Nghiên cứu ứng dụng nano kim loại ag và cu trong ức chế nấm penicillium digitatum và colletotrichum gloeosporioides gây bệnh trên quả cam tại hàm yên tuyên quang (citrus nobilis lour)

Sự kháng thuốc của các vi sinh vật ngày càng gia tăng, thiếu hụt các biện pháp thay thế thuốc diệt nấm hiệu quả đồng thời những lo ngại về sức khỏe do đặc tính gây ung thư của hóa chất l

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-*** -

Nguyễn Vũ Mai Linh

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NANO KIM LOẠI AG VÀ CU

TRONG ỨC CHẾ NẤM PENICILLIUM DIGITATUM VÀ

COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDES GÂY BỆNH TRÊN

QUẢ CAM TẠI HÀM YÊN - TUYÊN QUANG (CITRUS NOBILIS LOUR)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-*** -

Nguyễn Vũ Mai Linh

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NANO KIM LOẠI AG VÀ CU

TRONG ỨC CHẾ NẤM PENICILLIUM DIGITATUM VÀ

COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDES GÂY BỆNH TRÊN

QUẢ CAM TẠI HÀM YÊN - TUYÊN QUANG (CITRUS NOBILIS LOUR)

Chuyên ngành: Khoa học Môi trường

Mã số: 8440301.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Phan Thị Hồng Thảo PGS TS Nguyễn Kiều Băng Tâm

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS Phan Thị Hồng Thảo và PGS.TS Nguyễn Kiều Băng Tâm đã tận tâm hướng dẫn và truyền đạt kiến thức chuyên môn cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài Xin cảm ơn nguồn kinh phí từ dự án Khoa học công nghệ trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số VAST.TĐ.NANO-NN/15-18, “Nghiên cứu ứng dụng Công nghệ nano trong nồng nghiệp” do PGS.TS Nguyễn Hoài Châu làm chủ nhiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dành mọi tâm huyết giảng dạy, trang bị kiến thức cho tôi trong suốt khóa học này

Tôi cũng xin cảm ơn tập thể nghiên cứu viên Phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn nhiệt tình cộng tác và giúp đỡ tôi để hoàn thành đề tài này

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên, chia sẻ khó khăn giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Học viên cao học

Nguyễn Vũ Mai Linh

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC BẢNG 4

DANH MỤC HÌNH 5

MỞ ĐẦU 7

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 9

1.1 Giới thiệu về giá trị của quả cam và vai trò của cây cam Hàm Yên – Tuyên Quang 9

1.2 Các bệnh phổ biến trên quả cam sau thu hoạch 11

1.2.1 Bệnh mốc xanh do nấm Penicillium digitatum trên cam 12

1.2.2 Bệnh thán thư do Colletotrichum gloeosporioides gây ra 16

1.3 Các phương pháp bảo quản trái cây sau thu hoạch 20

1.3.1 Phương pháp bảo quản hóa học 20

1.3.2 Phương pháp bảo quản bằng các loại màng 22

1.4 Công nghệ nano và tiềm năng ứng dụng của nano 22

1.4.1 Giới thiệu về công nghệ nano và tình hình nghiên cứu trên thế giới 22

1.4.2 Tiềm năng ứng dụng của nano 24

1.4.3 Tình hình nghiên cứu nano trong nước 29

2.1 Hóa chất 31

2.2 Vật liệu nghiên cứu 31

2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Phân lập nấm từ cam bệnh 32

2.3.2 Xác định đặc điểm nuôi cấy và phân loại nấm dựa trên phân tích trình tự gen ITS 32

2.3.3 Khảo sát khả năng ức chế của nano kim loại đối với nấm ở giai đoạn bào tử

32

2.3.4 Khảo sát khả năng ức chế của nano kim loại đối với nấm ở giai đoạn sinh

dưỡng 33

2.3.5 Xác định tác dụng của nano kim loại ở các nồng độ khác nhau lên nấm gây bệnh trên cam 33

2.3.6 Đánh giá chất lượng của quả cam bảo quản sau xử lý nano ở quy mô phòng thí nghiệm 34

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Phân lập nấm Penicilium và Colletotrichum gây bệnh trên cam Hàm Yên -Tuyên Quang 35

3.1.1 Phân lập nấm Penicillium 35

3.1.2 Phân lập nấm Colletotrichum 36

3.2 Định danh nấm N8 và N11 dựa vào trình tự gen ITS 38

3.3 Khả năng ức chế của các nano kim loại Ag và Cu đến sự sinh trưởng của nấm Penicillium digitatum N11 và Colletotrichum gloeosporioides N8 40

3.3.1 Giai đoạn bào tử 40

3.3.2 Giai đoạn sinh dưỡng 46

3.4 Nghiên cứu ứng dụng nano trong hạn chế bệnh trên quả cam Hàm Yên -Tuyên Quang trong lây nhiễm nhân tạo 54

3.5 Đánh giá chất lượng của quả cam sau xử lý nano bảo quản ở quy mô nhỏ

58

3.5.1 Ảnh hưởng của sử dụng nano đến tỷ lệ thối hỏng và mốc cuống quả cam58 3.5.2 Ảnh hưởng của sử dụng nano AgH đến chất lượng quả cam trong bảo quản 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

PCR Polymerase Chain Reaction – phản ứng khuếch đại gen

DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Một số chất diệt nấm được sử dụng trong bảo quản quả sau thu hoạch - 20 Bảng 2 Tính chất của các nano Ag và Cu sử dụng trong nghiên cứu - 31 Bảng 3 Mức độ tương đồng của gen mã hóa vùng ITS của chủng nấm N11 với các

chủng trên GenBank - 39

Bảng 4 Mức độ tương đồng của gen mã hóa vùng ITS của chủng nấm N8 với các

chủng trên GenBank - 40

Bảng 5 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt (MFC) của nano kim loại

Ag và Cu đối với bào tử nấm P digitatum N11 - 41

Bảng 6 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và tiêu diệt (MFC) của các chất nghiên cứu

đối với bào tử nấm C gloeosporioides N8 - 42

Bảng 7 Ảnh hưởng của nano kim loại đến khả năng phát triển của nấm N11 - 47 Bảng 8 Tỷ lệ cam bị bệnh trong điều kiện xâm nhiễm nấm N11 xử lý với nano

AgH sau 5 ngày - 56

Bảng 9 Tỷ lệ cam bị bệnh trong điều kiện xâm nhiễm nấm N8 xử lý với nano AgH

DANH MỤC HÌNH Hình 1 Sản lượng cây có múi Việt Nam từ năm 1990 đến năm 2015 10 Hình 2 Quả cam bị bệnh mốc xanh, hình thái nấm N11 trên môi trường Hansen,

Czapek và cấu trúc sinh sản và bào tử nấm N11 36

Hình 3 Cam bị bệnh thán thư 36 Hình 4 Hình thái khuẩn lạc nấm N8 nuôi cấy trên đĩa môi trường PDA sau 3 ngày

và 2 tuần 37

Hình 5 Khuẩn lạc nấm N8 trên môi trường Czapek; cơ quan sinh bào tử và bào tử

của nấm N8 37

Hình 6 Điện di kiểm tra DNA tổng số và sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS của

chủng nấm N11 và N8 trên gel agarose 1% 38

Hình 7 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các nano kiểm tra với bào tử nấm

N11với nano Cu , nano AgH, nano Ag và Carbendazim 42

Hình 8 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với bào tử nấm N8 với nano Cu, nano Ag,

nano AgH và Carbendazim 43

Hình 9 Đánh giá mức độ tác động của nano với nấm N11 ở giai đoạn bào tử với

nano Ag, nano Cu 44

Hình 10 Ảnh hưởng của nano đến khả năng phát triển hình thành khuẩn lạc của

nấm N8 ở giai đoạn bào tử với nano AgH, nano Ag, nano Cu 45

Hình 11 Hiệu quả ức chế nấm của nano Ag và nano Cu đối với nấm N11 sau 10

ngày 48

Hình 12 Hiệu quả ức chế nấm của các nano AgH đối với nấm N11 sau 3 ngày và

10 ngày 48

Hình 13 Hiệu quả ức chế nấm của Carbendazim đối với nấm N11 trong 10 ngày 49

Hình 14 Hiệu quả ức chế của nano Cu đối với C gloeosporioides N8 sau 7 ngày 49 Hình 15 Hiệu quả ức chế của nano Ag đối với C gloeosporioides N8 sau 7 ngày 50

Hình 16 Ảnh hưởng của nano đồng đến sinh trưởng của nấm N8 50 Hình 17 Ảnh hưởng của bạc đồng đến sinh trưởng của nấm N8 50

