Nghiên cứu khả năng tích luỹ coenzyme q10 của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp phân lập tại việt nam

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---Đoàn Thị Bắc NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Đoàn Thị Bắc

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP

PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội, 2020

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Đoàn Thị Bắc

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP

PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: TS Lê Thị Nhi CôngHướng dẫn 2: TS Tạ Thu Hằng

Hà Nội, 2020

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tácvới các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần

đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và chophép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Đoàn Thị Bắc

Lời cảm ơn

Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắcnhất tới TS Lê Thị Nhi Công, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường,Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và

TS Tạ Thu Hằng, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Nông nghiệp, ViệnNghiên cứu và Phát triển Vùng, là những người thầy đã dành cho tôi những ýtưởng quý báu, cũng như sự hướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi

và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Liên và các anh chịtrong Phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh học đãgiúp đỡ nhiệt tình và đóng góp những ý kiến quý báu cũng như tận tình chỉdạy, tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoahọc và Công nghệ cùng với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học- Viện Hànlâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi được họctập và nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu và Pháttriển Vùng đã tạo điều kiện cho tôi có thời gian để học tập trong thời giancông tác ở Viện, tôi đã nhận được sự hỗ trợ nhiệt tình từ Phòng Công nghệsinh học Nông nghiệp nơi tôi đang công tác, sự giúp đỡ nhiệt tình và độngviên của các anh, chị, em đồng nghiệp, nhân dịp này tôi xin chân thành cảm

ơn sự giúp đỡ quí báu đó

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những ngườithân trong gia đình và những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh, động viên

và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tác giả

Đoàn Thị Bắc

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

tắt, kí hiệu

Bchl Bacteriochlorophyll Sắc tố diệp lục vi khuẩn

CoQ10 Coenzyme Q with chain Coenzyme Q với chuỗi

containing 10 isoprene subunits isoprene có chứa 10 tiểu

đơn vị

HPLC High-performance liquid Sắc kí lỏng hiệu năng

TCL Thin layer chromatography Sắc kí lớp mỏng

Danh mục các bảng

Bảng 1.1 Hàm lượng Coenzyme Q10 (μg/g) của một số loại thực phẩm 7

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá hàm lượng Coenzyme Q10 của các chủng 28

Bảng 3.2 So sánh khả năng sử dụng một số nguồn C của các chủng lựa chọnvới

Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel BCRC16408 31

Bảng 3.3 Hàm lượng CoQ10 của các chủng VKTQH tích lũy trên môi trườngnuôi cấy khác nhau 42

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1 Chuỗi vận chuyển điện tử 4

Hình 1.2 Hình ảnh quang phổ của vi khuẩn tía quang hợp 13

Hình 3.1 Khả năng sinh trưởng các chủng vi khuẩn tía quan hợp trên môitrường DSMZ 27 sau khi hoạt hóa 27

Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng thể hiện sự có mặt của Coenzyme Q10 28

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng FO2 (A, B) vàcủa chủng DQ4 (C, D) 30

Hình 3.4 Cây phát sinh chủng loại chủng FO2 và DQ4 dựa vào so sánh trình

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ COENZYME Q10 3

1.1.1 Cấu tạo của Coenzyme Q10 3

1.1.2 Đặc tính của Coenzyme Q10 3

1.1.2.1 Đặc tính lý hóa 3

1.1.2.2 Đặc tính sinh học trong cơ thể sinh vật 4

1.1.3.1 Tổng hợp hóa học 5

1.1.3.2 Coenzyme từ động vật và thực vật 6

1.1.3.3 Coenzyme Q10 từ vi sinh vật 7

1.1.4 Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 8

1.1.5 Ứng dụng của Coenzyme Q10 10

1.1.5.1 Ứng dụng trong y học 10

1.1.5.2 Trong mỹ phẩm 11

1.2 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC SẢN XUẤT COENZYME Q10 11

1.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp 11

1.2.2 Giới thiệu chung về vi khuẩn tía quang hợp 12

1.2.3 Ảnh hưởng của các nhân tố lý hóa đến sinh trưởng của vi khuẩn tía quang hợp 13

1.2.4 Các nghiên cứu về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp 15

1.2.4.1 Nghiên cứu trên thế giới về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp 15

1.2.4.2 Nghiên cứu trong nước về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp 16

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC 18

2.1.1 Nguyên vật liệu 18

2.1.2 Các thiết bị máy móc 18

2.1.3 Hóa chất 19

2.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy 19

2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy, hoạt hóa và đánh giá sinh trưởng của vi khuẩn tía quang hợp 20

2.3.2 Phương pháp xác định Coenzyme Q10 từ các chủng vi khuẩn tía quang hợp 20

2.3.3 Phương pháp xác định các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn tía quang hợp 22

2.3.3.1 Phương pháp đánh giá sinh trưởng và xác định các đặc điểm hình thái 22

2.3.3.2.Phương pháp xác định khả năng sử dụng một số nguồn carbon .22

2.3.3.3 Phương pháp phân tích gene mã hóa 16S rRNA 23

2.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 23

2.3.5.Xây dựng phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 từ các chủng lựa chọn 25

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VKTQH CÓ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CAO 26

3.1.1.Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng tích lũy

Coenzyme Q10 cao 26

3.1.1.1.Hoạt hóa và đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía quang hợp 26

3.1.1.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả tích lũy Coenzyme Q10 cao 27

3.1.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng lựa chọn.29 3.1.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào 29

3.1.2.2 Khả năng sử dụng các nguồn carbon 31

3.1.2.3 Xác định trịnh tự gene 16S rRNA của các chủng lựa chọn 32

3.2 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA 2 CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LỰA CHỌN 33

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 33

3.2.2 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 35

3.2.3 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 36

3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của 2 chủng lựa chọn .37

3.2.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sinh trưởng của 2 chủng lựa chọn 38

3.3 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT COENZYME Q10 TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LỰA CHỌN 39

CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

4.1 KẾT LUẬN 44

4.2 KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

MỞ ĐẦU

Coenzyme Q10 hay còn được gọi là ubiquinone (ubidecarenone hoặcCoQ10) là một trong ba Coenzyme tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử ởmàng tế bào của sinh vật nhân sơ và lớp màng trong ty thể của sinh vật nhânchuẩn CoQ10 có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp ATP – nănglượng sinh học của cơ thể sống Ngoài ra, CoQ10 còn có tính chất chống oxyhóa mạnh và có khả năng trung hòa các gốc tự do, vì vậy CoQ10 ngày càngđược ứng dụng rộng rãi làm nguồn thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sứckhỏe; được đưa vào mỹ phẩm làm đẹp như một chất chống oxy hóa, chống lãohóa để giúp cơ thể trẻ hóa; được ứng dụng trong y tế nhằm ngăn ngừa ungthư, điều trị nhiều bệnh về tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng cường hệthống miễn dịch …

Với nhiều ứng dụng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày mộttăng lên và đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để tổng hợp CoQ10như: lên men, tổng hợp sinh học, tổng hợp hóa học hoặc tách chiết từ môđộng vật và thực vật Đối với quá trình tổng hợp hóa học vẫn bị nhược điểm

là các chất hóa học sử dụng có thể gây độc ra môi trường CoQ10 có thể đượcthu nhận từ động vật và thực vật, tuy nhiên nồng độ CoQ10 trong tế bào rấtthấp không thể tách chiết ở qui mô công nghiệp và chi phí rất cao Vì vậy, quátrình tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp sinh học được sử dụng rất nhiềuhiện nay, có thể đem lại hiệu quả thương mại, đặc biệt sản phẩm CoQ10 rất antoàn cho người sử dụng, đồng thời giá thành lại rẻ nhất

CoQ10 có thể được tổng hợp thông qua quá trình lên men nhờ các vi

khuẩn (Agrobacterium tumefaciens, Paracoccus denitrificans, Rhizobium radiobacter, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter sulfidophilus, Rhodopseudomonas palustris …), nấm mốc và nấm men (Asperillus, Bullera, Bulleromyces, Cyptococcus, Fellomyces, Kockovaella, Rhodoturola, Sporobolomyces, Utilago) Trong số các vi khuẩn này, vi khuẩn tía quang hợp

(VKTQH) là nguồn vi sinh vật lý tưởng để thu nhận CoQ10 vì chúng có khảnăng tổng hợp, tích luỹ hàm lượng ubiquinone cao hơn các vi sinh vật khác,đặc biệt cho sản phẩm chủ yếu là CoQ10 Bên cạnh đó, VKTQH có thể nuôi

cấy dễ dàng bằng môi trường đơn giản dưới ánh sáng mặt trời Vì vậy, đây cóthể là nguồn tiềm năng thu nhận một lượng lớn các chất có tác dụng sinh học,đặc biệt là CoQ10.

VKTQH có rất nhiều loài và khả năng tích lũy CoQ10 sẽ khác nhau phụthuộc vào sự sinh trưởng cũng như điều kiện nuôi cấy của các loài Ở tế bàoVKTQH, CoQ10 nằm trong vùng kỵ nước của lớp màng phospholipid củamàng tế bào, do đó điều cần thiết là phá vỡ màng tế bào để chiết xuất thànhphần này Phương thức phá vỡ màng tế bào VKTQH sẽ ảnh hưởng đến hiệuquả của việc chiết xuất CoQ10 Một số phương pháp chiết xuất CoQ10 đãđược thực hiện với hiệu quả khác nhau và chủ yếu phù hợp cho quy mô phòngthí nghiệm Các nghiên cứu về tác động của một số yếu tố như nhiệt độ, ánhsáng, độ pH và nồng độ muối ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển củaVKTQH cũng như khả năng tích lũy CoQ10 của VKTQH chưa được công bố

nhiều ở Việt Nam Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp phân lập tại Việt Nam”.

*Mục tiêu nghiên cứu:

- Lựa chọn và xác định được điều kiện nuôi cấy thích hợp các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng tích lũy CoQ10 cao

- Xây dựng phương pháp tách chiết CoQ10 nhằm định hướng ứng dụngtrong sản xuất thực phẩm chức năng

*Nội dung nghiên cứu

- Tuyển chọn và đánh giá đặc điểm sinh học của 1-2 chủng VKTQH có khả năng tích lũy CoQ10 cao

- Khảo sát các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho việc sinh trưởng của các chủng lựa chọn

- Xây dựng phương pháp tách chiết CoQ10 từ các chủng VKTQH lựachọn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1 TỔNG QUAN VỀ COENZYME Q10

1.1.1 Cấu tạo của Coenzyme Q10

Coenzyme Q10 (CoQ10) có công thức phân tử C59H90O4, trọng lượngphân tử 863,34 g/mol CoQ10 có cấu trúc dạng chuỗi dài nằm trên màng sinhchất của tế bào vi khuẩn và màng trong ty thể của tế bào sinh vật nhân thực[1] Đầu của CoQ10 là đầu quinone, nó có chức năng chuyển giao điện tử.Đuôi của CoQ10 là một chuỗi isoprenoid dài, giúp cho các phân tử CoQ10 cóthể khuếch tán dễ dàng trong lớp màng lipid [2]

Coenzyme Q có thể tồn tại dưới 3 trạng thái: dạng khử ubiquinol(CoQH2), dạng trung gian (CoQH •), và dạng ôxi hóa ubiquinone (CoQ) [2]

120 oC hoặc cao hơn

Molyneux (2006) cho rằng CoQ10 bị nhạy cảm với ánh sáng và bị phânhủy gần như hoàn toàn sau 24 giờ tiếp xúc với ánh sáng (bao gồm ánh sánghuỳnh quang) Hàm lượng CoQ10 không bị thay đổi khi được gói trong giấy bạc

do tránh khỏi sự tác động của ánh sáng Vì vậy, trong quá trình tách chiết CoQ10cần bảo vệ mẫu tránh tiếp xúc với ánh sáng và định lượng CoQ10 có thể đượctiến hành trong điều kiện ánh sáng bình thường của phòng thí nghiệm với thờigian không quá 2 giờ [1] CoQ10 được bảo vệ tốt nhất khi tạo phức với

β – cylodextrin, hàm lượng CoQ10 bị tổn thất chỉ khoảng 20 % khi có sự kết hợp chiếu sáng UV và ở nhiệt độ cao [4, 5]

 Tính chất hóa học:

CoQ10 là một hợp chất kị nước, tan trong chất béo và các dung môi phân cực, có những tính chất tương tự như vitamin [6, 7] Nó rất dễ tan trong

chloroform và carbontetra chloride, tan tự do trong dioxane, ether và hexane,tan một phần trong acetone, hầu như không tan trong nước, methanol vàethanol.

CoQ10 kỵ với các tác nhân oxy hóa mạnh, khi tiếp xúc với các hợp chấtkiềm tính CoQ10 có thể tạo ra ubichromenol, là một dạng sản phẩm phân hủy

1.1.2.2.Đặc tính sinh học trong cơ thể sinh vật

 Vận chuyển điện tử và cung cấp năng lượng

CoQ10 được xác định chủ yếu nằm ở lớp màng trong ty thể của sinh vậtnhân chuẩn và màng plasma của sinh vật nhân sơ CoQ10 đóng vai trò chínhtrong việc chuyển điện tử giữa các phức hợp hô hấp của chuỗi vận chuyểnđiện tử, nằm trong màng trong ty thể, mà sản phẩm cuối cùng là adenosinetriphosphate (ATP) Quá trình này thường được gọi là sự hô hấp

Hình 1.1 Chuỗi vận chuyển điện tử [8]

Cả dạng khử (quinol) và dạng ôxi hóa (quinone) của Coenzyme Q có thể

di chuyển dễ dàng trong lớp màng lipid Trong chuỗi hô hấp, CoQ10 chịu tráchnhiệm vận chuyển điện tử từ phức hợp protein I (NADH dehydrogenase) đếnphức hợp protein II (succinate dehydrogenase) và từ phức hợp II đến phức hợpIII (phức hợp bc1) [9] Khi nhận các electron từ cả phức I và phức II, nó

vẫn ở dạng khử là ubiquinol và sau khi chuyển các electron sang phức III, nótrở lại dạng oxy hóa thành ubiquinone [8] (Hình 1.1) Chính sự khuếch táncủa CoQ cùng với Cytochrome C trong lớp màng ti thể đã đóng vai trò quantrọng trong việc luân chuyển các điện tử đến các phức hợp kế nhau trongchuỗi chuyển điện tử [2] Các cơ quan đòi hỏi nhu cầu năng lượng cao hơnnhư não, tim, thận và gan có hàm lượng CoQ10 cao hơn.

 Chức năng chống oxy hóa

CoQ10 là chất chống oxy hóa hòa tan lipid duy nhất được tìm thấy ởngười và nó tập trung vào hầu hết mọi màng, từ màng ty thể đến mànglipoprotein mật độ rất thấp (VLDL) [9] Nhờ tính hòa tan này CoQ10 có thểbảo vệ lipoprotein và lipid khỏi sự peroxy hóa và tổn thương oxy hóa

[10] CoQ10 có thể kết hợp cùng với các chất chống oxy hóa khác, chẳng hạnnhư vitamin C và vitamin E để chống lại tác hại của các gốc tự do phát sinh từcác phản ứng trong ty thể tạo ra năng lượng [11]

CoQ10 có khả năng dọn dẹp gốc tự do trong cơ thể sống kém hiệu quảhơn so với các vitamin Tuy nhiên CoQ10 lại là một chất chống oxy hóa cókhả năng tái tạo vitamin E [12] CoQ10 còn có chức năng bảo vệ màng tế bào,protein và các acid nucleic (DNA, RNA) khỏi quá trình oxy hóa bằng cáchtrực tiếp ngăn cản tia UV, làm sạch các gốc tự do hoặc gián tiếp bằng cách táitạo thành α- tocopherol [13, 14]

CoQ10 cũng ức chế collagenase - một loại enzyme phá hủy các môliên kết của da [8], trao đổi các proton và Ca 2+ qua màng sinh học [15].CoQ10 có vai trò trong các quá trình sinh lý khác, bao gồm quá trình hìnhthành liên kết disulfide, oxy hóa sulfide, chuyển hóa pyrimidine [16]

1.1.3 Nguồn thu Coenzyme Q10

CoQ10 được sản xuất từ 3 nguồn thu: từ vi sinh vật (tổng hợp sinh học),các mô động vật và thực vật, tổng hợp từ các chất hóa học (tổng hợp hóa học)

1.1.3.1 Tổng hợp hóa học

CoQ10 có thể tổng hợp theo một số con đường bán tổng hợp [17].Phương pháp này sử dụng solanesol một chất nền khởi đầu cho quá trình tổng

hợp chuỗi mạch nhánh isoprene liên kết với dẫn xuất quinone, sau đó đượcchuyển đổi thành CoQ10 Solanesol có thể được tổng hợp hoặc dễ dàng thuđược bằng cách chiết xuất từ lá thuốc lá hoặc khoai tây [18, 19].

Mu và cộng sự (2011) đã tiến hành tổng hợp CoQ10 bằng phương pháphóa học một cách đơn giản và hiệu quả thông qua hợp chất (2'E) -1- (3-methyl-4-p-toluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2,3,4,5-tetramethoxybenzene là tiền thâncủa vòng quinone Hợp chất này là chất trung gian quan trọng để tổng hợpCoQ10 thông qua một phản ứng ghép đôi với các bromide solanesyl [18]

Tuy nhiên, việc sản xuất theo phương pháp này thường trải qua nhiềubước và tốn kém rất nhiều chi phí liên quan đến các phản ứng xúc tác nănglượng cao do sử dụng chất nền đắt tiền và gây ra nhiều ảnh hưởng tới môitrường bởi các chất thải hóa học được tạo ra nhiều từ quá trình sản xuất [18]

Vì vậy, quá trình tổng hợp CoQ10 vẫn được cải tiến để ứng dụng trong sảnxuất công nghiệp

1.1.3.2 Coenzyme từ động vật và thực vật

CoQ10 có trong nhiều loại thực phẩm nhưng với hàm lượng ít, nhưnghàm lượng CoQ10 đặc biệt cao trong các loại nội tạng như tim, gan, thận,cũng như thịt bò, dầu đậu nành CoQ10 lần đầu tiên được phân lập từ tim bòbởi Frederick Crane (USA) năm 1957 [20]

Một số loài có chất béo như cá thu, cá trích là những nguồn tài nguyên

có chứa hàm lượng dầu và CoQ10 cao trong mô cơ của chúng [8, 21] Ngoài

ra, CoQ10 cũng có trong cây thuốc lá (360 μg/g CoQ10), lúa (600 μg/g), cácloại quả và các loại rau củ (nhiều nhất là trong bông cải xanh, rau bina, dầuđậu nành, cải dầu, dầu cọ, các loại hạt và cây họ đậu) [22, 23]

Mặc dù có thể thu nhận CoQ10 từ động vật và thực vật tuy nhiên nồng

độ CoQ10 trong tế bào rất thấp không thể chiết tách ở quy mô công nghiệp dohiệu suất thấp và chi phí cao Đây là lí do chính khiến cho các nghiên cứu vềCoQ10 từ động vật và thực vật bị hạn chế

Bảng 1.1 Hàm lượng Coenzyme Q10 (μg/g) của một số loại thực phẩm [24]

Thịt & Cá Rau củ quả Dầu và các loại hạtTuần lộc 157,9 Trái bơ 9,5 Dầu ô liu (EV) 114-160

 Coenzyme Q10 từ nấm men và nấm mốc

Một số loại nấm men đã được nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp

Coenzyme Q10 như Cryptococcus laurentii, Trichosporon sp., Sporobolomyces salmonicolor, và R sphaeroides và các loại nấm men khác như Candida, Rhodotorula và Saitoella [25, 37] Các loài nấm men như

Sporidiobolus johnsonii, tích lũy CoQ10 nội bào từ 0,8 đến 3,3 μg/g khối

lượng tế bào khô [28]

Schizosaccharomyces pombe cũng là một loại nấm phổ biến để sản

xuất protein và CoQ10 [29] Saccharomyces cerevisiae cũng đã được nghiên

cứu về các điều kiện tối ưu quá trình sản xuất CoQ10 [30] Trong một số loài

nấm mốc như Neurospora crassa và Aspergillus fumigatus cũng sinh tổng hợp

CoQ10 nhưng với hàm lượng thấp [31]

 Coenzyme Q10 từ vi khuẩn

Các vi khuẩn sinh tổng hợp CoQ10 nhiều chủ yếu tập trung ở các chủng

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Paracoccus denitrificans và Rhodopseudomonas sphaeroides [25, 26, 27, 32] Agrobacterium tumefaciens cho thấy năng suất tổng hợp CoQ10 cao nhất

[26]

1.1.4 Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết Coenzyme Q10

 Tách chiết bằng phương pháp cơ học

Có thể dùng các phương pháp như siêu âm hoặc dùng áp suất để phá

vỡ tế bào và thu nhận CoQ10 Tian (2010) tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens 1.2554 theo quy trình: sinh khối sau ly tâm

bổ sung đệm 2 mM Tris HCl (pH 7,5), tiến hành siêu âm (12 giây on, 10 giâyoff) năng lượng sóng siêu âm 500W, tổng thời gian siêu âm 12 phút [33]

Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013), sử dụng biện pháp cơ học để tách

chiết CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides như sau: các tế bào thô được trộn với 5

mL nước cất và bị phá vỡ ở các áp suất khác nhau (5,5; 16,5; 27,5 hoặc 38,5MPa) bằng cách sử dụng máy đồng nhất hóa cao (Constant, England) [34]

 Tách chiết bằng phương pháp nhiệt độ

Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013), tách chiết CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides như sau: các tế bào ướt (0,5 g DCW) được trộn đều với nước cất

(2 mL) và để đông lạnh ở -75 oC trong 30 phút, sau đó được làm nóng ở 100

oC trong 30 phút, thêm 5 ml HCl 4N vào dung dịch mẫu Hỗn hợp được lắcvotex trong 20 phút ở 30 oC, sau đó được chiết xuất với 28 ml hỗn hợp n-propanol và hexane (tỷ lệ thể tích = 3: 5) và lắc đều trong 5 phút ở 40 oC Mẫuchiết sau đó được hòa tan trong ethanol 95 % Dung dịch mẫu (10 mL) làđược xử lý bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác địnhhàm lượng của CoQ10 [34]

 Tách chiết bằng phương pháp sử dụng các chất hóa học

Ranadive và cộng sự (2011) đã tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng

Sporidiobolus johnsonii ATCC 20490 20 ml dịch nuôi được ly tâm với tốc độ

1000 vòng/phút trong 20 phút để thu sinh khối Để chiết CoQ10, sinh khốiđược bổ sung 20 ml 100 % ethanol lắc trong nước 60 oC trong 3 giờ Tế bàođược loại bỏ bằng phương pháp ly tâm và thu dịch, ethanol được chiết lại với

20 ml n-hexane Thu lấy pha n-hexane có chứa CoQ10, cô đặc tới 1 ml và đưavào sắc ký để định lượng [35]

Narendra và cộng sự (2012) đã tiến hành thu nhận CoQ10 từ

Saccharomyces cerevisiae như sau: sinh khối ướt tế bào được ủ với ethanol tỷ

lệ (1:5) ở 60 oC trong 1 giờ Chiết xuất lặp lại 3 lần bằng n-hexane [30]

Theo Nguyễn Bá Kiên và cộng sự (2010), CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides đột biến được thu nhận theo phương pháp sau: 10 g sinh khối ướt

được hòa trong 70 ml methanol, ủ 55 oC trong 5 phút Bổ sung 140 mlchloroform và khuấy ở 30 oC trong 20 phút, sau đó được lọc qua giấy lọc(Whatman no.1) Bổ sung NaCl (0,58 %, w/v) bằng 1/5 so với thể tích dịchlọc Dịch lọc và dung dịch muối NaCl được đảo trộn, để yên, thu pha dưới,làm khô và hòa tan lại trong ethanol [36]

Thitima Rujiralai và cộng sự (2014) đã nghiên cứu phương pháp chiết

xuất Coenzyme Q10 (CoQ10) từ Artemia 1 g Artemia tươi được ủ với acid

axetic 75 % ở (30 ± 2) oC trong 24 giờ, sau đó là ba lần chiết liên tiếp với hỗnhợp 5 ml hexane và 5 ml ethanol, sau đó phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năngcao được kiểm chứng với máy dò mảng diode [37]

 Tách chiết bằng phương pháp sử dụng enzyme

Theo Ha và cộng sự (2007b), khi thực hiện với chủng Agrobacterium tumefaciens KCCM 10413 sinh khối được bổ sung dung dịch ly giải tế bào

Cellytic B, ủ 30 phút, bổ sung hỗn hợp dung môi propanol và n-hexane (3:5)vào dịch ly giải tế bào và khuấy mạnh Chiết thu pha trên sau đó đem cô đặc,hòa tan trong ethanol [38]

Zahiri và cộng sự (2006) đã lựa chọn Lysozym thường thủy phân liênkết β (1-4) glucosid của các peptidoglucan để tạo ra độ cứng cho tế bào vikhuẩn Gram dương và Gram âm Lysozym thường được liên kết với EDTA đểtạo phức với canxi sẽ làm giải phóng các lipopolysacarit và phá hủy tế bàođặc biệt là vỏ tế bào vi khuẩn gram âm Nhóm nghiên cứu tách CoQ10 từ các

tế bào E coli tái tổ hợp theo phương pháp sau: sinh khối sau ly tâm bổ sung

dung dịch ly giải tế bào [sucrose 8 %, Triton X-100 5%, Tris-HCl 50 mM (pH8.0), EDTA 50 mM (pH 8.0) và 1 mg/ml lysozyme] ủ 37 oC trong 30 phút Bổsung n-hexane: n-propanol (5:3) (tỉ lệ 1: 2 so với dịch nuôi), thu pha trên, lặplại bước chiết 2 lần Cô đặc, và hòa tan sản phẩm trong ethanol [39]

Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013) cũng xử lý enzyme để phá vỡ tế bàobằng cách: khi được rửa hai lần bằng nước cất, các tế bào ướt (0,5 g DCW)được hòa tan trong 450 µl dung dịch Cell Lytic B, trộn với 50 µl dung dịchlysozyme (10 mg/mL), sau đó được ủ trong 20 phút 25 oC để gây ra ly giải tếbào Sau khi phá vỡ tế bào, CoQ10 được chiết xuất bằng hỗn hợp 25 ml n-propanol và hexane (tỷ lệ thể tích = 3: 5) Thời gian chiết là 5 phút ở nhiệt độ

40 oC Lượng CoQ10 trong mẫu được đo bằng HPLC [34]

1.1.5 Ứng dụng của Coenzyme Q10

1.1.5.1 Ứng dụng trong y học

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sử dụng CoQ10 có chức năng cải

thiện chức năng tim mạch thông qua việc tăng cường sản xuất năng lượng, cobóp cơ tim, hoạt động chống oxy hóa và ngăn chặn quá trình oxy hóalipoprotein mật độ thấp [6, 40] Việc điều trị với CoQ10 cải thiện đáng kểchức năng cơ tim mà không có tác dụng phụ hoặc tương tác thuốc [41]

Điều trị bằng CoQ10 làm giảm các thay đổi sinh lý bệnh tế bào liênquan đến rối loạn chức năng ty thể ở bệnh nhân Parkinson PD [42], làm giảmcác biểu hiện stress oxy hóa ở bệnh nhân Huntington [43], bảo vệ thần kinhvới việc điều trị các tổn thương gây ra bởi rối loạn chức năng ty thể trong biểuhiện bệnh Alzheimer (AD), có liên quan đến tổn thương oxy hóa gây ra bởirối loạn chức năng ty thể [44, 45]

CoQ10 cũng có khả năng tăng cường hệ miễn dịch thông qua làm tăngcường hoạt động của đại thực bào và làm tăng sinh bạch cầu hạt Điều trịCoQ10 dẫn đến làm giảm khối u và biến mất các di căn được chẩn đoán vàkhoảng 1-3 năm sau di căn không xuất hiện trở lại [46] Bổ sung CoQ10 giúpngăn ngừa tổn thương tim, nhiễm độc gan, tiêu chảy và viêm miệng mà khônglàm giảm hiệu quả điều trị trong quá trình hóa trị với doxorubicin [47, 48].Thực phẩm và đồ uống có chứa CoQ10 đã được đề xuất để ngăn ngừa ung thư

và giảm thiểu các phản ứng bất lợi của bệnh ung thư [49]

Ngoài ra, CoQ10 còn được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường [50],

sơ vữa động mạch [34], bệnh hen suyễn [51], bệnh hen phế quản, đau nửa đầu[52]

1.1.5.2 Trong mỹ phẩm

CoQ10 được bổ sung vào mỹ phẩm có tác dụng ngăn ngừa các nếpnhăn CoQ10 có hiệu quả trong việc bảo vệ các tế bào sừng bởi sự phá hủycủa tia UVA CoQ10 cũng có hiệu quả đáng kể trong việc giảm sự lão hóa cơthể người bằng cách làm giảm nếp nhăn thông qua khả năng làm tăng cườngsức đề kháng của da, giảm sự lão hóa da và dọn dẹp gốc tự do CoQ10 có thểxâm nhập vào lớp biểu bì, nơi mà có sự biến đổi từ dạng oxy hóa sang dạngkhử và hoạt động như một chất chống oxy hóa Hiện nay CoQ10 được kết hợpvới retinoic acid dùng để điều trị bệnh lão hóa

Như vậy có thể thấy, CoQ10 có rất nhiều ứng dụng trong thực tế và cóthể được tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau như tổng hợp hóa học, từ động

thực vật, đặc biệt là từ vi sinh vật Trong các nhóm vi sinh vật, vi khuẩn tía

quang hợp là một trong những vi sinh vật tiềm năng và có khả năng tích lũyCoQ10 khá cao

1.2 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP VÀ ỨNGDỤNG TRONG VIỆC SẢN XUẤT COENZYME Q10

1.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp

Đây là nhóm vi khuẩn có khả năng quang hợp nhờ có sắc tố quang hợp.Sắc tố quang hợp ở vi khuẩn (bacteriochlorophyll) khác với sắc tố quang hợpcủa thực vật Đặc biệt VKQH không sử dụng nước làm nguồn hidro như thực

vật và không tạo ra sản phẩm cuối cùng là oxi Chúng sử dụng nguồn hidro làsunfit thiosunfat, hidro tư do, chất hữu cơ và sản sinh ra nhiều sản phẩm phụdạng oxi hóa Bao gồm: vi khuẩn lưu huỳnh lục, vi khuẩn tía lưu huỳnh và vikhuẩn tía không lưu huỳnh.

1.2.2 Giới thiệu chung về vi khuẩn tía quang hợp

Vi khuẩn tía quang hợp là các tế bào gram âm, đơn bào, có các dạngcầu, xoắn, hình que ngắn, hình phẩy đứng riêng rẽ hoặc thành chuỗi Các loài

vi khuẩn tía quang hợp đều sinh sản bằng cách nhân đôi, một số loài sinh sản bằng cách nảy chồi [53]

Chúng có khả năng chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượnghóa học bởi quá trình quang hợp kị khí VKTQH thường có màu hồng đếnmàu đỏ tía, sắc tố quang hợp chính là bacteriochlorophyll a hoặc b Cơ quanquang hợp là màng quang hợp được gắn với màng tế bào

Năm 1907, Molish là người đầu tiên phát hiện ra các vi khuẩn có sắc tốmàu đỏ và có khả năng quang hợp, nên ông gọi chủng vi khuẩn quang hợp này là

Rhodobacteria Nhóm này gồm hai họ là Thiorhodaceae (những vi khuẩn tía có

khả năng hình thành giọt “S” bên trong tế bào) và Athiorhodaceae (là những

vi khuẩn tía không có khả năng hình thành giọt “S” bên trong tế bào) [54].Nhóm vi khuẩn tía bao gồm hai họ này sau này được đổi tên là bộRhodosprillales và hai họ Choromatiaceae và Rhodospirillaceae [55]

Vi khuẩn tía lưu huỳnh và vi khuẩn tía không lưu huỳnh ban đầu đượcphân biệt dựa trên cơ sở sinh lý (dựa trên khả năng chứa và sử dụng sulfidecủa chúng) Nhóm vi khuẩn tía lưu huỳnh là các loài có thể chống chịu đượchàm lượng sulfide trong môi trường ở mức độ cao và trong quá trình oxy hóasulfide, "giọt" lưu huỳnh được tích lũy bên trong tế bào, trong khi đó, nhóm vikhuẩn tía không lưu huỳnh thì có thể chống chịu sulfide ở mức độ thấp hơn vàkhông tích lũy giọt lưu huỳnh bên trong tế bào (Hình.1.2a)

Vì vậy, khi sinh trưởng trên môi trường chứa sulfide thì có thể dễ dàngphân biệt được nhóm vi khuẩn tía lưu huỳnh và nhóm vi khuẩn tía không lưuhuỳnh nhờ sự quan sát giọt lưu huỳnh tích lũy trong hay ngoài tế bào dướikính hiển vi điện tử phản pha (Hình 1.2a)

Hình 1.2 Hình ảnh quang phổ của vi khuẩn tía quang hợp [56]

Ngoài ra, phân tích phylogenetic của VKTQH dựa trên trình tự sosánh 16S rRNA đã chỉ ra rằng vi khuẩn tía lưu huỳnh là loài vi khuẩngammaproteobacteria trong khi vi khuẩn tía không lưu huỳnh là alpha hoặcbetaproteobacteria [57]

1.2.3 Ảnh hưởng của các nhân tố lý hóa đến sinh trưởng của vi khuẩn tía quang hợp

 Ảnh hưởng của pH

Quang hợp của vi khuẩn tía có thể xảy ra trong môi trường có pH 3-11[58] Vi khuẩn tía sinh trưởng và phát triển ở pH tối ưu khoảng 6-7

VKTQH ưa acid là khá ít, chỉ có hai chi (ba loài) được biết đến như là

Rhodoblastus acidophilus (trước đây là Rhodopseudomonas acidophila) là

phổ biến trong môi trường acid yếu như đầm lầy Các chủng này đều cho thấy

sự tăng trưởng bị giới hạn khi pH gần bằng 4 [59] Rhodopila continiformis

được phân lập từ các suối nước nóng có tính acid (pH 3,5 – 4) [60]

Rhodopila continiformis có độ pH tối ưu cho sự tăng trưởng tương tự như của các loài Rhodoblastus, nhưng có khả năng chịu acid cao hơn vì tính chất acid

mạnh hơn trong môi trường sống của nó Rất ít vi khuẩn tía quang hợp sống ở

điều kiện acid và điều này có thể là do ở môi trường acid pH thấp, sulfide sẽ tồn tại ở dạng độc hại H2S.

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Năm 1980, vi khuẩn tía lưu huỳnh Thermochromatium (ban đầu là Chromatium) được phân lập trong nuôi cấy thuần [62] là một loài vi khuẩn ưa

nhiệt (tối ưu hóa nhiệt độ ~ 50 ºC, nhiệt độ tối đa 57 ºC) và tạo ra một phứchợp hấp thụ ánh sáng (LH) hấp thụ tối đa gần 920 nm [63]

Các vi khuẩn tía ưa nhiệt nhẹ khác (nhiệt độ tăng trưởng tối ưu ~ 40 ºC)

đã được nuôi cấy từ thảm vi khuẩn suối nước nóng Chúng bao gồm các loài

có chứa BChl như Rhodopseudomonas sp chủng GI, Rhodocista cryptolactis

và Rhodocista centenum Quang hợp của vi khuẩn tía có thể xảy ra ở nhiệt độ

lên tới 57 oC và xuống tới 0 oC [64] Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng vàphát triển của hầu hết vi khuẩn tía là 30 oC

 Ảnh hưởng của các yếu tố khác

Nhiều loài vi khuẩn tía có thể sinh trưởng quang dưỡng với sulfide như làchất cho điện tử với nồng độ nhỏ hơn 2 mM (tương đương 64 mgS-2/L) Nếu môitrường sống có nồng độ sulfide quá cao sẽ ức chế sự sinh trưởng của chúng

[58] Hai loài Rhodobacter Sulfi dophilus và loài Rhodoferax antarcticus có

thể chịu đựng được sulfide với nồng độ hơn 4 mM [65] Ngoài ra, nồng độNaCl trong môi trường cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi khuẩn tía

Có loài sống được trong môi trường nước biển có độ mặn từ 8-11 % NaCl

1.2.4 Các nghiên cứu về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp

1.2.4.1 Nghiên cứu trên thế giới về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về khả năng tích lũy CoenzymeQ10 của một số loài VKTQH

Tian và cộng sự (2010) nghiên cứu về tối ưu môi trường nuôi cấy đối

với loài Rhodospirillum rubrum nhằm tăng khả năng tổng hợp CoQ10 bằng

phương pháp phản ứng bề mặt (RSM) trong nuôi cấy ống nghiệm tĩnh Môitrường tối ưu để sản xuất CoQ10 là: 2,5 g/l axit malic; 1,29 g/l chiết xuấtmen; 1,34 g/l (NH4)2SO4; 0,20 g/l MgSO4.7H2O; 0,9 g/l K2HPO4; 0,6 g/lKH2PO4; 0,08 g/l citrat sắt; 0,02 g/l EDTA Hàm lượng thu được cao nhất củaCoQ10 là 9,76 mg/l, phù hợp với hàm lượng dự đoán RSM (9,63 mg /l) Năngsuất của CoQ10 trong thiết bị lên men 3 l cao hơn so với đạt được trong nuôicấy tĩnh và đạt 10,81 mg /l, có thể được quy cho sự khuấy trộn liên tục (400vòng/phút) giúp tăng cường tiếp xúc với chất nền tế bào trong suốt quá trìnhlên men [66]

Jiang và cộng sự (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa

tan (DO) về khả năng tích lũy CoQ10 của Rhodopseudomonas palustris bằng

cách sử dụng quy trình lên men hai giai đoạn J001 Hàm lượng DO tối ưu cho

sự phát triển của tế bào và tích lũy CoQ10 lần lượt là 45 % và 15 % Quá trìnhlên men hai giai đoạn, bao gồm giai đoạn 1 với 45 % DO, giai đoạn 2 với 15

% DO và 2,0 % NaAc tại thời điểm chuyển đổi (42 giờ sau khi tiêm chủng),

đã được chứng minh là tối ưu quá trình lên men để sản xuất CoQ10 Sinh khốitối đa, hàm lượng CoQ10 và tỷ lệ tích lũy CoQ10 lần lượt là 1,31 mg/l; 89,1mg/l và 1,142 mg/l, tăng lần lượt 28 %; 585 % và 426 % so với quá trình lênmen giai đoạn 1 với nồng độ DO là 45 % Nồng độ DO là yếu tố chính đểtăng hàm lượng CoQ10 theo quy trình lên men hai giai đoạn [67]

Nghiên cứu của Whu và cộng sự (2013) về tách và tinh chế CoQ10 từ

các tế bào ướt được sản xuất bởi Rhodobacter sphaeroides BCRC 13100.

Hàm lượng của CoQ10 được xử lý trước bằng cách sử dụng enzyme, ethanolhoặc homogenizer cao ở nông độ lần lượt là 2,85 mg/g; 2,01 mg/g và 2,11mg/g CoQ10 được chiết xuất với các dung môi hữu cơ khác nhau Sử dụngethanol để chiết xuất CoQ10 hai lần trực tiếp từ các tế bào thô sau khi lên mentạo ra năng suất CoQ10 là 2,9 mg/g Chiết xuất thô được tinh chế bằng cách

sử dụng chiết xuất ethanol, sử dụng hexane để phá vỡ tế bào, sự kết tinh đểtinh chế CoQ10 tinh khiết Độ tinh khiết của CoQ10 được xác định bằngphương pháp HPLC đạt 96 % [34]

Wang và cộng sự (2016) đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sản xuất

CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides Các quy trình tối ưu để sản xuất CoQ10

từ Rhodobacter sphaeroide là: hàm lượng chủng thêm vào là 2 % so với môi

trường, nhiệt độ lên men 30 °C, thời gian lên men 72 h, thể tích môi trườngđến bình tổng thể tích 60 %, nhiệt độ chiết 90 °C, giá trị pH của nước axittrong chất chiết là pH=3 Trong các điều kiện tối ưu, năng suất của CoQ10được tăng thêm 141 % so với các điều kiện trước khi tối ưu hóa [68]

1.2.4.2 Nghiên cứu trong nước về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp

Từ năm 1999, nhóm nghiên cứu của PGS.TS Lê Quang Huấn đã cónhững kết quả ban đầu về khả năng tích lũy CoQ10 của một chủng VKTQH

thuộc chi Rhodobacter Nhóm tác giả đã tinh sạch được ubiquinone với phổ

hấp thụ đặc trưng ở dạng oxy hóa tại bước sóng 275 nm và phổ hấp thụ đặctrưng ở dạng khử tại bước sóng 291 nm [69]

Năm 2005, nhóm tác giả Đỗ Thị Tố Uyên và Trần Văn Nhị đã bước đầuxây dựng được quy trình sản xuất ubiquinone từ sinh khối VKTQH Kết quảcho thấy, nhóm tác giả đã lựa chọn được bể thủy tinh để nuôi lấy sinh khốiVKTQH và sử dụng phương pháp siêu âm để phá vỡ tế bào Từ đó, tách chiếtubiquinone dạng thô bằng hệ dung môi diethyl ether/ethanol với tỷ lệ 3/1(v/v) [70]

Trong nghiên cứu của Lê Thị Thanh Thảo, tiến hành khảo sát các yếu

tố ảnh hưởng như nguồn carbon, nguồn nitơ, vitamin, dịch chiết cà rốt và dịch

chiết cà chua đến sự tăng trưởng tế bào cũng như sản xuất CoQ10 của các

chủng vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris PN16, PN21 và PN31 được

phân lập tại Việt Nam Bổ sung vào môi trường nuôi cấy mannitol, pepton,cao nấm men và vitamin E sẽ làm tăng việc sản xuất CoQ10 từ các chủng vikhuẩn khảo sát Chọn được phương pháp chiết Q10 từ tế bào vi khuẩn vàchủng PN31 có hàm lượng Q10 là 399,8 µg/g sinh khối sau thời gian nuôi cấy

là 72 giờ [71]

Tuy nhiên, khu hệ vi sinh vật ở nước ta là rất đa dạng, nhưng số lượngnghiên cứu và công bố về VKTQH có khả năng tích lũy CoQ10 còn chưaphong phú Qua so sánh với các công bố trên thế giới, có thể thấy rằng hàmlượng tích lũy CoQ10 ở các chủng này còn chưa cao và quy trình tách chiếtcòn chưa được tối ưu [9, 49] Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu khả năng tích lũy

Coenzyme Q10 của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp phân lập tại Việt Nam” đã được đặt ra.

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC

2.1.1 Nguyên vật liệu

- 06 chủng VKTQH có khả năng tích lũy sinh khối cao được phân lập

từ các mẫu nước nhiễm dầu được ký hiệu là: FO2, DQ1, DQ2, DQ3, DQ4 và

DQ5 và chủng Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel BCRC16408

được lưu giữ tại Phòng CNSH Môi trường, Viện Công nghệ sinh học

- Trình tự nucleotide của các cặp mồi đã sử dụng để tách gen 16SrRNA: cặp mồi đặc hiệu 27F (5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và1527R (5′-AGAAAGGAGGTGATCC AGCC-3′)

- Vector pCRTM được sử dụng làm vector tách dòng nhân đoạn gen 16S

rRNA, chủng E coli DH5 được sử dụng cho biến nạp do Phòng Vi sinh vật

học phân tử, Viện Công nghệ sinh học

2.1.2 Các thiết bị máy móc

Các thiết bị máy móc được sử dụng bao gồm thiết bị của Phòng côngnghệ sinh học Môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen,Viện Công nghệ sinh học:

+ Tủ nuôi cấy vi sinh (Binder, infors, Đức);

+ Bình khí nitơ (Nga), máy quang phổ NOVASPEC II (Anh);

+ Máy quang phổ UV-1650PC (Shimazdu, Nhật Bản);

+ Cân phân tích Mettler toldo (Thụy Sỹ);

+ Máy li tâm lạnh CT15RE HiMac (Hitachi);

+ Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ);

+ Máy điện di Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ);

+ Máy soi DNA (mini-transllumminator, Bio-Rad, Mỹ);

+ Máy Vortex (Đức),

+ Máy đo pH (Thommas Scientific, Mỹ),

+ Máy lắc ổn nhiệt (N-Biotex, Hàn Quốc),

+ Bể ổn nhiệt (N-Biotex, Hàn Quốc),

+ Máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ),

+ Tủ lạnh thường GR-K22EA (Toshiba) và

+ Tủ lạnh sâu -20oC (Alaska),

+ Box cấy Biocyt ESI Flufrance (Pháp),

+ Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật Bản) và

+ Kính hiển vi điện tử JEM1010 (Nhật Bản),

+ Máy đọc trình tự gene tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic

Analyzer

2.1.3 Hóa chất

- CoQ10 chuẩn từ hãng Sigma Các hóa chất thông thường dùng trongmôi trường nuôi cấy vi sinh vật do Trung Quốc và Việt Nam sản xuất Cáchóa chất dùng trong sinh học phân tử đều là các hóa chất có độ tinh khiết caođặt từ các hãng như Merk (Đức), Ferrmentas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Ấn Độ

2.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy

- Môi trường phân lập và nuôi cấy VKTQH là môi trường DSMZ 27bao gồm các thành phần sau: Cao nấm men (0,3 g/l), succinate –Na (1 g/l),acetate (0,5 g/l), K2HPO4 (1 g/l), KH2PO4 (0,5 g/l), MgSO4.7H2O (0,4 g/l),CaCl2.2 H2O (0,05 g/l), NH4Cl (0,4 g/l), vi lượng SL6 (1 ml/l), dung dịchvitamin B12 (0,4 ml/l), nước cất (1000 ml), pH (6,8)

- Môi trường DSMZ 27 có bổ sung 2% thạch

- Vitamin và vi lượng bổ sung:

+ Dung dịch vi lượng SL6 (mg/l): HCl (25%) 6,5 ml; FeCl2.4H2O 1,5 g;

H3BO3 0,3 g; MnCl2.2H2O 0,03 g; CoCl2.6H2O 0,2 g; ZnSO4 7H2O 0,1 g;CuCl2.2H2O 17 mg; NiCl2.6H2O 24 mg; Na2MoO4.2H2O 36 mg, H2O 993 ml.+ Dung dịch vitamin B12: 10 mg trong 100 ml nước được khử trùng bằng màng lọc và bổ sung vào môi trường trước khi sử dụng

2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Thời gian thực hiện: từ 15/8/2018 đến 15/8/2019

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ sinh học Môi trường

(CNSHMT), Viện Công nghệ sinh học, VAST

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy, hoạt hóa và đánh giá sinh trưởng của

vi khuẩn tía quang hợp

VKTQH được nuôi cấy trong ống thủy tinh có nắp đậy cao su hoặctrong các bình thủy tinh hình trụ có thể tích chứa dịch môi trường DSMZ 27.Môi trường trong các bình và các ống thủy tinh được sục khí nitơ qua mànglọc vô trùng thay thế khí oxy trong môi trường sao cho nồng độ oxy hòa tan 0mg/l Các chủng VKTQH được nuôi trong lọ penicillin V=10 ml hoặc bìnhthủy tinh V=100 ml chứa môi trường DSMZ 27 ở điều kiện kỵ khí, ánh sángđèn sợi đốt có cường độ 5000 lux, nhiệt độ 27-30 oC

Hoạt hóa các chủng VKTQH bằng cách: Khi sinh trưởng của các chủngVKTQH được nuôi cấy ở pha log với mật độ tế bào khoảng 109 thì được cấyvào bình thí nghiệm thể tích 500 ml khoảng 5-10 % (v/v) để đạt mật độ banđầu OD800 khoảng 0,1 Sau đó các chủng VKTQH được nuôi bằng cách nuôitĩnh trong môi trường DSMZ 27 điều kiện kỵ khí với cường độ ánh sáng 5000lux từ đèn sợi đốt Mỗi chủng VKTQH được hoạt hóa làm lặp lại 3 lần, mỗilần 3 bình thí nghiệm

Sinh trưởng của các chủng VKTQH được xác định thông qua độ hấp phụcủa dịch huyền phù tế bào ở pha log (khoảng 5 ngày nuối cấy) tại bước sóng 800

nm (OD800), vì trong tế bào VKTQH Bchl có cực đại hấp thụ ở 800 nm và độhấp thụ này tỷ lệ với hàm lượng Bchl và do vậy tỷ lệ thuận với sinh khối của tếbào Các chỉ số này được đo trên máy máy quang phổ UV-1650 PC

2.3.2 Phương pháp xác định Coenzyme Q10 từ các chủng vi khuẩn tía quang hợp

- Tách chiết, tinh sạch CoQ10 [13]: Dịch nuôi cấy các chủng VKTQHtrong môi trường DSMZ 27 sau 5 ngày nuôi cấy được ly tâm loại dịch thu

sinh khối tươi (ly tâm ở 8000 vòng/phút, 4 oC trong 10 phút) CoQ10 được tiến hành chiết xuất dựa theo phương pháp của Paterson và Buddie [72].

+ Cân khoảng 2,5 g sinh khối tươi cho vào ống falcol được thêm 25 mlhỗn hợp methanol: n- hexane (tỉ lệ thể tích 3:2) Sau đó lắc votex hỗn hợptrong 20-30 phút, ly tâm ở 8000 vòng/phút, 4 oC trong 10 phút Tách lấy dịch trên và cô chân không ở 60 oC thu được cặn thô

+ Cặn khô có chứa CoQ10 được hoàn tan trở lại trong hỗn hợp dungmôi methanol: hexane và chiết lấy pha hexane; sau đó pha hexane được côđặc đến khô (quá trình lặp lại 3 lần) Sau đó CoQ10 tiếp tục được tinh sạchbằng cột silica với dung môi methanol làm pha động và được cân bằng 10 lầnthể tích cột Mẫu dịch chiết CoQ10 được đưa lên cột và chạy với hệ dung môirửa giải là ethanol Do CoQ10 có màu vàng nên tiến hành thu nhận các phânđoạn chứa CoQ10 Cặn thô được hòa tan dung môi n –hexan được gọi là dịchthô chứa CoQ10

- Xác định sự có mặt của CoQ10 bằng sắc ký bản mỏng (TCL): Dịchthô thu được từ sinh khối các chủng được sử dụng để xác định sự có mặt củaCoQ10 bằng phương pháp sắc kí bản mỏng tráng silicagel 60 F254 (TCL) phathường với hệ dung môi n–hexan: etyl ete với tỉ lệ là 4:1 (v/v) Lượng dịchthô của mỗi chủng tiêm vào sắc kí bảng mỏng là 5 µl Chủng VKTQH có vếtCoQ10 đậm nhất và sinh trưởng tốt nhất được lựa chọn cho các nghiên cứutiếp theo

- Định lượng CoQ10 bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao(HPLC) [73]

Xây dựng đường chuẩn Q10 bằng phương pháp HPLC

Xây dựng đồ thị mối quan hệ giữa nồng độ Q10 và diện tích píc hấpthụ sắc ký trong khoảng nồng độ là 1200; 2400; 3600; 4800 và 6000 mg/l.Phân tích từng mẫu trên với thiết bị sắc ký lỏng cao áp HPLC 1100 tại bướcsóng  = 280 nm cho ra đường chuẩn dùng để xác định hàm lượng Q10 trongmẫu thí nghiệm

Phân tích hàm lượng CoQ10 được thực hiện trên hệ thống HPLC: Dịchthô thu được từ sinh khối các chủng VKTQH được xác định hàm lượng bằngphương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với các điều kiện: sử dụng cộtHypersil C18 (200 x 4 mm); tỷ lệ pha động Hexan : Aceton = 90: 10 (v/v); tốc

độ dòng chảy 0,5 ml/phút và áp suất là 220 bar

Tiến hành: Sau khi đặt xong các thông số cần thiết, tiến hành rửa bơm,rửa cột, chạy đường nền và áp suất ổn định 30  45 phút Lọc mẫu trước khi

đo bằng micro filter 2-3 lần, lượng mẫu tối thiểu đạt 0,5 ml Dùng Micropipetlấy 5 ml dung dịch phân tích đưa vào buồng mẫu Máy sẽ tự động ghi cácthông số: Thời gian lưu (RT), chiều cao pic và tính điện tích cũng như thànhphần phần trăm (%) của từng cấu tử trong hỗn hợp

+ Sau khi đo xong mẫu để thiết bị chạy đường nền 10 phút trước khi

bơm mẫu tiếp theo.

2.3.3 Phương pháp xác định các đặc điểm sinh học của các chủng

vi khuẩn tía quang hợp

2.3.3.1 Phương pháp đánh giá sinh trưởng và xác định các đặc điểm hình thái

Chủng VKTQH sinh tổng hợp CoQ10 tốt nhất được nuôi cấy đồng thờitrên môi trường DSMZ 27 thạch để quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào Hìnhthái tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật Bản)

và chụp ảnh tế bào trên kính hiển vi điện tử JEM1010 (Nhật Bản) và đượctiến hành tại phòng Vi sinh vât – Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Hà Nội

Phương pháp nhuộm Gram: Xác định Gram của vi khuẩn theo phương

pháp của Harry, sử dụng chủng vi khuẩn E coli và vi khuẩn Bacillus subtillis

làm đối chứng

2.3.3.2.Phương pháp xác định khả năng sử dụng một số nguồn carbon

Các chủng lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường DSMZ-27 trong đónguồn carbon được thay thế bằng các nguồn như: glucose, acetate, fructose,citrate, succinate, benzoate với nồng độ 1 g/l Khả năng sinh trưởng của

chúng được ghi nhận sau 5 ngày nuôi cấy ở điều kiện kỵ khí, có chiếu sángvới cường độ khoảng 5000 lux.

2.3.3.3 Phương pháp phân tích gene mã hóa 16S rRNA

ADN của các chủng lựa chọn đã được tách chiết bằng bộ kit QIAmpADN mini và Blood Hard Book theo quy trình của nhà sản xuất Qiagen Phảnứng PCR để nhân đoạn gen 16S rARN với cặp mồi đặc hiệu 27F (5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và 1527R (5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′) Quá trình nhân tiến hành với tổng thể tích 25 l bao gồm: 12,5 lPCR master mix; 0,75 l mồi (20 M) mỗi loại; 8 l dH2O; 3 l ADN khuôn.Việc nhân gen được tiến hành với chu trình nhiệt: 94 0C trong 5 phút; 32 chu

kỳ lặp lại (94 oC trong 1 phút; 56 oC trong 50 giây; 72 oC trong 50 giây); 72

oC trong 7 phút và 4 oC để bảo quản

Sản phẩm PCR được phân tách trên gel agarose 1 % và tinh sạch bằng

bộ kit AccuPrep PCR Purification theo quy trình của nhà sản xuất Bioneer.Tiếp đó sản phẩm PCR (kích thước khoảng 1500 bp) được gắn vào vectơ tách

dòng, biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α Dòng plasmid chứa đoạn

gen mong muốn được tách chiết, tinh sạch và xác định trình tự trên máy xácđịnh trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer Việc so sánhtrình tự nucletide và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng BTLP1 vớicác chủng vi khuẩn đại diện khác sử dụng phần mềm Blast, Bioedit, Clustal X

độ khác nhau 14-16 oC, 27-30 oC, 38-40 oC Mỗi thí nghiệm về khoảng nhiệt

độ nuôi cấy làm lặp lại 3 lần Các bình được nuôi ở điều kiện kỵ khí, có ánhsáng Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào

ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kết quả

- Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng: thí nghiệm được tiến hành nhưmục 2.3.1 trong các bình thủy tinh hình trụ 100 ml, nhiệt độ 27-30 oC dướiánh sáng đèn sợi đốt, có 6 mức cường độ ánh sáng thí nghiệm là 0, 1000,

2000, 3000, 4000 và 5000 lux Ở mỗi thí nghiệm về cường độ ánh sáng làmlặp lại 3 lần Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù

tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kếtquả

- Ảnh hưởng của pH: thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.1 trongcác bình thủy tinh hình trụ 10 ml chứa các môi trường DSMZ-27 được điềuchỉnh với 9 mức pH: 4; 5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5 và 9 Các bình được nuôi trongđiều kiện kị khí, sáng, nhiệt độ 27 – 30 oC Ở mỗi thí nghiệm pH làm lặp lại 3lần.Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ởcác bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kết quả

- Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl: thí nghiệm được tiến hành nhưmục 2.3.1, các chủng lựa chọn được nuôi trong các bình thủy tinh hình trụ 10

ml chứa môi trường DSMZ-27 với nồng độ muối ban đầu được điều chỉnh ở

10 mức nồng độ: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4 và 5 % Ở mỗi thí nghiệmnồng độ muối làm lặp lại 3 lần Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụcủa dịch huyền phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm(OD800) và đánh giá kết quả

- Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ: thí nghiệm được tiến hành nhưmục 2.3.1 trong các bình thủy tinh hình trự 100 ml chứa các môi trườngDSMZ-27 có thay thế hàm lượng nitơ trong NH4Cl bằng 7 nguồn nitơ từpepton, (NH4)2SO4, ure, NH4NO3, KNO3, NaNO3 và Ca(NO3)2.4H2O Ở mỗithí nghiệm về các nguồn nitơ làm lặp lại 3 lần Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành

đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng

800 nm (OD800) và đánh giá kết quả

2.3.5 Xây dựng phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 từ các chủng lựa chọn

Tiến hành nuôi cấy các chủng VKTQH lựa chọn trong bình 500 ml cóchứa môi trường DSMZ 27 và môi trường tối ưu thu được từ các điều kiệnnuôi cấy ở trên

Sau đó tiến hành tách chiết, xác định hàm lượng CoQ10 theo các bước

ở mục 2.3.2 và so sánh đánh giá kết quả hàm lượng CoQ10 thu được

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình của các lần lặp lạithí nghiệm ± độ lệch chuẩn (Standard Deviation - SD) Sử dụng phương pháp

xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007 và phần mềm Irristat 5.0

để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa là α = 0,05

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁCCHỦNG VKTQH CÓ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CAO

3.1.1.Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng tích lũy Coenzyme Q10 cao

Việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng sinhtổng hợp CoQ10 cao trước tiên dựa trên khả năng sinh trưởng (tạo sinh khối)

và hàm lượng CoQ10 tích lũy

3.1.1.1.Hoạt hóa và đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía quang hợp

06 chủng VKTQH từ bộ sưu tập chủng giống của phòng CNSH Môitrường được hoạt hóa trên môi trường DSMZ 27 Sau 5 ngày nuôi tĩnh trongđiều kiện kỵ khí, sáng, chúng tôi tiến hành đo độ huyền phù tế bào OD800của các chủng và thu được kết quả thể hiện ở Hình 3.1A và Hình 3.1B

(A)