Nghiên cứu ứng dụng khả năng kháng nấm colletotrichum gloesporides của nanochitosan trong bảo quản thanh long

Thành phần hóa học của quả thay đổi nhiều trong quá trình bảo quản [3], Phương pháp bảo quản sử dụng kết họp màng bao có chứa chitosan với nấm men đối kháng Candida sake TL01 giúp bảo qu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

I TÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu ứng dụng khả năng kháng nấm Colletotrichum gỉoeosporioides của nanochitosan

ttong bảo quản thanh long

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

1 Tạo chế phẩm nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion với Sodium

Tripolyphosphate (STPP)

2 Xác định ngưỡng gây bệnh của nấm Colỉetotrichum gioeosporioides ưên quả Thanh

long Bình Thuận

3 Khảo sát khả năng ức chế của nanochitosan lên sự sinh trưởng và phát triển của

Coỉletotrichum gloeosporioides trong điều kiện in vitro và ở điều kiện in vivo ưên quả

Thanh long Bình Thuận

4 Đánh giá hiệu quả bảo quản thanh long bằng nanochitosan thông qua các chỉ tiêu sinh

lý, sinh hóa của thanh long Bình Thuận

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 08/2015

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/2015

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Cao Đẳng Nghề TP.HỒ Chí Minh, ban chủ nhiệm khoa công nghệ thực phẩm trường Cao Đẳng Nghề TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về thời gian cũng như hỗ trợ về trang thiết bị trong thời gian tôi học tập và làm luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các bạn cùng khóa đã hỗ ừợ tôi ừong thời gian làm thí nghiệm và trong suốt quá trình học tập

Và cuối cùng, con xin gởi lời cảm ơn đến bố mẹ, các thành viên Ương gia đình, đã tạo điều kiện và ủng hộ cho con ừong suốt thời gian học tập và thực hiện luận vãn

Tp Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng 12 năm 2015

Học viên thực hiện

Lê Hoàng Thanh Vy

ii

TÓM TẮT

Thán thư là một loại bệnh rất phổ biến ừên thanh long, do nấm Colletotrichum

gloeosporioides gây ra Ngoài việc làm giảm năng suất, bệnh thán thư còn làm giảm chất

lượng ưái thanh long sau thu hoạch Những năm gần đây, chitosan là một trong những hợp chất sinh học được nghiên cứu rất nhiều về khả năng ứng dụng trong bảo quản rau quả sau thu hoạch do nó có đặc tính kháng nấm, kháng khuẩn và an toàn cho người tiêu dùng

Trong nghiên cứu này chúng tôi tạo ra chế phẩm nanochitosan bằng phương pháp gel ion có nồng độ 0,14% với các kích thước 157, 241 và 42nm Ngưỡng gây bệnh trên trái thanh long Bình Thuận 104 bào tử/ml Ở điều kiện in vitro nanochitosan kích thước 157nm,

nồng độ 0,04% có hiệu lực ức chế cao nhất là 82,59% so với các kích thước 241, hay 42nm

cùng nồng độ Điều kiện in vivo, hiệu lực ức chế cao nhất là 95,4% bởi nanochitosan kích

thước 157nm nồng độ 0,14% so với nồng độ 0,06; 0,08; 0,1 và 0,12%

Chất lượng thanh long Bình Thuận được đánh giá sau 35 ngày bảo quản ở nhiệt độ 15°c Kết quả là với mẫu có xử lý nanochitosan, giảm tỷ lệ hao hụt khối lượng 10,55% Các chỉ số hóa sinh đều biến đổi ít hon so với mẫu không xử lý nanochitosan: pH, hàm lượng chất khô hòa tan và tỉ lệ hao hụt vitamin c so với mẫu đối chứng Sự biến thiên hàm lượng đường khử và đường tổng cũng diễn ra chậm hơn Như vậy chitosan ở dạng nano có khả

năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides và duy trì chất lượng của thanh long Bình

Thuận trong thời gian 35 ngày ở 15°c

3

ABSTRACT

Anthracnose is a very common disease in the dragon fruit, caused by Coỉỉetotrichum

gỉoeosporioides Besides reduced productivity, anthracnose reduces quality dragon fruit

postharvest In recent years, chitosan is one of the biological compounds be studied a lot about the applicability in preserving fruits and vegetables postharvest because it has antifungal, antibacterial and safe for consumers

In this study, chitosan nanoparticles was received by ionic gelation method in the concentration of 0,14% with the size 157, 241 and 42nm Level the lowest disease of

Colletotrichum gloeosporioides in Binh Thuan dragon fruit is found 104 cfu/ml In the in

vitro chitosan nanoparticles size 157nm, concenttation 0,04% had highest inhibitory effect

82.59% compared with the particle size of 241, 42nm in same concenttation In the in vivo,

chitosan nanoparticles the particle size 157nm had the highest inhibitory effect 95.4% in theconcenttation of 0,14% compared with concenttation 0,06; 0,08; 0,1 and 0,12% in the same size

The quality Bình Thuan of dragon fruits coated with chitosan nanoparticles was evaluated after storaged at 15°c for 35 day The results sample ưeatment chitosan nanoparticles, the weight loss ratio 10.55% The biochemists index change less than the

sample untreated chitosan nanoparticles: pH, total soluble solid content and vitamin c loss

ratio respectively over the control The changing in total sugar and reducing sugar took place with a slower speed compared with the control The results of this study show that chitosan nanoparticles is probably used in preservation to maintain the quality of dragon fruit for 35 days at 15°c

4

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả

và các kết luận ừong luận văn này là trung thực không sao chép bất kỳ nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào và việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận văn

Lê Hoàng Thanh Vy

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC V DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT X MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Nội dung nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu về quả thanh long 4

1.1.1 Đặc điểm thực vật học của quả thanh long 4

1.1.2 Một số loại thanh long phổ biến 5

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng 5

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thanh long 5

1.1.5 Thực hạng bảo quản 6

1.2 Tổng quan về nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides 7

1.2.1 Đặc điểm hình thái và sinh học 7

vi

1.2.2 Sinh lý học 8

1.2.3 Cơ che gây thối hỏng ttái cây của nấm mốc Colletotrichum gloeosporioidesS 1.3 Tống quan về chitosan và nano chitosan 10

1.3.1 Tính chất chitosan và naono chitosan 10

1.3.2 Các phương pháp tạo nanochitosan 11

1.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan 13

1.4 Những công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài 14

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 14

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Nguyên liệu thanh long 17

2.1.2 Chế phẩm chitosan 17

2.1.3 Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.2 Phương pháp tạo chế phẩm nano chitosan 19

2.2.3 Bố trí thí nghiệm 20

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả thí nghiệm chế tạo nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion 26

