SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT HIỆN độc tố AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM

MỞ ĐẦUAflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus và Aspergillus nomius – đây là các loại nấm mốc. Aflatoxin là độc tố và là tác nhân gây ung thư. Chính vì thế, việc kiểm định độc tố aflatoxin trong thực phẩm giữ vai trò hết sức quan trọng. Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa, miến, gạo, lúa mì…), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông…), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng…) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ, dừa…Trên cơ sở những nghiên cứu của các nhà khoa học, Bộ Y tế đã ban hành QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI GIỚI HẠN Ô NHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM TRONG THỰC PHẨM. Văn bản pháp quy này được công bố ngày 25 tháng 10 năm 2011. Nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới là điều kiện thuận lợi để các loại vi nấm như aflatoxin phát triển. Do ảnh hưởng của khí hậu nhiệt đới, tác động của các loại vi nấm gây nên tổn thất lớn cho nông sản giai đoạn sau thu hoạch và bảo quản, trong đó tổn thất gây ra do nấm mốc chiếm phần đáng kể. Ngoài việc gây tổn thất về số lượng, nấm mốc còn sinh ra các độc tố đặc biệt nguy hiểm với sức khỏe con người và động vật. Nấm mốc phát triển trên lương thực, ngũ cốc, bên cạnh việc sử dụng chất dinh dưỡng của hạt như protein, glucid, lipid, vitamin… chúng còn sinh ra các độc tố. Aflatoxin có thể gây độc cho người và gia súc như gây tổn thương gan, gây quái thái, đột biến, ung thư, thậm chí với liều lượng cao có thể gây tử vong…Có nhiều phương pháp để xác định aflatoxin như phương pháp sắc ký lỏng, phương pháp khối phổ. Đây là phương pháp cho phép ngưỡng phát hiện rất cao, tuy nhiên các thiết bị rất đắt tiền chỉ có ở cơ sở kiểm định chuyên nghiệp đồng thời quy trình rất phức tạp đòi hỏi nhiều thời gian. Phương pháp sử dụng kít thử nhanh, phương pháp này cho kết quả nhanh tuy nhiên giới hạn phát hiện và độ chính xác lại bị hạn chế. Phương pháp quang phổ dựa trên tính chất quang của độc tố aflatoxin – hấp thụ – phát quang trong vùng nhìn thấy cho phép phát hiện aflatoxin với ngưỡng cao hơn nhiều so với phương pháp dùng kit thử nhanh với thao tác đơn giản, không cần hóa chất xử lý mẫy, thiết bị phân tích quá đắt tiền.Mục đích của đề tài:Sử dụng phương pháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) thông qua tương tác của cặp donor – acceptor là aflatoxin B1 – chấm lượng tử CdSeZnS phát hiện aflatoxin B1. Phương pháp này cho phép phát hiện hàm lượng aflatoxin B1 tới ppM.Thử nghiệm phương pháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang phát hiện AFB1 trong ngô.Phương pháp nghiên cứuLuận văn được tiến hành chủ yếu bằng phương pháp thực nghiệmLuận văn với tiêu đề “ Sử dụng phương pháp quang phổ phát hiện độc tố aflatoxin trong thực phẩm”. Nội dung luận văn được chia làm 3 chương:Chương 1: Tổng quan. Tìm hiểu về khái niệm aflatoxin, các loại aflatoxin và dạng chuyển hóa của chúng, điều kiện gây nhiễm aflatoxin và độc tính của aflaftoxin. Các phương pháp phát hiện aflatoxin và phương pháp quang phổ phát hiện aflatoxin.Chương 2: Kỹ thuật thực nghiệm. Trình bày quá trình chuẩn bị mẫu đo, các phương pháp thực nghiệm được sử dụng trong luận văn như đo phổ hấp thụ, phổ huỳnh quang, thời gian sống huỳnh quang.Chương 3: Trình bày các kết quả tính chất quang của aflatoxin, đặc trưng hình thái và tính chất quang của chấm lượng tử CdSeZnS. Truyền năng lượng huỳnh quang cộng hưởng của aflatoxin và chấm lượng tử CdSeZnS. Thử nghiệm xác định aflatoxin trong hạt ngô.

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Hà Nội – 2019

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Hà Nội – 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn “sử dụng phương pháp quang phổ phát

hiện độc tố aflatoxin trong thực phẩm” do PGS.TS Nguyễn Thanh Bình

hướng dẫn là công trình nghiên cứu của tôi Các nội dung nghiên cứu, kết quảtrong luận văn này là trung thực và không sao chép các công trình của ngườikhác Nếu có sai sót tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, tháng 09 năm 2019

Học viên

Đỗ Thị Lan

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS NguyễnThanh Bình – người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trongquá trình thực hiện luận văn!

