Nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen DREB2 liên quan đến tính chịu hạn

Do đó, bên cạnh các biện pháp thủy lợi, việc nghiên cứu tạo giống ngô có khả năng thích ứng cao với điều kiện hạn hán là một trong những mục tiêu chính trong các chương trình lai tạo giố

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Nguyễn Thùy Linh

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN

DREB2.7 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Nguyễn Thùy Linh

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN

DREB2.7 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Huỳnh Thị Thu Huệ

TS Lê Hồng Điệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Huỳnh Thị Thu Huệ và TS Lê Hồng Điệp Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào

Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ

Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn

Học viên

Nguyễn Thùy Linh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Huỳnh Thị Thu Huệ – Viện Nghiên cứu hệ gen và TS Lê Hồng Điệp –Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản Luận văn Thạc sĩ này Xin được cảm ơn đề tài cấp nhà nước: ―Phân lập thiết kế gen chịu hạn phục vụ công tác tạo giống ngô biến đổi gen‖ do Viện Nghiên cứu hệ gen chủ trì, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ quản đã hỗ trợ tôi về mọi phương diện để thực hiện nghiên cứu này

Tôi xin cảm ơn các cán bộ Phòng Đa dạng sinh học hệ gen - Viện Nghiên cứu hệ gen đã tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm

Học viên

Nguyễn Thùy Linh

MỤC LỤC

MỤC LỤC ii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG vi

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Cây ngô và hạn hán 3

1.1.1 Tình hình về cây ngô ở nước ta 3

1.1.2 Hạn hán ảnh hưởng đến năng suất cây ngô 4

1.1.3 Nâng cao năng suất ngô trong điều kiện hạn hán 5

1.2 Nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen chịu hạn 6

1.2.1 Tình hình nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen trên thế giới 6

1.2.2 Tình hình nghiên cứu tạo giông ngô biến đổi gen chịu hạn trên thế giới 7

1.2.3 Tình hình nghiên cứu cây ngô biến đổi gen ở Việt Nam 9

1.3 Tính trạng chịu hạn ở thực vật và nhân tố phiên mã DREB 10

1.3.1 Cơ sở phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật 10

1.3.2 Họ nhân tố phiên mã DREB 12

1.3.3 Nhân tố phiên mã ZmDREB2.7 13

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15

2.1 Vật liệu 15

2.1.1 Mẫu thực vật 15

2.1.2 Chủng vi khuẩn, vector và mồi 15

2.1.3 Hóa chất và môi trường 17

2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Tách chiết DNA 19

2.2.2 Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA 20

2.2.5 Tạo tế bào khả biến E coli và biến nạp bằng sốc nhiệt 21

2.2.6 Tạo tế bào khả biến A tumefaciens và biến nạp bằng xung điện 22

2.2.7 Nhân dòng gen ZmDREB2.7tv 22

2.2.8 Tạo vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv: :polyA 23

2.2.9 Chuyển gen vào cây ngô thông qua vi khuẩn A tumefaciens 24

2.2.10 Real-time PCR định lượng để ước lượng số bản sao của gen trong cây chuyển gen 26

2.2.11 Real-time PCR định lượng để đánh giá sự biểu hiện của gen trong cây chuyển gen 27

2.2.12 Phân tích cây chuyển gen 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả phân lập gen ZmDREB2.7tv từ cây ngô Tẻ vàng 1 29

3.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ lá cây ngô Tẻ vàng 1 29

3.1.2 Phân lập và tạo dòng gen ZmDREB2.7tv 30

3.1.3 Phân tích trình tự gen ZmDREB2.7tv 32

3.2 Kết quả thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2.7tv 35

3.2.1 Thiết kế vector trung gian pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv 35

3.2.2 Thiết kế vector biểu hiện pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv 39

3.2.3 Tạo chủng A tumefaciens EHA105 mang vector biểu hiện 42

3.3 Kết quả tạo cây ngô biến đổi gen mang gen ZmDREB2.7tv 42

3.3.1 Chuyển gen ZmDREB2.7tv vào cây ngô thế hệ T0 42

3.3.2 Đánh giá cây chuyển gen thế hệ T0 47

3.3.3 Tạo và đánh giá cây chuyển gen thế hệ T1 50

3.3.4 Ước lượng số bản sao của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế hệ T1 51

3.3.5 Đánh giá sự biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế hệ T2 53

KẾT LUẬN 56

KIẾN NGHỊ 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tổng sản lượng ngô tiêu thụ theo năm tài chính giai đoạn 2015-2018 ở nước ta 4Hình 1.2 Số lượng các thử nghiệm cây biến đổi gen trên đồng ruộng qua các năm [32] 7 Hình 1.3 Số lượng các thử nghiệm đồng ruộng của cây biến đổi gen chịu hạn [32] 8 Hình 1.4 Các nhóm protein tham gia vào quá trình đáp ứng của cây khi gặp hạn [28] 11

Hình 2.1 Phương pháp tạo vector biểu hiện mang gen ZmDREB2.7tv 24

Hình 3.1 Điện di đồ kiểm tra DNA tổng số từ ba mẫu lá ngô Tẻ vàng 1 29Hình 3.2 Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp

pJET1.2/ZmDREB2.7tv 31 Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm xử lý plasmid pJET1.2/ZmDREB2.7tv bằng

enzyme giới hạn BglII 32 Hình 3.4 Kết quả so sánh trình tự ZmDREB2tv phân lập từ giống ngô Tẻ vàng 1

và trình tự tham chiếu ngô B73 bằng công cụ BioEdit 34

Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại vùng mã hóa gen ZmDREB2.7tv

36

Hình 3.6 Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pRTL2/rd29A: :ZmDREB2.7tv 37 Hình 3.7 Kết quả kiểm tra plasmid pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv 38

Hình 3.8 Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pCAMBIA1300/

rd29A::ZmDREB2.7tv 40 Hình 3.9 Kết quả tạo plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv 41 Hình 3.10 Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra vi khuẩn A tumefaciens EHA105 mang vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA

42 Hình 3.11 Quá trình chuyển gen vào ngô trung gian qua vi khuẩn

Agrobacterium 43 Hình 3.12 Điện di đồ DNA tổng số tách từ các cây chuyển gen ZmDREB2.7tv

thế hệ T0 47

Hình 3.14 Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen HygR trong cây

chuyển gen thế hệ T0 49 Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm trong cây

chuyển gen ZmDREB2.7tv thế hệ T2 54 Hình 3.17 Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7

của cây chuyển gen khi gặp hạn 54

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Actin-1 Gen actin-1

AP2/ERF2 AP2/ethylene-responsive element-binding

CBF C-repeat Binding Factors

DREB Dehydration-responsive element-binding

Glb-1 Gen globulin-1

HygR Gen hygromycin

ISAAA International Service for the Acquisition of Agribiotech

Applications

PCR Polymerization Chain Reaction

rd29A Gen/promoter của gen rd29A

USDA The United States Department of Agriculture

ZmDREB2.7tv Gen ZmDREB2.7 phân lập từ ngô Tẻ vàng 1

MỞ ĐẦU

Cây ngô là một trong các loài cây trồng quan trọng đối với con người Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa Mặc dù sản lượng tăng lên đáng kể trong vài năm trở lại đây, năng suất trồng ngô vẫn chưa đạt được giá trị tiềm năng của nó do nhiều nguyên nhân khác nhau Trong đó, nguyên nhân chính ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất ngô là khô hạn, nhất là khi hiện tượng biến đổi khí hậu khiến các đợt hạn hán xảy ra thường xuyên hơn và nghiêm trọng hơn Do

