòa tan chụi ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố

– Ngoài 3 yếu tố cơ bản: quy trình công nghệ ứng dụng trong trích ly, thiết bị sản xuất và quản lý, còn có yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trích ly, đó là: loại dung môi, nồng độ dung môi, nhiệt độ trích ly, kích thước vật liệu dùng trong trích ly, tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi, thời gian trích ly

– Khi nghiên cứu về một quá trình trích ly nguyên liệu, bắt buộc phải quan tâm tới những yếu tố kể trên, kết quả nghiên cứu sẽ cho phép xác định được các thông số của qui trình công nghệ trích ly

a Loại dung môi :

– Quá trình hình thành một dung dịch tùy thuộc vào đặc tính của chất tan và dung môi Để hình thành một dung dịch, trước hết phải có sự phá vỡ các đầu mối liên kết nội trong hợp chất tan và trong dung môi, để từ đó có thể hình thành dây liên kết mới giữa chất tan và dung môi

– Chính vì thế, dung môi có thể sử dụng để trích ly một chất tan hoặc một nhóm chất tan nào đó ra khỏi nguyên liệu, là phải phù hợp với bản chất của chất mà ta muốn trích ly, phù hợp với mức độ phân cực của chất muốn trích ly

– Hay nói cách khác, dung môi khác nhau có hiệu suất trích ly khác nhau Hiệu suất trích ly phản ánh hiệu quả của một quá trình trích ly Quá trình công nghệ trích ly tốt nhất là quá trình trích ly có hiệu suất trích ly cao nhất

b Nồng độ dung môi chiết xuất

– Thực chất quá trình trích ly là quá trình khuếch tán Vì vậy sự chêch lệch nồng

độ giữa hai pha cũng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trích ly Khi sử dụng dung môi có nồng độ quá thấp hiệu suất trích ly thấp do quá trình trích ly hoạt chất hòa tan không triệt để, sản phẩm giảm thành phần các chất hòa tan, chi phí tăng, tốn nhiệt

– Nồng độ dung môi dùng trong quá trình trích ly cao thì lượng chất trích ly tăng, thời gian trích ly giảm nhưng làm tăng chi phí, lượng dung môi dư thừa Mặt khác, sử dụng dung môi nồng độ quá cao có thể gây biến đổi các chất làm ảnh hưởng xấu đến sản phẩm

– Vì thế, việc xác định nồng độ dung môi sử dụng trong quá trình trích ly là yếu

tố quan trọng cần xác định để đảm bảo hiệu suất trích ly và hiệu quả kinh tế của quá trình

c Kích thước vật liệu

– Với các loại nguyên liệu rắn, cần tăng diện tích tiếp xúc giữa chúng và dung môi Điều này được thực hiện bằng cách nghiền nhỏ, thái nhỏ, băm nhỏ vật liệu Nó còn làm phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình tiếp xúc triệt để giữa dung môi và vật liệu

– Kích thước càng nhỏ thì quá trình trích ly càng dễ, hiệu suất trích ly càng cao – Kích thước vật liệu quá lớn thì dung môi không đi vào nội phân tử, do diện tích tiếp xúc giữa dung môi và vật liệu nhỏ nên gây sự hao hụt lớn về lượng chất trích ly gây ảnh hưởng lớn đến hệ số trích ly

– Việc lựa chọn kích cỡ vật liệu trong quá trình trích ly rất quan trọng để đảm bảo hiệu suất, dễ áp dụng trong sản xuất thực tế

d Nhiệt độ trích ly

– Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, phân tử chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phân tử dung môi Tuy nhiên nhiệt độ là một yếu tố giới hạn

– Nhiệt độ quá thấp thì thời gian trích ly dài gây ảnh hưởng đến chi phí và lao động, ảnh hưởng đến hệ số trích ly

– Nhiệt độ quá cao thì sản phẩm cháy khét, các chất hòa tan bị biến đổi do xảy ra các phản ứng không cần thiết, ảnh hưởng lớn đến sản phẩm, chi phí cao cho phần cung cấp nhiệt

– Nên cần xác định nhiệt độ sử dụng trong qui trình trích ly để đảm bảo sản phẩm đạt hiệu quả về mặt chất lượng và kinh tế

e Tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi dùng trong trích ly

– Nếu tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu càng nhỏ thì quá trình trích ly xảy ra không triệt để, giảm hệ số trích ly Nếu tỷ lệ này quá lớn gây hao tổn dung môi, làm tăng chi phí vì hệ số trích ly sẽ đạt cao nhất ở một tỷ lệ nào đó nhất định và không thể tăng hơn nữa Vì vậy, khi tiến hành trích chất tan nào đó từ nguyên liệu, chúng ta phải cân nhắc giữa chi phí tổn thất cho dung môi và hiệu suất thu được để đạt lợi nhuận cao Đây cũng là một giới hạn của quá trình trích ly

f Thời gian trích ly

– Khi thời gian tăng lên, lượng chất khuếch tán tăng Tuy nhiên, thời gian phải có giới hạn, khi đã đạt được mức độ trích ly cao nhất, nếu kéo dài thời gian sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế (Kitrigin,1981)

– Cách trích và dụng cụ trích

– Có nhiều loại thiết bị trích ly: gián đoạn một bậc hoặc nhiều bậc, liên tục, tổ hợp một số nhóm thiết bị, chúng còn khác nhau về hình dáng, khác nhau về cơ cấu vận chuyển vật liệu và dung môi trong thiết bị, cơ cấu khuấy đảo, độ phức tạp của thiết bị.Tuy nhiên, thiết bị sử dụng để trích ly một nguyên liệu nào đó phải đảm bảo các yêu cầu sau:

– Trích ly triệt để các cấu tử ra khỏi hỗn hợp

– Đảm bảo trích ly ngược chiều giữa dung môi và vật liệu

– Tổn thất trong bã nhỏ nhất, nồng độ dung dịch cao, chất lượng tốt để tiết kiệm các khâu tiếp theo

– Cấu tạo đơn giản, không phức tạp, dễ lắp ráp sửa chữa, dễ thao tác (Lê Bạch Tuyết, 1996)

– Trong thực tế người ta sử dụng phổ biến hai cách trích ly sau: trích ly ở nhiệt độ nhiệt độ thường và trích ly nóng

Một số yêu cầu cơ bản đối với các chất trích ly ra từ nguyên liệu thực vật

– Dù xuất phát từ loại nguyên vật liệu nào thì các sản phẩm trích ly ra – muốn tồn tại trên thị trường – phải đạt một số yêu cầu cơ bản sau:

– Hàm lượng hoạt chất cao và ổn định

– Có tác dụng tốt trong sử dụng

– Dễ sử dụng và dễ bảo quản

1.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ( HPLC)

Hình 11: Máy HPLC 1.3.4.1 Định nghĩa

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ

sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

4-Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample)

5-Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong bộ điều nhiệt )

• Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

• Sắc ký phân bố (partition chromatography)