Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm linh chi ganoderma lucidum karst

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- PHẠM THANH BÌNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM LEYSS EX... Các thí n

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

PHẠM THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM

(LEYSS EX FR.) KARST

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2018

Trang 2

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM

(LEYSS EX FR.) KARST

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 60440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: 1 TS NGUYỄN TIẾN ĐẠT

2 TS TRẦN MẠNH TRÍ

Hà nội – Năm 2018

Trang 3

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Hóa học và Phòng sau đại học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã đào tạo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã cổ vũ động viên tôi hoàn thành tốt luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Trang 4

3

LỜI CAM ĐOAN Tôi là: Phạm Thanh Bình

Học viên cao học: Chuyên ngành Hóa hữu cơ – K26

Tôi xin cam đoan luận văn thạc sĩ này là một công trình nghiên cứu này là trung thực và chưa từng được sử dụng trong bất kì công trình nào khác

Các thí nghiệm để thu thập số liệu trong luận văn đã được chính bản thân tôi tiến hành thí nghiệm tại phòng Hoạt chất Sinh học, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với sự đồng ý hướng dẫn của TS Nguyễn Tiến Đạt và TS Trần Mạnh Trí

Các số liệu phục vụ cho phân tích, nhận xét đánh giá được tôi thu thập từ các nguồn có ghi rõ trong tài liệu tham khảo

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Phạm Thanh Bình

Trang 5

4

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 2

LỜI CAM ĐOAN 3

MỤC LỤC 4

DANH MỤC BẢNG 6

DANH MỤC HÌNH 6

DANH MỤC VIẾT TẮT 8

ĐẶT VẤN ĐỀ 9

Chương 1: TỔNG QUAN 10

1.1 Đặc điểm thực vật 10

1.2 Giới thiệu về nấm Linh chi 10

1.2.1 Phân bố và sinh thái của nấm Linh chi 13

1.2.2 Thành phần hóa học của nấm Linh chi 13

1.2.3 Tác dụng dược lý 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc 23

2.4 Phương pháp thử hoạt tính 24

2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-Amylase 24

2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 26

2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm 28

Chương 3 THỰC NGHIỆM 30

3.1 Xử lý mẫu nghiên cứu: 30

3.2 Quy trình phân lập các chất sạch 30

3.3 Thông số hóa lý các hợp chất phân lập được 32

3.3.1 Hợp chất 1 (GL-1): ergosterol 32

3.3.2 Hợp chất 2 (GL-2): ergosterol peroxide 32

3.3.3 Hợp chất 3 (GL-3): 3β,26-dihydroxy-5α-lanosta-8,24-dien-11-one 33

3.3.4 Hợp chất 4 (GL-4): ganoderic aldehyde A (3-hydroxy-11-oxolanosta-8,24-dien-26-al) 33

3.3.5 Hợp chất 5 (GL-5): 3β,24S,25S,26-tetrahydroxy-5α-lanosta-8-en-11-one 34

Trang 6

5

3.3.6 Hợp chất 6 (GL-6): ganoderma acid AM1 (3β-hydroxy-7,11,15,23-tetraoxo

5α-lannost-8-en-26-oic acid) 34

3.3.7 Hợp chất 7 (GL-7): ganoderic acid C6 (3β,12β-dihydroxy-7,11,15,23-tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oic acid) 35

3.3.8 Hợp chất 8 (GL-8): ganoderic acid C 35

3.3.9 Hợp chất 9 (GL-9): ganodermadiol (lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol) 36

3.3.10 Hợp chất 10 (GL-10): methyl 3β-hydroxy-12β-acetoxy-7,11,15,23-tetraoxo-5α-lanosta-8-en-26-oate 36

3.4 Thử hoạt tính sinh học của 10 hợp chất sạch phân lập được từ nấm Linh chi (G lucidum) 37

3.4.1 Thử hoạt tính ức chế enzyme α-amylase 37

3.4.2 Thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 37

3.4.3 Thử hoạt kháng viêm 37

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

4.1 Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ nấm Linh chi 39

4.1.1 Hợp chất 1: (GL-1): ergosterol 39

4.1.2 Hợp chất 2: (GL-2): ergosterol peroxide 43

4.1.3 Hợp chất 3: (GL-3): 3β,26-dihydroxy-5α-lanosta-8,24-dien-11-one 47

4.1.4 Hợp chất 4 (GL-4): Ganoderic aldehyde A (3-hydroxy-11-oxolanosta-8,24-dien-26-al) 50

4.1.5 Hợp chất 5 (GL-5): 3β,24S,25S,26-tetrahydroxy-5α-lanosta-8-en-11-one 53

4.1.6 Hợp chất 6 (GL-6): ganoderma acid AM1 (3β-hdroxy-7,11,15,23-tetraoxo 5α-lannost-8-en-26-oic acid) 60

4.1.7 Hợp chất 7 (GL-7): Ganoderic acid C6 (3β,12β-dihydroxy-7,11,15,23-tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oic acid) 63

4.1.8 Hợp chất 8 (GL-8): ganoderic acid C 67

4.1.9 Hợp chất 9 (GL-9): Ganodermadiol (Lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol) 70 4.1.10 Hợp chất 10 (GL-10): methyl 3β-hydroxy-12β-acetoxy-7,11,15,23-tetraoxo-5α-lanosta-8-en-26-oate 73

4.2 Hoạt tính sinh học các chất phân lập được từ nấm Linh chi G lucidum 77

4.2.1 Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase 77

4.2.2 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 78

4.2.3 Hoạt tính kháng viêm 79

KẾT LUẬN 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 85

Trang 7

6

DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Bảng số liệu 13C NMR của các hợp chất sạch từ nấm Linh chi (G lucidum) 42

Bảng 2 Số liệu phổ hợp chất GL-5 54

Bảng 3 Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase 77

Bảng 4 Kết quả thử hoạt tính enzyme α-glucosidase 78

Bảng 5 Kết quả thử hoạt tính kháng viêm 79

DANH MỤC HÌNH Hình 1 Một số loài nấm thuộc chi Ganoderma 11

Hình 2 Mẫu nấm linh chi (G lucidum Karst) 30

Hình 3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm Linh chi (G lucidum) 31