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô, cán bộ phòng tại Viện Vật

Lý – Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điềukiện thuận lợi cho tôi thực hiện và hoàn thiện luận văn!

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bèđồng nghiệp của tôi – những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôitrong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này!

Trong quá trình thực hiện luận văn, do kiến thức còn hạn chế khôngtránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng gópcủa quý Thầy Cô để tôi có thể hoàn thiện luận văn này!

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC CÁC BẢNG 4

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ 5

MỞ ĐẦU 7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 9

1.1: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN 9

1.1.1: Khái niệm các loại aflatoxin 9

1.1.1.1: Khái niệm aflatoxin 9

1.1.1.2: Lịch sử phát hiện aflatoxin 9

1.1.1.3: Điều kiện gây nhiễm bẩn của aflatoxin 10

1.1.1.4: Các dạng aflatoxin và chuyển hóa của chúng 12

1.1.2: Cấu tạo hóa học và tính chất của aflatoxin B1 13

1.1.2.1: Cấu tạo hóa học của aflatoxin B1 13

1.1.2.2: Tính chất của aflatoxin B1 14

1.1.3: Độc tính và cơ chế gây bệnh của aflatoxin B1 15

1.1.3.1: Độc tính của aflatoxinB1 15

1.1.3.2: Cơ chế gây bệnh của aflatoxin B1 15

1.2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN AFLATOXIN 17

1.2.1: Phương pháp sử dụng kít thử nhanh độc tố nấm mốc aflatoxin 17

1.2.2: Phương pháp sử dụng sắc ký kết hợp phổ khối 17

1.2.2.1: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography – TLC) 17

1.2.2.2: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high ferformane

thin layer chromatography – HPTLC) 18

1.2.2.3: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high ferformane liquid chromatography – HPLC) 19

1.3: PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT HIỆN AFLATOXIN 19

1.3.1: Khái niệm hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) 20

1.3.2 Cơ sở lý thuyết của hiệu ứng FRET [8], [27] 22

CHƯƠNG 2: KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 27

2.1: CHUẨN BỊ MẪU 27

2.1.1: Aflatoxin B1 27

2.1.2: Chấm lượng tử bán dẫn CdSe/ ZnS 27

2.2 PHỔ HẤP THỤ UV – VIS 28

2.3: PHỔ HUỲNH QUANG 31

2.4: PHỔ HUỲNH QUANG PHÂN GIẢI THỜI GIAN SỐNG 32

2.4.1 Quang phổ phân giải thời gian và thời gian sống phát quang 32

2.4.2 Cấu tạo và nguyên lý kỹ thuật của hệ đo huỳnh quang phân giải thời gian 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1: TÍNH CHẤT QUANG CỦA AFLATOXIN B1 39

3.2: TÍNH CHẤT QUANG CỦA CHẤM LƯỢNG TỬ CdSe/ZnS 40

3.3: TRUYỀN NĂNG LƯỢNG HUỲNH QUANG CỘNG HƯỞNG CỦA AFLATOXIN VÀ CHẤM LƯỢNG TỬ CdSe/ZnS 41

3.4: THỬ NGHIỆM XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG NGÔ 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

*: Trạng thái kích thích

A: Acceptor

AFB1: Aflatoxin B1

D: Donor

ELISA: Enzyme – linked Immunosorbent Assay

FDA: Cục Dược Phẩm và Thực Phẩm Hoa Kỳ

FRET: Truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang

HPLC: Phương pháp sắc ký lỏng cao áp

HPTLC: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

IAC: Vincam Aflatest P 1 ml

Ml: Microgam/ kg

PBS: Phosphate buffer solution

TCSPC: Đếm đơn photon tương quan thời gian

TLC: Phương pháp sắc ký lớp mỏng

SILAR: Successive ionic layer adsorption and reaction

UV – Vis: Phổ hấp thụ vùng tử ngoại- khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Các giới hạn tối đa hàm lượng aflatoxin trong thực phẩmBảng 1.2: Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của bộ y tế Việt NamBảng 2.1: Chuẩn bị mẫu aflatoxin B1 – CdSe/ZnS

Bảng 3.1: Thời gian sống huỳnh quang của mẫu aflatoxin B1-CdSe/ZnStại bước sóng 435 nm và 545 nm

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Aspergillus flavus

Hình 1.2: Aspergillus parasiticus

Hình 1.3: Một số loại nông sản bị nhiễm aflatoxin

Hình 1.4: Cấu tạo hóa học của một số loại aflatoxin

Hình 1.5: Cấu tạo hóa học của aflatoxin B1

Hình 1.6: Mô hình hiệu ứng FRET

Hình 1.7: Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET

Hình 1.8: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất donor vàaccepter