3.2 Kết quả xác định ngưỡng gây bệnh 28

3.3 Ket quả khả năng ức chế của nano chitosan lên sự phát triển của nấm

vii

Colletotrichum gỉoeosporioides trong điều kiện in vitro 30

3.4 Ket quả khả năng ức che của nano chitosan lên sự phát triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides trong điều kiện in vivo 37

3.5 Đánh giá chất lượng thanh long Bình Thuận bảo quản bằng nanochitosan 43

3.5.1 Thay đổi khối lượng 46

3.5.2 Sự thay đổi hàm lượng chat rắn hòa tan 48

3.5.3 Sự thay đổi pH 49

3.5.4 Sự thay đổi hàm lượng Vitamin c 50

3.5.5 Sự thay đổi hàm lượng đường khử 51

3.5.6 Sự thay đổi hàm lượng đường tổng 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

1 Kết luận 55

2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 64

PHỤ LỤC 2 SỐ LIỆU KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 73

PHỤ LỤC 3 THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN 83

8

DANH MỤC HÌNH

•

Hình 1.1 Hình ảnh đại thể và vi thể của chủng nấm c.gloeosporioides ừên PDA 8

Hình 2.1 Sơ đồ tổng thể phương pháp nghiên cứu 19 Hình 3.1 Ảnh chụp ừên kính hiển vi điển tử FE - SEM của 3 công thức nanochitosan

26

Hình 3.2 vết bệnh ừên thanh long khi tạo vết bệnh nhân tạo với các nồng độ bào tử

nấm c gloeosporioies (bào tử/ml) khác nhau sau 96 giờ 30

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nano chitosan đến đường kính tản nấm Coỉỉetotrichum

gloeosporioides sau 240h nuôi cấy 36

Hình 3.4 vết bệnh ừên thanh long phủ màng bao nanochitosan ở các nồng độ khác

nhau và lây bệnh nhân tạo sau 240 giờ 42

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nanochitosan đến khả năng bảo quản thanh long ở nhiệt độ

15°c 45

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn % sự hao hụt khối lượng của thanh long sau 35 ngày bảo

quản ở nhiệt độ 15°c 46

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng chất rắn hòa tan của thanh long sau

35 ngày bảo quản ở nhiệt độ 15°c 48

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH của thanh long sau 35 ngày bảo quản ở nhiệt

độ 15°c 49

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng Vitamin c của thanh long sau 35

ngày bảo quản ở nhiệt độ 15°c 50

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường khử của thanh long sau 35

ngày bảo quản ở nhiệt độ 15°c 52

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường khử của thanh long sau 35

ngày bảo quản ở nhiệt độ 15°c 53

9

DANH MỤC BẢNG

•

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của thanh long (Hylocereus undatus) ưong lOOg 5

Bảng 2.1 Bảng chỉ tiêu của chitosan của công ty TNHH Hùng Tiến 17

Bảng 2.2 Bảng bố trí điều kiện tạo nanochitosan 20

Bảng 3.1 Kết quả tạo nanochitosan ở các điều kiện 27

Bảng 3.2 Tỉ lệ vết bệnh (%) ở các nồng độ bào tử trên thanh long Bình Thuận 28

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nanochitosan đến đường kích tản nấm c.gloeosporioides 32

Bảng 3.4 Thời gian nảy mầm của Colletotrichum gloeosporioides ở các mẫu 33

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nanochitosan đến tỷ lệ vết bệnh và thời gian hình thành vết bệnh trên thanh long 38

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nanochitosan đến đường kính vết bệnh trên thanh long 40

Bảng 3.7 Sự biến đổi hóa sinh của thanh long trong thời gian bảo quản 43

STPP Sodium tripolyphosphate

PIRG Percentage inhibition of radial growth

DNS Dinitto salysilic acid

CTV Công thức ở điều kiện in vivo

AA1 Kích thước nanochitosan được chọn để khảo sát ở điều kiện in vivo

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam có điều kiện thời tiết thuận lợi cho việc ttồng và phát triển thanh long Thanh long là loại ưái cây có giá ưị dinh dưỡng cao và giá ưị xuất khẩu, loại quả có kim ngạch xuất khẩu cao nhất so với các loại ttái cây khác ở nước ta [1],

Việc xuất khẩu thanh long đang bị phụ thuộc vào thị trường Trung Quốc (chiếm 70

- 80%), việc xuất khẩu bị chi phối nhiều về vị trí địa lý do chúng ta chưa có biện pháp kéo dài thời gian bảo quản để vận chuyển đến các thị trường ở xa như Mỹ, Châu Âu dẫn đến việc cạnh tranh về giá cả gặp nhiều khó khăn do chi phí vận chuyển đường hàng không quá cao [1],

Thanh long sau thu hoạch dễ bị hư hỏng khi bảo quản mà chủ yếu do các chủng nấm

mốc sau gây ra: Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillium, Botryosphaeria sp., và

Colletotrichum gloeosporioides Trong đó, bệnh thán thư do Colletotrichum gloeosporioides gây ra chiếm tỉ lệ lớn nhất [2], [3], [4],

Đe hạn chế bệnh thán thư ưên thanh long sau thu hoạch, ngoài việc hạn chế tổn thương trcn quả thì ở Việt Nam sử dụng các phương pháp bảo quản như: bảo quản lạnh,

xử lý hóa chat (carbenadazim, GA3, anolyte), chiếu xạ, xử lý hơi nước nóng Trong đó chiếu xạ và xử lý hơi nước nóng là hai phương pháp được sử dụng cho xuất khẩu

Với thực trạng về vấn đề VSATTP cũng như vấn đề ô nhiễm môi trường thì xu hướng của ngành công nghiệp thực phẩm nói chung hay công nghệ sau thu hoạch nói riêng đang hướng tới sử dụng các phương pháp sinh học để dần thay thế cho các phương pháp hóa học

Trong những năm gần đây, chitosan là một ttong những hợp chất sinh học được nghiên cứu rất nhiều về khả năng ứng dụng ttong bảo quản rau quả sau thu hoạch do nó

có đặc tính kháng nấm, kháng khuẩn và an toàn cho người tiêu dùng Chitosan ở dạng

chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng khả năng kháng nấm Coỉỉetotrichum

gỉoeosporioides của nanochitosan trong bảo quản thanh long”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng được công thức bảo quản thanh long bằng màng nanochitosan để có thể kéo dài thời gian bảo quản lên đến 35 ngày ở điều kiện nhiệt độ 15 ±2°c

3 Đổi tượng và phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu thực hiện trên quả thanh long vỏ đỏ ruột trắng được trồng ở Bình Thuận, tỉnh có diện tích trồng thanh long lớn nhất cả nước

Bệnh thán thư thanh long do nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides

4 Nội dung nghiên cứu

Tạo chế phẩm nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion với Sodium Tripolyphosphate (STPP)