Hình 4 Cấu trúc hợp chất GL-1 39

Hình 5 Phổ 1H của hợp chất GL-1 39

Hình 6 Phổ 13C NMR của hợp chất GL-1 40

Hình 7 Phổ DEPT của hợp chất GL-1 41

Hình 8 Phổ MS của hợp chất GL-1 41

Hình 10 Phổ 1H NMR của hợp chất GL-2 44

Hình 13 Phổ HSQC của hợp chất GL-2 45

Hình 14 Phổ HMBC của hợp chất GL-2 46

Hình 15 Phổ MS hợp chất GL-2 46

Hình 17 Phổ 1H NMR của hợp chất GL-3 48

Hình 22 Phổ 1HNMR của hợp chất GL-4 51

Trang 8

7

Hình 32 Phổ COSY của hợp chất GL-5 59

Hình 33 Phổ NOESY của hợp chất GL-5 59

Hình 40 Cấu trúc của hợp chất GL-7 63

Trang 9

8

DANH MỤC VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic

resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân proton

Trang 10

9

ĐẶT VẤN ĐỀ Hóa học các hợp chất thiên nhiên, một bộ phận của chuyên ngành hóa hữu cơ, đang có xu hướng phát triển mạnh mẽ Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên vô cùng phong phú và quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp

Việt Nam có hệ thực vật đa dạng và phong phú do nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa Theo ước tính, nước ta có khoảng gần 13.000 loài thực vật bậc cao trong

đó có khoảng hơn 5.000 loài được sử dụng làm thuốc Nhân dân ta từ lâu đã biết sử dụng các loại cây cỏ trong tự nhiên để làm thuốc chữa bệnh Bắt nguồn từ kinh nghiệm dân gian, cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, đến nay rất nhiều dược liệu đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trong cuốc sống và khoa học

Nấm Linh chi là một trong những dược liệu quý, cây thuốc quan trọng tại các nước Đông Nam Á Trong những năm gần đây, các nhóm nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm thực hiện và bước đầu đã thu được nhiều kết quả khả quan Các công bố trong nước cũng như quốc tế chỉ ra rằng, thành phần hóa học chính trong nấm Linh chi

có phổ hoạt tính sinh học rộng phải kể đến như: điều hòa hệ miễn dịch, kháng khuẩn, kháng viêm, giảm mỡ máu, hạ huyết áp, hoạt tính chống oxy hóa, chống ung thư… Xuất phát từ những lợi ích của nấm Linh chi, các hoạt tính sinh học của nó mang lại cho con người, cũng như để hiểu sâu hơn và thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm Linh chi, đã thúc đẩy tác giả tiến hành nghiên cứu đề tài này, nhằm góp phần nhỏ của mình vào việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây nấm Linh chi nhằm mục đích phát hiện các dược tố mới, phục vụ công cuộc bảo vệ sức khỏe cộng đồng, chúng tôi lựa chọn đề tài:

“Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst”

Mục tiêu của đề tài là thực hiện các nội dung sau:

1 Phân lập các hợp chất từ cây nấm Linh chi (G lucidum);

2 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ cây nấm Linh chi (G lucidum);

3 Đánh giá một số hoạt tính các hợp chất phân lập được

Trang 11

Giới: Nấm (Fungi)

Ngành: Nấm đảm (Basidiomycota)

Lớp: Nấm đảm (Agaricoycetes)

Bộ: Nấm đa tầng (Polyporales) Họ: Nấm lim (Ganodermataceae) Chi: Ganoderma

Loài: G lucidum (Leyss ex Fr.) Kars [7]

1.2 Giới thiệu về nấm Linh chi

Các nhóm nấm có tính chất dược lý quý được xác định là thuộc họ Ganodermataceae Họ Ganodermataceae (1948) có khoảng 171 loài với các chi như: Amauroderma M., Elfvingia K., Ganoderma K., Haddowia S., Huhreya S và Magoderma S., trong đó nổi bật là 2 chi Ganoderma và Amauroderma [8, 9]

- Chi Ganoderma P, Karst (1881): anamorph Thermophymatospora, có khoảng

80 loài, được phân bố rộng đặc biệt là ở vùng nhiệt đới

+ G australe: sống trên các thân gỗ mục, nấm dược liệu

+ G applanatum: làm mục cây gỗ, nấm dược liệu

+ G lucidum: gây mục cây, nấm dược liệu

+ G philipii (G pseudoferreum): kí sinh trên dễ của ca cao, cà phê, cao su… + G orbiformum (G.boniense): kí sinh trên rễ của các cây họ cau dừa

- Chi Amauroderma Murrill (1905): có khoảng 30 loài, phân bố rộng đặc biệt là

ở vùng nhiệt đới Tuy nhiên nấm Linh chi (G lucidum) được nghiên cứu nhiều nhất bởi đặc tính dược lý và lợi ích kinh tế mà chúng đem lại

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr) Karst Trên thế giới có khoảng 80 loài khác nhau và phân bố rộng ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới Nấm Linh chi có nhiều tên gọi khác nhau như Bất lão, Chi linh, Đoạn

Trang 12

11

G tornatum (Pers.) Bres G steyaertanum B.J Sm & Sivasith

G amboinense (Lam.) Pat G australe (Fr.) Pat

G lobatum (Schwein.) G.F Atk G sinense J.D Zhao

Hình 1 Một số loài nấm thuộc chi Ganoderma

Trang 13

12

thảo, Nấm lim… Nấm Linh chi chứa nhiều thành phần khoáng vi lượng, trong đó có một

số khoáng tố như: selenium, germanium… Nấm Linh chi được chứng minh là một loại thảo dược để chống ung thư, lão hóa, xơ vữa thành mạch, viêm gan, bảo vệ cấu trúc nhân

tế bào

- Đặc điểm hình thái: Quả thể có cuống dài, ngắn hoặc hầu như không cuống và

mũ đính lệch hay đính bên màu nâu đỏ, bóng nhoáng Mũ nấm mới hình thành có dạng cục lồi, tròn; sau khi phát triển thành dạng thận, dạng bán cầu, dạng quạt, có khi tròn Mặt mũ nấm có vân tròn đồng tâm, lượn sóng nhiều hay ít, mép nấm mỏng hoặc hơi tù lượn sóng Mũ nấm sinh ra có màu trắng có sắc thái vàng lưu huỳnh sau chuyển sang vàng rỉ sắt, nâu, nâu đỏ, nâu hồng tím… tạo nên một lớp vỏ bóng nhoáng như quét sơn hoặc vecni Kích thước mũ nấm 2- 2,5 3- 30 cm; dày 0,5- 1,5 cm Thịt nấm bằng chất lie cứng, khi non màu trắng, sau đó chuyển sang màu vàng nhạt, màu nâu vàng Mô đồng nhất, không phan tầng Hệ sợi dimitric gồm sợi không vách ngang và sợi bện, kích thước

từ 2 - 7μm, màng dày, nội chất hầu như không màu, trong suốt Bào tầng dạng ống nhỏ, mỗi milimet có 4 -5 (6) ống, miệng ống nấm tròn đều, ống nấm sâu 0,2 – 0,7 cm Miệng ống nấm khi non màu trắng, khi già chuyển sang màu vàng nhạt Bào tử hình trứng nhọn một đầu, kích thước 5 – 11,5 μm  8,5 – 11,5 μm, màng hai lớp (lớp ngoài nhẵn, không màu, lớp trong có gai nhẹ), có màu nâu gỉ sắt Đảm đơn bào, hình chùy ngắn, kích thước

