Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2 oxoindolin tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ MAI DUNG TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ D

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ MAI DUNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

HÀ NỘI, 2020

Công trình được hoàn thành tại:

Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Hải Nam Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá cấp Trường họp tại: Vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia Việt Nam

Thư viện Đại học Dược Hà Nội

I MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Trong những năm gần đây, các chất ức chế enzym HDAC đã trở thành các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên đã được FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dưới da Sau đó, belinostat, panobinosat cũng đã được phép sử dụng trong điều trị một số bệnh ung thư Bên cạnh đó, rất nhiều chất ức chế enzym HDAC, đặc biệt các dẫn chất kiểu propenamid, cũng được nghiên cứu và đang đưa vào thử nghiệm lâm sàng như NVP-LAQ824, MS-275, cyclodepsipeptid FK-228… Luận án được thực hiện theo hướng nghiên cứu nhằm tìm kiếm ra các chất ức chế HDAC mới có

hoạt tính kháng tế bào ung thư Đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin” được tiến

3 Những đóng góp mới của luận án

Về thiết kế tổng hợp các acid hydroxamic

Luận án đã thiết kế và tổng hợp được 62 acid hydroxamic mới, những cấu trúc này chưa được công bố trong các tài liệu trước đó

Về thử tác dụng sinh học

Thử tác dụng ức chế enzym: 21 chất dãy I-III được thử tác dụng ức chế

HDAC bằng phương pháp Wesstern blot ở nồng độ 3 µg/ml, có 18/21 chất

thể hiện tác dụng ức chế HDAC 41 chất dãy IV-X được định lượng nồng

độ ức chế HDAC2 bằng phương pháp định lượng huỳnh quang, có 6 chất

có IC50 nhỏ hơn SAHA, đa số các chất có IC50 < 6,5 µM Cả 62 chất đều được thử độc tính tế bào trên 3-4 dòng tế bào ung thư Kết quả, 20 chất bao

gồm Ia-g, IIa-e, Ve, Vf, VIIIe, IXc, IXg, Xa-c có độc tính mạnh hơn SAHA ở các dòng tế bào thử nghiệm Trong đó, chất Xc thể hiện tác dụng

mạnh nhất và được tiến hành thêm một số thử nghiệm gồm đánh giá tác

dụng ức chế HDAC1, 6, 8 và cùng với IXg, Xa, Xb được đánh giá độc tính trên tế bào phổi thường MRC-9 Kết quả, Xc có khả năng ức chế các

HDAC tương đương SAHA và có xu hướng chọn lọc HDAC1 và 6 hơn HDAC2 và 8 Các chất thử nghiệm đều thể hiện khả năng gây độc chọn lọc

tế bào ung thư hơn so với tế bào thường và mức độ chọn lọc cao hơn SAHA

4 Bố cục luận án

Luận án có 149 trang, 16 bảng, 66 hình, 15 sơ đồ Bố cục gồm các phần: Đặt vấn đề (1 trang), tổng quan (41 trang), nguyên liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu (11 trang), kết quả nghiên cứu (57 trang), bàn luận (36 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), danh mục các bài báo đã công bố liên quan đến luận án (1 trang) Luận án có 172 tài liệu tham khảo (14 trang) và 281 phụ lục (148 trang)

II NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương 1 TỔNG QUAN

Chương tổng quan đã trình bày về:

- Enzym HDAC: Khái niệm, phân loại và cấu trúc các HDAC nhóm I, II, IV

- Các chất ức chế HDAC đã được công bố theo các nhóm chất: acid hydroxamic, benzamid, peptid vòng, ceton, acid béo mạch ngắn và các nhóm chất khác

- Phương pháp tổng hợp vòng triazol: cơ chế, xúc tác, phối tử

- Phương pháp tổng hợp acid hydroxamic từ ester

- Định hướng thiết kế cấu trúc các chất trong luận án

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

- Các nguyên liệu, hóa chất, dung môi: Đức, Trung Quốc, Việt Nam

- Các dụng cụ thí nghiệm thông thường dùng trong tổng hợp hữu cơ

- Các máy đo nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân Máy đo độ hấp thụ huỳnh quang, tủ nuôi cấy, máy điện di

- Các dòng tế bào ung thư người thử nghiệm

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Tổng hợp 62 dẫn chất acid hydroxamic

- Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp dựa trên phân tích dữ liệu phổ

khối, phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1

H, 13C-NMR)

- Thử tác dụng ức chế HDAC của các chất tổng hợp được

- Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro của các chất tổng hợp được

Chương 3 KẾT QUẢ

3.1 Tổng hợp và kết quả phân tích phổ

Các chất được tổng hợp theo các quy trình dưới đây:

* Nhóm các acid hydroxamic không chứa vòng triazol

Gồm 3 dãy chất Ia-g, IIa-g, IIIa-g được tổng hợp theo các sơ đồ dưới đây,

và được khẳng định có cấu trúc đúng như dự kiến dựa vào kết quả phân tích các phổ

+ Dãy Ia-g

+ Dãy IIa-g

+ Dãy IIIa-g

+ Dãy IV - VIII

+ Dãy IXa-g

+ Dãy Xa-c

Bảng 3.1: Tóm tắt các kết quả tổng hợp

Chất Ia Ib Ic Id Ie If Ig

H (%) 74,0 72,0 69,3 67,0 71,0 75,0 75,0 Chất IIa IIb IIc IId IIe IIf IIg

H (%) 76,0 67,0 70,0 65,0 68,0 71,0 75,0 Chất IIIa IIIb IIIc IIId IIIe IIIf IIIg

H (%) 40,0 64,0 65,0 70,0 62,0 45,0 67,0 Chất IVa IVb IVc

H (%) 64,0 63,0 63,0

Chất Va Vb Vc Vd Ve Vf Vg

H (%) 68,0 72,0 64,0 68,0 71,0 60,0 70,0 Chất VIa VIb VIc VId VIe VIf VIg

H (%) 68,0 69,0 69,0 74,0 75,0 64,0 73,0 Chất VIIa VIIb VIIc VIId VIIe VIIf VIIg

H (%) 67,0 65,0 64,0 62,0 67,0 57,0 64,0 Chất VIIIa VIIIb VIIIc VIIId VIIIe VIIIf VIIIg

H (%) 69,0 72,0 75,0 75,0 68,0 64,0 76,0 Chất IXa IXb IXc IXd IXe IXf IXg

H (%) 50,0 54,0 51,0 55,0 52,0 53,0 52,0 Chất Xa Xb Xc

-7,10 -7,20 -7,30 -7,20 -7,60 -7,00 -7,40 Chất VIIIa VIIIb VIIIc VIIId VIIIe VIIIf VIIIg

Năng lượng tương tác của các chất đều nhỏ hơn SAHA cho thấy tiềm năng ức chế HDAC2 của các chất có thể so sánh với SAHA Ngoài ra, hình ảnh tương tác của các chất ở mô hình trung tâm hoạt động của HDAC2 (Hình 3.1) cũng cho thấy, các chất đều có phần cầu nối nằm trọn trong lòng kênh enzym, nhóm chức acid hydroxamic tiếp cận được tới ion kẽm ở khoảng cách đủ gần để có thể tạo được phức chelat Ngoài ra, những chất

có vòng thơm trong phần cầu nối, đặc biệt là vòng benzen, tạo được các tương tác van der Waals kiểu xếp chồng π-π với Phe155 và Phe210 Đây được dự đoán là yếu tố quan trọng tạo nên ái lực liên kết tốt

Hình 3.1: Hình ảnh docking của dãy chất IIIa-g

Phản ứng alkyl hoá: Cơ chế phản ứng là phản ứng thế nucleophil, được

minh hoạ trong Sơ đồ 4.1

Sơ đồ 4.1 Cơ chế phản ứng alkyl hoá

Theo các tài liệu tham khảo, phản ứng N-alkyl hoá khung indolin đều

được tiến hành trong môi trường base với tác nhân alkyl hoá là các dẫn xuất halogen Một số loại base thường được sử dụng trong quá trình gắn mạch alkyl vào nguyên tử N trên khung indolin có thể kể đến như: Na2CO3,

K2CO3, Cs2CO3, LiH, NaH, CaH2, TEA, LiOH, NMP, NaOEt Các loại dung môi có thể sử dụng trong phản ứng này gồm: DMF, DMA, HMPT, MeCN, DMSO, NMP, EtOH, MeOH, Me2CO So sánh các xúc tác base và dung môi về sự thuận lợi cho thao tác, sự sẵn có cũng như giá thành của nguyên liệu luận án đã lựa chọn sử dụng chất xúc tiến là K2CO3, dung môi DMF và xúc tác KI Sự có mặt của KI giúp tăng tốc độ phản ứng, do xảy phản ứng trao đổi nhóm khó bị thế -Br bằng nhóm dễ bị thế hơn -I theo

phản ứng Finkelstein Kết quả thu được các phản ứng N-alkyl hoá đều có

thể tiến hành thuận lợi trong điều kiện này với hiệu suất tương đối cao từ khoảng 75,0–96,0%