Hình 1.9: Hiệu suất truyền năng lượng FRET được vẽ như hàm khoảngcách cặp donor – acceptor, khoảng cách R0 là khoảng cách mà hiệu suất truyềnbằng 50%

Hình 1.10: Quang phổ huỳnh quang của donor và accepter và dung dịchhỗn hợp của donor – accepter

Hình 2.1: Sơ đồ nguyên lí của hệ đo hấp thụ quang học UV – VIS

Hình 2.2: Máy đo quang phổ UV – VIS

Hình 2.3: Sơ đồ nguyên lí của máy quang phổ kế huỳnh quang CaryHình 2.4: Máy đo phổ huỳnh quang Cary

Hình 2.5: Nguyên lí tổng quát của kỹ thuật TCSPC

Hình 2.6: Sơ đồ tổng quát của hệ TCSPC

Hình 3.1: Phổ hấp thụ và huỳnh quang của Aflatoxin B1

Hình 3.2: Phổ hấp thụ và huỳnh quang của chấm lượng tử CdSe/ZnSHình 3.3: Phổ hấp thụ (a); phổ huỳnh quang (b) của các mẫu aflatoxin

B1 với tỉ lệ hàm lượng khác nhau

Hình 3.4: Đường cong suy giảm huỳnh quang của aflatoxin B1 –CdSe/ZnS với tỉ lệ khác nhau đo tại bước sóng 435 nm (a) và 545 nm (b) kíchthích tại bước sóng 405 nm

Hình 3.5: Xác định nồng độ aflatoxin B1 theo thời gian sống huỳnhquang

Hình 3.6: Phổ huỳnh quang trạng thái dừng của aflatoxin B1 chiết suất

từ ngô

MỞ ĐẦU

Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số loài Aspergillusflavus, Aspergillus parasiticus và Aspergillus nomius – đây là các loại nấmmốc Aflatoxin là độc tố và là tác nhân gây ung thư Chính vì thế, việc kiểmđịnh độc tố aflatoxin trong thực phẩm giữ vai trò hết sức quan trọng Các loạinông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa, miến, gạo, lúamì…), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông…), gia vị (ớt,hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng…) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ,dừa…Trên cơ sở những nghiên cứu của các nhà khoa học, Bộ Y tế đã banhành QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI GIỚI HẠN ÔNHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM TRONG THỰC PHẨM Văn bản pháp quy nàyđược công bố ngày 25 tháng 10 năm 2011

Nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới là điều kiện thuận lợi để các loại vinấm như aflatoxin phát triển Do ảnh hưởng của khí hậu nhiệt đới, tác độngcủa các loại vi nấm gây nên tổn thất lớn cho nông sản giai đoạn sau thu hoạch

và bảo quản, trong đó tổn thất gây ra do nấm mốc chiếm phần đáng kể Ngoàiviệc gây tổn thất về số lượng, nấm mốc còn sinh ra các độc tố đặc biệt nguyhiểm với sức khỏe con người và động vật Nấm mốc phát triển trên lươngthực, ngũ cốc, bên cạnh việc sử dụng chất dinh dưỡng của hạt như protein,glucid, lipid, vitamin… chúng còn sinh ra các độc tố Aflatoxin có thể gây độccho người và gia súc như gây tổn thương gan, gây quái thái, đột biến, ung thư,thậm chí với liều lượng cao có thể gây tử vong…

Có nhiều phương pháp để xác định aflatoxin như phương pháp sắc kýlỏng, phương pháp khối phổ Đây là phương pháp cho phép ngưỡng phát hiệnrất cao, tuy nhiên các thiết bị rất đắt tiền chỉ có ở cơ sở kiểm định chuyênnghiệp đồng thời quy trình rất phức tạp đòi hỏi nhiều thời gian Phương pháp

sử dụng kít thử nhanh, phương pháp này cho kết quả nhanh tuy nhiên giới hạnphát hiện và độ chính xác lại bị hạn chế Phương pháp quang phổ dựa trêntính chất quang của độc tố aflatoxin – hấp thụ – phát quang trong vùng nhìnthấy cho phép phát hiện aflatoxin với ngưỡng cao hơn nhiều so với phương

pháp dùng kit thử nhanh với thao tác đơn giản, không cần hóa chất xử lý mẫy,thiết bị phân tích quá đắt tiền.