Xác định ngưỡng gây bệnh của nấm Coỉỉetotrichum gỉoeosporioides trên quả Thanh

long Bình Thuận

Khảo sát khả năng ức chế của nanochitosan lên sự sinh trưởng và phát triển của

Colletotrichum gloeosporioides /rong điều kiện in vitro

Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nanochitosan đến sự sinh trưởng và phát triển

của Colỉetotrichum gloeosporioides ở điều kiện in vivo trên quả Thanh long Bình Thuận

Đánh giá hiệu quả bảo quản thanh long bằng nanochitosan thông qua các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của thanh long Bình Thuận

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp dữ liệu khoa học về khả năng của nanochitosan kháng bệnh thán thư do

4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giói thiệu về quả thanh long

Cây thanh long (tên tiếng Anh là Pitahaya, hay còn gọi là Dragon fruit), thuộc họ Xương rồng, có nguồn gốc ở các vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia Thanh long được người Pháp đem vào trồng ở Việt Nam trcn 100 năm nay, nhưng mới được đưa lên thành hàng hóa từ thập niên 1980 [1],

1.1.1 Đặc điểm thực vật học của quả thanh long

Là cây có nguồn gốc nhiệt đới, chịu hạn, nên được trồng ở những vùng nóng Một

số loài chịu được nhiệt độ từ 50°C- 55°c, nhưng nó không chịu được giá lạnh Sự phát triển của cây tốt ở nơi có cường độ ánh sáng mạnh [7], [8],

Rễ cây: rễ thanh long không mọng nước nên nó không phải là nơi tích trữ nước giúp cây chịu hạn Cây thanh long có hai loại rễ: địa sinh và khí sinh [8]

Rễ địa sinh phát triển từ phần lõi ở gốc hom Rễ địa sinh có nhiệm vụ bám vào đất

và hút các chất dinh dưỡng nuôi cây [8],

Rễ khí sinh mọc dọc theo thân cây phần trcn không, bám vào cây chống để giúp cây leo lên giá đỡ [8],

Thân, cành: Thanh long là một loại xương rồng có thân, cành trườn bò trên trụ đỡ Thân chứa nhiều nước nên nó có thể chịu hạn một thời gian dài Thân, cành thường có ba cánh dẹp, xanh Tiết diện ngang cho thấy có hai phần: bên ngoài là nhu mô chứa diệp lục, bên trong là lõi cứng hình trụ Mỗi cánh chia ra làm nhiều thùy có chiều dài 3 - 4cm [8] Hoa: Thanh long là cây ngày dài Miền Nam Bộ ra hoa sớm nhất vào trung tuần tháng 3-10 hàng năm, rộ nhất từ tháng 5 dương lịch tới tháng 8 dương lịch Trung bình có

từ 4 - 6 đợt ra hoa rộ mỗi năm Hoa lưỡng tính, rất to, có chiều dài trung bình 25 - 35 cm, nhiều lá đài và cánh hoa dính nhau thành ống, nhiều tiểu nhị và một nhụy cái dài 18 - 24

cm, đường kính 5-8 mm, nhụy cái chia làm nhiều nhánh Hoa thường nở tập trung từ 20 -

23 giờ đêm và đồng loạt trong vườn Từ khi nở đến khi tàn kéo dài độ 2-3 ngày Thời gian

5

từ khi xuất hiện nụ tới hoa tàn độ 20 ngày Các đợt nụ đầu tiên rụng từ 30% đến 40%, về sau tỉ lệ này giảm dần khi gặp điều kiện ngoại cảnh thuận lợi [8], [9],

1.1.2 Một sổ loại thanh long phổ biến

Quả thanh long có ba loại: [10]

• Hylocereus undatus thuộc chi Hylocereus' ruột ttắng vỏ hồng

• Hylocereus polyrhizus thuộc chi Hylocereus' ruột đỏ vỏ hồng

• Hylocereus megalanthus thuộc chi Seỉenicereus: ruột trắng vỏ vàng

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của thanh long (Hylocereus undatus) trong lOOg [11]

LI

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thanh long

Hiện nay, nước ta đã xuất khẩu thanh long ra nhiều nước dưới dạng quả tươi Đối với thị trường Nhật do sự kiểm dịch thực vật khắt khe nên chỉ nhập thanh long dưới dạng đông lạnh Ở Bình Thuận nói riêng và Nam Bộ nói chung mùa thanh long tự nhiên từ tháng 4 tới tháng 10, rộ nhất từ tháng 5 tới tháng 8 Vài năm gần đây Thái Lan, Taiwan

và cả Trung Quốc cũng đã bắt đầu nghiên cứu ừồng cây này [1], [12],

Trái thanh long Việt Nam đã có mặt ở 40 quốc gia và vùng lãnh thổ, trong đó có cả các thị trường được coi là khó tính như Mỹ, Châu Âu, Nhật Bản Tuy nhiên hiện nay, thanh long đạt chuẩn xuất khẩu sang các thị trường khó tính và mang lại giá trị cao như

Mỹ, Nhật, Hàn Quốc, Châu Âu vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường không đủ

6

hàng đạt chuẩn mà nhà nhập khẩu mong muốn [1],

Tính đến cuối năm 2014, tỉnh Bình Thuận có diện tích sản xuất thanh long lớn nhất

so với cả nước (24.212 ha) với sản lượng thu hoạch hàng năm trên 500.000 tấn Và có 14 thị trường, trong đó Trung Quốc là thị trường tiêu thụ chủ lực thanh long Bình Thuận (ước tính 80-85% sản lượng) Để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước và xuất khẩu, Trung Quốc đang có chính sách khuyến khích người dân phát triển ừồng thanh long trên diện tích lớn tại hai tỉnh Quảng Đông và Quảng Tây, phía Nam Trung Quốc (diện tích hiện nay là 20.000 ha) [1],

Trung Quốc là thị trường tiêu thụ hầu hết sản lượng thanh long của Việt Nam nói chung và Bình Thuận nói riêng Do vậy trong thời gian tới, thanh long Việt Nam sẽ phải cạnh tranh với thanh long Trung Quốc ngoài giá cả còn liên quan đến chất lượng, rào cản

kỹ thuật trong thương mại mà Trung Quốc sẽ áp dụng trong tương lai [13]

1.1.5 Thực trạng bảo quản

Quả thanh long có thời gian bảo quản ngắn do có cường độ hô hấp cao, nếu bảo quản ở điều kiện thường, vỏ quả sẽ bị nhãn lại chỉ sau 7-8 ngày bảo quản Thành phần hóa học của quả thay đổi nhiều trong quá trình bảo quản [3],

Phương pháp bảo quản sử dụng kết họp màng bao có chứa chitosan với nấm men đối kháng Candida sake TL01 giúp bảo quản thanh long được trong 37 ngày ở 5°c, độ ẩm