Phản ứng azid hoá: dùng trong các giai đoạn tổng hợp các chất trung

gian azid Đây là phản ứng theo cơ chế thế nucleophil (Sơ đồ 4.2):

Sơ đồ 4.2 Cơ chế phản ứng azid hoá

Trong trường hợp này, muối azid natri là một tác nhân nucleophil rất mạnh nên quá trình phản ứng có thể diễn ra trực tiếp mà không cần giai đoạn hoạt hoá Phản ứng azid hoá là phản ứng thế SN2 nên thường được tiến hành trong dung môi phân cực không proton như acetonitril, dimethylsulfoxid, dimethylformamid Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây cho thấy phản ứng azid hóa cũng có khả năng phản ứng tốt trong môi trường nước có sử dụng sóng siêu âm hỗ trợ hay hỗn hợp dung môi nước-THF Trong giai đoạn khảo sát lựa chọn dung môi, luận án đã thử tiến hành

phản ứng tổng hợp chất 3.9 trong nước và hỗn hợp nước-THF Nhưng do nguyên liệu ban đầu methyl 3-bromopropanoat (chất 3.8) là chất lỏng

không màu, có tính phân cực kém, không đồng tan trong nước và có tỷ trọng nặng hơn nước nên thường tách lớp nằm phía dưới đáy bình cầu Dù

đã sử dụng khuấy từ cũng như đun hồi lưu để hỗ trợ quá trình khuấy trộn trong bình cầu nhưng phản ứng vẫn diễn ra rất khó khăn Do đó, phản ứng được khảo sát tiếp theo với dung môi methanol, dung môi này ít phân cực

hơn nước, có khả năng hoà tan được cả ester 3.8 và NaN3 Kết quả khảo sát cho thấy sau khoảng 6 h ở điều kiện nhiệt độ phòng phản ứng diễn ra hoàn

toàn Quá trình tổng hợp các dẫn xuất alkyl azid khác gồm 3.12, 3.15, 3.18, 3.21, 3.24 cũng được tiến hành tương tự với dung môi methanol và điều

kiện nhiệt độ phòng Nhìn chung, các phản ứng tổng hợp các dẫn chất azid diễn ra tương đối thuận lợi, nhưng quá trình xử lý phản ứng phải trải qua giai đoạn tách chiết nên hiệu suất thu không cao chỉ khoảng từ 48,5% đến 68,4%

Phản ứng đóng vòng Click: phản ứng dùng để tạo thành cấu trúc

1,2,3-triazol trong cấu tạo của các dãy chất từ IV đến X Để phản ứng diễn ra

theo hướng tạo một sản phẩm duy nhất mang khung 1,2,3-triazol xúc tác được lựa chọn là muối đồng (I): CuI Muối CuI có ưu điểm là độ phân cực khác biệt nhiều so với các sản phẩm tạo ra nên giai đoạn xử lý phản ứng loại xúc tác tồn dư diễn ra thuận lợi hơn so với các muối đồng khác thường được dùng làm xúc tác như CuOTf.C6H6 hay CuSO4.5H2O/Natri ascorbat Dựa trên kết quả nghiên cứu của Yan Z.Y và cộng sự và một số nghiên cứu khác một số dung môi đã được lựa chọn để khảo sát phản ứng đóng vòng Click gồm: nước, aceton, t-BuOH, acetonitril, DMF Các alkyn và nitril không tan hoặc ít tan trong nước, aceton và t-BuOH nên phản ứng hầu như không diễn ra trong các dung môi này Ngược lại, phản ứng diễn ra khá tốt trong dung môi DMF và acetonitril Khi sử dụng dung môi DMF, phản ứng đóng vòng có thể tiến hành ở điều kiện nhiệt độ phòng và thời gian phản ứng khá nhanh từ 3-5 h Do nhiêt độ sôi của DMF khá cao (153o

C) nên không thể loại dung môi bằng phương pháp cất quay chân không Hướng

xử lý phản ứng trong trường hợp này sẽ là tạo kết tủa sản phẩm trong môi trường nước, kết tủa thu được sẽ bao gồm sản phẩm và lượng CuI dùng làm xúc tác Quá trình xử lý buộc phải tiến hành tinh chế thêm một bước nữa