7 - 10 μm  12 -14 μm, màng là một lớp mỏng, nội chất không màu trong suốt Cuống nấm ngắn, thường đính bên phần lõm của mũ nấm Cuống nấm có màu sắc như màu mũ nấm và có lớp vỏ bóng loáng, thường có hình trụ tròn hay hơi dẹt, kích thước 0,5 – 1,5 (2) cm  3 – 17 cm Mô của cuống nấm và mũ đồng nhất [6]

- Chi nấm Linh chi (Ganodermataceae) được đặt tên khoa học bởi Karsten vào năm 1881 Hiện nay, nhờ hệ thống phân tích sinh hóa bằng cách sử dụng trình tự thông tin DNA có nguồn gốc rDNA, ty thể SSU đã làm rõ mối quan hệ giữa các loài nấm Linh chi và chia thành 6 nhóm đơn ngành [3]:

+ Nhóm nấm Linh chi G applanatum

+ Nhóm nấm Linh chi G tsugae

+ Nhóm nấm Linh chi Châu Á G lucidum

Trang 14

13

+ Nhóm nấm Linh chi G merrdithiae

+ Nhóm nấm Linh chi G resinaceum

Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh Linh chi có tác dụng điều trị bệnh như: rối loạn tiền đình, tăng huyết áp, viêm phổi, tiểu đường, tăng hàm lượng cholesterol trong máu [7, 29]

1.2.1 Phân bố và sinh thái của nấm Linh chi

Nấm Linh chi phân bố đa dạng và phong phú nhất ở các khu rừng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ngoài ra chúng còn sinh trưởng và phát triển ở khu vực Bắc Mỹ Ở Việt Nam, nấm Linh chi có thể tìm thấy ở hầu hết các tỉnh vùng núi từ Lào Cai (Sa Pa) đến Lâm Đồng (Lang Biang) Ở các vùng rừng trước kia có nhiều cây lim khác đã bị khai thác, trên gốc hoặc phần thân cành còn lại đều có thể thấy nấm này mọc, như vùng thuộc lâm trường Hương Sơn (Hà Tĩnh), tỉnh Thanh Hoá, Tam Đảo (Vĩnh Phúc)…

Nấm Linh chi thường hoại sinh trên gỗ mục hoặc trên đất ngay ở nơi có gốc cây

gỗ đã mục, thuộc đại diện của các họ Caesalpiniaceae (Lim, Lim xẹt, Muồng đen, Me…)

và Fagaceae (một số loài thuộc các chi Quercus, Lythocarpus, Castanopsis…) Môi trường sống của nấm thường ở rừng kín thường xanh ẩm, độ cao từ vài chục mét đến nghìn mét [2]

1.2.2 Thành phần hóa học của nấm Linh chi

Nấm Linh chi đã được dùng làm thuốc từ lâu và đã có nhiều công bố về thành phân hóa học và hoạt tính sinh học Trong nấm Linh chi chứa nhiều thành phần khác nhau, nhưng thành phân hóa học chủ yếu trong cây chứa hàm lượng lớn lớp chất triterpenoid, sau đó là polysaccharide, hợp chất phenolic, peptid và protein

 Triterpenoid

Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có độ dài mạch carbon là bội số của 5 như: menthol (monoterpene) và β-caroten (tetraterpene) Phần lớn các terpenoid có cấu trúc mạch vòng Triterpenoid là một phân lớp của terpenoid và có công thức tổng quát C30H48, cấu trúc hoá học của các triterpenoid có thể là mạch hở, 3, 4, hoặc 5 vòng với 33 khung carbon cơ bản Trong nấm Linh chi, cấu trúc hoá học của các triterpene có dạng lanostane, tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol (1), quá trình sinh tổng hợp

Trang 15

14

giúp hình thành nên các squalen mạch vòng Những triterpenoid đầu tiên được Kubota

T và cộng sự đã phân tách từ nấm Linh chi là acid ganoderic A (2) và acid ganoderic B (3) [20]

Những nghiên cứu sau đó cũng đã phân lập được các hợp chất có khung lanostane như: n-butyl ganoderate H (n-butyl 12β-aceroxy-3β-hydroxy-7,11,15,23-tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oate) (4) [21], ganolucidic acid A (5), methyl ganolucidate A (methyl 15α-hydroxy-3,11,23-trioxo-5α-lanost-8-en-26-oate) (6) và ethyl 12β-acetoxy-3,7,11,15,23-pentaoxo-5α-lanost-8-en-26-oate (7) [11]

Trang 16

15

Acid ganoderic δ dien-26-oic acid) (8), acid ganoderic ε ((23S)-3β,7β,23β-trihydroxy-11,15-dioxo-5α-lanost-8,24(E)-dien-26-oic acid) (9), acid ganoderic ζ ((23S)-3β,23β-trihydroxy-7,11,15-trioxo-5α-lanost-8,24(E)-dien-26-oic acid) (10) và acid ganoderic η ((23S)-3β,7β,12β,23β-trihydroxy-11,15-dioxo-5α-lanost-8,24(E)-dien-26-oic acid) (11) [24]

((23S)-7α,15α,23β-trihydroxy-3,11-dioxo-5α-lanost-8,24(E)-Komoda Y và cộng sự đã phân lập được các hợp chất từ nấm Linh chi vào năm 1985: (20E)-7β,15α-dihydroxy-3,11,23-trioxo-5α-lanost-8,20-dien-26-oic acid (12), (20E)-3β,7β-dihydroxy-11,15,23-trioxo-5α-lanost-8,20-dien-26-oic acid (13), (20E)-3β,7β,15α-trihydroxy-11,23-dioxo-5α-lanost-8,20-dien-26-oic acid (14), (20E)-7β-hydroxy-3,11,15,23-tetraoxo-5α-lanost-8,20-dien-26-oic acid (15) [18]