85 - 90% với tỉ lệ hư hỏng sau bảo quản là 5% [14],

Aspergillus niger và Colletotrichum gloeosporioides là 2 trong số các nấm mốc

chính gây hư hỏng quả thanh long [14],

1.1.5.1 Bảo quản ở nhiệt độ thường

Đây là cách bảo quản ở nhiệt độ và độ ẩm không khí tự nhiên Thanh long bảo quản trong điều kiện này với độ thoáng mát tốt, có thể giữ tươi được 5-8 ngày [15],

1.1.5.2 Bảo quản lạnh

Bảo quản ở nhiệt độ 20 - 24°c, thanh long sẽ tươi được 8-10 ngày Bảo quản ở nhiệt

độ 12 - 14°c sẽ giữ tươi được 15-20 ngày [9],

7

1.1.5.3 Xử lý hóa chất

Dùng chế phẩm acid gibberelic (GA3) với liều 0,2g/l pha ừong nước, tưới đều quanh

trấi, có tác dụng làm các cuống thanh long xanh hơn và cứng hơn Xử lý trước khi thu

hoạch từ 1 - 3 ngày, thanh long có thể bảo quản tươi được 10-20 ngày [9],

1.1.5.4 Phưong pháp điều khiển thành phần không khí

Nguyên tắc của phương pháp này là làm tăng nồng độ khí co2 và giảm nồng độ o2

Ương không khí xung quanh trái để giảm cường độ hô hấp của trái Dùng túi polyetylen

có đục 20 - 30 lỗ bằng kim, bao bọc trái thanh long và hàn kín bao lại Kỹ thuật này kết hợp với nhiệt độ lạnh ở 5°c, thanh long có thể giữ tươi được 40 - 50 ngày [9]

1.1.5.5 Xử lý bằng ozon

Dùng dung dịch hoạt hoá anolyte (hay còn gọi là nước ozon), rửa sạch trái, sau đó hong khô, đóng gói, bảo quản bong nhà mát, thanh long giữ tươi được 25 ngày [9],

1.2 Tổng quan về nấm mốc Colletotrichum gỉoeosporioides

1.2.1 Đặc điểm hình thái và sinh học

Trên môi trường PDA (Potato dextrose agar), tản nấm của Coỉỉetotrichum

gỉoeosporioides có có màu ừắng xám đến xám đậm Các tản nấm hình thành nên các quả

thể, chúng mọc riêng rẽ hoặc từng đám hình cầu hay hình quả lê, kích thước đường kính 85-350pm Bên trong quả thể có các túi bào tử nằm rải rác, xen kẽ với các sợi nấm vô tính, thường có 8 bào tử túi Bào tử túi hình trụ hoặc hình chuỳ, kích thước 35- 80 X 8-14pm Bào tử phân sinh hình thành ừên cành bào tử ngắn, hẹp, ừong suốt, hình trụ, đầu hơi tù, đỉnh hòn, không có vách ngăn, kích thước từ 9-24 X 3-6pm [16],

8

Hình 1.1 Hình ảnh đại thể và vỉ thể của chủng nẩm c.gloeosporioides trên PDA a Tản

nấm; b Khuẩn ty; c Bào tử

1.2.2 Sinh lý học

Nấm c gloeosporỉoides có khả năng sinh trưởng ở 4°c, tối thích là từ 25°-28°C

Bệnh phát triển mạnh mẽ khi độ ẩm và nhiệt độ tăng cao Quá trình nảy mầm, xâm nhiễm

và sinh trưởng của nấm có thể bị ảnh hưởng nếu bề mặt mô bệnh ẩm ướt ttong thòi gian dài Ở điều kiện độ ẩm môi trường cao, bào tử nảy mầm và xâm nhiễm được ngay cả khi

độ ẩm ở bề mặt quả ký chủ thấp Nấm bắt đầu phát triển mạnh mẽ và biểu hiện thành bệnh khi gặp độ ẩm thích hợp Thanh long có hàm lượng nước cao lên đến 87% là môi trường

thuận lợi cho c gloeosporioides phát triển và gây hại [17],

1.2.3 Cơ chế gây thổi hỏng trái cây của nấm mốc Colletotrichum gỉoeosporioides

Nấm c gỉoeosporioides có thể tồn tại ở nhiều vị trí khác nhau của cây ưồng: tồn tại

ttong hạt giống, ttên cây ký chủ và trên tàn dư cây hồng sau thu hoạch Chúng phát tán nguồn bệnh nhờ mưa và nước Sau khi tiếp xúc hên bề mặt quả, khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử sẽ nảy mầm, phát triển và gây bệnh [16],

Thanh long là loại quả rất dễ bị hư hại bởi các loại bệnh khác nhau, chúng có thể gây bệnh ở nhiều bộ phận, bằng nhiều con đường lây nhiễm khác nhau Gặp điều kiện thuận lợi (ẩm độ, nhiệt độ), bào tử nấm nảy mầm thành ống mầm

Quá hình xâm nhập này có thể xảy ra qua hai con đường chính [16]:

- Xâm nhập trực tiếp qua bề mặt ký chủ nguyên vẹn

- Xâm nhập thông qua các vết thương trên bề mặt quả do các tác động cơ học làm bầm dập, nứt quả

2.2.3.I Xâm nhập trực tiếp qua bề mặt ký chủ nguyên vẹn

Coỉỉetotrichum spp thuộc nhóm nấm hoại dưỡng (nccrotrophic), nghĩa là bong quá

hình xâm nhập luôn tiết ra các enzyme thủy phân và các độc tố để phá hủy mô tế bào vật

chủ Tuy nhiên trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhập, Coỉỉetotrichum spp lại tấn

công và tiến hành hoạt động giết chết tế bào chủ như một nấm sinh dưỡng (biotrophic), kết hợp với lượng lớn sợi nấm chính trong tế bào Quá trình sinh dưỡng này thường không

9

kéo dài lâu (từ ít hơn 24 giờ đến 42 giờ) nên Colletotrichum spp còn gọi là loài nấm bán

sinh dưỡng (hemibiotrophic), sau đó chúng sẽ phát triển sang giai đoạn hoại dưỡng, kết hợp với các sợi nấm thứ cấp [2], [18],