Vì vậy, thời gian xử lý phản ứng khá dài và lượng sản phẩm tinh khiết thu được với hiệu suất khá thấp (dưới 40%) Trong khi đó, nếu sử dụng dung môi acetonitril thì sau khi kết thúc phản ứng có thể dễ dàng loại bỏ dung môi bằng phương pháp cất quay và tinh chế sản phẩm chỉ cần qua một bước, lượng sản phẩm tinh khiết thu được với hiệu suất tương đối cao

khoảng trên 60% Vì vậy, dung môi acetonitril là dung môi được lựa chọn

để tiến hành các phản ứng đóng vòng để tạo khung 1,2,3-triazol Nhìn chung, phản ứng Click là một phản ứng tương đối dễ thực hiện, tiến hành trong điều kiện đơn gian và có hiệu suất cao từ 58,2% đến 89,0%

Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic: phản ứng cuối cùng của mỗi

chuỗi phản ứng để tạo ra các acid hydroxamic theo thiết kế ban đầu Cơ chế phản ứng được minh hoạ trong Sơ đồ 4.3 như sau:

Sơ đồ 4.3 Sơ đồ cơ chế phản ứng tạo acid hydroxamic từ ester

Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic từ ester và hydroxylamin là một

phản ứng N-acyl hoá theo cơ chế thế nucleophil Phản ứng chỉ có thể diễn

ra trong môi trường kiềm mạnh pH > 10 Nguyên liệu hydroxylamin tham gia phản ứng thường được dùng dư khá nhiều so với ester để đảm bảo thu được tối đa sản phẩm acid hydroxamic từ một lượng ester ban đầu Theo các tài liệu tham khảo, hydroxylamin có thể dùng dưới dạng muối NH2OH HCl và khi tham gia phản ứng cần sự có mặt của các chất kiềm mạnh để chuyển hoàn toàn thành dạng base Do đó, các phản ứng tạo acid hydroxamic trong luận án đều sử dụng NaOH thêm vào hỗn hợp phản ứng với tỷ lệ gấp đôi số mol NH2OH.HCl Lượng NaOH dùng dư để chuyển hoàn toàn hydroxylamin thành dạng base, đồng thời tạo được pH môi trường đủ cao để phản ứng có thể diễn ra Ngoài ra, do cấu trúc của các acid hydroxamic được thiết kế khá cồng kềnh, không có nhiều nhóm chức thân nước nên khả năng tan trong nước có thể dự đoán là rất thấp (thực tế là các chất đều không tan trong nước) nên khi được tạo thành có thể kết tủa ngay trong bình phản ứng, cản trở sự tương tác của các ester với hydroxylamin

Do đó, một lượng dư NaOH là cần thiết để chuyển dạng acid sang dạng muối hydroxamat tan được trong hỗn hợp dung môi phản ứng Và sau khi kết thúc phản ứng cần acid hoá dung dịch về pH = 3 – 4 để thu được sản phẩm acid hydroxamic dạng kết tủa Phản ứng tạo acid hydroxamic của các chất trong luận án có hiệu suất phản ứng dao động từ 45,0 đến 82,5%

4.2 PHÂN TÍCH CẤU TRÚC

Tất cả các chất sau khi tổng hợp và tinh chế được đo phổ IR, MS, 1

NMR và 13C-NMR để xác định cấu trúc Ngoài ra, các chất trung gian được

H-tạo thành trong quá trình tổng hợp chất Ia là 3.2a, chất trung gian trong quá trình tổng hợp IXa gồm chất 3.7, 3.24, 3.25a cũng được tiến hành đo phổ

MS, 1H-NMR và 13C-NMR Các chất Ia, VIIa và IXa được chọn làm chất

đại diện để đo phổ 2D NMR HMBC và HSQC

là chứng minh cho sự hiện diện của nhóm chức acid hydroxamic ở tất cả các chất mục tiêu tổng hợp được

- Các vòng benzen có dao động hóa trị C-H vòng thơm xuất hiện trong khoảng 3089 – 3004 cm-1

và dao động hóa trị C=C vòng thơm xuất hiện trong khoảng 1615 – 1456 cm-1

- Phần cầu nối alkyl của các chất tổng hợp được cũng cho thấy sự có mặt trên phổ đồ với dao động hóa trị bất đối xứng CH2 từ 2998 – 2903 cm-1 và dao động hóa trị đối xứng CH2 từ 2895 – 2834 cm-1 Vị trí xuất hiện của hai đỉnh hập thụ này tương đối cố định trong mỗi dãy dẫn chất

- Trong vùng khoảng 1660 –1820 cm-1 của hầu hết các chất đều có hai đỉnh hấp thụ với cường độ mạnh và độ rộng trung bình Đây là dải phổ đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C=O Tương ứng với hai nhóm chức carbonyl trong cấu trúc của các chất mục tiêu gồm nhóm C=O ở vị trí số 2 trên khung indolin và nhóm C=O của chức acid hydroxamic Giá trị của 2 đỉnh hấp thụ dao động trong khoảng 1685-1638 và 1735-1703 cm-1

4.2.2 Phổ khối lượng

Phổ khối lượng đóng vai trò quan trọng trong khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp và thường được dùng để kiểm chứng xem sản phẩm phản ứng được tạo thành có khối lượng phân tử đúng như công thức dự kiến hay không Sau khi phân tích ion phân tử thu được trên phổ khối lượng, kết quả cho thấy tất cả các chất đều có sự phù hợp giữa kết quả đo khối phổ với công thức phân tử dự kiến Một số chất trên phổ đồ xuất hiện pic M+23 tương ứng với ion [M+Na]+

thay vì pic [M+H]+ trên phổ ESI(+) Đây là hiện tượng thường gặp trong phương pháp đo ESI vì dòng khí mang hoặc

bên trong thiết bị có thể chứa ion H, Na,K Như vậy, phổ khối lượng là cơ sở

để khẳng định các chất tổng hợp được có công thức phân tử đúng như dự kiến

4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ cộng hưởng từ proton 1

H-NMR:

4.2.3.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của dãy chất Ia-g, IIa-g và IIIa-g

- Proton vị trí 4” (H-4”) có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 7,03 – 8,01 ppm Tín hiệu cộng hưởng của proton H-4” có thể có dạng singlet, doublet hoặc doublet-doublet, do có tương tác ghép cặp với proton H-5”,

JH4”-H5”(ortho) = 7,0 – 8,5 Hz, tương tác với proton H-6”, JH4”-H6”(meta) = 2,0 –

2,5 Hz hoặc tương tác với F, JH4”-F(ortho) = 6,5 – 8,5 Hz

- Proton vị trí 5” có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 7,07–7,15 ppm, tín hiệu cộng hưởng có dạng triplet do có tương tác ghép cặp với proton H-4” và H-6” ở các chất không có nhóm thế hoặc các chất mang nhóm thế 7”-

Cl Hằng số ghép cặp của proton H-5” với hai proton bên cạnh là JH5”-4”(ortho) =

JH5”-6”(ortho) = 7,5–8,5 Hz

- Proton vị trí 6” có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 6,94 – 7,56 ppm Tín hiệu cộng hưởng của proton H-6” có các dạng là doublet, triplet, doublet-doublet hoặc doublet-triplet Dạng tín hiệu cộng hưởng doublet và doublet-doublet của proton H-6” có thể xuất hiện ở phổ đồ của các chất mang nhóm thế không phải F ở vị trí 5”, 7” do tương tác với các proton H-5”, 7” và 4” Dạng tín hiệu cộng hưởng triplet hoặc doublet-triplet xuất hiện trên phổ đồ của các chất không mang nhóm thế hoặc mang nhóm thế F ở vị trí 5” do tương tác với H-4”, 5”, 7” và nguyên tử F

- Proton vị trí 7” có độ dịch chuyển hóa học tương đối ổn định, ít bị ảnh hưởng bởi các nhóm thế hút hay đẩy electron, chỉ thay đổi trong một khoảng hẹp 6,82 – 7,02 ppm Dạng tín hiệu cộng hưởng của proton H-7” đa

số trường hợp là doublet do có tương tác ghép cặp với H-6”, JH7”-6”(ortho) =

7,5 – 8,5 Hz Riêng với hai chất có nhóm thế 5”-F (Ib, IIIb), tín hiệu cộng

hưởng có dạng doublet-doublets do H-7” ngoài tương tác với H-6” còn có

tương tác ghép cặp với nguyên tử F, JH7”-F(meta) = 4,0 Hz

- Hai proton của cầu nối methylen cũng có độ dịch chuyển hóa học tương đối ổn định, nằm trong khoảng 4,82 – 4,95 ppm Ngoại trừ, các dẫn xuất có nhóm thế 7”-Cl, pic của proton methylen bị dịch chuyển về vùng trường thấp nằm trong khoảng 5,21 – 5,30 ppm

- Khung benzen trong phần cầu nối có dạng thế di-para, có 4 proton tạo thành hai cặp đối xứng là cặp 2’, 6’ và 3’, 5’ Vị trí cộng hưởng của các cặp tương đối cố định với δH3’-H5’ = 7,19 – 7,35 ppm, δH2’-H6’ = 7,51 – 7,54 ppm Tín hiệu cộng hưởng của cả hai cặp proton luôn là doublet có hằng số ghép

cặp JH2’-H3’(ortho) =JH5’-H6’(ortho) = 7,0 – 8,5 Hz

- Cầu nối –CH2=CH2- có hai proton có giá trị nằm trong khoảng δH-2 = 6,42