Trang 17

16

dihydroxy-11,15,23-trioxo-5α-lanost-8,16-dien-26-oic acid (16), dihydroxy-11,15,23-trioxo-5α-lanost-8,16-dien-26-oic acid methyl ester (17), 12β-acetoxy-3β,7β-dihydroxy-11,15,23-trioxo-5α-lanost-8,16-dien-26-oic acid (18) [12]

3β,7β-Lanosta-7,9(11),24-trien-15α-acetoxy-3α-hydroxy-23-oxo-26-oic acid (19), lanosta-7,9(11),24-trien-3α,15α-diacetoxy-3α-hydroxy-23-oxo-26-oic acid (20), lanosta-7,9(11),24-trien-3α-acetoxy-15α-hydroxy-23-oxo-26-oic acid (21), lanosta-7,9(11),24-trien-3α,15α-diacetoxy-3α,22β-dihydroxy-23-oxo-26-oic acid (22) [31]

hydroxy lucidelic acid D2 (23), 20-hydroxy lucidelic acid E2 (24), 20-hydroxy lucidelic acid F (25) và 20-hydroxy lucidelic acid N (26) [8]

Trang 18

20-17

Nghiên cứu mới gần đây về cây G lucidum của nhóm nghiên cứu người Trung Quốc Chen B và các cộng sự đã phân lập được 81 hợp chất sạch triterpenoid và meroterpenoid, trong đó có 8 hợp chất mới và 73 hợp chất đã biết Sau đây là một số hợp chất có trong báo cáo: Ganolucinins A (27), ganomycin J (28), ganomycin I (29) và ganoleuconin P(30) [10]

Trang 19

OH 35

O HOH2C

Trang 20

O

2 CH

n

 Các hợp chất phenolic

Ngoài 2 lớp hoạt chất sinh học chính của nấm Linh chi thì còn có rất nhiều những phân tử có hoạt tính sinh học như các terpenoid, steroid, nucleotide và phenolic Các hợp chất phenolic có hoạt tính sinh học và dược lý đặc biệt, hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic liên quan đến khả năng tạo phức kim loại, ức chế lipoxygenase và khả năng quét các gốc tự do Flavonoid là một phân lớp của polyphenol có khả năng quét gốc tự do, ức chế quá trình thuỷ phân và oxy hoá của enzyme, kháng viêm

Trong nghiên cứu của Kim Min Young và các cộng sự đã xác định được 28 hợp chất phenolic trong mẫu nấm bằng phương pháp HPLC, kết quả cho thấy hàm lượng trung bình của các hợp chất phenolic là 326 µg/g, hàm lượng flavonoid là 76 µg/g [16]

Trang 21

20

1.2.3 Tác dụng dược lý

Từ ngày xưa, ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước châu Á khác

đã sử dụng nấm Linh chi để giúp tăng cường sức khoẻ và kéo dài tuổi thọ của con người Trong dược điển Trung Quốc xuất bản năm 2000 đã công bố nấm Linh chi có tác dụng giảm căng thẳng, giảm ho và hen suyễn, được sử dụng để điều trị chóng mặt, mất ngủ… Ngày nay nấm Linh chi còn được biết đến với tác dụng phòng và chống ung thư, kháng khuẩn, chống nấm, kháng virus, chống HIV, chống viêm, tăng cường khả năng miễn dịch

Trước những lợi ích mà nấm Linh chi đem lại thì đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về các hoạt chất của chúng, trong đó có những nhóm hoạt chất quan trọng như: saponin triterpenoid, polysaccharide, steroid, acid amine… Chúng có vai trò quyết định trong điều trị các bệnh về tim mạch, gan mật, ung thư, chống oxy hoá và tăng khả năng miễn dịch cho cơ thể

 Phòng ngừa ung thư

Năm 2012, nghiên cứu của Teekachunhatean và các cộng sự đã chứng minh khả năng gây độc đối với các tế bào ung thư qua các cơ chế hoạt động khác nhau như: kích thích quá trình tự chết của tế bào hay những tác động cản trở quá trình phát sinh, di chuyển, xâm nhập và di căn của dòng tế bào ung thư biểu mô Vì vậy, các hoạt động chống ung thư in vivo có thể được biểu hiện thông qua sự kết hợp giữa các triterpene với các hợp chất có hoạt tính sinh học khác ví dụ như protein miễn dịch L.Zhi-8 [35]

 Tăng cường khả năng miễn dịch

Nhiều thành phần trong nấm Linh chi đã được chứng minh có tác dụng tăng cường

sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào lyho, các bạch cầu đơn nhân Nghiên cứu của Wang và các cộng sự đã chứng minh polysaccharide có trong nấm Linh chi có tác dụng làm tăng khả năng hoạt động của các tế bào lyho T và các đại thực bào, bằng cách làm tăng hàm lượng interleukin IL-1β, TNF-α và IL-6 Đây là những yếu tố tăng tiết interferon α và γ, do đó chúng được cho là có tác dụng trên hệ miễn dịch [12]

 Khả năng kháng HIV

Năm 1998, Sahar và các cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính của nấm Linh chi Ban đầu nhóm nghiên cứu thử nghiệm cặn tổng methanol của nấm Linh chi với virut

Trang 22

21

HIV thấy có hoạt động trung bình để ức chế sự sản sinh HIV-1 gây ra trên dòng tế bào MT-4 với giá trị 31.1 μg/mL và có khả năng ức chế enzyme protease của virut HIV-PR Sau đó nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân lập phân đoạn đó và tiến hành thử hoạt tính với tế bào HIV-1 và enzyme của nó HIV-PR Nhóm nghiên cứu đã phân lập được 13 hợp chất sạch Các hợp chất đều là triterpnenoid và có tác dụng kháng virut HIV, trong

đó có 5 hợp chất thuộc họ acid ganoderic A, B, C1, H và α [11]

 Tác dụng chống oxy hoá

Nấm Linh chi (G lucidum) có tác dụng chống oxy hoá, kích thích hoạt động của

hệ miễn dịch, làm giảm tác dụng phụ của thuốc hoá trị liệu ung thư Năm 2005, Nguyễn Thượng Dong và cộng sự tiến hành nghiên cứu tác dụng của nấm Linh chi trên chuột nhắt trắng, nhận thấy cao nước và cao ethanol 80% chiết xuất từ nấm Linh chi có hoạt tính chống oxy hoá trên mô hình gây viêm gan cấp bằng CCl4 [4]

Nấm Linh chi đỏ thể hiện hoạt tính khử gốc superoxyd in vitro điển hình ở các cao chiết EtOH và MeOH, cùng cao chiết phân đoạn n-butanol và diethyl ether Theo nhóm nghiên cứu của Trần Thị Văn Thi, cao triterpenoid tổng từ chiết xuất nấm Linh chi có tác dụng chống oxy hoá (ức chế 19,94 % sự tăng hàm lượng MDA so với liều 484

mg cao/ kg thể trọng chuột) [5]

 Tác dụng bảo vệ gan

Vào năm 2013, Ha và các cộng sự đã nghiên cứu cao chiết methanol và các phân đoạn n-hexan, dichloromethane, dịch chiết methanol, cùng các hợp chất phân lập được

từ nấm Linh chi (ergosterol, ergosterol peroxyd và ganodermanontriol) có tác dụng bảo

vệ gan in vitro và vitro liên quan đến sự kích hoạt enzyme HO-1 và các yếu tố GDT kích ứng tác dụng của protein HO-1 thông qua sự kích hoạt yếu tố chuyển vị trong nhân tế bào Nrf-2, trong các con đường tín hiệu PI3K/Akt và p38; làm tăng cường mức độ bảo

vệ các tế bào gan chống lại t-BHP [34]

Các polisaccarit trong nấm Linh chi có tác dụng tăng tích luỹ anbumin huyết tương, có tác dụng bảo vệ gan và phục hồi chức năng gan, đặc biệt là điều trị viêm gan

B Acid ganoderic R và S trong hệ sợi; acid ganoderic A trong bào tử của nấm Linh chi

có tác dụng bảo vệ gan gây ra bởi galactosamin [1]

Trang 23

22

 Tác dụng khác

- Tác dụng hạ huyết áp: Năm 1986, Morigiwa A và cộng sự đã nghiên cứu dịch chiết methanol từ quả thể của nấm Linh chi có tác dụng ức chế men chuyển có liên quan trong việc kiểm soát tăng huyết áp Một số acid ganoderic như acid ganoderic B, D, F,

H phân lập từ nấm Linh chi có tác dụng chống cao huyết áp, trong đó acid ganoderic F

- Tác dụng hạ đường huyết: các glycan A, B và C phân lập từ nấm Linh chi có tác dụng hạ đường máu rõ rệt ở chuột trắng bình thường và chuột gây đái tháo đường aloxan [2]

Trang 24

23

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu: Mẫu nấm Linh chi được thu hái tại vườn Quốc gia Chu Mom Ray tỉnh Kontum

Mẫu sau khi thu hái sẽ được làm mẫu tiêu bản và giám định tên khoa học bởi các nhà thực vật học Mẫu tươi được làm sạch, phơi khô trong bóng râm, nghiền nhỏ và được bảo quản cho tới khi nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng tia

tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4

10% được phun đều lên bản mỏng, rồi sấy khô từ từ bằng máy sấy nhiệt cho đến khi hiện màu

- Sắc ký lớp mỏng điều chế: Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch

H2SO4 10%, sấy nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất; sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp

- Sắc ký cột: Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường

và chất hấp phụ pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Chất hấp phụ pha đảo là octadecylsilyl (ODS) hoặc YMC (30-50 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.) Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem Ind Co., Ltd.) 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ NMR đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan) Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

Trang 25

24

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC và HMBC

+ Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: CD3OD và CDCl3

- Phổ khối lượng: có hai loại là phổ khối phun mù điện tử phân giải thường và phổ khối phân giải cao:

+ Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS, LTQ Orbitrap XLTM Mass Spectrometer, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

+ Phổ khối phân giải thấp: máy Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems (Agilent Technologies, USA), Viện Hóa sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Ngoài ra còn đo thêm góc quay cực và đo điểm nóng chảy:

+ Độ quay cực: Góc quay cực [α]D được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam + Nhiệt độ nóng chảy: Nhiệt độ nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Bước 2: 200 mL đệm 0,05 M Tris HCl 0,01 M CaCl2 pH 6,9

+ Cân 1,34 g Tris và hòa tan hoàn toàn vào 160 mL H2O (được chưng cất 2 lần và loại bỏ ion)

+ Thêm 0,22 g CaCl2 hoặc 0,3 g CaCl2.2H2O, hòa tan hoàn toàn Chuẩn bị pH 6,9 bằng 1M/2,5 M HCl Thêm H2O cho đủ 200 mL

Trang 26

25

- Bước 3: Chuẩn bị mẫu

+ Mẫu pha sàng lọc: mẫu gốc được pha trong 50% DMSO, 50% đệm Pha loãng theo nồng độ 0,1 và 0,5 mg/mL (tính theo giá trị cuối cùng, chia cho tổng thể tích phản ứng là 0,5 mL)

+ Mẫu pha IC50: pha loãng theo 5 thang nồng độ tùy theo kết quả sàng lọc Ví dụ:

10, 20, 50, 100 và 200 μg/mL hoặc 10, 25, 50, 75 và 100 μg/mL (tính theo giá trị cuối cùng, chia cho tổng thể tích phản ứng là 0,5 mL)

+ Các mẫu đối chứng dương, âm cũng cần được chuẩn bị đồng thời

+ Acarbose 10, 100 μg/mL sử dụng cho các mẫu sàng lọc

- Bước 4: 100 mL 50% acid acetic

Pha 50 mL 100% acid acetic và 50 mL H2O (đã chưng cất hai lần và loại bỏ ion)

- Bước 5: 8 mL dung dịch enzyme (2 mol/mL) (pha trước phản ứng)

Cân 1 mg bột enzyme (porcine pancreatic α-amylase 16U/, Ec 3.2.1.1) pha trong 8

mL đệm 0,05 M Tris HCl, 0,01 M CaCl2 pH 6,9

* Lưu ý: Ngay sau khi dùng giữ dung dịch ở 4oC

- Bước 6: 10mg/mL dung dịch tinh bột xanh (starch azure)

Pha 20 mg tinh bột xanh trong 2 mL đệm (đủ cho khoảng 15 mẫu phản ứng), đun sôi 100oC trong 5 phút, ủ tiếp trong 37oC trong 5 phút, sử dụng ngay cho phản ứng

 Tiến hành

Dung dịch được chuẩn bị trong ống eppendoft 1,5 mL theo thứ tự lần lượt: 100

μL dung dịch tinh bột xanh, 100 μL mẫu thử và 50 μL dung dich enzyme Ủ trong 37oC khoảng 15 phút, sau đó thêm 250 μL acid acetic vào mỗi ống để dừng phản ứng Ly tâm

ở 3000 rpm trong 5 phút Hút phần 200 μL dung dịch phía trên ra giếng 96 (2 giếng/ mẫu) Đo ở bước sóng A295 nm

 Tính toán

Hoạt tính kìm hãm: I= [( ) – ( )]

( ) 𝑥 100 Trong đó:

As: độ hấp thụ của mẫu đo

Trang 27

Ab: độ hấp thụ của mẫu blank

100 µL mẫu, 100 µL dung dịch tinh bột xanh và 50 µL đệm: sử dụng trong trường hợp mẫu dung dịch chiết hoặc các chất có cường độ màu cao, có thể gây ảnh hưởng đến kết quả phép đo

Các trường hợp khác: Ab = Ac-

*Giá trị IC50 được tính theo phần mềm cung cấp

2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

Theo phương pháp của Ranilla L G et al [29]

 Nguyên lý

α-glucosidase

p-Nirophenyl α-D-glucosidase α-D-glucosidase + p-Nirophenol

 Chuẩn bị

- Bước 1 Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ

+ Máy đọc ELISA Bio-Rad (Laboratories, Mỹ)

+ Bình ổn nhiệt lập ở 37oC, mấy đo pH, máy khuấy từ

+ Micropipet loại 10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL (Isolab, Đức)

+ Pha 49 mL 0,2 MKH2PO4 + 51 mL 0,2 M KH2PO4

+ Thêm 90 mL nước cất, kiểm tra bằng pH meter, thêm KOH hoặc H3PO4 nếu cần thiết cho đủ 200 mL

Trang 28

27

- Bước 3 Chuẩn bị mẫu:

+ Chuẩn bị lượng mẫu đủ thử cho 3 giếng x 200 mL/mẫu

+ Mẫu pha sàng lọc

+ Mẫu gốc được pha trong 50% DMSO, 50% đệm Pha loãng theo các nồng độ 0,1

và 0,5 mg/mL (tính theo giá trị cuối cùng, chia cho tổng thể tích phản ứng là 0,2 mL) + Mẫu pha IC50: Pha loãng theo 5 thang nồng độ tùy theo kết quả sàng lọc

Ví dụ: 10, 20, 50, 100 và 200 (μg/mL) (tính theo giá trị cuối cùng, chia cho tổng thể tích phản ứng là 0,2 mL)

Các mẫu chứng dương, chứng âm cũng cần được chuẩn bị đồng thời

+ Acarbose: 100, 500 μg/mL sử d ụng cùng với các mẫu sàng lọc 5 mL

- Bước 4 5 mL cơ chất: 5 mL p-nitrophenyl-α-D-glucose (pNPG) (dùng cho khoảng 30 mẫu)

+ Cân 7,5 mg PNPG trong 5 mL 0,1 M KPP pH 6,8

- Bước 5 10 mL dung dịch enzyme (0,5 mol/mL)

+ Enzyme sử dụng: yeast α-glucose (26,5 U/mg) EC 3.2.1.20

+ Chuẩn bị dung dịch enzyme gốc 10 mol/mL

Cân 1 mg bột enzyme pha trong 2,65 mL đệm 0,1 M KPP pH 6,8

Ngay sau khi dùng lưu trong tủ đá – 20oC

+ Chuẩn bị dung dịch enzyme phản ứng (pha trước khi thử phản ứng)

Trang 29

28

 Tính toán

Hoạt tính kìm hãm tính theo công thức sau

I = ((Ac+ - Ac- ) – (As – Ab)) / (Ac+ - Ac- )x 100

- As: Độ hấp thụ của mẫu đo

- Ac-: Độ hấp thụ của mẫu chứng âm – 100% kìm hãm (150 μL đệm + 50 μL dung dịch cơ chất) Độ hấp thụ nên nằm trong khoảng 0.04 – 0.06

- Ac+: Độ hấp thụ của mẫu chứng dương – 0% kìm hãm (50 μL đệm + 50 μL

cơ chất + 100 μL enzyme) Độ hấp thụ nên nằm trong khoảng 0.5 - 0.7

- Ab: Độ hấp thụ của mẫu blank ( 50μL mẫu+ 50μL cơ chất+ 100 μL đệm): sử dụng trong trường hợp mẫu dịch chiết hoặc các chất có cường độ màu cao, có thể gây ảnh hưởng đến kết quả phép đo Các trường hợp khác: Ab = Ac-

* Giá trị IC50 được tính theo phần mềm cung cấp

2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm

 Thiết bị, dụng cụ

- Máy đọc ELISA Bio-Rad (Laboratories, Mỹ)

- Micropipet loại 10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL (Isolab, Đức)

Trang 30

29

 Chuẩn bị mẫu

Mẫu thử nghiệm được pha thành dung dịch gốc với nồng độ 100 mM trong DMSO, sau được pha loãng ở các nồng độ khác nhau

 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm

Gốc tự do nitric oxide (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau Dạng

•NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn khi xuất hiện các đáp ứng viêm [8]

Một phương pháp được sử dụng để xác định gián tiếp •NO là đo màu các thành phần sản phẩm của nó (nitrate và nitrite) Phản ứng này đòi hỏi rằng nitrate (NO3) đầu tiên được khử thành nitrite (NO2), do tác động của nitrate reductase

Nitrite được phát hiện và phân tích bằng cách hình thành một màu hồng đỏ khi mẫu thử có chứa NO2- với thuốc thử Griess

Khi thêm acid sulphanilic, nitrite tạo thành muối diazonium, sau đó các thuốc nhuộm azo (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) được thêm vào để tạo thành màu hồng

Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năng sống sót của tế bào Ở các tế bào sống, hệ enzyme oxydoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan không hoà tan, màu tím đậm Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót được suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT Lượng formazan tạo thành được hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo

độ hấp thụ ở bước sóng 570 mm Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm được suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào

Trang 31

30

Chương 3 THỰC NGHIỆM 3.1 Xử lý mẫu nghiên cứu:

Nguyên liệu: Mẫu nấm linh chi được thu hái tại vườn Quốc gia Chu Mom Ray tỉnh Kontum vào tháng 6 năm 2014

Tên khoa học được giám định bởi TS Nguyễn Phương Đại Nguyên, Trường Đại học Tây Nguyên Mẫu tiêu bản số M-186.2014 và được lưu giữ tại Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Trường Đại học Tây Nguyên

Hình 2 Mẫu nấm linh chi (G lucidum Karst) 3.2 Quy trình phân lập các chất sạch

Mẫu quả thể Linh chi được thu hái, làm sạch, cắt nhỏ, phơi khô trong bóng râm, sau đó đem xay thu được bột khô (850 g) Ngâm bột khô này với methanol (2 lít) trong

bể siêu âm ở 40oC, trong 30 phút Sau đó gạn, lọc cặn dịch chiết và đem cô cặn trên máy cất quay ở 50oC dưới áp suất thấp để loại dung môi Làm lặp lại thêm hai lần thì thu được cặn chiết methanol (40 g) Cặn tổng methanol này được hòa tan vào nước ấm 50oC (600 mL) và chiết phân lớp lần lượt với n-hexane và ethyl acetate thu được hai cặn chiết phân đoạn là n-hexane (3,34 g) và cặn ethyl acetate (17,54 g), còn lại dịch nước

Cặn ethyl acetate được sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải gradient (100% dichloromethane → 100% methanol v/v) thu được 7 phân đoạn GL-2.1 → GL-2.7 Phân đoạn GL-2.1 thấy xuất hiện kết tinh, rửa kết tinh bằng ethanol thu được hợp

Trang 32

31

Hình 3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm Linh chi (G lucidum)

chất sạch GL-1 (200,0 mg) Tiếp theo phân đoạn GL-2.2 (950,4 mg) sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải n-hexane/acetone (4,5/1 v/v) thu được phân đoạn GL-11.4 (56,0 mg) Từ phân đoạn GL-11.4 tiến hành sắc ký trên cột silica gel cùng hệ dung môi n-hexane/acetone (3/1 v/v) thu được hai hợp chất sạch GL-9 (7,3 mg) và GL-2 (13,0 mg) Tiếp tục sắc ký phân đoạn GL-2.5 (1478,0 mg) trên cột silica gel cùng hệ dung môi rửa giải dichloromethane/acetone (6/1 v/v) thu được hai phân đoạn GL-3.8 (305,1 mg)

và GL-3.12 (43,7 mg), sau khi sắc ký lần lượt hai phân đoạn này trên hai cột silica gel với cùng hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate (3/1 v/v) thu được hai hợp chất sạch tương ứng là GL-3 (150,0 mg) và GL-4 (20,9 mg) Tiến hành sắc ký phân đoạn GL-2.7 (2500,0 mg) trên cột pha đảo RP18 với hệ dung môi rửa giải acetone/nước (1/1 v/v) thu được ba phân đoạn GL-5.3, GL- 5.4 và GL- 5.10 Từ phân đoạn GL-5.3 (59,6 mg) tiến hành sắc

ký trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol/nước (20/1/0,01 v/v) thu được hai hợp chất sạch GL-6 (6,2 mg) và GL-7 (6,1 mg) Hai hợp chất sạch GL-8 (5,5 mg) và GL-10 (17,0 mg) cùng thu được khi sắc ký phân đoạn GL-5.4 (1049,0 mg) trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol (20/1 v/v) Cuối cùng tiến hành sắc ký phân đoạn GL-5.10 (126,4 mg) trên cột silica gel n-hexane/acetone (3/1 v/v) thu được hợp chất sạch GL-5 (48,4 mg)

Gradient, 100%D→100%M

GL-2.2

(950,4 mg)

GL-2.5 (1478,0 mg)

GL-2.7 ( 2500,0 mg) D/A : 16/1

GL-3.8

(43,7 mg) H/E: 3/1

GL-3 (150,0 mg)

H/E: 3/1

GL-4 (20,9 mg)

Nấm Linh chi khô (850,0 g)

Cặn metanol (40,0 g)

Cặn n-hexane (3,34 g)

GL-5.4 ( 1049,0 mg)

GL-6 (6,2 mg)

GL-7 (6,1 mg)

D/M/W:20/1/0,01

GL-8 (5,5 mg)

GL-10 (17,0 mg) D/M:20/1

YMC-PR18 A/W: 1/1

GL-5.10 (145,7 mg)

GL-5 (48,4 mg) H/A: 3/1

GL-2.1

(830,6 mg)

GL-2 ( 13,0 mg)

Trang 33

s, H-19), 1,03 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 1,22 (2H, m, Hb-11, 17), 1,32 (1H, m, Hb-12), 1,36 (1H, m, Hb-16), 1,40 (1H, m, Hb-15), 1,46 (1H, m, H-25), 1,48 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, Ha-11), 1,54 (1H, m, Hb-2), 1,55 (1H, m, H-14), 1,59 (1H, m, Ha-15), 1,69 (1H,

m, Hb-1), 1,76 (1H, m, Ha-16), 1,84 (1H, m, Ha-2), 1,91 (1H, m, Hb-4), 1,93 (1H, m, Ha1), 2,02 (1H, m, Ha-12), 2,28 (1H, m, H-20), 2,47 (1H, m, Ha-4), 3,63 (1H, m, H-3), 5,15-5,24 (2H, m, H22, 23), 5,38 (1H, dd, J = 2,5, 10,5 Hz, H-7) và 5,56 (1H, dd, J = 2,5, 10,5 Hz, H-6) Số liệu phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) trình bày ở bảng 1

Hz, H-28), 1,00 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 1,22 (2H, m, Hb-11, H-17), 1,32 (1H, m, Hb12), 1,36 (1H, m, Hb-16), 1,40 (1H, m, Hb-15), 1,46 (1H, m, H-25), 1,48 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, Ha-11), 1,54 (1H, m, Hb-2), 1,55 (1H, m, H-14), 1,59 (1H, m, Ha-15), 1,69 (1H, m, Hb-1), 1,76 (1H, m, Ha-16), 1,84 (1H, m, Ha-2), 1,91 (1H, m, Hb-4), 1,93 (1H,

-m, Ha-1), 1,94 (1H, m, Ha-12), 2,02 (1H, m, H-20), 2,11 (1H, m, Ha-4), 3,96 (1H, m,

Trang 34

H-33

3), 5,14 (1H, dd, J = 7,5, 15,0 Hz, H-22), 5,22 (1H, dd, J = 7,5, 15,0 Hz, H-23), 6,24 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6) và 6,50 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-7) Số liệu phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) trình bày ở bảng 1

m, Ha-2), 1,59 (1H, m, Hb-15), 1,65 (3H, s, H-27), 1,69 (1H, m, Ha-1), 1,76 (1H, m, Hb16), 1,81 (1H, m, Hb-6), 1,83 (1H, m, H-17), 1,84 (1H, m, Hb-2), 1,85 (2H, m, H-22), 1,85 (1H, m, Hb-23), 1,93 (1H, m, Hb-1), 2,36 (1H, m, Ha-7), 2,47 (1H, m, Hb-7), 2,48 (1H, d, J = 16,5 Hz, Hb-12), 2,66 d (1H, d, J = 16,5 Hz, Ha-12), 3,24 (1H, dd, J = 5,0, 11,0 Hz, H-3), 3,98 (2H, s, H-26) và 5,38 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-24) Số liệu phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) trình bày ở bảng 1

-3.3.4 Hợp chất 4 (GL-4): ganoderic aldehyde A dien-26-al)

(3-hydroxy-11-oxolanosta-8,24 Chất kết tinh hình kim màu trắng

Trang 35

34

(1H, m, Ha-16), 1,40 (1H, m, Ha-15), 1,50 (1H, m, H-20), 1,52 (1H, m, Ha-6), 1,54 (1H,

m, Ha-2), 1,59 (1H, m, Hb-15), 1,69 (1H, m, Ha-1), 1,76 (1H, m, Hb-16), 1,76 (3H, s, 27), 1,81 (1H, m, Hb-6), 1,83 (1H, m, H-17), 1,84 (1H, m, Hb-2), 1,85 (2H, m, H-22), 1,85 (1H, m, Hb-23), 1,93 (1H, m, Hb-1), 2,36 (1H, m, Ha-7), 2,47 (1H, m, Hb-7), 2,50 (1H, d, J = 16,5 Hz, Hb-12), 2,69 d (1H, d, J = 16,5 Hz, Ha-12), 3,25 (1H, dd, J = 5,0, 11,0 Hz, H-3), 6,48 (1H, m, H-24) và 9,40 (1H, s, H-26) Số liệu phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) trình bày ở bảng 1

H-m, H-2), 1,92 (1H, H-m, Ha-16), 2,36 (1H, m, H-20), 2,40 (1H, m, Hb-22), 2,53 (1H, m,

Hb-6), 2,56 (1H, m, Hb-24), 2,60 (1H, m, Ha-22), 2,71 (1H, m, H-17), 2,74 (2H, m, Ha6), 2,76 (1H, m, Ha-1), 2,80 (1H, m, Hb-16), 2,86 (2H, m, Ha-24 và H-25) và 3,42 (1H,

-dd, J = 5,0, 11,5 Hz, H-3) Số liệu phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) trình bày bảng 1

Trang 36

H-m, H-2), 1,95 (1H, H-m, Hb-16), 2,37 (1H, m, H-20), 2,53 (1H, m, Hb-6), 2,56 (1H, m, Hb24), 2,60 (2H, m, H-22), 2,71 (1H, m, H-17), 2,74 (2H, m, Ha-6), 2,76 (1H, m, Ha-1), 2,80 (1H, m, Ha-16), 2,86 (2H, m, Ha-24 và H-25), 3,22 (1H, m, H-3) và 4,60 (1H, s, H-12) Số liệu phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) trình bày ở bảng 1

Trang 37

3.3.10 Hợp chất 10 (GL-10): methyl 5α-lanosta-8-en-26-oate

H-J = 7,0 Hz, H-27), 1,36 (3H, s, H-19), 1,65 (1H, m, H-5), 1,68 (2H, m, H-2), 1,73 (3H,

s, H-28), 1,97 (1H, m, Hb-16), 2,23 (3H, s, CH3CO), 2,33 (1H, m, H-20), 2,40 (1H, m,

Hb-22), 2,50 (1H, m, H-17), 2,53 (1H, m, Hb-6), 2,56 (1H, m, Hb-24), 2,60 (1H, m, Ha22), 2,65 (2H, m, Ha-6), 2,70 (1H, m, Ha-1), 2,74 (1H, m, Ha-16), 2,82 (1H, m, Ha-24), 2,90 (1H, m, H-25), 3,24 (1H, m, H-3), 3,35 (3H, s, COOCH3), 5,71 (1H, s, H-12) Số liệu phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD) trình bày ở bảng 1

Trang 38

Dung dịch được chuẩn bị trong ống eppendoft 1,5 mL theo thứ tự lần lượt: 100

µL dung dịch tinh bột xanh, 100 µL mẫu thử và 50 µL dung dịch enzyme Ủ trong 37oC khoảng 15 phút, sau đó thêm 250 µL acid asetic vào mỗi ống để dừng phản ứng Ly tâm

ở 3000 rpm trong 5 phút Hút phần 200 µL dung dịch phía trên ra giếng 96 (2 giếng/ mẫu) Đo ở bước sóng A595 nm

3.4.2 Thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

- Chuẩn bị mẫu thử:

Các mẫu thử nghiệm được pha thành dung dịch gốc với nồng độ 100 mM trong DMSO, sau đó pha loãng với hai nồng độ 10 μM và 30 μM

- Các bước tiến hành:

Trang 39

38

Tế bào RAW264.7 được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường DMEM ở 37oC, 5%

CO2 với 10% FBS, penicillin và streptomycin sulphate Sau đó chúng được nuôi cấy trong giếng phiến 96 với mật độ 2,5 x 105 tế bào/giếng Tế bào được kích thích với LPS trong 24 giờ với sự có mặt của các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau, được pha sẵn trong DMSO Dịch nổi của tế bào phản ứng với thuốc thử Griess NaNO2 ở các nồng

độ khác nhau được sử dụng để xây dựng đường chuẩn Độ hấp thụ được đo ở 570 nm Cardamonin được sử dụng làm mẫu đối chứng

Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính in vitro được bổ sung dung dịch MTT (5 mg/mL pha trong PBS), ủ 4h ở 37oC và 5% CO2 Sau đó hút bỏ hết môi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol Độ hấp thụ được đo ở 570 nm

Trang 40

1H-NMR trên vùng trường mạnh xuất hiện tín hiệu đặc trưng của 6 nhóm methyl tại H

0,63 (3H, s, H-18), 0,82 (3H, d, J = 6,7 Hz, H-27), 0,84 (3H, d, J = 6,7 Hz, H-26), 0,91 (3H, d, J = 6,8 Hz, H-28), 0,94 (3H, s, H-19) và 1,03 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21)

Hình 5 Phổ 1H của hợp chất GL-1

Định dạng
Số trang	86
Dung lượng	4,87 MB