Khi bào tử tiếp xúc với bề mặt kí chủ, chúng lắng đọng và gắn kết lại với nhau Gặp điều kiện thuận lợi, bào tử bắt đầu nảy mầm thành ống mầm, đầu ống mầm sẽ hình thành một cấu trúc đặc biệt gọi là giác bám hay còn gọi là vòi áp/vòi bám/đĩa áp (appressorium) Sau đó, giác bám hình thành đế xâm nhập hay còn gọi là vòi xâm nhập/móc xâm nhập (penetration peg) đâm xuyên qua mặt ký chủ gồm tầng cutin và vách tế bào Sự hình thành vòi xâm nhập đâm xuyên qua bề mặt ký chủ tạo ra cấu trúc vòi hút sau đó tạo ra áp lực thẩm tích cao hút nước từ bên ngoài vào ừong giác bám và một áp suất trương lớn được tạo ra Áp suất cao sẽ cho phép nấm xâm nhập dễ dàng qua bề mặt ký chủ bằng đế xâm nhập Mặc dù sự xâm nhập bằng giác bám và đế xâm nhập là do lực cơ học nhưng nấm

cũng tiết ra các enzyme để hỗ ừợ sự xâm nhập như các cellulase và pectinase [19],

Sau khi xâm nhập vào tế bào, các sợi nấm có thể trương phồng lên hình thành nên một túi bọng gọi là tiểu nang (vesicle) và sợi nấm chính (primari hyphae) Trong giai đoạn sinh dưỡng (biotrophic), các tế bào chủ vẫn còn sống, màng tế bào của nó có thể được nhìn thấy xung quanh các sợi nấm Một hai ngày sau màng tế bào phân cách đó mỏng dần

và bắt đầu bị phân hủy, làm chết tổ chức tế bào ở đó Tương tự vói các tế bào xung quanh, quá trình sinh dưỡng này cứ thế tiếp tục Tiếp theo đó, xảy ra quá trình hoại dưỡng, phá

vỡ tế bào dưới tác dụng của hệ thống enzyme do các sợi nấm thứ cấp sản xuất ra Bỏ qua giai đoạn sinh dưỡng, giai đoạn hoại tử nhanh chóng xảy ra trong trường họp này các sợi nấm lây lan khắp các vách ngăn giữa các tế bào vật chủ và cả ưong tế bào thông qua lớp biểu bì dưới, đồng thời tiết ra enzyme phân hủy vách tế bào và nguyên sinh chất của vật chủ, quá trình nhiễm trùng không đi kèm việc phát sinh các sợi nấm thứ cấp [20],

2.2.3.2 Xâm nhập gián tiếp qua các vết nứt tự nhiên, các vết thưong cơ giới

Sau thu hoạch, sức đề kháng của quả sẽ giảm dần ttong thời gian chín và lưu trữ, lúc này các mầm bệnh dễ dàng nhiễm vào quả ký chủ và gây hại Quá trình xâm nhập sẽ diễn ra nhanh chóng hay kéo dài phụ thuộc vào khả năng kháng của vật chủ Trong quá

10

trình thu hoạch, vận chuyển và bảo quản việc tạo ra các tổn thương cơ học khó tránh khỏi, đây là điều kiện thuận lợi cho các loại nấm xâm nhập và phát triển nhanh chóng, gây bệnh sau thu hoạch trên quả Thông thường, độ ẩm trên bề mặt quả không đáp được sự nảy mầm của bào tử, tuy nhiên nếu bào tử tiếp xúc tại vết thương, dịch quả tiết ra sẽ tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sự nảy mầm [19],

Sau khi xâm nhập thành công, sợi nấm tiết ra các độc tố ngấm vào mô quả để tiêu diệt các tế bào Các enzyme ngoại bào thực hiện chức năng chuyển hóa các chất phức tạp thành các họp chất có ưọng lượng phân tử thấp mà tế bào nấm có thể hấp thu làm quả nhanh chóng bị hư hỏng [21],

1.3 Tổng quan về chitosan và nano chitosan

1.3.1 Tính chất chitosan và naono chitosan

Chitosan là một aminopolysaccharide mạch thẳng của glucosamine và N- acetylglucosamine, thu được bằng cách khử acetyl của chitin giải phóng nhóm (-NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí c (2), được chiết xuất từ vỏ các loài giáp xác (tôm, cua, hến, trai, sò, mai mực, ), cũng như từ các màng tế bào của một số loại nấm Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết 0-(l-4)-glicozit, do vậy chitosan có thể gọi là Poly-0-(l,4)-D-glucosamin, hay còn gọi là poly-0-(l,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose Chitin có mức độ khử acetyl khoảng 75% trở lên thường được gọi là chitosan [22],

Chitosan có những tính chất cơ bản sau:

• Tính tan: Chitosan không hoà tan trong nước và dung dịch kiềm Tan trong dung dịch acid loãng tạo nhành một dung dịch keo có độ nhớt cao

• Chitosan tác dụng với lốt trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím Đây

là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan

• Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một polycationic (pH<6,5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein, aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (NH2) Chính tính chất này giúp cho chitosan thể hiện được khả năng kháng

đó hoạt tính sinh học cao hơn nhiều so với chitosan Chính đặc điểm khác biệt này đã tạo

ra sự quan tâm đáng kể theo hướng nghiên cứu ứng dụng chitosan ở kích thước nanomet trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong lĩnh vực nông nghiệp (kháng khuẩn, kháng nấm, kích thích sinh trưởng, bảo vệ cây trồng)

1.3.2 Các phương pháp tạo nanochỉtosan

Hiện nay, có nhiều phương pháp tạo nanochitosan Có các phương pháp phổ biến như sau: phương pháp khâu mạch nhũ tương; phương pháp tạo giọt/kết tủa; khuếch tán dung môi nhũ tương; phương pháp sấy phun; phương pháp tạo gel ion [21]

- Phương pháp hợp giọt nhũ tương

Phương pháp này sử dụng nguyên tắc của cả hai phương pháp: tạo nối ngang và kết tủa Một hệ nhũ tương W/O bền vững chứa chitosan ừong dung dịch paraffin Đồng thời một hệ nhũ tương khác cũng được chuẩn bị song song bằng cách cho NaOH vào trong hỗn hợp nhũ tương giống như trên Sau đó, trộn đều hai hệ nhũ tương này vào nhau trong điều kiện có kết họp cánh khuấy với tốc độ cao, nhờ tác dụng của cánh khuấy các giọt sẽ chuyển động liên tục, va chạm ngẫu nhiên vào nhau và kết tủa lại tạo các hạt có kích thước nanomet Phương pháp này cho thấy rằng khi mức độ deacetyl hóa của chitosan giảm dẫn đến các nối đôi được hình thành giảm, điều này sẽ làm tăng kích thước và giảm số lượng các hạt nano được hình thành [22], [23],

- Phương pháp khuếch tán dung môi nhũ tương

Phương pháp này liên quan tới việc bổ sung một pha dung môi hữu cơ như methylene clorua và acetone Hỗn hợp nhũ tương O/W được hình thành khi cho hỗn hợp