đó, bên cạnh các biện pháp thủy lợi, việc nghiên cứu tạo giống ngô có khả năng thích ứng cao với điều kiện hạn hán là một trong những mục tiêu chính trong các chương trình lai tạo giống Với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật và sự chấp thuận cây trồng biến đổi gen ở nước ta đã mở ra một cơ hội, đồng thời là thách thức lớn trong việc tạo ra giống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn Nguyên nhân gồm cả khách quan và chủ quan như nguồn gen chưa được tập trung khai thác/nghiên cứu nhiều, công nghệ chuyển gen chưa được tiếp cận sớm, đồng thời cây ngô cũng là đối tượng khó để chuyển gen

Giống ngô Tẻ vàng 1 sống ở vùng núi đá thuộc tỉnh Điện Biên, nơi có nhiệt

độ và lượng mưa hằng năm thấp Giống ngô này đang được sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho các chương trình cải tạo giống bởi khả năng chịu hạn và chịu lạnh tốt Đặc điểm có lợi này có thể liên quan đến các gen tham gia vào con đường chống chịu với bất lợi của cây Thực vật đáp ứng với các yếu tố bất lợi thông qua các thay đổi về hình thái và sinh lý, mà cơ sở là thay đổi sự biểu hiện của các gen tham gia quá trình đáp ứng và bảo vệ Sự biểu hiện của gen có liên quan chặt chẽ với hoạt động của các nhân tố khởi đầu phiên mã DREB (Dehydration Responsive Element Binding) là một họ nhân tố phiên mã lớn, tham gia vào con đường đáp ứng với bất lợi của cây Các gen mã hóa cho các protein trong họ này lần lượt được phân

lập và nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau Ở ngô, họ gen DREB gồm nhiều thành viên và trong đó ZmDREB2.7 đã được nhận định là một gen tiềm năng và

tham gia đáng kể vào phản ứng chịu hạn ở cây

Do đó, với mục đích cung cấp nguyên liệu cho việc tạo giống ngô biến đổi

gen có khả năng chịu hạn, luận văn thạc sĩ được tiến hành với nội dung: ―Nghiên

cứu tạo cây ngô chuyển gen DREB2.7 liên quan đến tính chịu hạn‖ Mục tiêu

của nghiên cứu là phân lập gen DREB2.7 từ dòng ngô Tẻ vàng 1 chịu hạn Từ đó, phân tích đặc điểm trình tự của gen và protein được dự đoán Tiếp theo, gen ZmDREB2.7tv dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng mạnh với hạn - rd29A

được chuyển vào dòng ngô thuần để đánh giá khả năng chống chịu hạn của cây ngô chuyển gen

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Cây ngô và hạn hán

1.1.1 Tình hình về cây ngô ở nước ta

Ngô là cây lương thực quan trọng ở nước ta, đứng vị trí thứ hai sau lúa Ngô

là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng và là bữa ăn chính của người dân tại nhiều khu vực đồi núi Việt Nam Ngô cũng được sử dụng để sản xuất một vài sản phẩm công nghiệp như cồn, siro ngô, bột ngô Đồng thời, thân và hạt ngô được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi Trong đó, 80% tổng sản lượng ngô tiêu thụ hằng năm phục vụ cho ngành công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi

Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, diện tích trồng ngô ở nước ta vào năm 2017 là 1,1 triệu héc ta [1] Con số này được dự báo sẽ tăng trưởng nhẹ vào các năm tới, sau đó giữ ổn định trong khoảng 0,95 – 1,1 triệu héc ta sau năm 2025 [1] Theo số liệu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc, Việt Nam đứng thứ 24 về sản lượng ngô và thứ 28 về diện tích trồng ngô nhưng chỉ đứng thứ 56 về năng suất ngô vào năm 2016 [31] Năng suất ngô trung bình năm 2016/2017 chỉ đạt 4,60 tấn/ha và với chi phí sản xuất lớn, sản lượng ngô quốc nội không thể cạnh tranh với ngô từ các nước khác Ngô sản xuất trong nước chỉ đủ để đáp ứng từ 40 - 50% nhu cầu của thị trường Do đó, hàng năm, Việt Nam phải nhập khẩu hàng triệu tấn hạt để phục vụ công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi (Hình 1.1) Vài năm trở lại đây, lượng ngô nhập nhẩu tăng đáng kể khiến nhà nước phải có các chính sách khuyến khích người dân chuyển đổi các vùng trồng lúa sang trồng ngô Tuy nhiên, lợi nhuận từ việc trồng ngô thấp, chi phí trồng ngô cao khiến người nông dân từ bỏ nhiều diện tích trồng ngô Theo dự đoán, để đáp ứng được nhu cầu về ngô, năng suất ngô nước ta phải đạt ít nhất 5 tấn/ha, giảm giá thành sản xuất và tăng thu nhập trong người nông dân [19] Do đó, vấn đề nâng cao sản xuất ngô nội địa không chỉ đóng vai trò trong nông nghiệp mà còn quan trọng đối với kinh tế nước nhà

Hình 1.1 Tổng sản lượng ngô tiêu thụ theo năm tài chính giai đoạn 2015-2018 ở nước ta

Đơn vị: triệu tấn [33]

1.1.2 Hạn hán ảnh hưởng đến năng suất cây ngô

Năng suất trồng ngô nước ta tăng đáng kể trong những năm gần đây Tuy nhiên, con số 4,60 tấn/ha vẫn tương đối thấp và chưa đạt được đúng tiềm năng có thể có ở cây ngô (so với Mỹ 11,08 tấn/ha) [31] Năng suất của cây ngô có thể cao hơn nhiều, nhưng trên thực tế, nhiều nhân tố chủ quan và khách quan có tác động tiêu cực đến sản lượng ngô Trong đó, hạn hán là một trong những nguyên nhân chính gây mất mùa ở ngô Nhất là khi, cùng với hiện tượng biến đổi khí hậu, các đợt nắng nóng và hạn hán kéo dài xảy ra với tần suất ngày càng cao Năm 2018 chứng kiến nhiều đợt hạn hán nghiêm trọng kéo dài ở khu vực châu Âu; Mỹ phải chịu đựng nhiều làn sóng nhiệt trong suốt mùa hè; châu Úc cũng báo cáo năm 2018 là năm nắng nóng kỉ lục Ở nước ta, thời điểm cuối tháng 6, đầu tháng 7 năm nay, nắng nóng gay gắt xảy ra trên diện rộng các tỉnh Bắc Bộ và Trung Bộ đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt động canh tác của nông dân Trong khi đó, vụ đông xuân năm 2018-2019 cũng dược dự báo sẽ xảy ra nắng hạn đối với các tỉnh nam Trung

bộ và Tây Nguyên Do đó, hạn hán là vấn đề cấp bách không chỉ đối với cây ngô

mà cả sản xuất nông nghiệp nói chung

Hạn hán gây ảnh hưởng đến toàn bộ chu trình sống của cây ngô, đặc biệt

Khi bị thiếu nước, cây ngô biểu hiện một loạt các triệu chứng như toàn bộ thân và lá

sẽ chuyển từ màu xanh sang màu xanh xám, các lá có hiện tượng cuộn lại từ dưới lên trên ngọn, khí khổng lá đóng lại, quang hợp giảm mạnh, giảm cố định carbon và

do đó sinh trưởng bị chậm lại Nếu cây gặp hạn trước khi ra hoa 7-10 ngày, sự phát triển của bắp sẽ chậm hơn cờ, do đó quá trình phun râu chậm hơn sự tung phấn, điều này dẫn đến khả năng thụ phấn thấp Nếu hạn nặng ở giai đoạn ra hoa có thể dẫn đến việc mất hoàn toàn bắp và do đó mất năng suất [8] Nếu hạn hán xảy ra trong thời gian tạo hạt, bắp ngô sẽ có ít hàng hạt và các hàng không có nhiều hạt [13] Như vậy, hạn hán dù ngắn hay dài, nhẹ hay nghiêm trọng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất của cây ngô

1.1.3 Nâng cao năng suất ngô trong điều kiện hạn hán

Hai hướng tiếp cận chính để giảm thiểu thiệt hại do thiên tai nói chung và hạn hán nói riêng đối với cây trồng là (1) giảm khả năng cây gặp điều kiện bất lợi

và (2) làm tăng khả năng cây chống chịu với các bất lợi đó

Để giảm khả năng cây gặp hạn, thông thường cần cải tạo hệ thống thủy lợi tưới tiêu, xây dựng các hồ dự trữ nước để đối phó với điều kiện hạn Đôi khi, việc thay đổi phương thức canh tác, thời gian canh tác cũng có thể giúp cây hạn chế gặp hạn ở các giai đoạn quan trọng trong chu trình sống Tuy nhiên, thực tế là, ước tính khoảng 80% diện tích trồng ngô của nước ta không có hệ thống thủy lợi, hoạt động tưới tiêu phụ thuộc vào nguồn nước mưa tự nhiên Hơn nữa, phần lớn ngô được trồng trên khu vực đồi núi trọc, núi đá, các khu vực này thường có khí hậu khắc nghiệt, điều kiện thời tiết thất thường, khả năng giữ nước của đất kém Vì vậy, biện pháp giảm khả năng cây ngô gặp hạn trở nên bất khả thi trong thời gian cấp bách khi các đợt hạn xảy ra nhiều và khó dự báo hơn

Biện pháp làm tăng khả năng chống chịu với hạn của cây ngô được cho là có tiềm năng và lợi thế hơn Hiện nay, người ta có thể dùng phương pháp lai tạo giống hoặc tạo cây chuyển gen để tạo ra các cây có tính trạng mới tốt hơn Phương pháp lai tạo được coi là phương pháp truyền thống để tạo giống mới Tuy nhiên, lai tạo

ngô cần nhiều thời gian, công sức và diện tích trồng Hơn nữa, trong quá trình lai tạo, bên cạnh tính trạng mong muốn thường đi kèm với các tính trạng không mong muốn Ngoài ra, sự cách ly sinh sản giữa các loài cũng là một trong những hạn chế của phương pháp lai tạo giống này [6] Trong khi đó, phương pháp tạo cây biến đổi gen mang lại nhiều lợi thế cho người tạo giống Thời gian để tạo cây mang tính trạng mong muốn cần ít thời gian hơn, phương pháp sàng lọc đơn giản hơn Đồng thời, sự cách biệt về khoảng cách di truyền được xóa bỏ giúp các nhà khoa học có thể đưa vào cây trồng các đặc tính tốt của những loài nằm rất xa trong cây phát sinh chủng loại [6] Do đó, ngày càng nhiều các giống cây trồng mới được tạo ra là kết quả của công nghệ tạo cây biến đổi gen

1.2 Nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen chịu hạn

1.2.1 Tình hình nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen trên thế giới

Các nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen trên thế giới bắt đầu từ những cuối những năm 1980, sau đó tăng dần vào đầu những năm 1990 và tăng mạnh trong giai đoạn 2000 - 2010 cùng với sự phát triển của cây trồng biến đổi gen nói chung (Hình 1.2) [32] Tuy nhiên, số lượng các thử nghiệm trên đồng ruộng của cây ngô biến đổi gen luôn chiếm tỉ lệ cao trong tổng số các thử nghiệm được USDA cấp phép trong những năm qua, khoảng 30-50% (Hình 1.2) Đồng thời, diện tích trồng ngô biến đổi gen cũng tăng mạnh trong những năm gần đây Tuy nhiên, số lượng các thử nghiệm trên đồng ruộng của cây ngô chuyển gen đang có xu hướng giảm trong vài năm gần đây, cùng với xu hướng của cây chuyển gen nói chung Nguyên nhân là do cây số lượng lớn các nghiên cứu tìm kiếm các gen và con đường tiềm năng liên quan đến các tính trạng tốt đã được thực hiện từ những năm 2000 Do đó, các nghiên cứu hiện tại phần lớn tập trung vào việc khai thác các gen giá trị, tích hợp các gen này vào cùng một cây và tối ưu các yếu tố liên quan đến điều hòa gen trong cây chuyển gen

Hình 1.2 Số lượng các thử nghiệm cây biến đổi gen trên đồng ruộng qua các năm [32]

Đến nay, ngô là loài cây trồng có số lượng sự kiện chuyển gen được USDA thông qua nhiều nhất với 148 sự kiện [18] Từ đó đến nay, không thể phủ nhận lợi ích của ngô chuyển gen mang lại cho kinh tế, xã hội và môi trường Năm 2017, diện tích trồng ngô biến đổi gen đạt 59,7 triệu ha toàn cầu, chiếm 32% tổng diện tích trồng ngô nói chung (188 triệu ha) [19] Trong đó, 5,3 triệu ha trồng ngô có khả năng kháng sâu, 6,3 triệu ha ngô kháng thuốc diệt cỏ và 48,1 triệu ha trồng ngô có

cả hai đặc tính trên Việc trồng ngô biến đổi gen đã mang lại lợi nhuận cho người nông dân trong giai đoạn 21 năm (1996-2016) ước tính đạt 63,7 tỷ đô la Mỹ và chỉ riêng trong năm 2016 là 6,9 tỷ đô la Mỹ [19]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu tạo giông ngô biến đổi gen chịu hạn trên thế giới