Hình 18 Hiệu quả ức chế của AgH đối với C gloeosporioides N8 sau 7 ngày 51

Hình 19 Ảnh hưởng của nano AgH đến sự phát triển của nấm N8 51

Hình 20 Hiệu quả ức chế của Carbendazim với nấm N8 51

Hình 21 Cam Hàm Yên - Tuyên Quang được chuẩn bị cho thí nghiệm 54

Hình 22 Hình ảnh cam lây nhiễm nấm bệnh trong in vitro đối với nấm N8 55

Hình 23 Hình ảnh cam lây nhiễm nấm bệnh trong in vitro đối với nấm N11 55

Hình 24 Hình ảnh cam lây nhiễm nấm bệnh trong in vitro xử lý với Anvil đối với nấm N11 và nấm N8 55

Hình 25 Ảnh hưởng của nano bạc đến tỷ lệ mốc cuống của quả cam 60

Hình 26 Hình ảnh cam bảo quản theo ngày ở quy mô pilot 64

MỞ ĐẦU

Cam là một loại quả rất quan trọng, được Việt Nam định hướng là mặt hàng thương mại được chú trọng đầu tư đến năm 2030 Sau khi thu hoạch, quả cam thường được lưu trữ, bảo quản và phân phối Tuy nhiên, hư hỏng do nấm gây bệnh thực vật là yếu tố chính hạn chế thời hạn sử dụng của trái cam, gây ra những thất thoát về cả số lượng và chất lượng của quả Tăng thời gian bảo quản bằng cách hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây thối hỏng trên trái cây có thể giảm tổn thất kinh

tế Hiện nay, tại Việt Nam, thuốc bảo quản hóa học đang được sử dụng tràn lan và

sự lạm dụng hóa chất đang gây ra những tác động tiêu cực đến môi trường cũng như sức khỏe con người Sự kháng thuốc của các vi sinh vật ngày càng gia tăng, thiếu hụt các biện pháp thay thế thuốc diệt nấm hiệu quả đồng thời những lo ngại về sức khỏe do đặc tính gây ung thư của hóa chất là thách thức lớn trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm Thực tế này đặt ra yêu cầu cấp thiết cho sự tìm kiếm cách tiếp cận và các phương pháp khác an toàn hơn, thân thiện với môi trường để giảm tổn thất sau thu hoạch

Trong vài thập kỷ gần gây, vật liệu nano đã nhanh chóng chiếm vị trí quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghệ do những đặc tính khác biệt của chúng so với vật liệu khối và khả năng ứng dụng chuyên sâu trong nhiều lĩnh vực khoa học Trong những năm đầu tiên, việc áp dụng công nghệ nano trong sản xuất nông nghiệp chủ yếu được thực hiện qua các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nhưng ngay sau đó nó đã bắt đầu và đang tiếp tục có ảnh hưởng đáng kể trong các ngành quan trọng Các vật liệu nano cũng được chú trọng sử dụng trong lĩnh vực quản lý chất lượng nước và nông sản, đặc biệt là để bảo quản, đóng gói nông sản Các ứng dụng trong tương lai hướng tới kéo dài thời hạn sử dụng, cải thiện chất lượng thực phẩm Việc áp dụng công nghệ nano vào các ngành nông nghiệp và thực phẩm được đặt ra lần đầu tiên trong chương trình hành động của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ vào tháng 9 năm 2003 và được dự đoán sẽ là công nghệ then chốt tạo ra thay đổi quan trọng trong các ngành này

Vật liệu chứa nano kim loại kháng khuẩn, kháng nấm dùng trong đóng gói thực phẩm là một hình thức đầy hứa hẹn của “bao bì thực phẩm hoạt hóa”, đóng một vai trò quan trọng trong việc kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm và giảm nguy cơ gây bệnh Xuất phát từ ý tưởng đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu ứng dụng nano kim loại Ag và Cu trong ức chế nấm Penicillium

digitatum và Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh trên quả cam tại Hàm Yên

- Tuyên Quang (Citrus nobilis Lour)” nhằm ứng dụng và phát triển công nghệ

nano trong hạn chế nấm bệnh thực vật điển hình trên quả cam, thay thế cho các loại hóa chất độc hại đang hiện hành, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người

 Mục tiêu của luận văn: Nghiên cứu ứng dụng của chế phẩm nano để ức chế

nấm gây bệnh mốc xanh và bệnh thán thư trên quả cam Hàm Yên- Tuyên Quang

 Ý nghĩa khoa học của luận văn:

+ Góp phần nghiên cứu phát triển thêm giải pháp hiệu quả theo hướng thân thiện với môi trường, thay thế cho biện pháp sử dụng hóa chất trong xử lý nấm gây thối hỏng quả cam sau thu hoạch

 Nội dung nghiên cứu:

+ Phân lập và định danh được chủng nấm Penicillium sp gây bệnh mốc xanh

và Colletotrichum sp bệnh thán thư trên quả cam Hàm Yên- Tuyên Quang + Xác định được nano kim loại thích hợp để ức chế nấm Penicillium sp và

Colletotrichum sp trên quả cam

+ Xác định được nồng độ nano kim loại có khả năng ứng dụng trong bảo quản quả cam

+ Đánh giá chất lượng quả cam khi được xử lý với nano sau thời gian bảo quản

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về giá trị của quả cam và vai trò của cây cam Hàm Yên –

Tuyên Quang

 Giá trị của quả cam

Cam là một loại quả rất quan trọng được con người sử dụng từ thời cổ đại, và hiện nay được trồng ở trên 100 nước trên thế giới Quả cam là nguồn cung cấp dồi dào vitamin C - là hoạt chất có khả năng chống oxy hóa cao [18] Trong 100 g cam

có chứa hàm lượng dinh dưỡng cao: Calo (47 kcal), Kali (181 mg), Cacbohydrat (11,75 g), chất xơ (2,4 g), đường (9,35 g), protein (0,94 g ), vitamin A (225 IU ), vitamin C (53,2 mg), Canxi (40 mg ) [50]

40 - 45% sản lượng cam của thế giới được tiêu thụ trong công nghiệp sản xuất nước ép Brazil là nước sản xuất nước cam nhiều nhất thế giới, sau đó là Florida, Hoa Kỳ Tinh dầu cam được chế biến bằng cách ép vỏ, nó được dùng làm gia vị trong thực phẩm và làm hương vị trong nước hoa Tinh dầu từ quả cam chứa khoảng 90% D-Limonene, một dung môi có trong nhiều hóa chất dùng trong gia đình, cùng với dầu chanh dùng để làm chất tẩy dầu mỡ và tẩy rửa nói chung Chất tẩy rửa từ tinh chất cam hiệu quả, thân thiện với môi trường, và ít độc hại hơn sản phẩm cất từ dầu mỏ, đồng thời có mùi dễ chịu hơn [54]

 Vai trò của cây cam trên thế giới và tại Việt Nam

Cây có múi là cây ăn quả quan trọng nhất trên thế giới, với tổng sản lượng vượt xa các cây rụng lá như táo, lê, đào và mận Sản lượng trồng các loại cây có múi ở thế giới trong niên vụ 2014 - 2015 vào khoảng 130,947 triệu tấn, trong đó cam giữ vị trí dẫn đầu với 52,39%, thứ hai là quýt 29,25%, 11,83% chanh, và 6,53% bưởi Tổng số sản lượng các loại trái cây có múi đã tăng lên trong những thập kỷ qua và đạt mức cao nhất là 131 triệu tấn trong năm 2014 [15] Cam được trồng rộng rãi ở những nơi có khí hậu ấm áp, và vị cam có thể biến đổi từ ngọt đến chua Khu vực Địa Trung Hải gồm các nước xuất khẩu trái cây tươi lớn nhất Các nhà nhập khẩu lớn nhất là Đức, Pháp, Hà Lan và Anh Hiện nay cam quýt được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, giới hạn bởi vĩ độ 40 Bắc, Nam tại hơn

137 quốc gia trên 6 lục địa và tạo ra khoảng 105 tỷ $ mỗi năm trên thị trường trái cây thế giới [19]

Theo số liệu về cây có múi năm 2014 và 2015 của FAO [15], tại Việt Nam, tổng sản lượng cây có múi năm 1990 đạt 109,2 nghìn tấn đã tăng lên 985,6 nghìn tấn năm 2015 và 998,7 nghìn tấn năm 2016 Trong đó, sản lượng cam đạt 520 nghìn tấn năm 2015 và luôn đóng vai trò quan trọng nhất trong sản lượng cây có múi Trong quy hoạch phát triển cây nông nghiệp đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm

2030 của Chính Phủ, cây cam, quýt được định hướng phát triển từ 61,5 nghìn ha năm 2010 mở rộng đến diện tích 115 nghìn ha và là quả thương mại được chú trọng đầu tư

Hình 1 Sản lượng cây có múi Việt Nam từ năm 1990 đến năm 2015 [15]

Một số giống cam đặc sản ở Việt Nam bao gồm cam Sành Bố Hạ, cam Sành

Hà Giang - Tuyên Quang - Yên Bái, Cam Xã Đoài, Cam Ham-Lin, Cam Sông Con, Cam Vân Du, Cam Bù Hà Tĩnh, Cam Canh [51]

109,2

998,7

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

 Cam Sành Hàm Yên-Tuyên Quang

Tuyên Quang có tọa độ 21°46′38″B 105°13′42″Đ, là một tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Việt Nam Khu vực này có điều kiện tự nhiên - kinh tế xã hội thuận lợi

để sản xuất một số sản phẩm nông nghiệp Trong đó, cam Sành là giống cây địa phương đã được người dân ưu tiên khai thác từ lâu đời và đem lại nguồn thu nhập đáng kể cho người nông dân Trên địa bàn huyện Hàm Yên, cam Sành được trồng ở

15 xã, thị trấn, trong đó có 9 xã, thị trấn nằm trong vùng được quy hoạch gồm: Yên Thuận, Yên Phú, Bạch Xa, Minh Khương, Minh Dân, Yên Lâm, Tân Thành, Phù Lưu và thị trấn Tân Yên Trong mùa vụ 2015-2016, huyện Hàm Yên có 4037,9 ha cam Sành, năng suất trung bình trên 13 tấn / ha, sản lượng đạt 31,075 tấn quả; tổng thu nhập trên 310 tỷ đồng Đặc biệt, năm 2013 cam Sành Hàm Yên đã được vinh danh và lọt vào Top 10 loại trái cây nổi tiếng bậc nhất Việt Nam Xác định đây là loại cây trồng mũi nhọn trong phát triển kinh tế, huyện Hàm Yên sẽ ưu tiên phát triển, mở rộng diện tích vùng trồng cam trong những năm tiếp theo và đẩy mạnh thương hiệu cam Sành Hàm Yên [56]

1.2 Các bệnh phổ biến trên quả cam sau thu hoạch

Trái cây sau thu hái luôn có những biến đổi về vật lý, sinh lý và sinh hóa, gây ra những thất thoát về cả số lượng và chất lượng của quả Các biến đổi này xảy

ra có mối liên hệ chặt chẽ với nhau và phụ thuộc nhiều vào yếu tố như giống, điều kiện chăm sóc, độ chín, vận chuyển, kỹ thuật bảo quản Trong đó, yếu tố vi sinh vật gây ra sự tổn thất đáng kể của trái cam sau thu hoạch Tại Việt Nam, khí hậu nhiệt đới nóng ẩm quanh năm, nhiệt độ trên 20oC đến 35oC (hoặc cao hơn), và độ

ẩm không khí thường xuyên trên 80 ÷ 90% nên rất thích hợp cho vi sinh vật phát triển Do đó, trái cây dù ở dạng tươi hay dạng đã chế biến, thường bị các vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc gây hư hỏng, ảnh hưởng xấu đến chất lượng và giá trị thương phẩm của trái cây [2]

Hư hỏng sau thu hoạch do nhiễm nấm tiềm ẩn thông qua vết thương gây ra tổn thất lớn (25 ÷ 50%) và vẫn là một thách thức quan trọng trong sản xuất lương thực bền vững [39] Tình trạng tổn thất sau thu hoạch của các loại trái cây có múi

nói chung và quả cam nói riêng bắt nguồn từ một trong hai giai đoạn phát triển của cây Giai đoạn đầu là khoảng thời gian từ khi ra hoa đến khi quả chín Giai đoạn thứ hai kéo dài trong suốt quá trình thu hoạch đến các hoạt động bảo quản Nhiễm nấm thường tiềm ẩn trong quả trước khi thu hoạch, ngay tại các vườn trồng, trong quá trình thu hái và trong quá trình hoàn thiện sản phẩm: tại các nhà buôn, nhà phân phối, bán lẻ… nhưng tồn tại trong trạng thái nghỉ và hoạt động khi gặp các điều kiện thích hợp cho sự phát triển

Trong nhiều năm qua, Viện Bảo vệ thực vật đã điều tra phát hiện trên cây có múi tại Việt Nam có tới 19 loại bệnh do nấm, 2 loại bệnh do vi rút, 2 loại do bệnh vi khuẩn Hiện nay, các vùng trồng cam quýt ở nước ta bị nhiễm các bệnh do nấm

Phytophthora (bệnh chảy gôm), Capnodium citri (bệnh nấm muội đen), vi khuẩn Xanthomonas (bệnh loét) vv…, nấm Colletotrichum gloeosporioides (bệnh thán

thư), nấm Lasiodiplodia theobromae (bệnh thối cuống), Penicillium digitatum (bệnh mốc xanh lá), P intalicum (bệnh mốc xanh da trời)… [52] Bệnh thán thư và

bệnh mốc xanh là nguyên nhân chính gây thất thoát nặng nề sau thu hoạch cho trái cam tại Hàm Yên, Tuyên Quang

1.2.1 Bệnh mốc xanh do nấm Penicillium digitatum trên cam

Trong số các tác nhân gây bệnh từ vết thương, nấm mốc xanh lá

(P.digitatum) và mốc xanh da trời (P italicum) chính là nguyên nhân gây hư hỏng quả có múi trên toàn thế giới [31] Các bào tử trong Penicillium chứa sắc tố màu

xanh lá hoặc xanh da trời, đây là màu sắc đặc trưng của nấm khi phát triển và phát bệnh trên quả

Penicillium digitatum, nấm mốc màu xanh lá, được mô tả và phân loại bởi

Saccardo năm 1886 Hiện nay, tên khoa học được chấp nhận là Penicillium

digitatum (Pers: Fr.) Sacc (MycoBank # 169.502) Theo cơ sở dữ liệu MycoBank,

có ba tên đơn vị phân loại: P digitatum var californicum Thom (1930), P

digitatum var digitatum, và P digitatum var latum S Abe (1956) Các loài được

xếp vào giới Nấm, ngành Ascomycota (nấm túi hay nấm nang), ngành phụ

Pezizomycotina, lớp Eurotiomycetes, lớp phụ Eurotiomycetidae, bộ Eurotiales, họ

Trichocomaceae, và chi Penicillium [28]

Bề mặt khuẩn lạc có màu xanh lá và mặt dưới thường có màu vàng hoặc xanh Kết cấu khuẩn lạc có lông tơ, không có giọt tiết Các loại nấm có khả năng nảy mầm trong môi trường nhân tạo tại 5°C, không tăng trưởng ở 37°C Bộ máy sinh bào tử rất dễ vỡ và có xu hướng phá vỡ thành nhiều tế bào Bào tử sinh ra từ sợi nấm khí sinh, bề mặt bào tử đính trơn, có thành bao quanh, hình dạng thay đổi

từ elip đến hình trụ, kích thước không đồng đều, trung bình là 3,5 ÷ 8,0 × 3,0 ÷ 4,0

mm Nảy mầm bào tử là bước đầu tiên để nấm bệnh xâm nhiễm vào cây chủ [28]

Thiệt hại thực tế do tác động của Penicillium thay đổi phụ thuộc vào khí hậu

và các yếu tố vườn cây ăn quả, giống quả, mức độ chấn thương vật lý quả trong thu hoạch, hiệu quả của phương pháp xử lý nấm, và môi trường sau thu hoạch [41] Tại Tây Ban Nha, nghiên cứu của Tuset (1988) ước tính rằng quả thối hỏng do

Penicillium spp chiếm 55 ÷ 80% tổng số quả bị hư hỏng sau thu hoạch khi theo dõi

trong suốt mùa vụ thương mại, và chiếm 30 ÷ 55% trong các phòng lưu trữ đóng gói quả trong nhà Kiểm tra ở New York, quả có múi ở California và Florida bị nhiễm nấm mốc màu xanh lá và màu xanh da trời chiếm 30% các lô hàng kiểm tra [7] Mốc xanh lá thường gây thiệt hại lớn hơn trong thương mại hóa bởi vì nó chiếm

ưu thế ở nhiệt độ môi trường, nhưng mốc xanh da trời trở nên nghiêm trọng hơn khi

trái cây có múi bảo quản ở nhiệt độ rất lạnh trong thời gian dài vì P italicum phát triển nhanh hơn so với P digitatum dưới 10°C [31] Nhìn chung, tỷ lệ hư hỏng sau

thu hoạch cao hơn trong trồng trọt tại những vùng có lượng mưa dồi dào, như

Brazil, Florida hay Đông Nam Á Mầm bệnh do nấm Penicillium spp có ảnh hưởng

rất lớn đến tất cả các khu vực này vì chúng sinh sản rất nhanh, bào tử của chúng có mặt khắp nơi trong bầu không khí, trên bề mặt trái cây và dễ dàng được phát tán bởi dòng không khí Vì vậy, nguồn gốc nấm bệnh trong vườn cam quýt và khu bảo quản tồn tại trong suốt mùa vụ, và chính trái cây có thể bị lây nhiễm trong khu vườn, trong khu bảo quản, đóng gói, phân phối và tiếp thị

 Quá trình nhiễm bệnh của nấm

Bệnh sau thu hoạch được chia thành hai nhóm dựa trên thời gian chiếm ưu thế nhiễm bệnh: nhiễm bệnh trước thu hoạch gây ra những mầm bệnh tiềm ẩn, và nhiễm bệnh sau thu hoạch do những mầm bệnh trên vết thương Nấm mốc