12

dung môi hữu cơ trên vào khuấy trộn cùng dung dịch có chứa chitosan và chất ổn định như poloxamer và lecithin Hỗn hợp nhũ tương này sau đó được đưa đi đồng hóa dưới áp suất cao Ở giai đoạn này acetone sẽ khuyếch tán vào trong pha nước làm giảm khả năng hòa tan của chitosan và tạo thành các hạt kết tủa có kích thước nanomet Các hạt nano chitosan được thu hồi bằng cách ly tâm Nhược điểm của phương pháp này là quá trình thực hiện phức tạp [24]

- Phương pháp tạo gel ionic (ionic gelation)

Cơ chế của phương pháp này dựa trên tương tác tĩnh điện giữa chitosan tích điện dương và một polyanion như Sodium tripolyphosphat hoặc glutaraldehyde, Lúc này các nhóm -NH2 của chitosan sẽ liên kết với nhóm H3P3O102' của STTP hay - CHO của glutaraldehyde và nhờ đó các hạt nano chitosan được hình thành Đầu tiên chitosan được hòa tan vào dung dịch axit acetic Sau đó chitosan được trộn lẫn với polyanion để tạo hạt nano chitosan dưới điều kiện khuấy từ liên tục ở nhiệt độ phòng Kích thước và điện tích

bề mặt phụ thuộc vào tỷ lệ chitosan và polyanion, pH, và loại polyanion khác nhau

Phương pháp này có ưu điểm là giai đoạn chuẩn bị đơn giản, chi phí thấp, dễ thực hiện, hạt nano chitosan có kích thước hạt nhỏ, phân bố kích thước đồng đều và điện thế hạt nano cao Đây cũng là phương pháp thường được lựa chọn phổ biến cho các nghiên cứu ứng dụng nanochitosan [24]

- Phương pháp sẩỵ phun:

Sấy phun là kỹ thuật phổ biến ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm để tạo bột, hạt

từ hỗn hợp huyền phù thuốc với tá dược, thực phẩm Kỹ thuật này dựa ừên nguyên tắc dung dịch huyền phù được làm khô khi được phun ừong dòng không khí nóng Trong phương pháp này, chitosan được hòa tan thành dung dịch, sau đó bổ sung hoạt chất khâu mạch và được phun vào dòng không khí nóng, kết quả các hạt nano chitosan được tạo thành [24],

- Phương pháp tạo giọt kểt tủa (coacervation/precipitation)

Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung dịch kiềm hoặc acid đậm đặc Để tạo ra các hạt nano chitosan dung dịch chitosan sẽ được một thiết

13

bị nén phun vào dung dịch kiềm, lúc này chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt ngay khi dung dịch chitosan tiếp xúc với dung dịch Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH - methanol hoặc ethandiamine [23],

Phương pháp này có thể được cải tiến hơn bằng cách nhỏ dung dịch natri sunphat vào dung dịch chitosan (pH acid có chất hoạt động bề mặt) trong điều kiện khuấy và tác động của sóng siêu âm (ultrasonic) Hạt nano chitosan thu được bằng cách ly tâm, sau đó tiếp tục bước làm cứng và bền hơn bằng cách khâu mạch với glutaraldehyde

1.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan

Cơ chế hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm của nanochitosan:

Nanochitosan xâm nhập vào tế bào chất của vi sinh vật và thông qua liên kết của chúng với DNA, gây ưở ngại đến sự tổng hợp của mRNA và protein [25], [26],

Nanochitosan trên bề mặt của tế bào có thể hình thành một lớp polymer bán thấm làm thay đổi tính thấm của tế bào và ngăn ngừa các chất dinh dưỡng đi vào tế bào [27] Màng tế bào vi sinh vật có chứa các gốc tích điện âm, màng có vai trò điều hòa sự trao đổi chất giữa tế bào và môi trường xung quanh Khi có mặt chitosan sẽ xảy ra liên kết giữa các gốc tích điện dương trên phân tử của chúng với các gốc tích điện âm trên màng ngoài tế bào vi sinh vật dẫn đến những thay đổi trong cấu trúc màng tế bào và tính thấm của màng, rò rỉ tế bào chất Vì vậy, chế phẩm nanochitosan làm thay đổi các chức năng sinh hóa và sinh lý của vi sinh vật dẫn đến rối loạn trao đổi chất và cuối cùng là vi sinh vật chết

Nanochitosan đóng vai trò như một chất tạo phức, là chất liên kết có chọn lọc với các kim loại vết, sau đó ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật

Nanno chitosan kích hoạt một số phản ứng phòng vệ trong mô vật chủ để chống lại các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài môi trường bằng việc kích ứng cho hoạt động sản sinh các enzyme bảo vệ như chitinase, chitosanase, glucanase và phenylalanine ammonia-lyase Đồng thời làm tăng việc tổng hợp các hợp chất, phytoalexin, chất ức chế protease

và lignin, các hợp chất phenolic (axit ferulic, axít salicylic, axit p- coumaric) là các thành phần quan trọng ữong hoạt động bảo vệ vật chủ trước sự xâm nhập của các tế bào gây

14

bệnh [28],

1.4 Những công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Nghiên cứu ứng dụng nanochitosan trong y dược và thực phẩm để kháng khuẩn, kháng nấm gây hại trên các đối tượng rau quả sau thu hoạch đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, tuy nhiên số lượng các nghiên cứu này vẫn chưa nhiều Năm 2006, T.T Hoa và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu về phương pháp xử

lý hơi nước nóng trên thanh long cho kết quả phương pháp xử lý hơi nước nóng có thể giúp kéo dài thời gian bảo quản thanh long lên 4 tuần ở nhiệt đô 5°c [29],

Năm 2010, A Ali và cộng sự nghiên cứu bảo quản một số loại trái cây nhiệt đới bằng nano chitosan có kích thước 200, 400, 600, 800 và 1000 nm ở các nồng độ khác

nhau trong điều kiện in vitro với các chủng thán thư phân lập từ chuối, đu đủ và thanh

long Kết quả kích thước nano chitosan 200nm có hiệu quả trên chuối, 600nm có hiệu quả trên đu đủ và thanh long với các chủng thán thư phân lập ừên các loại trái cây ở điều kiện

in vitro và duy trì chất lượng ở tất cả ưái cây sau 28 ngày bảo quản lạnh [30],

Năm 2011, A Ali và cộng sự nghiên cứu bảo quản đu đủ bằng chitosan kết quả chitosan giúp hạn chế sự thất thoát khối lượng, duy ừì cấu trúc cũng như tính chất cảm quan của quả đu đủ sau 5 tuần bảo quản ở 12°c, độ ẩm 85 - 90% [31],