Mục đích của đề tài:

Sử dụng phương pháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang(FRET) thông qua tương tác của cặp donor – acceptor là aflatoxin B1 – chấmlượng tử CdSe/ZnS phát hiện aflatoxin B1 Phương pháp này cho phép pháthiện hàm lượng aflatoxin B1 tới ppM

Thử nghiệm phương pháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quangphát hiện AFB1 trong ngô

Phương pháp nghiên cứu

Luận văn được tiến hành chủ yếu bằng phương pháp thực nghiệm

Luận văn với tiêu đề “ Sử dụng phương pháp quang phổ phát hiện

độc tố aflatoxin trong thực phẩm” Nội dung luận văn được chia làm 3

chương:

Chương 1: Tổng quan Tìm hiểu về khái niệm aflatoxin, các loại

aflatoxin và dạng chuyển hóa của chúng, điều kiện gây nhiễm aflatoxin và độctính của aflaftoxin Các phương pháp phát hiện aflatoxin và phương phápquang phổ phát hiện aflatoxin

Chương 2: Kỹ thuật thực nghiệm Trình bày quá trình chuẩn bị mẫu

đo, các phương pháp thực nghiệm được sử dụng trong luận văn như đo phổhấp thụ, phổ huỳnh quang, thời gian sống huỳnh quang

Chương 3: Trình bày các kết quả tính chất quang của aflatoxin, đặc

trưng hình thái và tính chất quang của chấm lượng tử CdSe/ZnS Truyền nănglượng huỳnh quang cộng hưởng của aflatoxin và chấm lượng tử CdSe/ZnS.Thử nghiệm xác định aflatoxin trong hạt ngô

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN

1.1.1: Khái niệm các loại aflatoxin

1.1.1.1: Khái niệm aflatoxin

Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một sốloài Aspergillus, là một loại nấm mốc, đáng chú ý nhất là Aspergillus flavus

và Aspergillus parasiticus Aflatoxin là độc tố và là tác nhân gây ung thư Saukhi thâm nhập vào cơ thể, các aflatoxin có thể được gan chuyển hóa thànhdạng trung gian epoxit hoạt hóa hoặc được thuỷ phân và trở thành M1 ít độchơn

1.1.1.2: Lịch sử phát hiện aflatoxin

Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở Anh bị tổn thất nặng nề, lúc đầuhơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “bệnh gà tây X” (Turkey Xdisease) Sau đó, các loại gia cầm khác như: Vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và

tử vong rất nhiều.Qua điều tra, người ta xác định được bệnh có liên quan đếnmột loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra Đến năm 1961, người ta đãtìm ra bản chất hóa học của độc tố này là aflatoxin do vi nấm Aspergillusflavus và Aspergillus parasiticus

Hình 1.1 Aspergillus flavus Hình 1.2 Aspergillus parasiticus

Hình 1.3 Một số loại nông sản bị nhiễm aflatoxin

Năm 1961, các công trình nghiên cứu công nhận rằng aflatoxin đượctạo ra bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u gan

ở động vật Trên động vật thủy sản, những nghiên cứu đầu tiên về độc tốaflatoxin trên cá hồi được thực hiện bởi Ashley và các cộng sự

Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố aflatoxin Cácnhà khoa học cũng đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạocủa aflatoxin

1.1.1.3: Điều kiện gây nhiễm bẩn của aflatoxin

Các loài sinh aflatoxin thuộc chi Aspergillus phân bố rất rộng trong tựnhiên Chúng có thể tạo khuẩn lạc và gây nhiễm vào hạt trước khi thu hoạch

và trong quá trình bảo quản Cây chủ rất dễ bị gây nhiễm bởi Aspergillus sauphơi nhiễm kéo dài trong môi trường có độ ẩm cao hoặc bị tổn thương cácđiều kiện xấu như hạn hán

Các môi trường sống bản địa của Aspergillus là trong đất, thực vật mụcnát và ngũ cốc đang bị giảm sức đề kháng vi sinh vật và nó xâm nhập tất cảcác loại chất hữu cơ mỗi khi có điều kiện được thuận lợi cho sự phát triển của

nó Điều kiện thuận lợi bao gồm độ ẩm cao (ít nhất là 7%) và nhiệt độ cao

Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa

miến, gạo, lúa mì…), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt

bông…), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng…) và các loại quả hoặchạt khác như hạt dẻ, dừa…

Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ănbằng thức ăn nhiễm aflatoxin

Hầu như tất cả các nước đều đã có quy chuẩn sử dụng aflatoxin TạiHoa Kỳ có hàm lượng aflatoxin từ 0 ppb đến 20 ppb cho tiêu dùng trực tiếp,mặc dù thức ăn dùng để vỗ béo cho bò thịt, lợn, gia cầm trong giai đoạn cuối

có thể chấp nhận mức 300 ppb, nhưng trong thực tế thường thấp hơn nhiềumức khuyến cáo an toàn của Cục Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA)

FDA đã đưa ra mức khuyến cáo về hàm lượng aflatoxin trong thựcphẩm và thức ăn chăn nuôi nhằm bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng và sứckhoẻ động vật

Tại Việt Nam , Bộ Y tế đã ban hành quy chuẩn QCVN 8-1:2011/BYTQuy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm độc tố vi nấm trongthực phẩm trong đó gới hạn đối với aflatoxin được cho trong bảng 1.1 vàbảng 1.2

Bảng 1.1 Các giới hạn tối đa hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm

Hàm lượng,

ppb

Tiêu chí

trưởng thành (kể cả gia cầm chưa trưởng thành) và cácvật nuôi cho sữa hoặc dùng cho các mục đích kháckhông được công bố; và đối với thức ăn chăn nuôi ngoạitrừ ngô và bột từ hạt bông

(bò, lợn) hoặc gia cầm đã trưởng thành

pound trở lên

(ví dụ vỗ béo) và đối với bột hạt bông dùng cho bò, lợn

15 Đối với Aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong thực phẩm nói

chung0,5 Đối với Aflatoxin M1 trong sữa và các sản phẩm sữa

1.1.1.4: Các dạng aflatoxin và chuyển hóa của chúng

Aflatoxin có ít nhất 18 dạng khác nhau trong tự nhiên, trong đóAflatoxin B1, B2, G1, G2, M1 và M2 được coi là quan trọng vì có độc tốmạnh [6] Các nhóm aflatoxin khác nhau phân biệt bởi cấu trúc phân tử.Aflatoxin nhóm B (B1 và B2) có một vòng cyclopentane, trong khi nhóm G(G1 và G2) chứa vòng lacton [7] Aflatoxin nhóm B có huỳnh quang màu xanhdương (Blue), nhóm G thể hiện huỳnh quang màu lục (Green) Trong số cácnhóm aflatoxin, aflatoxin B1 là nhiều và phổ biến [8] chiếm 75% tổng sốaflatoxin gây ô nhiễm thực phẩm [16]

Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hóa thành aflatoxin M1, M2

Hình 1.4 Cấu tạo hóa học của một số loại aflatoxin

Ngoài 6 loại aflatoxin chủ yếu trên, người ta còn phát hiện một số loạiaflatoxin khác, người ta đã đề nghị gọi các hợp chất đó là flavatoxin hoặcflavacuramin:

- Aflatoxin P1: là một sản phẩm trao đổi chất, là dẫn xuất fenolic củaAflatoxin B1 Người ta đã phân lập được chúng trên cột ambeclit XAD – 2(Rohm và Haas) Trọng lượng phân tử của nó xác định bằng khối phổ là 2.8.Sản phẩm này là kết quả sự khử metyl của aflatoxin B1

- Aflatoxin 3B hay toxin B3: Một chất có Rf thấp, phân lập từ bình nuôicấy aflatoxin Flavus, dạng tinh thể, màu vàng kim, độ độc kém aflatoxin B1 từ

40 đến 50 lần

- Aflatoxin B3 còn gọi là prositicol: Nhân xiclopenten tận cùng củaaflatoxin B1 được thay thế bằng một chuỗi etanol, do đó chất này là 6 – metoxi– 7 – (2 – hydroxi etyl) difuro Cumarin

1.1.2: Cấu tạo hóa học và tính chất của aflatoxin B1

1.1.2.1: Cấu tạo hóa học của aflatoxin B 1

Aflatoxin B1 được coi là dạng độc nhất và được sản sinh bởiAspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Có công thứ là C17H12O6 vớitrọng lượng phân tử là 321 Trong cấu trúc phân tử có nhóm lacton và

metoxyl, không có nhóm hidroxyl tự do B là chữ viết tắt của blue (màu xanhnước biển), aflatoxin B1 có màu huỳnh quang xanh nước biển.

Hình 1.5 Cấu tạo hóa học của Aflatoxin B1

1.1.2.2: Tính chất của aflatoxin B 1

Các aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím Điều này chophép xác định các hợp chất này ở nồng độ thấp (0,5ng hay thấp hơn trên mộtvết ở sắc kí bản mỏng)

Aflatoxin tinh khiết rất bền vững ở nhiệt độ cao lên đến điểm nóngchảy, khi được làm nóng trong không khí Tuy nhiên, nó tương đối không bềnkhi để dưới không khí và dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng, và đặcbiệt khi hòa tan ở các dung môi có độ phân cực cao Các aflatoxin trong cácdung môi clorofom và benzen bền vững trong nhiều năm nếu được giữ trongchổ tối và lạnh Các aflatoxin ít hoặc không bị phân hủy dưới điều kiện nấubình thường và làm nóng khi thanh trùng Tuy nhiên, khi có độ ẩm và ở nhiệt

độ cao vẫn có thể tiêu hủy aflatoxin trong một thời gian nhất định

Các aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ nhưclorofom, metanol Tính tan của aflatoxin trong nước dao động từ 10 –20mg/l

Tất cả các aflatoxin đều hiện diện dưới dạng tinh thể nhỏ, mịn, màutrắng hoặc vàng lợt.

Aflatoxin B1 có màu huỳnh quang xanh nước biển, là loại aflatoxinthường gặp và độc nhất Aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân tửthấp, dễ dàng được hấp thu sau khi ăn, sự hấp thu là hoàn toàn

1.1.3: Độc tính và cơ chế gây bệnh của aflatoxin B1

Aflatoxin gây ra các tác hại chính sau đây:

- Phá hủy tế bào gan, thận và các bộ phận khác

- Ức chế lên hệ miễn dịch

- Ăn mòn thành ruột và dạ dày

- Suy dinh dưỡng, chậm lớn, chết

- Gây ra ung thư gan ở người và gia súc

1.1.3.2: Cơ chế gây bệnh của aflatoxin B 1

Do cấu trúc hóa học có vòng dihydro – furan nên aflatoxin B1 liên kếtvới một số enzym làm cản trở trao đổi chất dẫn đến tử vong Ngoài ra,Aflatoxin B1 còn tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền (DNA, RNA)làm rối loạn cấu trúc di truyền dẫn đến tổn thương gan và ung thư gan Vớiphụ nữ mang thai, hấp thu lượng nhất định sẽ dẫn đến dị tật thai nhi hoặc quáithai, nặng có thể gây chết non thai nhi

Aflatoxin B1 là phân tử ái lực mạnh với thành ruột, có trọng lượng phân

tử thấp nên dễ dàng được hấp thu hoàn toàn sau khi ăn Khi đến ruột non,Aflatoxin B1 sẽ nhanh chóng được hấp thu vào tĩnh mạch và ruột non, tátràng Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, aflatoxin được tập trung vào gannhiều nhất (chiếm khoảng 17% lượng aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận,

cơ, mô mỡ, tụy, lách Trong vòng 24 giờ có khoảng 80% bị đào thải theođường tiêu hóa qua mật, đường tiết niệu qua thận và đáng chú ý nó còn bàitiết qua tuyến sữa gây bệnh cho thai nhi đang bú sữa mẹ

Cho đến nay, các luận chứng khoa học công nhận khả năng tác độnglên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn sau:

- Ức chế các men polymerase mà chúng có vai trò tổng hợp DNA vàRNA

- Làm chậm hoặc ngừng hẳn sự tổng hợp DNA

- Ngăn cản cơ chế sinh tổng hợp RNA truyền tin

- Biến đổi hình dạng nhân tế bào

- Hạn chế quá trình sinh tổng hợp protein

Hậu quả là gây ung thư biểu mô tế bào gan

Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc cấp tính và mãn tính ở người

và động vật, nghiêm trọng nhất và nguy hiểm nhất là khả năng gây ung thưgan và xơ gan

Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an toàn lương thựcthực phẩm, không sử dụng các thực phẩm đã bị hỏng, bị nấm mốc là một vấn

đề hết sức quan trọng có ý nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện bệnhung thư gan nguyên phát

1.2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN AFLATOXIN

1.2.1: Phương pháp sử dụng kít thử nhanh độc tố nấm mốc aflatoxin

Cơ sở để kiểm tra là dựa trên sự miễn dịch trên que thử Trên que thử cóchứa kháng nguyên- kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)(ELISA) [19] Kháng thể đặc hiệu chống lại độc tố aflatoxin và nhận raaflatoxin trong các phân tử trong mẫu Kết quả được đánh giá và đọc nhanhbằng hiển thị màu sắc trên kit thử Phương pháp này đơn giản dễ sử dụng, tuynhiên độ nhạy còn hạn chế và thường phải kết hợp với các phương pháp khác

1.2.2.1: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography – TLC)

Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định hàmlượng aflatoxin đầu tiên vào những năm 1960 Là một kỹ thuật sắc ký đượcdùng để tách các chất trong hỗn hợp Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao gồmpha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp thụ, thường là silicagel, aluminiumoxide được phủ trên một mặt phẳng chất trơ Pha động bao gồm dung dịchcần phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc

ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của cácthành phần trong dung dịch Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng

là cloroform: methnol và clroform: aceton Việc thêm nước vào hệ thống dungmôi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin

Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc ký, khoảng1cm từ dưới lên Bản sắc ký sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp,như methanol hoặc nước, và được đặt vào một vật chứa có nắp Dung môi dichuyển lên bản sắc ký bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thửlên bản sắc ký Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyểnvới tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh và độtan khác nhau trong dung môi Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnhtranh của chất tan và pha động để có chỗ liên kết với pha tĩnh.

Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc vào người phân tích Khilàm sắc ký một số hợp chất có thể tương tự aflatoxin

1.2.2.2: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high ferformane thin layer chromatography – HPTLC)

Do những khuyết điểm trong phương pháp sắc ký lớp mỏng đơn thuần

ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi Phươngpháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: Đưa mẫu lên bảnmỏng một các tự động, cải thiện được sự đồng nhất cả lớp hấp thụ, chạy banmỏng trong dung môi có kiểm soát

Quá trình đưa mẫu vào bản mỏng được tự động hóa, do đó các vết đượcđịnh đúng vị trí và đo lường độ huỳnh quang của vết cũng bằng máydensitimetess

Thể tích mẫu được dùng trong HPTLC có thể bằng 1(so với 5 – 10mẫu trong phương pháp TLC) như vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích củavết (1mm) Nồng độ chất chuẩn có thể cần 5pg trong phân tích bằng HPTLC,

do đó có thể xácđịnh tới 30pg aflatoxin

Sử dụng kỹ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương phápTLC như một phương pháp định lượng aflatoxin có hiệu quả nhất

1.2.2.3: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high ferformane liquid chromatography – HPLC)

Hệ thống phân tích high ferformane tự động HPLC là hệ thống phântích đắt tiền, chọn lọc dùng định lượng aflatoxin Phương pháp HPLC sử dụng

cả hai pha: Pha bình thường và pha phản

Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (uv) và xác định cường độhuỳnh quang

Mẫu phân tích được tách bằng chloroform: Nước Ly tâm chất tác dụnglàm sạch qua silicagel pha bình thường sử dụng cột nhối silicagel 0,5 và phađộng sử dụng benzen: acetonitrit: acid formic Giới hạn xác định là 0,5

Husst (1984) đã sử dụng pha phản kết hợp với TFA đồng phân để xácđịnh được các aflatoxin B1, B2,G1, G2 ở nồng độ 5pg

Davis (1980) cũng sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang củađồng phân iot của aflatoxin B1 Kết quả dẫn đến việc phát triển phương phápđồng phân cột

1.3: PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT HIỆN AFLATOXIN

Là phương pháp dựa trên đặc trưng vật lý của Aflatoxin như phổ hấpthụ, huỳnh quang, hấp thụ hồng ngoại [9], [10], [13], [15] Phương pháp nàycho phép phát hiện nồng độ tương đối cao, có thể tới ppM, trong khi đó vậnhành lại tương đối đơn giản và thời gian thực hiện nhanh Gần đây phươngpháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) được sử dụngnhiều để xác định các độc tố có hàm lượng thấp bằng cách đưa vào mẫu thửchất huỳnh quang tương thích với chất cần phát hiện Khi có mặt của chất

độc, tính chất huỳnh quang sẽ thay đổi Dựa vào sự thay đổi này người ta sẽxác định được hàm lượng chất cần phát hiện.

1.3.1: Khái niệm hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET)

Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FluorescenceResonance Energy Transfer - FRET ) là một cơ chế truyền năng lượng xảy ra

ở cấp độ nano thông qua tương tác lưỡng cực – lưỡng cực, đây là một hiệntượng vật lý quan trọng với nhiều lĩnh vực tiềm năng như lĩnh vực quang điện

tử và rất nhiều lĩnh vực khác FRET được đưa ra từ thập kỷ 50 của thế kỷtrước, hiện nay đang được ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực đặc biếttrong nghiên cứu y sinh học [4], [15] FRET là hiệu ứng phụ thuộc vàokhoảng cách truyền năng lượng từ một chất cho huỳnh quang (donor) tới mộtchất nhận huỳnh quang (acceptor) phù hợp, là một trong số ít các công cụ cósẵn để đo khoảng cách nanomet và xác định những thay đổi trong khoảngcách cả trong in vitro lẫn trong cơ thể Do có độ nhạy với khoảng cách cao,nên hiệu ứng FRET đã được sử dụng để nghiên cứu động học, tương tácnguyên tử [3], [20], [24]

Cơ chế truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang liên quan đến cácchất phát huỳnh quang mà ở đây là điện tử ở trạng thái kích thích (donor),một phân tử huỳnh quang có thể truyền năng lượng kích thích của nó cho mộtphân tử huỳnh quang khác (acceptor) không phát xạ gần đó thông qua cáctương tác lưỡng cực – lưỡng cực tầm xa Lý thuyết truyền năng lượng đượcdựa trên khái niệm về một chất huỳnh quang kích thích như một dao độnglưỡng cực có thể trải qua sự trao đổi năng lượng với một lưỡng cực thứ hai cótần số cộng hưởng tương tự Vấn đề này, truyền năng lượng cộng hưởngtương tự như sự dao động cùng tần số Ngược lại, năng lượng bức xạ yêu cầuphát xạ và tái hấp thụ một photon phụ thuộc vào kích thước vật lý và tính chấtquang học của donor – acceptor, cũng như hình dạng của bề mặt và khoảngcách của donor – acceptor Không giống như các cơ chế bức xạ, truyền năng

lượng cộng hưởng có thể mang lại một lượng đáng kể thông tin về cấu trúcliên quan đến các phân tử donor – acceptor [5], [20], [24].

Một cặp phân tử tương tác với nhau thông qua hiệu ứng FRET được gọi

là một cặp donor – acceptor Hiện tượng FRET không qua trung gian là quátrình phát xạ photon Ngoài ra, nó thậm chí không yêu cầu chất màu nhậnđược phát huỳnh quang Mặc dù trong hầu hết các ứng dụng, các donor vàacceptor đều có khả năng phát huỳnh quang [3], [14]

Một cặp nguyên tử tạo ra một điện trường do sự tương tác lưỡng cực.Đầu tiên phân tử donor hấp thụ ánh sáng kích, các điện tử chuyển từ trạng thái

cơ bản lên trạng thái kích thích Nếu không có mặt của phân tử acceptor, phân

tử donor có thể phát huỳnh quang và quay trở lại trạng thái cơ bản Khi cómặt phân tử acceptor một phần năng lượng ở trạng thái kích thích được truyềncho lượng cho phân tử acceptor gần nhất có trạng thái năng lượng kích thíchthấp nhất qua sự trao đổi của một photon ảo Phân tử donor trở về trạng thái

cơ bản còn phân tử acceptor chuyển lên trạng thái kích thích [19], [22], [24]

Như vậy phân tử acceptor được kích thích nhờ vào quá trình gián tiếpnhận photon ảo, mặt khác đây cũng là hiện tượng xảy ra rất tự nhiên [5].FRET là một hiện tượng tự nhiên đầy lý thú bởi vì nó không phụ thuộc vào sựtiếp xúc vật lý cũng như truyền điện tử

Hình 1.6 Mô hình hiệu ứng FRET

1.3.2 Cơ sở lý thuyết của hiệu ứng FRET [5], [24]

Khi cặp phân tử donor – acceptor thỏa mãn các điều kiện để xảy raFRET, cơ chế truyền năng lượng được minh họa bởi giản đồ năng lượngJablonski (Hình 1.7) Khi mẫu được kích thích các điện tử của donor chuyển

từ trạng thái cơ bản trong vùng hóa trị lên trạng thích kích thích trong vùngdẫn Tại đây, các điện tử sẽ hồi phục xuống trạng thái năng lượng thấp hơntrong vùng dẫn (thời gian hồi phục trong khoảng từ pico giây tới femto giây),thường khi hồi phục xuống trạng thái cơ bản trong vùng hóa trị và phát rahuỳnh quang Một phần năng lượng kích thích sẽ truyền cho phân tử acceptor(không phát xạ) làm cho phân tử acceptor bị kích thích Điện tử kích thích củaphân tử acceptor cũng hồi phục và tái hợp với lỗ trống trong vùng hóa trị vàphát ra huỳnh quang của acceptor

Hình 1.7 Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET

Quá trình truyền năng lượng FRET làm giảm huỳnh quang của donor(dập tắt) và tăng cường độ huỳnh quang acceptor đồng thời giảm thời giansống huỳnh quang donor [24]

D + h → D*+

D* + A → D +A*

A* → A + h’

D: donor; A: acceptor; Dấu “*” kí hiệu trạng thái kích thích

Một số điều kiện cần phải được thỏa mãn để cho FRET xảy ra đó là:

- Phổ phát xạ huỳnh quang của các phân tử donor phải chồng lên phổhấp thụ hoặc kích thích của chất màu nhận Mức độ chồng chập lên nhauđược gọi là phổ chồng lên nhau tích hợp (J)

- Donor phải có cường độ huỳnh quang mạnh

- Hai chất này (donor và acceptor) phải ở khoảng cách gần nhau(thường 1 đến 10 nanomet)

- Các lưỡng cực điện (dipole) của các donor và acceptor phải gần nhưsong song với nhau

- Thời gian sống huỳnh quang của các phân tử donor phải có khoảngthời gian đủ để cho hiệu ứng FRET xảy ra

Hình 1.8 Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất Donor và

Acceptor