Những thử nghiệm trên đồng ruộng đối với các giống cây biến đổi gen chịu hạn nói chung và cây ngô nói riêng bắt đầu từ năm 1998 với số lượng ít và tăng chậm trong 6 năm sau đó [32] Tuy nhiên, con số này tăng dần từ năm 2005, đạt ổn định tương đối vào giai đoạn 2008-2015 (khoảng 100-150 thử nghiệm mỗi năm) Sau đó, số lượng các thử nghiệm giảm từ từ, đến năm 2017, chỉ 55 thử nghiệm về cây chuyển gen chịu hạn được cấp phép (Hình 1.3) Trong đó, cây ngô có số lượng thử nghiệm trên đồng ruộng cao nhất, trung bình chiếm 87% trong tổng số các loài cây trồng Tuy vậy, so với các tính trạng trên cây ngô như kháng thuốc diệt cỏ hoặc thuốc trừ sâu, các thử nghiệm về tính trạng chịu hạn vẫn còn hạn chế (chiếm 9%)

Hình 1.3 Số lượng các thử nghiệm đồng ruộng của cây biến đổi gen chịu hạn [32]

Giống ngô chịu hạn đầu tiên là Genuity® DroughtGard™, do Công ty Mosanto sản xuất, được phê duyệt bởi USDA vào tháng 12 năm 2011, chứa gen

CspB (cold shock protein B) có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus subtilis Theo thống

kê của ISAAA [19], diện tích trồng ngô Genuity® DroughtGard™ tăng từ 50.000

ha vào năm 2013 lên 810.000 ha vào năm 2015 Năm 2016, diện tích trồng ngô biến đổi gen chịu hạn đạt 1,2 triệu ha đã tạo ra lợi ích về kinh tế đạt 20 triệu đô la Mỹ, so với giai đoạn 2014-2016 là 33,3 triệu đô la Mỹ [19] Giống ngô này sử dụng nước hiệu quả trong điều kiện bất lợi, do đó đã làm giảm các chi phí liên quan đến động tưới tiêu Người nông dân ở các nước đang phát triển, có cánh đồng nhỏ và ít tập trung hơn sẽ thu được nhiều lợi ích hơn từ công nghệ này Hơn nữa, các sự kiện ngô với tính trạng kết hợp như chịu hạn, chịu thuốc diệt cỏ và thuốc trừ sâu đã được thử nghiệm từ năm 2014 Năm 2017, khoảng 1,4 triệu ha ngô chuyển gen chịu hạn với các tính trạng kết hợp khác [19] Giống ngô biến đổi gen chịu hạn này cũng sẽ mang lại lợi ích cho người nông dân ở các nước thường xuyên phải đối mặt với các đợt hạn nghiêm trọng như châu Phi, châu Âu và một vài khu vực châu Mỹ Latin và châu Á

1.2.3 Tình hình nghiên cứu cây ngô biến đổi gen ở Việt Nam

Công nghệ sinh học được coi là công cụ quan trọng để đạt các mục tiêu quốc gia, do đó đang được tập trung nghiên cứu và phát triển để hiện đại hóa nền nông nghiệp và góp phần phát triển nông thôn Việt Nam Tầm nhìn của nước ta đến năm

2020 là 70% các sản phẩm công nghiệp có nguồn gốc từ công nghệ sinh học Trong

đó, 30-50% là cây trồng biến đổi gen, 70% các cây giống có nguồn gốc từ nuôi cấy

in vitro, 80% diện tích trồng rau và hoa quả sử dụng phân bón và chế phẩm trừ sâu

có nguồn gốc sinh học Cuối cùng, công nghệ sinh học với vai trò là một cấu thành của khoa học và công nghệ đóng góp 50% vào giá trị nông nghiệp ở nước ta [19]

Ở Việt Nam, ngô là cây trồng biến đổi gen đầu tiên được chấp thuận trồng thương mại [19] Với con số 45.000 ha vào năm 2017, diện tích trồng ngô đạt mức tăng trưởng 13 lần so với năm 2015 là 3.500 ha Đồng thời, ước tính 37.500 người nông dân đã chấp thuận và trồng ngô biến đổi gen vào năm 2017, tăng 29% so với năm 2016 [19] Đến nay, Việt Nam đã cấp phép cho 22 sự kiện cây biến đổi gen, trong đó có 14 sự kiện là cây ngô được sử dụng làm thức ăn và thức ăn chăn nuôi Trong đó, năm sự kiện (một sự kiện kháng thuốc diệt cỏ và bốn sự kiện đồng thời kháng côn trùng và thuốc diệt cỏ) được cho phép trồng thương mại ở nước ta [19] Các giống ngô chuyển gen được trồng từ năm 2015 chủ yếu mang tính trạng kết hợp kháng côn trùng và kháng thuốc diệt cỏ Nghiên cứu của Brookes và Barfoot đã ước tính rằng, việc chấp thuận ngô biến đổi gen vào năm 2015 đã dần dần mang lại lợi nhuận cho người nông dân và đồng thời được cho là làm giảm lượng ngô nhập khẩu [7] Cụ thể, lợi ích của việc trồng ngô biến đổi gen từ năm 2015 đến 2016 ở Việt Nam đạt 5,45 triệu đô la Mỹ, trong đó 5 triệu đô la Mỹ chỉ tính trong năm

2016 Do đó, người nông dân Việt Nam sẽ có lợi nhiều hơn khi xu hướng chấp nhận cây biến đổi gen tăng nhanh [7]

Các nghiên cứu phân lập gen và tạo cây ngô chuyển gen ở Việt Nam mới đang ở giai đoạn đầu tuy nhiên đã đạt được những thành tựu nhất định Nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Đồng [2-4] đã phân lập và chuyển thành công

các gen chịu hạn ZmNF-YB2 và IPT vào các dòng ngô VH1 và C8H9 cho kết quả

ổn định và đồng đều Một nghiên cứu khác thực hiện chuyển gen CspB đã tối ưu

hóa codon vào ba dòng ngô Việt Nam V152N, C436 và C7N với hiệu suất chuyển gen của ba dòng lần lượt là 0,90%, 0,28% và 0,50% [5] Các nghiên cứu khác hiện nay tập trung vào việc phân lập các gen có giá trị và tiềm năng liên quan đến các tính trạng mong muốn; tối ưu hóa các quy trình chuyển gen và nuôi cấy mô để phù hợp với các dòng ngô nền của Việt Nam