Năm 2012, N Zahid, A Ali và cộng sự nghiên cứu tác dụng của nanochitosan ở

kích thước 200nm, 600nm và lOOOnm đối với Coỉỉetotrichum gỉoeosporioides gây bệnh

thán thư trcn quả thanh long Ket quả cho thấy với kích thước 600nm đạt hiệu quả kháng

nấm tốt nhất trong điều kiện in vitro, thể hiện ở việc ức chế sự hình thành bào tử, nảy

mầm của bào tử và sinh khối Một kết quả ừong nghiên cứu khi chitosan sử dụng ở nồng

độ lớn hơn 1,5% gây ra những ảnh hưởng xấu đến chất lượng của ttái cây [6]

Năm 2013, A.Ali và cộng sự nghiên cứu hiệu quả của nano chitosan trong kiểm soát bệnh thán thư và duy trì chất lượng của thanh long Kết quả kích thước nano chitosan

600nm nồng độ 1% có hiệu quả kháng nấm Colletotrichum gloesporioides phân lập từ

thanh long duy trì chất lượng 28 ngày ở 10+- 2°c [3],

15

Năm 2013, A Fabregas và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số vật

lý tổng hợp hạt nanochitosan dựa trên phương pháp ion gel hóa của chitosan với STPP Ket quả tạo ra các kích thước nano chitosan kích thước dao động từ 113 đến 296 nm [32] ,

Năm 2014, N.Zahid, S.Manickam và A.Ali nghiên cứu khả năng trị bệnh của nanochitosan và sinh trưởng của cây thanh long Kết quả kích thước 600nm nanochitosan 1% có hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh thán thư trcn cây thanh long

[33] ,

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Khả năng kháng nấm nanochitosan đã được khẳng định trong nhiều nghiên cứu với nhiều đối tượng khác nhau ở nước ngoài trong những năm gần đây Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng nanochitosan vẫn còn khá mới

Năm 2011, Dương Thị Ánh Tuyết và cộng sự đã nghiên cứu chế tạo nanochitosan bằng phương pháp tạo gel ion làm chất hấp phụ protein ứng dụng ưong dẫn truyền thuốc Kết quả cho thấy với tỷ lệ chitosan/STPP là 6/1 tại pH 4 cho chế phẩm nanochitosan có kích thước nhỏ nhất 48,70nm Sử dụng chế phẩm này làm chất hấp phụ protein cho thấy khả năng hấp phụ cao 96,41 % (1,93 mg/mg) tại 0,5 mg hạt nanochitosan [34],

Năm 2013, Lê Thanh Long và các cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân chitosan tạo oligochitosan bằng H2O2, và ứng dụng vào việc kháng E.coli và kháng

thán thư trên xoài [35], [36],

Tóm lại, theo các công bố trong và ngoài nước các phương pháp phổ biến để chế tạo nanochitosan là tạo gel ion Các nghiên cứu về ứng dụng nanochitosan tạo màng bao nhằm mục đích bảo quản rau quả hiện nay vẫn đang phát hiển Đồ tài sẽ góp phần vào phương pháp bảo quản thanh long một cách an toàn và hiệu quả

16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cưu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu thanh long

Mầu thanh vỏ đỏ ruột ttắng thu nhận từ vườn thanh long xã Hàm Thắng, Huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận Có đặc điểm:

• Độ chín: 5 điểm (sau 30 ngày kết ttái)

• Khối lượng trung bình 450-600g

2.1.2 Chế phẩm chitosan

Chitosan sử dụng ở dạng bột mịn, được sản xuất bởi Công ty TNHH Hùng Tiến,

vói các thông số kỹ thuật như sau:

Bảng 2.1 Bảng chỉ tiêu của chitosan của công ty TNHH Hùng Tiến

2.1.3 Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides

17

Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides được lấy từ trung tâm nông nghiệp công nghệ

cao Củ Chi -TP.HCM

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu

Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides được chuẩn bị và gây nhiễm ở các nồng độ

khác nhau và quan sát sự phát triển của nấm thông qua đường kính tản nấm để xác định ngưỡng gây bệnh

Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides được nuôi cấy trcn môi trường thạch Potato

Dextro Agar (PDA) có nanochitosan để khảo sát ảnh hưởng của nanochitosan đến khả năng

sinh trưởng, phát triển của đối tượng nấm mốc trong điều kiện in vitro

Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides được cấy nhân tạo ttên quả thanh long và xử lý

nanochitosan, khảo sát ảnh hưởng của nanochitosan đến khả năng sinh trưởng, phát triển của

đối tượng nấm mốc trong điều kiện in vivo

Kích thước hạt nanochitosan được chụp và xác định bằng kính hiển vi điện tử quét SEM, tại trung tâm Công Nghệ Cao Thành phố Hồ Chí Minh

18

Hình 2.1 Sơ đồ tổng thể phương pháp nghiên cứu

2.2.2 Phương pháp tạo chế phẩm nano chitosan

Nanochitosan được tạo bằng phương pháp tạo gel ion vói STPP tham khảo kết quả của A Fabregas và cộng sự [32]

Cách tiến hành:

Dung dịch chitosan nồng độ 0,2% (w/v) được chuẩn bị bằng cách hòa tan ừong dung dịch acid acetic 1% (w/v), tiến hành lắc hòa tan ừong 2 giờ ở nhiệt độ thường Sau đó, điều chỉnh pH của dung dịch đến pH = 5,0 bằng NaOH 5N và đem lọc thu dung dịch

Sau đó nhỏ từ từ STPP 0,84 mg/ml vào dung dịch chitosan bằng thiết khuấy từ ở nhiệt

độ phòng, tốc độ như bố trí như bảng 2.2 Với tỷ lệ chitosan/STPP là 2,5/1 (v/v) theo thời gian khuấy tạo gel ion như đã bố trí

Chỉ tiêu theo dõi: Hình ảnh và kích thước hạt nanochitosan được chụp và xác định bằng kính

hiển vi điện tử FE - SEM, Hitachi Nhật, tại trung tâm công nghệ cao TP.HCM

Bảng 2.2 Bảng bố trí điều kiện tạo nanochitosan

2.2.3 Bố trí thí nghiệm

2.2.3.1 Thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh nhân tạo của nấm Coĩletotrichum

gloeosporioides trên quả thanh long

Nguyên tắc: Tạo vết thương nhân tạo đồng đều trên quả thanh long ở các công thức

khảo sát, cấy bào tử nấm vào vết thương đã tạo và theo dõi sự hình thành vết bệnh, tỷ lệ mắc bệnh Ở nồng độ bào tử thấp nhất mà 100% các vết bệnh được hình thành sau thời gian theo dõi được lấy là ngưỡng gây bệnh của nấm

Các bước tiến hành: Colletotrichum gloeosporioides được nuôi cấy ừên môi trường

PDA, thu bào tử và pha loãng thành các nồng độ tương ứng với các công thức [37],

Đặt mẫu quả vào khay nhựa đã được sát trùng bằng cồn 70°, sau đó ủ mẫu ở nhiệt độ phòng Tiến hành theo dõi thòi gian hình thành vết bệnh và tỉ lệ bệnh ở các công thức [38],

Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Thòi gian hình thành vết bệnh (giờ)

+ Theo dõi tỷ lệ bệnh (TLB) ở các công thức TLB của nhóm bệnh được tính theo công thức sau [39]:

VB TLB(°/o) = * 100%

Trong đó:

TLB: tỉ lệ vết bệnh

VB : số vết bệnh hình thành

VT: số vết thương nhân tạo

2.2.3.2 Thí nghiệm xác định khả năng ức chế của nano chitosan lên sự phát triển

của nấm Coĩletotrichum gỉoeosporioides trong điều kiện in vitro

Thực hiện nuôi cấy bào tử nấm mốc trên môi trường PDA có bổ sung nanochitosan ở các nồng độ khác nhau 0%; 0,04%; 0,06%; 0,08%; 0,1%; 0,14% mỗi nồng độ 3 kích thước NCT1, NCT2, NCT3 và theo dõi khả năng phát triển của chúng thông qua thời gian nảy

• CT 1 (nano chitosan kích thước hạt NCT1, nồng độ 0,04%)

• CT 2 (nano chitosan kích thước hạt NCT1, nồng độ 0,06%)

• CT 3 (nano chitosan kích thước hạt NCT1, nồng độ 0,08%)

• CT 4 (nano chitosan kích thước hạt NCT1, nồng độ 0,1%)

• CT 5 (nano chitosan kích thước hạt NCT1, nồng độ 0,14%)

• CT 6 (nano chitosan kích thước hạt NCT2, nồng độ 0,04%)

• CT 7 (nano chitosan kích thước hạt NCT2, nồng độ 0,06%)

• CT 8 (nano chitosan kích thước hạt NCT2, nồng độ 0,8%)

• CT 9 (nano chitosan kích thước hạt NCT2, nồng độ 0,1%)

• CT 10 (nano chitosan kích thước hạt NCT2, nồng độ 0,14%)

• CT 11 (nano chitosan kích thước hạt NCT3, nồng độ 0,04%)

• CT 12 (nano chitosan kích thước hạt NCT3, nồng độ 0,06%)

• CT 13 (nano chitosan kích thước hạt NCT3, nồng độ 0,08%)

• CT 14 (nano chitosan kích thước hạt NCT3, nồng độ 0,1%)

• CT 15 (nano chitosan kích thước hạt NCT3, nồng độ 0,14%)

Cấy IOỊLLI bào tử nấm theo công thức thu được từ thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh vào giữa đĩa petri đã chuẩn bị sẵn

ủ đĩa nấm đã cấy ở 28°c, tiến hành theo dõi tốc độ phát triển của tản nấm, chụp ảnh

và đo kích thước 1 lần/ngày bằng thước đo

- Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Tốc độ phát triển và đường kính tản nấm (mm)

+ Thời gian nảy mầm

21

+ Xác định hiệu lực ức chế được tính theo tỷ lệ phần trăm (%) ức chế tốc độ phát triển của đường kính tản nấm, PIRG (%) (Percentage Inhibition of Radial Growth) [36] [40],

PIRG(%)=fil~ifi2 *100%

Trong đó:

Ri: đường kính tản nấm ở công thức đối chứng (mm)

R2: đường kính tản nấm ở công thức thí nghiệm (mm)

2.2.3.3 Khảo sát khả năng kháng nấm Colletotrichum gỉoeosporioides gây bệnh trên thanh long trong điều kiện in vivo

Nguyên tắc: Tiến hành việc phủ màng nanochitosan ở các công thức khác nhau, lây

bệnh nhân tạo bằng bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides ừên quả thanh long Bình

Thuận Sau đó theo dõi sự phát triển của bệnh Ở công thức mà số vết bệnh tạo thành càng

ít, đường kính bệnh càng nhỏ thì hiệu quả càng cao

Cách tiến hành: Chọn kích thước thu được ở điều kiện in vitro (AA1) cho hiệu quả để

thực hiện khảo sát Nồng độ nanochitosan 0,06; 0,08; 0.1; 0,12; 0,14% dùng trong thí nghiệm này được chuẩn bị theo các công thức

Thí nghiệm được bố hí 5 công thức, lặp lại 3 lần

• CTV 1(nano chitosan kích thước hạt AA1, nồng độ 0,06%)

• CTV 2(nano chitosan kích thước hạt AA1, nồng độ 0,08%)

• CTV 3(nano chitosan kích thước hạt AA1, nồng độ 0,1%)

• CTV 4(nano chitosan kích thước hạt AA1, nồng độ 0,12%)

• CTV 5(nano chitosan kích thước hạt AA1, nồng độ 0,14%)

Mau thanh long sau khi mua về được tiến hành rửa sạch qua bằng nước, khử trùng bề mặt bằng cồn 70° rồi rửa lại bằng nước cất và làm khô bề mặt tự nhiên Sau khi bề mặt quả

đã khô, tiến hành tạo màng bao ưên bề mặt quả bằng cách nhúng quả vào dung dịch nanochitosan theo các công thức đã bố trí [38],

Bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides thu được đã xác định nồng độ bào tử và

22

tiến hành lây bệnh nhân tạo trên quả thanh long bằng cách:

Sử dụng dao mổ nhọn vô trùng để lây bệnh, mỗi quả tạo 5 vết thương, với độ sâu và rộng là 1 mm Dùng pippet lấy 10 |ri bào tử nấm đã chuẩn bị ở ưên cho vào các vết thương

đã tạo, để khô tự nhiên, mỗi công thức tiến hành trên 3 quả Thực hiện thí nghiệm ba lần Cho các mẫu quả vào khay được lót giấy vô trùng, tiến hành ủ bệnh ở 28°c Sau khi vết bệnh bắt đầu hình thành, tiến hành đo đường kính vết bệnh hằng ngày bằng thước đo và xác định mức độ phát hiển bệnh ở các công thức thí nghiệm

- Các chỉ tiêu theo dõi:

VT: số vết thương nhân tạo

2.2.3.4 Khảo sát thời gian bảo quản thanh long ở điều kiện 15°c kết hợp với

nanochitosan ở kết quả in vivo

Thí nghiệm được thực hiện đồng thời trên mẫu có sử dụng nanochitosan và mẫu đối chứng không có nanochitosan và so sánh các kết quả thu được

Cách tiến hành: Thanh long lành bệnh được mua về và rửa sạch bằng nước để khô tự

nhiên.Sau đó, nhúng vào dung dịch nanochitosan trong 2 phút để khô tự nhiên Thanh long được bảo quản trong khay có lót giấy vô trùng ở 15 ± 2°c, độ ẩm 85% Theo dõi trong thời gian 35 ngày

Các chỉ tiêu theo dõi: