NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN.NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊNNGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

NĂM HỌC 2016- 2017

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO

TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN

Sinh viên thực hiện: Thân Thị Kim Phượng

Đinh Thị Thùy Người hướng dẫn: T.S Nguyễn Hữu Quân

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

NĂM HỌC 2016- 2017

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO

TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN

Xác nhận của người hướng dẫn

T.S Nguyễn Hữu Quân

Sinh viên thực hiện

Thân Thị Kim Phượng

Đinh Thị Thùy

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017

LỜI CẢM ƠN

Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Nguyễn Hữu Quân đãtận tình hướng dẫn và thường xuyên giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài nghiêncứu khoa học

Chúng em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Hồng đã giúp đỡ trong thời gianlàm thực nghiệm

Chúng em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô giáo thuộc bộmôn Sinh học hiện đại và Giáo dục Sinh học, cùng toàn thể các thầy cô giáo trongKhoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ đểchúng em hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học

Chúng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ trongsuốt quá trình thực hiện đề tài

Thái Nguyên, ngày 10 tháng 4 năm 2017

Sinh viên

Đinh Thị Thùy Thân Thị Kim Phượng

MỤC LỤC

Trang

Trang bìa phụ

Lời cảm ơn i

Mục lục ii

Danh mục bảng biểu iv

Danh mục các hình v

Danh mục từ viết tắt v

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

3 Nội dung nghiên cứu 1

4 Phương pháp nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Enzyme chitinase 3

1.1.1 Khái niệm và phân loại 3

1.1.2 Cơ chế hoạt động của chitinase 4

1.1.3 Nguồn thu nhận chitinase 5

1.1.4 Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh chitinase của nấm sợi 7

1.1.5 Nghiên cứu về chitinase: 8

1.2 Enzyme protease 10

1.2.1 Khái niệm về protease 10

1.2.2 Nguồn gốc của protease 10

1.2.3 Phân loại 11

1.2.4 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật 12

1.2.5 Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease 13

1.2.6 Cơ chế xúc tác của protease 14

1.2.7 Ảnh hưởng của môi trường lên khả năng sinh protease 14

1.2.8 Tình hình nghiên cứu protease 16

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 18

2.1.1 Vật liệu 18

2.1.2 Thiết bị 18

2.1.3 Hóa chất 18

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phân lập nấm 19

2.2.2 Nuôi cấy nấm sinh tổng hợp enzyme 19

2.2.3 Định tính enzyme trên đĩa thạch 20

2.2.4 Xác định hoạt tính protease 20

2.2.5 Tối ưu điều kiện nuôi cấy 21

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Phân lập chủng nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp chitinase và protease 23

3.2 Xác định đặc điểm hình thái của các chủng nấm 24

3.3 Tối ưu điều kiện nuôi cấy nấm Aspergillus sinh tổng hợp protease 27

3.3.1 Khả năng sinh protease theo thời gian nuôi cấy 27

3.3.2 Ảnh hưởng của pH nuôi cấy 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29

KẾT LUẬN 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 2.1 Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm 18

Bảng 2.2 Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm 18

Bảng 3.1 Một số đặc điểm hình thái của các chủng nấm phân lập 25

Bảng 3.2 Hoạt tính protease theo thời gian từ nấm Aspergillus phân lập ở đất 27

Bảng 3.3 Hoạt tính protease ở các pH khác nhau từ nấm Aspergillus phân lập ở đất 28

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1 Phản ứng thủy phân liên kết peptide 10 Hình 1.2 Cơ chế hai bước hoạt động của serine protease 14 Hình 2.1 Đường chuẩn nồng độ tyrosin 21 Hình 3.1 Hoạt tính protease (A) và chitinase (B) của các chủng nấm phân lập được

23

Hình 3.2 Sợi nấm phát triển trên môi trường PDA và Crapek lỏng 26

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nấm sợi phân bố rộng rãi trong tự nhiên, chúng có rất nhiều ứng dụng trongnhiều lĩnh vực khác nhau như: y học, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm và thamgia tích cực vào quá trình chuyển hóa vật chất, khép kín các vòng tuần hoàn vật chấttrong tự nhiên, làm vật chất được ổn định và từ đó bảo vệ sự cân bằng sinh thái Nấmsợi được sử dụng vào quá trình phân hủy rác thải hữu cơ trong đất phân hủy các chấtđộc hại thành các chất không độc góp phần bảo vệ môi trường Ngoài ra, nấm sợi cònđược ứng dụng trong sản xuất phân bón và thuốc trừ sâu sinh học nhằm mục đích thaythế thuốc hóa học Nhiều enzyme được khai thác từ nấm sợi được ứng dụng trong thờigian qua như protease, amylase, cellulase, pectinase,…Đặc biệt, protease và chitinase

là hai loại enzyme có vai trò rất lớn trong tự nhiên

So với nguồn enzyme từ động vật và thực vật, enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưuđiểm vượt trội như: dễ sản xuất và thu nhận, môi trường lên men rẻ tiền, năng suấtsinh học cao Đặc biệt, giá thành của các enzyme từ vi sinh vật rẻ hơn rất nhiều lần sovới các chế phẩm enzyme từ động vật, thực vật và có thể sản xuất cóở quy mô côngnghiệp Trên thế giới các chế phẩm protease, chitinase tinh khiết thương mại hóa đãđược đưa vào ứng dụng nhưng lại có giá thành khá đắt

Nhằm mục đích khai thác nguồn enzyme tự nhiên từ nấm sợi, góp phần làm giảm giáthành và được ứng dụng trong thực tiễn Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến

hành lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào từ các loài nấm sợi phân lập ở Thái Nguyên”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập được loài nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp chitinase và protease tạiThái Nguyên

3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập một số chủng nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp chitinase và proteasengoại bào

Xác định đặc điểm hình thái của một số chủng nấm sợi thu được

Tối ưu thời gian sinh tổng hợp chitinase và protease

4 Phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Enzyme chitinase

1.1.1 Khái niệm và phân loại

Chitinase là enzyme thủy phân chitin thành các đơn phân N-acetyl glucosamine,chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-1, 4 glucoside giữa C1

và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin

Chitinase được chia thành 2 nhóm chính: Endochitinase (EC 3.2.1.14) vàexochitinase Mỗi loại enzyme tham gia vào thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhấtđịnh và nhờ sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủyphân hoàn toàn thành các đơn phân N-acetylglucosamine Các endochitinase phân táchngẫu nhiên chitin tại các vị trí nội tại tạo thành dimer dietylchitobiose và cácmultimers khối phân tử thấp hòa tan của GlcNAc như chitotriose và chitotetraose Các exochitinase được chia thành 2 nhóm: Chitobiosidase (EC 3.2.1.29) liênquan đến việc xúc tác cho sự giải phóng của các di-acetylchitobiose ở đầu không khửcủa chitin và 1-4-β-glucosaminidases (EC 3.2.1.30) khử các sản phẩm oligomer củaendochitinase và chitobiosidase tạo ra monomer của GlcNac dựa vào sự giống nhaugiữa các axit amin của chitinase từ các sinh vật khác nhau

Dựa vào cấu trúc phân tử, chitinase được sắp xếp vào ba họ là Glycohydrolase 18, glycohydrolase 19 và glycohydrolase 20 [15] Họ chitinase 18 phối rộng, có ở hầu hếtsinh vật (thực vật, vi khuẩn, nấm, động vật có vú, và virus) Họ Glycohydrolase 18 là

họ lớn nhất với khoảng 180 chi, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote,Prokaryote và virus Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có cácenzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase Cácenzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/βcuộn tròn, chúng hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn βpolymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer Các chitinase thuộc họ

Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các loài như Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens,…Họ

glycohydrolase 19 gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở

xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae,…Chúng có cấu trúc

hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển Họ

Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II, IV Chitinase loại I cóđặc điểm tương tự với chitinase trong lớp IV, bao gồm các đặc tính miễn dịch, nhưngchúng nhỏ hơn đáng kể so với các loại chitinase lớp I Họ Glycohydrolase 20 bao gồm

β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người

Dựa vào trình tự axit amin, sự định vị enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết

và vùng cảm ứng, chitinasae được chia thành 5 nhóm: I, II, III, IV, V Nhóm I: lànhững đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tácthông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết).Vùng gắn chitin này tạo ra các đặc tính sinh học riêng cho chitinase ở nhiều loài sinhvật khác nhau Ở nấm men, vùng gắn chitin nằm ở đầu C giúp định vị chitinase trênthành tế bào nấm men, đóng vai trò trong việc phân tách tế bào mẹ khỏi các tế bào chị

em Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chấtchitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác

Nhóm II: Là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếuđoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự axit amin tương tựchitinase ở nhóm I Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn

Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II, nhưngrất giống với trình tự với lysozym, vì thế chúng mang hoạt tính enzyme lysozym Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I,phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so vớichitinase nhóm I

Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin(vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậccao [16]

1.1.2 Cơ chế hoạt động của chitinase

Các loại enzyme tham gia phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin chitobiosidase, N-acetyl-β- D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase

1-4-β-Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo cácđoạn olygosaccharide, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm

Trichoderma harzianum Chitin 1, 4-β- chitobiosidase phân cắt chitin tạo thành các sản

phẩm chính là các dimer chitobiose, cụ thể enzyme này được thu từ Trichoderma harzianum.

N-acetyl-β- D - glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin từ mộtđầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine Chitobiase làenzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D-glucosamine

Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer,sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau,nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinasekhông thể phân cắt thêm được nữa Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin vàchitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầukhông khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2

β-N-acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liêntục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine(GlcNAc) Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide làm cơ chất Các oligsaccharide thường được thủyphân bên trong trên một vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên Một số chitinase

có khả năng thủy phân trisaccharide, một số khác thì không Có hai dạng chitinasethủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharid và trisaccharid; mộtphân cắt bên ngoài tạo các monosaccharid và tetrasaccharid Tóm lại chitinase thựcchất là enzyme cắt ngẫu nhiên

Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp choendochitinase hơn là chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase Chitooligomer(GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưngβ-N-acetylhexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục củahuyền phù chitin (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của β-N-acetylhexosaminidase nhưngkhông là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase Chính vì thế có thể sử dụng đểphân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và β-N- acetylhexosaminidase.Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine

1.1.3 Nguồn thu nhận chitinase

Chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn như Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus và đặc biệt ở xạ khuẩn Streptomycetes Vi

khuẩn tổng hợp chitinase nhằm phân giải các loại chitin trong môi trường nhằm sử

dụng nguồn cacbon cho sự sinh trưởng và phát triển Trong quá trình nuôi cấy vi sinhvật người ta thường bổ sung thêm cơ chất làm tăng khả năng sinh tổng hợp chitinase

và ổn định hoạt tính của enzyme sau tách chiết Vi khuẩn sinh chitinase nhằm đáp ứngnhu cầu dinh dưỡng Chúng thường tổng hợp nhiều loại chitinase để có thể phân cắtđược các loại chitin đa dạng trong tự nhiên Như vậy, chitinase vi khuẩn đóng vai tròquan trọng trong chu trình chitin trong tự nhiên

Chitinase cũng được sinh ra bởi các loài nấm sợi Các chủng nấm sợi sinh

chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia, …Đặc biệt là ở các loài nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus Chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan trọng về

mặt dinh dưỡng nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình pháttriển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách

tế bào nấm Trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật, người ta đều cho thêm

chitin-cơ chất của chitinase để làm tăng khả năng tổng hợp chitinase, đồng thời ổn định hoạttính chitinase sau quá trình chiết tách

Các thực vật bậc cao có khả năng sinh chitinase như: lúa, lúa mì, lúa mạch, lúamạch đen, cao su, thuốc lá,cà rốt, bắp cải, bắp, khoai tây, đậu Hà Lan, đậu nành, củ từ

và một số loài tảo biển Chitinase ở thực vật tồn tại chủ yếu trong các mô nhất địnhhoặc cơ quan sinh sản như hạt giống, củ, hoa và được cảm ứng bởi côn trùng, cũngnhư các tác nhân gây hại trên thực vật Ví dụ, các endochitinase mang tính base trong

lá đậu tập trung trong không bào và có chứa hầu hết các hoạt tính chitinase nội bào Các protein kháng khuẩn khác nhau được phân lập từ thực vật bao gồm thionin,protein bất hoạt ribosome, defensin và các enzyme phân giải như β-1,3-glucanase vàchitinase Nhiều chitinase, giống như các protein khác đóng vai trò bảo vệ, có thể chịuđược các protease ngoại bào, mang tính axit hoặc base

Từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóacủa nhiều loài động vật không xương: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt (ví

dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa), ta có thể thu nhận được chitinase Đối

với động vật có xương sống, chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của cácloài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dung dịch dạ dày của những loài chim, thú ănsâu bọ Chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trìnhphát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ lột da

Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticle) trong quá trình biến thái hay lộtxác

1.1.4 Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh chitinase của nấm sợi

1.1.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme củanấm sợi Enzyme xúc tác phản ứng hoạt động thích hợp ở dải nhiệt độ từ 20-50°C.Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ 28-32°C Nhiệt độ quá caohoặc quá thấp làm biến đổi cấu trúc của enzyme có thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậmchí có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzyme sẽ bị ức chế Mỗi chủng vikhuẩn khác nhau sẽ có giá trị nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động là khác nhau.Những nghiên cứu trước đây cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase

từ nấm T harzianusm là 28°C [28], Streptomyces sp ANU 6277 là 35°C [20] Aspergillus sp tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện nhiệt độ 37°C Lorito (1998) đã khảo sát hoạt tính chitinase từ nấm Trichoderma harzianum, nhận

thấy enzyme này có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ rộng từ 25-60°C,

nhiệt độ tối ưu là 40°C [4] Chitinase từ các chủng nấm sợi khác như Penicillium sp LYG 0704, Aspergillus carneus hoạt động tối ưu ở 40°C và Penicillium aculeatum ở

50°C [2]

1.1.4.2 Ảnh hưởng của độ ẩm

Độ ẩm có ý nghĩa trong nuôi cấy trên môi trường bán rắn Theo Matsumoto và

cộng sự (2001) nhận thấy độ ẩm 75% nấm Verticillium lecanii ATCC 26854 sinh chitinase cao nhất Takashi và cộng sự (2002) nhận thấy, nấm sợi Aspergillus sp tổng

hợp chitinase có hoạt tính cao ở điều kiện độ ẩm môi trường 57%

1.1.4.3 Ảnh hưởng của pH

Giá trị pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợpchitinase của các chủng nấm sợi Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môitrường ban đầu thích hợp là axit, trung tính hay kiềm Giá trị tối ưu của chitinase từ vi

sinh vật là 3,5-8,0 Nấm Aspergillus sp tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều

kiện pH = 5-6 [17] Nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy, chitinase từ một số loài như

nấm Penicillium chrochloron MTCC517 [23], L psaliotae [17] và vi khuẩn S.

marcescens MO-1 hoạt động tốt nhất ở pH 7,0 Trong khi, chitinase từ nấm L chlamydosporium và L suchlasporium, M anisopliae [27] hoạt động tốt nhất ở pH

5,2-5,7 Hoạt tính của chitinase sẽ nhanh chóng bị ức chế ở pH < 4,5, ngoại trừchitinase trong dạ dày của động vật có xương sống vẫn hoạt động ở pH 3,0

1.1.4.4 Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng

Trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật người ta đều bổ sung thêm cơ chấtchitin nhằm tăng khả năng tạo chitinase Nhìn chung sự có mặt của chitin trong môitrường nuôi cấy hữu ích cho việc tạo chitinase Năm 2003, Binod và cộng sự đã sửdụng nhiều cơ chất khác nhau (như vách tế bào nấm, vỏ tôm, cua) để tạo chitinase từnấm sợi nuôi cấy trên môi trường bán rắn Nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp và các

cộng sự (2003) chỉ ra rằng hệ enzym chitinase của Trichoderma sp có thể được cảm ứng bởi vách tế bào vi nấm (Curvularia oryzae, Phytophthoraprimulae), vách tế bào nấm lớn (Schizophyllum commune, Trametes versicolor) hoặc chitin vỏ tôm, trong đó

vách tế bào nấm cảm ứng quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của

Trichoderma tốt hơn chitin vỏ tôm Goma (2012) khi tối ưu điều kiện nuôi cấy vi khuẩn B thuringiensis và B licheniformis nhận thấy, nguồn nitơ là casein thích hợp

cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase [4]

1.1.5 Nghiên cứu về chitinase:

1.1.5.1 Trên thế giới

Đối tượng được nghiên cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn Streptomyces.

Những nghiên cứu trên đối tượng này nhằm thu nhận chitinase ứng dụng chủ yếu vàoviệc phá vỡ vách tế bào nấm Năm 1978, Carroad và Tom có công trình nghiên cứuviệc sử dụng phương pháp sinh học trong xử lý chất thải chứa chitin, và tiếp đó lànghiên cứu của Cosio và Fisher (1982) đề cập đến quá trình sản xuất enzyme nhằm xử

lý chất thải chứa chitin Những năm gần đây, chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối

tượng nấm sợi Trichoderma Năm 1991, Ulhoa và Peberdy nghiên cứu sự điều hòa quá trình sinh tổng hợp chitinase từ nấm Trichoderma harzianum cho thấy, Trichoderma là chi nấm đến nay được phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao, ứng

dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt trong bảo vệ thực vật Đối với chi nấm

Aspergillus cũng đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng sinh chitinase của

chúng trên môi trường bán rắn

Từ nấm Paecilomyces javanicus, Chen và đồng tác giả (2007) đã phân lập được

gen mã hóa chitinase từ DNA có chiều dài 1035 bp, không chứa intron, mã hóa chophân tử protein gồm 344 amino acid với khối lượng 37 kDa Như vậy, gen mã hóachitinase từ một số chủng nấm là khác nhau về số lượng, kích thước và trình tự sắpxếp của các nucleotide [8]

1.1.5.2 Trong nước

Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cộng sự (2004) khi nghiên cứu khả năng đối kháng

nấm F oxysporum và Phytophthora của một số chủng vi khuẩn đã phân lập được vi khuẩn S liquefaciens 1A8 có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao trong môi trường

có chứa chitin keo, ở 20°C và pH 7,0 [7] Năm 2008, Đinh Minh Hiệp và cộng sự đã

khảo sát hoạt tính chitinase từ một số chủng nấm Trichoderma phân lập tại Việt Nam Kết quả cho thấy, có 24/92 chủng nấm Trichoderma cho hoạt tính chitinase cao (hoạt tính ≥ 14x10-2 đvht/ml) Trong số 36 chủng nấm Trichoderma phân lập từ đất vùng Đông Nam Bộ, chủng Trichoderma TĐ14 sinh chitinase cao nhất sau 7 ngày nuôi

được sử dụng để tạo chitinase [3] Năm 2008, Nguyễn Đình Nga và cộng sự khảo sát

khả năng tác động lên nấm Candida albicans của chitinase thu nhận từ thực vật và từ nấm Trichoderma Trên thực vật, năm 2008, Đặng Trung Thành đã nghiên cứu quá trình thu nhận chitinase từ cây khoai lang Ipomoea batatas thu được chitinase có hoạt

tính khá cao (đạt 192 UI/ml) là 4 mg/ml

Quá trình tối ưu sinh tổng hợp chitinase cũng là hướng nghiên cứu được thựchiện Năm 2012, bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm, Quách Ngọc Tùng và

cộng sự đã lựa chọn được môi trường tối ưu cho vi khuẩn B licheniformis DS23 sinh

tổng hợp chitinase cao nhất Năm 2013, Vũ Thị Thanh và cộng sự đã phân lập được

chủng nấm Penicillium sp M4 có hiệu lực diệt rệp ngô cao (đạt 92,3% sau 7 ngày

phun) và được sử dụng để nghiên cứu khả năng sinh chitinase [9] Ở Việt Nam,nghiên cứu chitinase chủ yếu tập chung vào quá trình tối ưu khả năng sinh chitinasetrên một số chủng vi sinh vật và sử dụng chitinase để ức chế sự phát triển, cũng nhưnghiên cứu biểu hiện gen chitinase trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và khởi đầu tronglĩnh vực y dược

1.2 Enzyme protease

1.2.1 Khái niệm về protease

Protease là nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid trong phân

tử protein và polypeptid đến các sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiềuprotease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin (Hình 1.1).[31]

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân liên kết peptide 1.2.2 Nguồn gốc của protease

Protease thường có ở thực vật, động vật và vi sinh vật Tuy nhiên nguồn protease

ở vi sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn) là phong phú nhất

Ở động vật, protease thường có ở tụy tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ dàytrong đường tiêu hóa Hệ protease ở tụy tạng gồm các loại như trypsin, chymotrypsin

và một số enzyme khác được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy; pepsin có ở niêmmạc dạ dày được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị tham gia vào quá trình tiêu hóathức ăn Ở dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi có chứa renin, một loại enzyme đông tụ sữađiển hình, được sử dụng phổ biến trong công nghệ sản xuất phomat [6]

Bên cạnh đó, thực vật cũng được coi là nguồn sinh tổng hợp protease cao Hệprotease ở thực vật gồm các loại như papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ cònxanh; Bromelain có ở quả, chồi và vỏ quả dứa; Các enzyme này được sử dụng đểchống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh do kết tủa protein [16][26] Fixcin

có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả là nguồn enzyme được sử dụng để phân hủyprotein trong tự nhiên Hiện nay, các nhà khoa học đã tạo ra được các giống đu đủ cósản lượng mủ và hoạt tính papain cao để có thể khai thác hiệu quả nguồn enzyme này

Ở họ dứa: Bao gồm tất cả các nòi dứa trồng lấy quả, lấy sợi (kể cả các nòi dứa dại).Trong các bộ phận khác nhau của cây dứa (vỏ, lõi, chồi, thân, lá) đều có chứabromelain; sản lượng enzyme này phụ thuộc nhiều vào trạng thái và điều kiện bảoquản nguyên liệu Một số nghiên cứu đã chứng minh, các nguyên liệu khi sấy khô ở

nhiệt độ 40°C sẽ giữ được hoạt tính protease tốt hơn so với nguyên liệu đã được bảoquản lạnh ở 4°C [6].

Protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác và ứng dụnghàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống Nhưng hiện nay lượngenzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng enzyme từ vi sinhvật Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao; tốc độ sinh sản của vi sinh vậtmạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, lượngenzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao

Protease được sinh ra từ vi sinh vật gồm các nhóm như vi khuẩn, xạ khuẩn vànấm mốc.Vi khuẩn là một trong những nhóm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp

protease mạnh nhất Các vi khuẩn thuộc các chi như: Bacillus [14], Clostridium [25], Aeromonas [15], Micrococcus [22] và Serratia [30] Bên cạnh đó, nấm mốc cũng được

xem là đối tượng có khả năng sinh protease khá phong phú Protease được sinh ra từ

các loài nấm thuộc các chi như Aspergillus [29], Trichoderma [13], Metharhizium [24] và Penicillium [19] Ngoài ra, xạ khuẩn cũng được coi là đối tượng có khả năng sinh protase Các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh tổng hợp protease gồm các loài như: Streptomyces griseus, S fradiae và S gulbargensis Đặc biệt, nấm men cũng

là nhóm có khả năng sinh tổng hợp protease mạnh, gồm các chi như Mitochondria

Protease được tạo ra từ vi sinh vật có vai trò phân giải protein trong môi trường

để tạo nên các phân tử lượng nhỏ tham gia vào quá trình trao đổi chất của cơ thể.Protease là một enzyme không thể thiếu đối với cơ thể vi sinh vật Có thể nói, vi sinhvật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất protease ở qui mô lớn dùng trongcông nghệ và đời sống

Exopeptidase gồm hai loại: loại 1 là aminopeptidase là enzyme xúc tác thủyphân liên kết ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra các axit amin,

dipeptide hoặc tripeptide Loại 2 là carboxypeptidase là enzyme xúc tác thủy phân liênkết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một axit amin hoặc mộtdipeptide.

Endopeptidase gồm 4 loại là serin protease, cysteine protease, aspartic protease

và metallo protease

Loại 1: Serin protease là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trongtrung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác củaenzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ là chymotrypsin và subtilisin Nhómchymotrypsin bao gồm các emzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase.Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme từ vi khuẩn như subtilisin Carlsberg,subtilisin BPN Các serin protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thểhiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

Loại 2: Cysteine protease là các protease chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạtđộng Cysteine protease bao gồm các protease thực vật như papain, bromelin, một vàiprotein động vật và protein ký sinh trùng Các cysteine protease thường hoạt động ởvùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

Loại 3: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin gồm cácenzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic protease có chứanhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động ở pH trung tính

Loại 4: Metallo protease là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốccũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo protease thường hoạt động mạnh ởvùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Dựa vào điểm đẳng điện, protease được chia thành 3 nhóm là: Protease axit với

pH từ 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men nhưng ít thấy ở vi khuẩn Proteasetrung tính với pH từ 7-8 có ở động vật, thực vật và vi khuẩn Protease kiềm với pH từ9-11

1.2.4 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật

Các công trình nghiên cứu protease từ vi sinh vật ngày càng nhiều Các kết quảnghiên cứu cho thấy ngay cả protease của cùng 1 loài vi sinh vật cũng có thể khácnhau về nhiều tính chất Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động protease từ vi