1.3 Tính trạng chịu hạn ở thực vật và nhân tố phiên mã DREB

1.3.1 Cơ sở phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật

Khi cây đối mặt với hạn, một loạt các thay đổi về mặt sinh lý và hóa sinh được diễn ra ở cấp độ tế bào, bao gồm mất lực trương, thay đổi tính thấm và thành phần của màng, thay đổi nồng độ các chất hòa tan và sự tương tác của protein-protein hay protein-lipid [9] Cây có thể chống chịu với hạn bằng các cơ chế như tránh sự mất nước, thích ứng với sự mất nước, hoặc cả hai Các hình thức chống chịu trên được điều khiển bởi các tính trạng hình thái và sinh trưởng như độ dày của

rễ, khả năng rễ xâm nhập vào các lớp đất đặc, độ sâu và sinh khối rễ Các tính trạng mang tính cơ định trên được thể hiện kể cả khi cây không gặp điều kiện hạn Trong khi đó, các tính trạng mang tính thích ứng, ví dụ như khả năng điều hòa thẩm thấu

và thích nghi với hạn, xuất hiện khi hiện tượng thiếu nước xảy ra [17] Sự giảm hoạt động quang hợp, tích lũy các chất hữu cơ và hòa tan và sự thay đổi trong quá trình chuyển hóa carbohydrate là các đáp ứng sinh lý và hóa sinh điển hình khi cây gặp bất lợi Sự giảm các hoạt động quang hợp là do các sự kiện khác nhau, ví dụ việc đóng khí khổng và giảm hoạt động của enzyme trong chu trình Việc tổng hợp các chất có hoạt tính điều hòa thẩm thấu là một trong các cơ chế giúp cây thích nghi với điều kiện thiếu nước Các phân tử này, hoạt động như là các nhân tố giúp cân bằng thẩm thấu, sẽ tích lũy trong các tế bào thực vật khi hạn xảy ra và sau đó bị phân giải khi điều kiện môi trường trở về bình thường Đồng thời, các protein tham gia vào

trung hòa các gốc oxi hóa tự do sinh ra khi cây gặp bất lợi cũng đóng vai trò bảo vệ các thành phần của tế bào (Hình 1.4)

Hình 1.4 Các nhóm protein tham gia vào quá trình đáp ứng của cây khi gặp hạn [28]

Các thay đổi kể trên là kết quả của sự kết hợp hài hòa giữa sự đóng hoặc mở các nhóm gen liên quan trong cây Việc nắm rõ cơ sở phân tử của quá trình đáp ứng hạn là vô cùng quan trọng trong cải tiến khả năng chịu hạn của giống thông qua công nghệ gen Nhiều nghiên cứu đã phân lập và đánh giá hàng trăm gen được cảm ứng khi cây gặp hạn Sản phẩm của các gen này hoặc tham gia tiếp nhận và dẫn truyền tín hiệu bất lợi cho tế bào, hoặc điều hòa sự biểu hiện của các gen đáp ứng, hoặc tham gia bảo vệ và duy trì hoạt động tế bào (Hình 1.4) Trong khi các gen mã hóa cho protein tham gia bảo vệ có tác dụng trực tiếp, các gen mã hóa cho các protein tiếp nhận và dẫn truyền và nhân tố phiên mã lại gián tiếp giúp cây tồn tại bằng cách ảnh hưởng đến các gen khác [17]

Việc sử dụng một hoặc một vài gen mã hóa protein bảo vệ giúp các nhà khoa học kiểm soát đầu ra rõ ràng hơn bởi hoạt động của các sản phẩm gen có tác động trực tiếp lên kiểu hình chịu hạn Tuy nhiên, tính trạng chịu hạn là một tính trạng phức tạp, việc tác động lên một vài gen bảo vệ thường không đủ hiệu quả Hơn nữa, việc chuyển đồng thời nhiều gen vào cây không những yêu cầu kĩ thuật cao và thời

gian dài mà còn có thể gây ảnh hưởng tiêu cực đến sự cân bằng hệ gen của cây Do

đó mà hiện nay, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu đến nhóm gen mã hóa cho nhân tố phiên mã hoặc nhân tố tham gia tiếp nhận và truyền tín hiệu Nguyên nhân là do chỉ cần thao tác trên một gen thuộc nhóm này cũng có thể tạo nên ảnh hưởng đến nhiều gen khác nhau và do đó tác động lên kiểu hình theo nhiều hướng khác nhau để cùng tạo nên tính trạng mong muốn Tuy nhiên, điều này cũng cần được nghiên cứu một cách kỹ càng và cẩn thận bởi các tác động có thể gây ra bất thường trong sinh trưởng của cây

1.3.2 Họ nhân tố phiên mã DREB

Nhân tố phiên mã là các protein tham gia khởi động quá trình phiên mã của gen bằng cách bám vào các vùng trình tự đặc hiệu nằm trên vùng promoter của gen

đó Các nhân tố phiên mã làm thay đổi mức độ biểu hiện của các gen đáp ứng với hạn kể trên, từ đó các đặc điểm sinh lý và hóa sinh của cây được điểu chỉnh phù hợp

để cây sống sót và duy trì sinh trưởng trong điều kiện thiếu nước Trong nhiều năm qua, các nhà khoa học đã phát hiện và nghiên cứu nhiều họ nhân tố phiên mã khác nhau tham gia vào con đường đáp ứng của cây với điều kiện bất lợi, trong đó có điều kiện hạn Các nhân tố phiên mã đáp ứng với hạn gồm WRKY, zinc finger, AP2/ERF2 (AP2/ethylene-responsive element-binding), MYB và NAC [30]

Ở thực vật, nhóm nhân tố phiên mã đáp ứng tốt nhất với các điều kiện bất lợi

là protein C-repeat-binding factor (CBF)/dehydrationresponsive element-binding (DREB) thuộc họ protein AP2/ERF2 [22] Promoter của các gen được điều hòa bởi các nhân tố phiên mã DREB có chứa yếu tố DRE (Dehydration Responsive Element), với trình tự lõi là A/GCCGAC Nhân tố phiên mã DREB bám vào các trình tự DRE bằng domain bám DNA đặc hiệu - AP2 và được phân thành hai nhóm: DREB1 và DREB2 [21] Mặc dù chúng chủ yếu tham gia con đường điều hòa của các gen liên quan đến bất lợi về nước, những chức năng khác cũng được tìm thấy ở

từng gen DREB nhất định Ví dụ, gen DREB1D/CBF4 có vai trò trong khả năng

có chức năng trong đáp ứng với lạnh [16] Trong khi đó, protein DREB1C/CBF2 được xác định là nhân tố điều hòa dương tính trong con đường đáp ứng với lạnh ở

cây bằng việc điều hòa chặt chẽ sự biểu hiện của hai gen DREB1A/CBF3 và DREB1B/CBF1 [23] Hai nhân tố phiên mã thuộc nhóm DREB2 là DREB2A và DREB2B ở cây Arabidopsis thaliana lại cho thấy vai trò ở hai điều kiện bất lợi

khác nhau, lần lượt là bất lợi về thẩm thấu và nhiệt độ cao [26] Trong khi đó, gen

DREB2B phân lập từ lúa tăng cường khả năng chịu hạn và lạnh ở cây chuyển gen [10] Đồng thời, một gen thuộc nhóm DREB2 phân lập từ cây dương (Populus euphratica) lại có hiệu quả trong cả điều kiện lạnh, mất nước và nồng độ muối cao [11] Có thể thấy, các gen DREB khác nhau có sự phân hóa chức năng rõ ràng và

hiện đang là một vấn đề được quan tâm Dù vậy, các nghiên cứu trên nhiều loài khác nhau, ví dụ như lúa, cà chua, đậu tương, lúa mì, lúa mạch và ngô gợi ý rằng

gen DREB nằm ở trung tâm trong con đường đáp ứng bất lợi ở thực vật

1.3.3 Nhân tố phiên mã ZmDREB2.7

Protein DREB2.7 thuộc họ nhân tố phiên mã DREBs/CBFs (Dehydration Responsive Element Binding proteins/C-repeat Binding Factors - DREBs) Liu và cộng sự đã phân tích protein ZmDREB2.7 và phát hiện rằng protein có khả năng bám với hai trình tự DRE điển hình, ACCGAC và GCCGAC với ái lực như nhau [22] Khi so sánh với protein ZmDREB2A, protein ZmDREB2.7 cũng có ái lực bám thấp với trình tự GCC - trình tự đặc trưng trong promoter của các gen đáp ứng với ethylene hay các bất lợi sinh học [24] Điều này thể hiện rằng tình tự GCC không phải là vị trí nhận biết đặc hiệu của protein ZmDREB2.7 Khi chuyển gen

ZmDREB2.7 vào Arabidopsis, người ta nhận thấy, cây chuyển gen tăng khả năng

chịu hạn lên đáng kể Phần lớn các dòng chuyển gen biểu hiện protein ZmDREB2.7

có kiểu hình bình thường trừ một dòng có mức độ biểu hiện cao nhất của protein này có sự giảm nhẹ về kích thước lá Như vậy, sự biểu hiện của yếu tố phiên mã này không ảnh hưởng nhiều đến kiểu hình và sự sinh trưởng của cây [22]

Liu và cộng sự đã phân tích dữ liệu hệ gen của ngô tham chiếu B73 và xác

định được 20 gen ZmDREB khác nhau [22] Trong đó, gen ZmDREB2.7 trong ngô

B73 dài 1080bp, không chứa intron và nằm trên NST số 1 Nghiên cứu của Liu và

cộng sự đồng thời chỉ ra rằng gen ZmDREB2.7 có mức độ biểu hiện rất thấp ở các

mô khác nhau và chỉ được cảm ứng biểu hiện nhẹ ở mô rễ và lá dưới điều kiện khô hạn Tuy nhiên, protein ZmDREB2.7 lại có khả năng hoạt hóa phiên mã cao so với

các protein ZmDREB khác Như vậy, gen ZmDREB2.7 đóng vai trò quan trọng trong cơ chế đáp ứng với bất lợi phi sinh học của ngô [22] Do đó, gen ZmDREB2.7

từ các giống chống chịu hạn tốt có thể cung cấp nguồn vật liệu di truyền giá trị cho chuyển gen và lai tạo giống

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu thực vật

- Nguồn vật liệu phân lập gen là giống ngô Tẻ vàng 1 do Viện Nghiên cứu Ngô cung cấp Hạt ngô được gieo trong phòng thí nghiệm đến giai đoạn ba lá thì thu mẫu để phân lập gen

- Nguồn vật liệu để chuyển gen là phôi non dòng ngô K7 do Viện Nghiên cứu Ngô cung cấp Cây ngô được trồng và chăm sóc ngoài đồng ruộng Sau 55 - 60 ngày, các cây cho phôi được thụ phấn bằng các hạt phấn màu trắng hoặc vàng sáng

từ cây cho phấn Sau 9 - 13 ngày, bắp ngô non được thu để cung cấp phôi cho thí nghiệm chuyển gen

2.1.2 Chủng vi khuẩn, vector và mồi

- Chủng vi khuẩn cho thí nghiệm nhân dòng là Escherichia coli DH10β Chủng vi khuẩn sử dụng để chuyển gen vào cây ngô là A tumefaciens EHA105

Các chủng vi khuẩn do Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen cung cấp

- Các vector được sử dụng trong nghiên cứu gồm: vector nhân dòng pJET 1.2

(Thermo Scientific, Mỹ), vector nhân dòng trung gian pRTL2/rd29A và vector biểu

hiện thực vật pCAMBIA1300 do Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu

hệ gen cung cấp

- Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu được thiết kế và tổng hợp bởi Công ty Integrated DNATechnologies (Mỹ) Danh sách các cặp mồi được liệt kê trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh sách các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

2.1.3 Hóa chất và môi trường

- Các bộ kit, enzyme, hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm nhân dòng, nuôi cấy mô tế bào thực vật, chuyển gen, kiểm tra cây chuyển gen được cung cấp bởi các hãng uy tín như: Thermo Scientific (Mỹ), Merck (Đức), New England Biolabs (Mỹ),…

- Môi trường sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nuôi cấy mô thực vật được liệt kê trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần các môi trường được sử dụng trong nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

LB 5 g/L cao nấm men, 10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl

YEP 5 g/L cao nấm men, 10 g/L peptone, 5 g/L NaCl, 25 mg/L

Chọn lọc 1 MS + 2,4D 1,5mg/L + L-proline 0,7 g/L + MES 0,5 g/L + sucrose

30 g/L + phytagel 2,4 g/L + cefotaxim 100mg/L + vancomycin 100mg/L + AgNO3 0,85 mg/L + hygromycin 1,5 mg/L

pH 5,8

Chọn lọc 2 MS + 2,4D 1,5mg/L + L-proline 0,7 g/L + MES 0,5 g/L + sucrose

30 g/L + phytagel 2,4 g/L + cefotaxim 100mg/L + vancomycin 100mg/L + AgNO3 0,85 mg/L + hygromycin 3 mg/L

pH 5,8

Tái Sinh 1 MS + myo-inositol 100mg/L + sucrose 60 g/L + phytagel 2,4 g/L +

cefotaxim 100mg/L + vancomycin 100mg/L + hygromycin 3 mg/L

pH 5,8

Tái Sinh 2 MS + myo-inositol 100mg/L + sucrose 30 g/L + casein 400mg/L +

kinetin 1mg/L + nước dừa 150 mL/L + phytagel 2,4 g/L

2.1.4 Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị được sử dụng thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Bao gồm: Tủ lạnh 20C (Sanyo, Nhật Bản), Cân phân tích (Mettler Toledo, Thụy Sỹ), bể ổn nhiệt (Memmert, Đức), máy làm khô chân không (Concentrator Plus) (Eppendorf, Đức), máy li tâm lạnh Eppendorf 5424R (Eppendorf, Đức), máy li tâm lạnh đa năng 5810R (Eppendorf, Đức), máy chạy điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy PCR Master Cycler Pro S (Eppendorf, Đức), máy soi gel M-26 UVP (Mỹ), máy chụp ảnh gel (GelDoc) UVP (Mỹ), máy ủ nhiệt Thermomixer C (Eppendorf, Đức), máy giải trình tự ABI 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies, Nhật), máy biến nạp xung điện Gene Pulser

(Bio-Rad, Mỹ), box cấy vi sinh vật The Esco Airstream® Class II Biological Safety

Cabinet (Esco, Singapore) Phòng nuôi cấy mô vô trùng, box cấy thực vật Esco laminar flow cabinets (Esco, Singapore)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết DNA

DNA tổng số của lá ngô được tách chiết theo quy trình của Rogers và Bendich [25] 0,5 g lá tươi được nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng bằng cối chày

sứ Sau đó, bột lá được chuyển vào ống ly tâm 1,5 mL chứa 0,5 mL đệm chiết (100

mM Tris-HCl pH8,0, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA pH8,0, 2% CTAB, 0,2% mercaptoethanol) và đảo đều Hỗn hợp dịch chiết được ủ ở 65°C trong 60 phút Tiếp theo, ống mẫu được ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và dịch ở pha trên chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới Dung dịch phenol : choloroform : isoamyl alcohol (tỉ lệ thể tích 25 : 24 : 1) được bổ sung vào ống mẫu với tỷ lệ thể tích là 1:1, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°C Dịch ở pha trên được chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới Ống mẫu được xử lý loại bỏ RNA ở 37°C trong 1 giờ bằng cách bổ sung RNase 0,01 mg/mL DNA được tủa bằng cách

β-bổ sung hai lần thể tích EtOH 100% có β-bổ sung 0,3M CH3COONa, trộn đều và giữ trong 3 giờ ở -20°C Sau đó, ống mẫu được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút

ở 4°C và loại bỏ dịch Tủa DNA được rửa bằng cách bổ sung một lần thể tích EtOH 70%, lắc nhẹ ống, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch Bước rửa được thực hiện hai lần Tủa được làm khô trong máy SpeedVac trong 5 phút và được hòa trong nước không chứa Dnase DNA được bảo quản ở -20°C

Plasmid được tách chiết từ 3 mL dịch nuôi khuẩn lạc đơn trong ống nghiệm chứa môi trường lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp, ở nhiệt độ phù hợp (28°C

đối với A tumefaciens và 37°C đối với E coli ), nuôi qua đêm với tốc độ lắc 200

vòng/phút Đầu tiên, dịch nuôi khuẩn được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong

5 phút ở 4°C để thu cặn tế bào Sau đó, cặn tế bào được hòa tan trong 150 µL dung dịch I (50 mM glucose, 25 mM Tris-base, 10 mM EDTA pH 8,0) Sau khi bổ sung

150 µL dung dịch II (0,2 M NaOH, 1% SDS) và đảo nhẹ 3 – 5 lần, cho 150 µL dung dịch III ( 3M CH3COOK, 11,5% CH3COOH) vào ống mẫu và đặt trên đá trong 5 phút Ống mẫu được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, thu dịch

trên và chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới Ống mẫu được xử lý loại bỏ RNA ở 37°C trong 1 giờ bằng cách bổ sung RNase 0,01 mg/mL DNA được tủa bằng cách

bổ sung hai lần thể tích EtOH 100% có bổ sung 0,3M CH3COONa, trộn đều và giữ trong 3 giờ ở -20°C Sau đó, ống mẫu được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút

ở 4°C và loại bỏ dịch Tủa DNA được rửa bằng cách bổ sung một lần thể tích EtOH 70%, lắc nhẹ ống, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch Bước rửa được thực hiện hai lần Tủa được làm khô trong máy SpeedVac trong 5 phút và được hòa trong nước không chứa Dnase DNA được bảo quản ở -20°C

2.2.2 Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA

Trong nghiên cứu này, RNA được tách chiết theo phương pháp sử dụng TRI Reagent có cải tiến phù hợp với mẫu lá ngô Đầu tiên, 2 - 3 g lá được nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ Sau đó, bổ sung ngay 700 µL Trizol và bột lá và trộn đều Hỗn hợp mẫu được chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL và giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Tiếp theo, ống mẫu được ly tâm ở điều kiện 12.000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4°C, sau đó thu dịch ở pha trên và chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới 300 µL Chloroform được bổ sung vào ống và vortex trong 15 – 20 giây Ống mẫu được ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và dịch trên được chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới RNA được tủa bằng cách bổ sung 300 µL 2-propanol lạnh và ủ mẫu ở -20°C trong 1giờ Sau đó, ống mẫu được

ly tâm với điều kiện 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch Tủa RNA được rửa bằng cách bổ sung 300 µL EtOH 70%, lắc nhẹ ống và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch Bước rửa tủa được thực hiện hai lần Tủa RNA được làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút sau đó hòa tan RNA tổng số trong 50 µL nước đã được xử lý với DEPC (Diethyl pyrocarbonate) RNA tổng số được bảo quản ở -80°C

RNA được kiểm tra nồng độ bằng máy đo quang phổ và đưa về nồng độ 1 µg/µL để làm khuôn cho phản ứng tổng hợp sợi thứ nhất Phản ứng tổng hợp cDNA

(Affymetrix, Mỹ) Quy trình thao tác được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR phân lập trình tự ZmDREB2.7: 95°C - 3

phút; 30 chu kỳ: 95°C - 45 giây, 58°C - 45 giây, 72°C - 1 phút 30 giây; 72°C - 5 phút; 4°C

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng mã hóa gen ZmDREB2.7tv:

95°C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95°C - 30 giây, 54°C - 30 giây, 72°C - 1 phút; 72°C - 5 phút; 4°C

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng rd29A::ZmDREB2.7tv: 95°C

- 3 phút; 30 chu kỳ: 95°C - 30 giây, 56°C - 30 giây, 72°C - 1 phút 15 giây; 72°C - 5 phút; 4°C

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân gen HygR: 95°C - 3 phút; 30 chu

kỳ: 95°C - 30 giây, 54°C - 30 giây, 72°C - 50 giây; 72°C - 5 phút; 4°C

2.2.4 Tinh sạch DNA

- Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt với enzyme giới hạn được tinh sạch bằng

bộ kit GeneJET Gel Purification Kit (Thermo Scientific,Mỹ)

2.2.5 Tạo tế bào khả biến E coli và biến nạp bằng sốc nhiệt

Tế bào khả biến E coli được chuẩn bị bằng CaCl2 0,1 M và sau đó được dùng cho biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt theo quy trình của của Sambrook và cộng sự [27]

2.2.6 Tạo tế bào khả biến A tumefaciens và biến nạp bằng xung điện

Tế bào khả biến A tumefaciens được chuẩn bị bằng HEPES

(N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) 1 mM pH 7,0 để dùng cho biến

nạp theo phương pháp xung điện Đầu tiên, một khuẩn lạc đơn A tumefaciens được

nuôi cấy trong 2 mL môi trường YEP ở 28°C, 6 giờ Sau đó, 50 µL dịch vi khuẩn trên nuôi cấy tiếp ở 28°C qua đêm trên 50 mL môi trường YEP lỏng đến khi

OD660nm đạt 1-1,5 Tiếp theo, dịch vi khuẩn được làm lạnh mẫu trên đá 15 phút rồi

ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút để thu cặn tế bào Tế bào được hòa tan trong

10 mL 1 mM HEPES lạnh và ủ trên đá 15 phút; sau đó ly tâm ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút và bỏ dịch Bước này được thực hiện hai lần Sau đó, bổ sung 10 mL 10% glycerol vào ống tế bào, hòa tan tủa và ủ trên đá 15 phút; sau đó ly tâm ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút và bỏ dịch Tủa tế bào được hòa trong 500-700 µL 10% glycerol và chia 45 µL dịch tế bào vào mỗi ống ly tâm 1,5 mL Các ống tế bào khả biến được làm lạnh nhanh trong nitơ lỏng và giữ tế bào ở -80°C

Để biến nạp plasmid vào tế bào khả biến A tumefaciens bằng phương pháp xung điện, trước tiên tế bào khả biến A tumefaciens được làm tan bằng cách đặt

ống tế bào trên đá 15 phút 2 µL plasmid tái tổ hợp được bổ sung vào ống chứa tế bào khả biến, sau đó trộn đều và đặt ống trên đá trong 5 phút Hỗn hợp được chuyển sang cuvette đã được làm lạnh từ trước; lau sạch bên ngoài cuvette Tế bào khả biến được xung điện ở 5ms; hiệu điện thế 2,5 kV; điện trở 400Ω Sau đó, bổ sung ngay 1

mL môi trường SOC lạnh vào cuvette, đảo đều và chuyển dịch khuẩn sang ống vô trùng, lắc ở 28°C trong 1,5 giờ Dịch nuôi được cấy trải trên môi trường YEP đặc có

bổ sung kháng sinh chọn lọc Khuẩn lạc mọc sau hai ngày nuôi đĩa vi khuẩn ở 28°C

2.2.7 Nhân dòng gen ZmDREB2.7tv

DNA tổng số được tách chiết từ lá cây ngô Tẻ vàng 1 theo phương pháp đã

mô tả ở mục 2.2.1 Sau đó, phản ứng PCR phân lập gen ZmDREB2.7tv được thực

hiện với thành phần và chu trình nhiệt như đã mô tả ở mục 2.2.3; trong đó, khuôn là

dụng bộ kit CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific, Mỹ) để xử lý đầu bằng

sản phẩm PCR trên và ghép nối đoạn gen ZmDREB2.7tv vào vector pJET1.2 theo

quy trình của nhà sản xuất Các plasmid nhân dòng được kiểm tra bằng cách xử lý

plasmid với enzyme giới hạn BglII và đọc trình tự hai chiều

2.2.8 Tạo vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv:

:polyA

Vector chuyển gen pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA được xây

dựng bằng các phản ứng cắt và nối với enzyme phù hợp theo sơ đồ trên hình 2.1

Trước tiên, vùng mã hóa của gen ZmDREB2.7tv được gắn với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn SacI ở hai đầu bằng phản ứng PCR với cặp mồi ZmDREB2.7_SacI_F/R và khuôn là vector nhân dòng pJET1.2/ZmDREB2.7tv theo

thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như ở mục 2.2.3 Sản phẩm PCR

ZmDREB2.7_SacI và vector pRTL2/rd29A cùng được cắt bởi enzyme SacI, sau đó nối với nhau để tạo vector trung gian pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA Vector tái tổ hợp được kiểm tra bằng cách xử lý với enzyme giới hạn SacI và phản ứng

PCR với cặp mồi ZmDREB2.7_SacI_F và polyA_R Tiếp theo, vector pRTL2/

rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA và pCAMBIA1300 cùng được cắt bởi enzyme HindIII, sau đó nối với nhau để tạo vector pCAMBIA1300/rd29A: :ZmDREB2.7tv::polyA Các vector tái tổ hợp được kiểm tra bằng cách xử lý với

enzyme giới hạn thích hợp

Hình 2.1 Phương pháp tạo vector biểu hiện mang gen ZmDREB2.7tv

2.2.9 Chuyển gen vào cây ngô thông qua vi khuẩn A tumefaciens

Cây ngô chuyển gen được tạo ra bằng cách sử dụng quy trình chuyển gen

vào phôi ngô non trung gian qua vi khuẩn A tumefaciens theo Frame và cộng sự

[14]

- Chuẩn bị dịch vi khuẩn: Chuyển một khuẩn lạc A tumefaciens chứa

plasmid quan tâm trên đĩa nuôi cấy vào 3 mL môi trường YEP lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp và lắc 200 vòng/phút ở 28°C qua đêm Dịch nuôi được làm mới trong 50 mL môi trường YEP lỏng có kháng sinh thích hợp Khi dịch nuôi đạt

OD600 = 1, thu tế bào bằng cách ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, ở 4°C trong 15 phút Tế bào vi khuẩn được hòa tan trong môi trường lây nhiễm có bổ sung AS

- Chuẩn bị phôi non: Bắp ngô non được thu từ các cây ngô mẹ sau khi thụ phấn từ 9 - 13 ngày Bắp ngô được khử trùng bề mặt bằng dung dịch NaOCl 5% Ngay sau khi thu hái, phôi non được tách trong điều kiện vô trùng và được lây nhiễm với dịch vi khuẩn có bổ sung AS nồng độ 100 µM trong 20 phút

- Đồng nuôi cấy: Phôi sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy, đặt trong tối ở nhiệt độ 21°C trong 3 ngày

- Nuôi phục hồi: Chuyển phôi đã biến nạp từ môi trường đồng nuôi cấy sang môi trường phục hồi, đặt trong tối ở nhiệt độ 28°C trong 7 ngày

- Chọn lọc mô sẹo: Mô sẹo tạo thành từ phôi non được cấy chuyển từ môi trường phục hồi sang môi trường chọn lọc 1 có bổ sung kháng sinh hygromycin (1,5 mg/l), đặt trong tối ở nhiệt độ 28°C trong 14 ngày Sau đó, các mô sẹo tiếp tục được chuyển sang môi trường chọn lọc 2 có nồng độ kháng sinh hygromycin (3mg/l), đặt trong tối ở nhiệt độ 28oC trong 14 ngày

- Tạo chồi: Các mô sẹo phôi hoá tạo thành trên môi trường chọn lọc được cấy chuyển sang môi trường tái sinh 1, không có chất kích thích sinh trưởng, đặt trong tối ở nhiệt độ 25°C trong 7 ngày Các mô sẹo phôi hoá này tiếp đó được cấy chuyển sang môi trường tái sinh 2 không bổ sung kháng sinh, đặt ngoài sáng ở nhiệt

độ 25°C, liên tục chuyển môi trường tái sinh 2 cho đến khi các mô sẹo phôi hoá này tạo thành các chồi

- Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh: Chồi tái sinh trong môi trường tái sinh được cấy chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh ở điều kiện sáng 25°C, trong khoảng 10 - 20 ngày

- Chuyển cây ra đất: Cây tái sinh trên môi trường tái sinh khi có khoảng 2 - 3

lá được chuyển ra trồng trên giá thể trấu hun trong hai tuần, sau đó được chuyển ra trồng trên đất