Penicillum gây bệnh theo cách thứ hai

Penicillium digitatum và P italicum là nguyên nhân gây bệnh cho trái cây có

múi chỉ thông qua nhiễm trùng vết thương vỏ Thông thường, những vết thương được gây ra trong quá trình thu hoạch và xử lý trái cây trong nhà đóng gói hoặc trong quá trình thương mại hóa, nhưng một nấm bệnh có thể lây nhiễm trước khi thu hoạch thông qua chấn thương, vết nứt hay vết thương do côn trùng Trong trường hợp này, nếu trái cây nhiễm bệnh một thời gian dài trước khi thu hoạch thường rụng xuống khỏi cây, nhưng trái cây bị nhiễm ít hơn 3 ngày trước khi thu hoạch không thể phát hiện được và có thể được thu hoạch như quả lành Bào tử nấm

từ hoa quả thối rữa trên mặt đất trong vườn cây ăn quả, trong bao bì ở các cơ sở lưu trữ, hoặc ở bất kỳ nơi nào trong quá trình vận chuyển và tiếp thị đang liên tục chuyển động bằng dòng không khí và có thể dễ dàng lây nhiễm trái cây xung quanh Bệnh không phát tác nếu các trái cây có vỏ còn nguyên vẹn vì bào tử tự do nằm trên

bề mặt vỏ không thể nảy mầm Ngược lại, các bào tử nằm ở vết thương bị vỡ tuyến dầu của vỏ thường gây ra sự nhiễm bệnh chỉ trong vòng 48 giờ ở 20 ÷ 25°C Bào tử

của nấm Penicillium spp nảy mầm bên trong vết thương vỏ và sự phát triển sợi nấm

tiếp theo đòi hỏi nước, chất dinh dưỡng, điều kiện nhiệt độ và pH riêng [28]

Khi nhiễm P digitatum thường chỉ nhìn thấy bằng mắt thường sau 3 ngày ở

điều kiện nhiệt độ phòng Một vòng tròn xung quanh các chỗ bị nhiễm trùng (vỏ vết thương) xuất hiện ướt nước, mềm và mất màu Nấm sản xuất ra enzyme thủy phân, chủ yếu là polygalacturonase và cellulase làm mềm các mô vỏ, tạo điều kiện phát triển bệnh Khi phát triển, sợi nấm khí sinh màu trắng phát triển tại trung tâm tổn thương và mở rộng tỏa tròn Tùy thuộc vào mức độ của nguồn bệnh, bào tử bắt đầu hình thành sau 3 đến 5 ngày ở nhiệt độ phòng (15 ÷ 28°C), sau 7 đến 8 ngày, khu vực trung tâm của tổn thương có màu xanh lá được bao quanh bởi một dải rộng dày

đặc, trắng của những sợi nấm không hình thành bào tử, giới hạn ngoài là viền vỏ mục nát [28]

Chủng P digitatum có thể thay đổi khả năng tấn công, nhưng không có báo

cáo nào về những chủng phân lập bị biến đổi di truyền làm mất khả năng gây độc

Sự nhiễm bệnh rõ ràng và sự phát triển bệnh phụ thuộc vào số lượng bào tử của các

chủng Penicillium để sự xâm nhiễm thành công qua vết thương ở vỏ Các mối quan

hệ giữa số lượng bào tử và tỷ lệ nhiễm thực tế là tuyến tính, với điều kiện là các trái cây nhạy cảm cao (không non) và nhiệt độ thích hợp cho nhiễm trùng (20 ÷ 25°C)

Trong những điều kiện này, 50 và 500 bào tử của P digitatum được cấy vào vết

thương vỏ cam trên dẫn đến tỷ lệ nhiễm nấm màu xanh lá tương ứng là 10% và 65% Mật độ cấy 106 bào tử / ml P digitatum đã được đề nghị là mật độ thí nghiệm

để thu được các các mức độ gây bệnh có thể chấp nhận được sau khi cấy nhân tạo vào quả có múi để đánh giá khả năng kiểm soát của phương pháp điều trị chống

nấm sau thu hoạch Nhiều báo cáo cho rằng Penicillium spp thường kết hợp với

một mầm bệnh quan trọng từ vết thương sau thu hoạch trên cam quýt, ví dụ như

Geotrichum citri-aurantii (Ferraris) E.E Butler - nguyên nhân gây ra bệnh thối

chua [28]

Mốc xanh lá xuất hiện thường xuyên hơn trên trái cây giữ ở nhiệt độ phòng,

vì nó phát triển nhanh hơn trong những điều kiện này Các nghiên cứu in vitro khác nhau cho thấy P italicum nảy mầm và lớn nhanh hơn so với P digitatum ở nhiệt độ

thấp và trong điều kiện khô hạn Các nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm và phát triển của cả hai loài là 25°C và chúng hoạt động trong khoảng 4 ÷ 30°C Tuy nhiên, chúng đều không thể phát triển ở 37°C Khi cam bảo quản ở nhiệt độ 4°C, triệu

chứng mốc xanh lá có thể nhìn thấy sau 16 ngày Ngược lại, P digitatum lớn nhanh

hơn ở nhiệt độ khác nhau trên 10°C Về ảnh hưởng của pH, kết quả bởi Prusky et al

(2004) cho rằng P digitatum và P italicum tăng cường tính độc của chúng bằng

cách axit hóa môi trường xung quanh vết thương trên vỏ cam quýt [28]

 Các yếu tố sau thu hoạch ảnh hưởng đến sự xâm nhiễm của nấm

Cả P digitatum và P italicum là mầm bệnh gây hại trên vết thương sau khi

thu hoạch Sự xâm nhiễm vào trái non của các loại nấm rất hiếm khi phát triển thành bệnh do khả năng kháng bệnh tự nhiên của cây chủ được kích hoạt bằng hàng loạt cơ chế phức tạp

Tuy nhiên, còn có các yếu tố khác bên cạnh những điều kiện nội tại để mầm bệnh và cây chủ có thể ảnh hưởng đến sự xâm nhiễm hoặc phát triển bệnh Các thông số quan trọng (nhiệt độ, mật độ cấy, vỏ trưởng thành và điều kiện…) có thể giải thích ảnh hưởng của các hoạt động xử lý trái cây thương mại như làm sạch, phân loại hoặc lưu trữ kho lạnh

Thu hoạch: mối quan hệ trực tiếp giữa mức độ của chấn thương vỏ và tỷ lệ

nấm Penicillium đã được chứng minh Do đó, việc xử lý trái cây khi thu hoạch cần

rất cẩn thận để giảm thiểu việc trầy xước vỏ, tạo thương tổn, vết bầm tím, và chấn thương cơ học nói chung Mặt khác, thu hoạch không nên thực hiện sau mưa hoặc khi nước tự do tồn tại trên bề mặt trái cây Đây là những điều kiện thuận lợi cho sự hình thành bào tử mầm bệnh, và sự căng quá mức của vỏ làm cho nó dễ bị tổn thương cơ học và nhiễm trùng sau đó [28]

1.2.2 Bệnh thán thư do Colletotrichum gloeosporioides gây ra

Tên Colletotrichum gloeosporioides lần đầu tiên được đề xuất ở Penzig (1882) dưới tên Vermicularia gloeosporioides, loại mẫu được thu thập từ cây có múi ở Ý C gloeosporioides gây bệnh thán thư với nhiều loại cây trên toàn thế giới Ảnh hưởng nghiêm trọng của C gloeosporioides (Penz.) Penz & Sacc và bệnh thán

thư gây ra cho sản phẩm rau quả hiện là mối đe dọa đối với nông nghiệp toàn cầu Trong những khoản thua lỗ khi kinh doanh trái cây tươi và rau quả, hơn 50% gây ra

bởi loài nấm Colletotrichum [6, 29] Bệnh thán thư dễ bùng phát ở điều kiện ẩm ướt

và ấm [53] Các triệu chứng không xuất hiện trong suốt mùa vụ là nguyên nhân gây

ra bệnh và dẫn đến thua lỗ đáng kể sau thu hoạch Các tác nhân gây bệnh thán thư xâm nhiễm trước thu hoạch trong chùm hoa, trái cây, lá và thân của một loạt các loại cây ăn quả Các loại nấm sản xuất các enzym (polygalacturonase và

pectatelyase) làm suy giảm thành tế bào thực vật và nguyên nhân thiệt hại kinh tế đáng kể [34] Triệu chứng bệnh thán thư có đặc điểm điển hình là vết bệnh dạng đốm tròn hoặc bất kỳ, có viền xung quanh màu nâu đỏ đến nâu đen Vết đốm có thể nứt, lõm sâu trên thân, quả

Phân loại nấm Colletotrichum lần đầu tiên được nghiên cứu bởi Corda (1837), lúc đó được gọi là Colletothrichum, sau đó cũng chính tác giả đã đổi lại tên gọi thành Colletotrichum và được mô tả có 11 loài Theo ý kiến gần nhất của Baxter và cộng sự (1985), Colletotrichum được giới thiệu có 21 loài: C coccodes,

C dematium, C gloeosporioides, C graminicola, C falcatum và C capsici… là

những loài thường gây bệnh thán thư (anthracnose) Các loài Colletotrichum gây bệnh trên cây trồng tại một số vùng ở Việt Nam được xác định là C acutatum (cao su); C gloeosporioides (địa lan); C acutatum (dâu tây); C gloeosporioides (cà phê, cam, xoài); C capsici (ớt) [1]

Nấm có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 4oC nhưng nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là ở nhiệt độ 28 † 30°C và độ ẩm cao Đặc biệt bào tử nấm thán thư

có sức sống cao, có khả năng chịu đựng khô hạn, dễ dàng phát tán nhờ gió và côn trùng Bào tử nảy mầm sau 6 † 12 giờ ở độ ẩm 98 † 100% Bào tử phân sinh hình thành nhiều trên lá già trong giai đoạn khô có thể tồn tại vài tuần tới 60 ngày Nấm gây bệnh tồn tại chủ yếu ở dạng sợi nấm và bào tử phân sinh trên tàn dư lá, thân cành, quả và hạt bị nhiễm bệnh Vì vậy, tàn dư cây bị nhiễm bệnh và hạt giống cũng

là những con đường truyền lan bệnh chủ yếu trong tự nhiên Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi là hậu bào tử, nó

có thể ở tận cùng hoặc xen giữa sợi nấm và tồn tại trong thời gian dài, khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành sợi nấm mới [39]

Trên môi trường Hansen, tản nấm có màu trắng xám nhạt đến màu xám đậm

Ở một số mẫu phân lập sợi nấm kí sinh chỉ hình thành quả thể và quả thể hình thành trên khuẩn lạc non phổ biến hơn so với khuẩn lạc già

Phân loại các chủng Colletotrichum chủ yếu dựa vào đặc điểm khuẩn lạc,

hình dạng, kích thước bào tử, lông gai và giác bám Đĩa cành hình thành trên các bộ

phận của cây, có lông cứng dài màu nâu, thuôn về phía đỉnh, hơi phồng nhẹ ở phần gốc, kích thước khoảng 500 µm, đường kính 4 † 8 µm, có từ 1 ÷ 4 vách ngăn, đôi khi bào tử cũng được sinh ra từ lông gai Bào tử phân sinh hình thành trên cành bào

tử ngắn, trong suốt, hình trụ, đầu hơi tù, đỉnh tròn, không có vách ngăn, kích thước

9 ÷ 24 × 3 ÷ 6 µm Trên môi trường khoai tây PDA, kích thước và hình dạng bào tử

có sự thay đổi so với trên cây kí chủ Bào tử màu hồng nhạt được hình thành trên cành bào tử phân sinh đơn độc sinh ra từ sợi nấm trong đĩa cành nhẵn hoặc có lông gai Bào tử nảy mầm và hình thành giác bám màu nâu, hình ôvan hoặc hình quả

đấm, kích thước 6 † 20 × 4 † 12 µm Colletotrichum chỉ sinh sản vô tính bằng bào

tử đính, bào tử đính phát triển trên cuống bào tử trong dạng quả thể là cụm cuống bào tử Cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt Cuống bào tử không có vách ngăn kéo dài đơn bào, dạng liềm, cong, bào tử trong suốt Cùng với bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, dài, thuôn nhọn, không phân nhánh và cấu trúc đa bào như tơ cứng Frost (1964) mô

tả một loài Colletotrichum có hoặc không có lông cứng có thể được kiểm soát bởi

sự thay đổi độ ẩm Sự hình thành một số lớp của bào tử gây nứt gãy trên bề mặt vật chủ, gặp điều kiện thuận lợi, mỗi bào tử mọc từ một đến nhiều ống mầm để hình thành hệ sợi nấm [39]

Nấm Colletotrichum xâm nhập vào cây chủ yếu bằng bào tử Trước khi xâm

nhập bào tử phải tiếp xúc trực tiếp với kí chủ, gặp điều kiện thuận lợi (nhiệt độ, độ ẩm) bào tử nấm sẽ nảy mầm thành ống mầm Đầu ống mầm hình thành một cấu trúc đặc biệt gọi là giác bám Trên giác bám hình thành đế xâm nhập đâm xuyên qua bề mặt kí chủ gồm tầng cutin và vách tế bào Giác bám tích lũy nhiều cacbohydrate (chủ yếu là glycerol) tạo áp lực thẩm thấu giúp hút nước từ bên ngoài vào bên trong giác bám, tạo áp suất trương lớn, cho phép nấm xâm nhập vào bề mặt kí chủ Ngoài

ra, nấm cũng tiết ra các enzyme nhằm hỗ trợ cho sự xâm nhập như cellulase, pectinase Trong nhiều trường hợp, sự xâm nhập chỉ có thể xảy ra nếu giác bám tích

lũy sắc tố đen (melanin) Melanin sẽ làm cho vách giác bám vững chắc, không bị vỡ

khi hút nước để tạo áp suất trương lớn [39]

 Phạm vi cây chủ và sự mất mùa

Chu kỳ sống của mầm bệnh này bắt đầu từ sự nảy mầm của bào tử trên bề mặt thực vật để tạo thành các cấu trúc xâm nhiễm melanin hoá, được gọi là appressoria, sau đó là sự xâm nhập vào mô chủ Tại các điểm xâm nhiễm, các sợi nấm dày được sinh ra từ các tế bào bị nhiễm trùng sơ cấp, giai đoạn này được gọi là giai đoạn sinh biotrophic Sau đó, nấm đột ngột chuyển sang giai đoạn hoại tử, được đặc trưng bởi sự hình thành của các sợi nấm thứ cấp mỏng, có nguồn gốc từ các sợi nấm sơ cấp Sợi nấm thứ cấp bắt đầu xâm nhập vào các tế bào gần đó, dẫn đến sự phát triển của các tổn thương nhìn thấy được ở vị trí nhiễm trùng Cuối cùng các bào tử được hình thành trên bề mặt của mô bị nhiễm bệnh và chúng được phát tán bởi côn trùng, không khí và dòng nước để bắt đầu một chu kỳ lây nhiễm [38]

C gloeosporioides lây nhiễm cho khoảng 470 loại cây chủ khác nhau, gồm

một số cây trồng quan trọng trước và sau thu hoạch như: bơ, xoài, đậu, hạt điều, cây

sả, cây cam quýt, bông, đậu bò, dưa leo, cà tím, xanh lá, xoài, hành, tiêu, bí , đu đủ, đậu tương, cà chua, dưa hấu, lúa mì, dưa chuột, ngũ cốc, đậu và rau chân vịt [38]

Gần đây, các chi Colletotrichum được đánh giá là nhóm nấm gây bệnh thực vật

đứng thứ tám trên thế giới, dựa trên đánh giá giá trị khoa học và kinh tế [11]

Trong hai thập kỷ vừa qua thiệt hại đáng kể trong vùng sản xuất cam quýt ở

Bồ Đào Nha liên quan đến bệnh thán thư đã được ghi nhận, nguyên nhân chủ yếu là

do C gloeosporioides Trên cây cam quýt, C gloeosporioides (Penz.) Penz & Sacc

và C acutatum J H Simmonds là hai loài được báo cáo là các tác nhân phổ biến

gây ra triệu chứng của bệnh thán thư Gần đây hơn, các nghiên cứu bệnh dịch và

dịch tễ học được thực hiện tại Brazil cho thấy, C gloeosporioides cũng tham gia

vào quá trình hoại tử trong các cụm hoa của các giống cam ngọt [33] Sự nhiễm

bệnh đối với quả cà phê ở Việt Nam đã được quan sát và mầm bệnh gây bệnh C

gloeosporioides được xác định bằng các phương pháp hình thái học và phân tử

Viện Bảo vệ thực vật cho biết bệnh thán thư có mặt trên tất cả các vùng trồng cam của nước ta

1.3 Các phương pháp bảo quản trái cây sau thu hoạch

Sự ổn định các chỉ tiêu của nông sản thực phẩm là một vấn đề ưu tiên hàng đầu của nông dân, thương nhân và người sử dụng Có rất nhiều hình thức bảo quản nông sản (lý học, hóa học và sinh học) để duy trì, nâng cao chất lượng của nông sản sau khi đến tay người tiêu dùng

1.3.1 Phương pháp bảo quản hóa học

Tùy từng loại đối tượng quả sử dụng các loại hóa chất khác nhau Thông thường các hóa chất này có tác dụng diệt vi sinh vật, đặc biệt là nấm trên bề mặt quả Theo Nguyễn Mạnh Khải (2007) một số hóa chất diệt nấm thường được sử dụng để bảo quản quả sau thu hoạch như trên Bảng 1

Bảng 1 Một số chất diệt nấm được sử dụng trong bảo quản quả sau thu hoạch Tên hoá chất Đối tượng phòng trừ Đối tượng nông sản

Benzimidazole, Benomyl,

thiabendazole, thiophanate,

methyl, Carbendazim

Penicillium, Colletotrichum

Các nấm khác

Cam, quýt Chuối, táo, lê, dứa, đào, mận

Hydrocacbon và các dẫn

xuất: Biphenyl, Methyl

chloroform

Penicillium Diplodia Cam, quýt

Các chất oxy hoá: Axit

hypocloric, Iot

Nitơ trichlorit

Vi khuẩn và nấm nhiễm trong nước rửa

Penicillium

Nông sản nói chung, cam, quýt, nho

Cà chua, cam, quýt

Các axit hữu cơ và aldehyt

Axit dehydroaxetic, sorbic

Botrytis và các nấm khác Alternaria,

Cladosporium

Dâu tây Vải

Lưu huỳnh (vô cơ): Bột

lưu

Monilinia Botrytis

Đào Nho

huỳnh, Bisulphate, dioxide

sulphur

Lưu huỳnh HC: Captan,

Thiram, Zizam, Thiourea,

Thioacetamide

Thối hỏng trong bảo

quản bởi Clasdosporium

Thối đầu và cuống quả

bởi Alternaria Bào tử của Penicillium,

Diplodia

Rau quả các loại: Dâu tây, Chuối, Cam, quýt

Đối với các loại quả có múi, sử dụng dung dịch Carbendazim 0,1% hoặc dung dịch Topxin-M 0,1% Có thể sử dụng một số hóa chất khác như Guazatine:

1000 ppm (0,1%) + Benomyl 500 ppm, hoặc Thiabendazole 1000 ppm [2]

Carbendazim, Benomyl và Thiophanate Methyl là những hợp chất hóa học thuộc nhóm Benzimidazole Trên thực vật, trong nước và ngoài môi trường, Benomyl và Thiophanate Methyl nhanh chóng bị chuyển hóa chủ yếu thành Carbendazim (Benomyl chuyển hóa sau 2 giờ trong nước, 19 giờ trong đất; Thiophanate Methyl chuyển hóa sau 2 ngày trong nước và 1 ngày trong đất) Thuộc nhóm độc IV, LD50 qua miệng > 7.500 mg/kg, LD50 qua da >2.000 mg/kg Là thuốc trừ nấm nội hấp, phổ tác dụng rộng, liều lượng sử dụng thông thường từ 0,2 ÷ 2,0 kg, lít/ha, thời gian cách ly 7 đến 14 ngày, dư lượng tối đa cho phép trên rau 1,0

÷ 1,5 mg/kg; ngũ cốc, dưa leo 0,5 mg/kg; chuối 0,2 mg/kg; sản phẩm khác 0,1 mg/kg Tuy nhiên, do những hoạt chất trên có khả năng gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người, vật nuôi, hệ sinh thái, môi trường và có hiệu lực thấp đối với sinh vật gây hại (điểm a, b - khoản 2 – điều 49 Luật Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật), ngày 03/01/2017, Bộ Nông nghiệp & PTNT đã ban hành quyết định số 03/QĐ-BNN-BVTV về việc loại bỏ thuốc BVTV chứa hoạt chất Carbendazim, Benomyl và Thiophanate Methyl ra khỏi Danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng tại Việt Nam hiện hành Theo lộ trình được Bộ Nông nghiệp & PTNT đưa ra, các thuốc BVTV có chứa hoạt chất Carbendazim, Benomyl và Thiophanate Methyl chỉ được sản xuất, nhập khẩu tối đa 1 năm; được buôn bán, sử dụng tối đa 2 năm kể từ ngày

03/01/2017 Đồng thời ngừng toàn bộ các thủ tục đưa vào Danh mục đối với các hồ

sơ đăng ký thuốc BVTV có chứa 3 loại hoạt chất trên [55]

Hiện nay, kiểm soát nguồn bệnh sau thu hoạch phần lớn vẫn dựa trên các chất diệt nấm tổng hợp Tuy nhiên, sự lạm dụng hóa chất có độc tính mạnh đã làm gia tăng các chủng kháng thuốc cũng như lượng tồn dư sản phẩm hóa học gây ra nhiều bệnh lý trầm trọng tới sức khỏe con người Trước thực trạng này, người tiêu dùng đang yêu cầu thực hiện cắt giảm việc sử dụng thuốc hóa học về cả số lượng và hàm lượng Điều này thúc đẩy các nhà khoa học tìm kiếm các chiến lược kiểm soát thay thế thân thiện và hiệu quả hơn

1.3.2 Phương pháp bảo quản bằng các loại màng

Thuật ngữ "bao gói kháng khuẩn" hiện được sử dụng rộng rãi và được ngành công nghiệp thực phẩm quan tâm đặc biệt, bao gồm tất cả các kỹ thuật bao gói được

sử dụng để kiểm soát sinh trưởng của vi sinh vật trong thực phẩm

Đó là các vật liệu bao gói, các màng bọc, màng ăn được có chứa các chất kháng khuẩn và các kỹ thuật thay đổi không khí trong gói Màng có tiềm năng kiểm soát vận chuyển khối lượng giữa thực phẩm và môi trường và giữa các thành phần khác nhau của thực phẩm, như vậy sẽ kéo dài thời gian bảo quản và cải thiện chất lượng cũng như tăng thời gian sử dụng của quả tươi Người tiêu dùng đòi hỏi sản phẩm không có chất bảo quản nhưng vẫn giữ được chất lượng cao, vì vậy màng hoặc kỹ thuật bao gói được đánh giá có hiệu quả hơn, mặc dù áp dụng phức tạp hơn [2]

1.4 Công nghệ nano và tiềm năng ứng dụng của nano

1.4.1 Giới thiệu về công nghệ nano và tình hình nghiên cứu trên thế giới

Công nghệ nano là lĩnh vực khoa học mới xuất hiện nhưng đang dần chiếm lĩnh sự quan tâm về tiềm năng vượt trội trong việc chế tạo ra những vật liệu mới độc đáo có khả năng ứng dụng chuyên sâu trong nhiều lĩnh vực khoa học như dược phẩm, hóa học, nông nghiệp, công nghệ sinh học [47]

Công nghệ nano là công nghệ liên quan đến thiết kế, phân tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng cách điều chỉnh các hình dạng và

kích cỡ theo thang đo nano mét (nm, 1 nm = 10-9 m) Ở quy mô nano, vật liệu có các tính năng đặc biệt mà các vật liệu truyền thống không có do giảm kích thước và tăng diện tích bề mặt

Ý tưởng cơ bản về công nghệ nano được đưa ra bởi nhà vật lí người Mỹ Richard Feynman năm 1959 Thuật ngữ "công nghệ nano" bắt đầu được sử dụng năm 1974 bởi Norio Taniguchi - một nhà nghiên cứu thuộc Đại học Tokyo, để chỉ khả năng chế tạo vi cấu trúc [8]

Loại vật liệu này có đặc tính khác biệt, thường vượt trội hơn so với các vật liệu thông thường ở hai đặc điểm chính: hiệu ứng bề mặt (tỷ lệ bề mặt/khối lượng rất cao do đó các nguyên tử của hạt nano liên kết với nhau một cách yếu ớt nên chúng có phản ứng mạnh hơn) và hiệu ứng lượng tử (các điện tử thay đổi vị trí trong giới hạn bề mặt của hạt nano và không còn phân bố theo mức năng lượng một cách rõ ràng, do đó chúng dao động tập thể tạo ra hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt) [35] Những đặc điểm này ảnh hưởng đến đặc tính hóa lý chung của các vật liệu nano và tạo ra các đặc tính mới chưa từng có ở các vật liệu khối Công nghệ mới này đã hình thành cơ sở cho một lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng liên ngành rộng lớn được phát triển nhanh trên toàn thế giới trong một vài thập kỷ vừa qua [3]

Việc áp dụng công nghệ nano vào các ngành nông nghiệp và thực phẩm được đặt ra lần đầu tiên trong chương trình hành động của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ vào tháng chín năm 2003 [42] và được dự đoán sẽ là công nghệ then chốt tạo ra thay đổi quan trọng trong các ngành này Trong những năm đầu tiên, việc áp dụng công nghệ nano trong sản xuất nông nghiệp chủ yếu được thực hiện qua các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nhưng ngay sau đó nó đã bắt đầu và đang tiếp tục có ảnh hưởng đáng kể trong các lĩnh vực quan trọng như lai tạo các giống cây trồng mới, phát triển vật liệu chức năng mới và hệ thống phân phối thông minh cho hóa chất nông nghiệp như thuốc diệt cỏ, phân bón và thuốc trừ sâu, hệ thống thông minh cho chế biến thực phẩm, bao bì và các lĩnh vực khác như như khắc phục hậu quả của dư lượng chất diệt cỏ và thuốc trừ sâu trong thực vật và đất, trong xử lý nước

thải, quản lý tài nguyên thiên nhiên và phát hiện sớm các mầm bệnh, các chất gây ô nhiễm trong cây trồng và thực phẩm …[24]

Do khả năng ứng dụng kỳ diệu và sâu rộng của công nghệ nano mà hiện nay trên thế giới đang xảy ra một cuộc chạy đua sôi động về việc nghiên cứu và phát triển ứng dụng công nghệ nano vào đời sống Công nghệ nano được xem như là cuộc cách mạng công nghiệp mới không chỉ ở các nước phát triển, mà còn ở cả các nước đang phát triển Chính phủ của nhiều quốc gia đã dành một khoản ngân sách đáng kể để hỗ trợ cho việc nghiên cứu và phát triển ứng dụng công nghệ nano vào thực tiễn Không chỉ các trường Đại học, Viện nghiên cứu có các phòng thí nghiệm với các thiết bị nghiên cứu quy mô mà các tập đoàn sản xuất cũng tiến hành đầu tư vào nghiên cứu và phát triển công nghệ nano với các phòng thí nghiệm có tổng chi phí đầu tư không nhỏ Trong thời kỳ 2005-2006, Hoa Kỳ dẫn đầu với chi phí đầu tư

là 3,7 tỷ USD/năm thông qua Chương trình Sáng kiến Công nghệ nano quốc gia (NNI) Tiếp theo là Nhật Bản và Liên minh châu Âu với 750 triệu USD và 1,2 tỷ USD/năm Mức đầu tư ở các nước đang phát triển tuy thấp hơn, nhưng không làm giảm bớt dấu ấn của các nước này trong nghiên cứu và ứng dụng công nghệ nano Ở Trung Quốc, số lượng các công trình khoa học liên quan đến công nghệ nano đã tăng từ 7,5% vào năm 1995 lên 18,3% vào năm 2004 và trở thành nước đứng thứ hai trong việc đầu tư cho vấn đề này Các nước khác như như Ấn Độ, Hàn Quốc, Iran và Thái Lan cũng đang bắt kịp bằng cách tập trung vào các ứng dụng cụ thể cho sự phát triển và nhu cầu của từng nước đất Hiện nay, Iran có chương trình trọng điểm ứng dụng công nghệ nano trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm

1.4.2 Tiềm năng ứng dụng của nano

1.4.2.1 Khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của các hạt nano

Bạc và đồng là những kim loại từ lâu đã được biết đến với sự thể hiện độc tính mạnh, chống lại một loạt các vi sinh vật như vi khuẩn, virus, tảo và nấm Tuy nhiên, không giống với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể hiện tính độc với con người Do vậy, từ xa xưa các hợp chất cấu tạo từ bạc, đồng đã được sử dụng thường xuyên trong y học để điều trị bỏng và nhiễm trùng Sau khi

thuốc kháng sinh được phát minh và đưa vào ứng dụng với hiệu quả cao, người ta không còn quan tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc nữa Tuy nhiên, từ những năm gần đây, do hiện tượng các chủng vi sinh vật ngày càng trở nên kháng thuốc, người ta lại quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn và các ứng dụng khác của bạc, đặc biệt là dưới dạng hạt có kích thước nano Những tác dụng kháng khuẩn này đã được nhiều nhà nghiên cứu ghi nhận Các tiềm năng kháng khuẩn của kim loại này cho phép sử dụng chúng trong các sản phẩm liên quan đến chăm sóc sức khỏe con người Nghiên cứu cho thấy tác dụng kháng khuẩn mạnh mẽ của các hạt nano bạc trên cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-), chủ yếu là các chủng

đa kháng thuốc Nó cũng có thể được sử dụng như một tác nhân kháng nấm, và hoạt tính này đã được nghiên cứu khá cụ thể Các hạt nano, bao gồm nano bạc có thể có nhiều hình dạng khác nhau như hình cầu, que và hình khối [17] Các hạt nano bạc trải qua sự tương tác với vi khuẩn phụ thuộc vào hình dạng và trực tiếp ảnh hưởng đến hiệu quả kháng khuẩn [27]

Trong số các vật liệu kim loại chuyển tiếp, đồng là nguyên liệu quan trọng nhất Đặc biệt, hiệu quả ức chế nấm của nano Cu tốt hơn so với các hạt nano kim loại khác như Al, Fe, Mn, Ni, Zn, và các sản phẩm hạt Cu kích thước lớn hơn Đặc biệt, việc sử dụng các loại thuốc tổng quát với một lượng đồng lớn dẫn đến dư lượng đồng cao trong sản xuất cũng như trong đất và gây ô nhiễm nước Cu là nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự phát triển của cây trồng, tồn tại ở dạng Cu2+ và

Cu+ trong điều kiện sinh lý Nồng độ cần thiết cho sự phát triển bình thường của thực vật là 10-14 đến 10-16 M, thấp hơn nồng độ này sẽ xảy ra thiếu hụt Tuy nhiên nồng độ cao hơn so với nồng độ cần thiết lại sẽ ức chế quang hợp của cây trồng Nó hoạt động như một thành phần cấu trúc quy định sự tổng hợp protein, tham gia vận chuyển điện tử quang hợp, hô hấp của ty thể, chuyển hóa thành tế bào, tín hiệu của hormone, phản ứng oxy hóa, đồng là yếu tố cho nhiều phản ứng enzyme thực hiện bởi các enzyme như polyphenol oxidase, amino oxidase, plastocyanin, laccase, superoxide dismutase Ở cấp độ tế bào, nó đóng một vai trò quan trọng trong sự phosphoryl oxy hóa, và huy động sắt Sự thiếu hụt đồng trong thực vật được biểu

hiện như uốn cong cuống lá và úa nhẹ cùng với sự đi mất vĩnh viễn sức trương trong lá non [37] Tính chất kháng khuẩn của các hạt nano đồng đã được so sánh với triclosan và cả hai đều có tác dụng kháng khuẩn hiệu quả Đồng dạng nano ở nồng độ thấp có khả năng kháng khuẩn rất mạnh Cơ quan bảo vệ môi trường của

Mỹ đã công nhận nano đồng là chất kháng khuẩn để diệt các vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) Theo Durán [13] và Prabhu [32], giống như các hạt nano bạc, nano Cu cũng đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn phụ thuộc vào kích thước Vì vậy, để đạt được các hoạt tính kháng khuẩn tối đa, cần phải phát triển các phương pháp khác nhau nhằm tổng hợp các hạt nano Cu phân tán với kích thước nhỏ, tỷ lệ diện tích bề mặt/ thể tích lớn Kanhed và cộng sự (2014) đã thông báo khả năng của nano

đồng chống lại hàng loạt nấm gây bệnh ở cây trồng như Phoma destructiva,

Curvularia lunata, Alternaria alternata và Fusarium oxysporum [21] Ouda (2014)

đồng thời phát hiện nano đồng và nano đồng kết hợp với nano bạc có khả năng kìm

hãm và diệt hai loại nấm Uernaria alternata và Botrytis cinere gây bệnh trên nhiều

loại cây trồng khác nhau [26] Hơn nữa, việc sử dụng nano Cu giúp giảm lượng hóa

chất trong công tác phòng ngừa bệnh nấm Fusarium sp Đã có báo cáo chỉ ra ở nồng độ nano Cu 450 ppm đường kính của tản nấm Fusarium sp hầu như không

tăng và có thể ức chế 93,98% sự phát triển nấm sau 9 ngày ủ [44] Các nano Cu

cũng cho thấy hoạt tính kháng nấm đầy hứa hẹn đối với nấm gây bệnh thực vật F

oxysporum, C lunata, A alternata, và P destructiva Các hoạt động của nano Cu

đã được tìm thấy là tốt hơn so với các loại thuốc diệt nấm Bavistin thương mại chống lại tất cả 4 loại nấm gây bệnh thực vật Trong sự kết hợp của nano Cu với Bavistin, sự ức chế tăng không đáng kể và khi đó, chỉ sử dụng nano Cu đã đem lại hiệu quả để kiểm soát nấm gây bệnh cây trồng Như vậy, các nano Cu có thể được

sử dụng như một chất kháng nấm mới trong nông nghiệp để kiểm soát các loại nấm gây bệnh thực vật cũng như một chất khử trùng mạnh ở gia cầm và chăn nuôi [21]

Hoạt tính kháng khuẩn của các hạt nano có thể liên quan đến một số cơ chế Các hạt nano có thể tương tác trực tiếp với các tế bào vi sinh vật, ví dụ: làm gián đoạn quá trình vận chuyển điện tử qua màng, phá vỡ và thâm nhập vào thành tế bào,

hoặc oxy hóa các thành phần tế bào, hoặc sản xuất các sản phẩm thứ cấp (ví dụ: các các các gốc tự do oxy hóa (ROS) hoặc các ion kim loại nặng hòa tan gây thiệt hại) [23]

1.4.2.2 Lợi ích khi sử dụng các hạt nano trong kháng nấm, kháng khuẩn

Kích thước của các hạt nano kim loại đảm bảo rằng các hạt nano có diện tích tiếp xúc lớn đáng kể khi xử lý với nước thải chứa vi khuẩn Xem xét một tình huống giả định với các hạt hình cầu có kích thước đồng đều, giảm kích thước hạt từ ~10

μm xuống 10 nm sẽ tăng diện tích bề mặt tiếp xúc lên 109 lần Với bề mặt tiếp xúc lớn như vậy được dự kiến sẽ tăng cường mức độ loại bỏ vi khuẩn Theo Agnihotri

và cộng sự (2014), những hạt nano kích thước 10 nm sẽ tăng tác động kháng khuẩn

Do kích thước của chúng nhỏ nhất, hạt dễ dàng xâm nhập vào các vi sinh vật, gây ra hiệu ứng độc tính cao hơn so với những hạt lớn hơn [20] Khi sử dụng với nồng độ thấp hơn, các hạt có kích thước nano sẽ đủ khả năng để kiểm soát vi sinh vật Cách tiếp cận này có thể có hiệu quả hơn phương pháp điều trị hiện có, đặc biệt là đối với một số sinh vật ít nhạy cảm với kháng sinh vì khả năng chống lại sự thâm nhập tế bào [17] Tuy nhiên, kích thước không phải là mục đích chính khi lựa chọn các hạt nano có hoạt tính kháng khuẩn, mà đặc tính hóa lý của hạt nano là mối quan tâm lớn trong việc chế tạo các vật liệu diệt khuẩn [27]

Các hạt nano vô cơ có lợi thế khác biệt hơn hẳn các tác nhân kháng khuẩn hóa học thông thường Vấn đề quan trọng nhất gây ra bởi các tác nhân kháng khuẩn hóa học là kháng đa thuốc Các sản phẩm liên quan đến nano bạc nhấn mạnh thêm công bố về sức mạnh của nano bạc như: giết chết khoảng 650 loại vi khuẩn có hại trong một thời gian ngắn khoảng 30 phút, nhanh hơn so với các dạng khác của bạc

từ 2 ÷ 5 lần Gần đây, các hạt nano bạc được báo cáo là hợp chất kháng khuẩn mới

mà không phát triển vi khuẩn kháng thuốc Ion bạc rất dễ phản ứng, dẫn đến ức chế

hô hấp của vi sinh vật và sự trao đổi chất Hơn nữa, nó đã được đề xuất rằng các ion bạc xen vào DNA của vi khuẩn khi xâm nhập vào tế bào, ngăn chặn sự sinh sôi của các tác nhân gây bệnh [20]

1.4.2.3 Tiềm năng ứng dụng nano trong lĩnh vực bảo quản

Việc điều chỉnh polyme sử dụng cho các ứng dụng thực phẩm nhằm ngăn ngừa sự nhiễm vi sinh vật hoặc sự gia tăng hư hỏng thực phẩm do vi sinh vật đang được chú ý Một loại hợp chất thu hút sự quan tâm lớn trong lĩnh vực bao bì thực phẩm là các hạt nano kim loại, chẳng hạn như đồng, kẽm, titan, magiê, vàng và bạc Những vật liệu polyme được bổ sung các hạt nano và có thể thay đổi các hạt nano

để làm cho chúng hoạt động hơn do đó tạo ra các vật liệu mới phù hợp có khả năng ứng dụng trong bảo quản và bao gói, nhằm kéo dài thời hạn sử dụng của các mặt hàng thực phẩm Trong số các hạt nano có sẵn, các hạt nano bạc đã thu hút được sự quan tâm đáng kể do hiệu quả của chúng đối với một loạt các vi sinh vật Vì lý do này bạc đã được sử dụng như là một chất phụ gia hoặc lớp phủ trên các polyme khác nhau để kháng khuẩn Các ion kim loại như bạc, bạc zeolite, đồng và vàng, được chấp thuận làm phụ gia trong polyme thực phẩm, đặc biệt là ở Mỹ và Nhật Bản [12]

Bao bì kháng khuẩn là một hình thức đầy hứa hẹn của vật liệu đóng gói thực phẩm hoạt hóa ngăn ngừa nhiễm khuẩn trong thực phẩm [12] Việc kết hợp vật liệu nano cho bao bì thực phẩm được đẩy mạnh trong thập kỷ vừa qua, có thể được chia thành hai hình thức chính:

+ Bao bì cải thiện, cho phép vật liệu nano được trộn vào mạng lưới polymer để cải thiện các đặc tính rào cản khí như polymer hoặc lớp nanocomposites

+ "Bao bì hoạt hóa", trong đó hạt nano có đặc tính kháng khuẩn mạnh tương tác trực tiếp với thực phẩm hoặc môi trường để bảo vệ thức ăn tốt hơn Nano kim loại nổi bật đang thu hút sự nghiên cứu về tính chất diệt khuẩn là Cu, Zn, Au, Ti,

và Ag Nano kim loại có thể được gắn vào các mạng lưới khác nhau như polyme

và chất ổn định (citrate và rượu chuỗi dài) thông qua các phương thức sản xuất khác nhau như được phủ, hấp phụ hoặc kết hợp trực tiếp trong quá trình tổng hợp [6] Các vật liệu có mặt nano bạc kết hợp vào vật liệu đóng gói đã có thể kiểm soát vi sinh vật tạp nhiễm bằng cách giảm tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật Vì bạc kháng khuẩn có thể được giải phóng dần khỏi bao bì trong một thời

gian dài, hoạt động này cũng có thể được kéo dài sang giai đoạn vận chuyển và lưu trữ phân phối thực phẩm [12].

Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để kết hợp các hạt nano bạc thành các vật liệu đóng gói có thể chấp nhận được như giấy lọc, polyethylene mật độ thấp và polymethyl methacrylate Ngoài ra, nhiều vật liệu phân hủy sinh học, ví dụ: polysaccharide (như tinh bột, chitosan, alginate, và konjak glucomannan) đã được

sử dụng để chế tạo hỗn hợp dựa trên màng nano bạc Ví dụ, zeolit bạc đã được phát triển như là chất kháng khuẩn phổ biến nhất được kết hợp thành nhựa và được phép

sử dụng trong bảo quản thực phẩm, thanh trùng các sản phẩm Zeolit có một số nguyên tử bề mặt được thay thế bằng các nguyên tử bạc được ép thành lớp mỏng (3

÷ 6 mm) trên bề mặt của các polyme bao bì tiếp xúc với thực phẩm, liên tục giải phóng các ion bạc khi các hạt nano bạc tiếp xúc với dung dịch nước từ thức ăn [45]

Một số bằng chứng đã chứng minh sự an toàn của việc áp dụng các vật liệu bạc Có rất ít báo cáo trong các tài liệu về độc tính bạc mặc dù phơi nhiễm lớn với bạc trong điều trị vết thương bỏng Tính không độc hại của dung dịch nano bạc đặc biệt là trong trường hợp các hạt nano nhỏ hơn đã được chứng minh qua xét nghiệm kích thích da thực hiện trên thỏ Hendi và cộng sự báo cáo rằng các hạt nano bạc có thể thúc đẩy chữa lành vết thương và giảm sự xuất hiện vết sẹo theo các mức độ phụ thuộc vào liều Hơn nữa, kết quả thí nghiệm cho thấy các hạt nano bạc hoạt động bằng cách giảm viêm, và không có tác dụng phụ trên chức năng gan và thận thông qua mô hình thí nghiệm trên chuột [45]

Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu đã khuyến cáo nồng độ giới hạn của nano Ag giải phóng từ bao bì không được vượt quá 0,05 mg/L trong nước và 0,05 mg/kg trong thực phẩm [6] Các sản phẩm của nano bạc đã được chứng minh có thể được sử dụng như một lớp phủ bề màng trên các loại rau dễ hư hỏng để tăng cường

sự kháng khuẩn và tăng thời hạn sử dụng thực phẩm [43]

1.4.3 Tình hình nghiên cứu nano trong nước

Ở nước ta, công nghệ nano đã được triển khai nghiên cứu và ứng dụng từ hơn 2 thập kỷ trước, tuy nhiên chủ yếu nhằm phục vụ cho các nghiên cứu vật lý và

nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano trong một số lĩnh vực như môi trường, y học, sinh học, điện tử v.v Đến nay mới chỉ có rất ít công ty cho lưu hành một vài sản phẩm nano như Nano bạc N200 Pro phòng trị bệnh cho cây trồng của Công ty Cổ phần Đầu tư và Phát triển Bắc Sơn Công ty Tratipha cũng đã cung cấp ra thị trường sản phẩm Nano bạc phục vụ sản xuất nông nghiệp từ tháng 6/2013 với khuyến cáo

sử dụng cho nhiều loại cây trồng khác nhau, dùng để xử lý đất, xử lý cho hoa, cây cảnh, cây lương thực, cây rau các loại và cây công nghiệp, ngoài ra nano bạc còn khuyến cáo dùng trong phòng và trị các bệnh hại do vi khuẩn

CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Hóa chất

Glucose, cao thịt (Merk, Đức) Cao nấm men (Merk, Đức) và các hoá chất thông dụng khác (Trung Quốc)

Môi trường Hansen (g/l): glucose: 50; trypton: 10; KH2PO4: 2, MgSO4.7H2O: 2; agar: 20; pH 6,0

Môi trường Czapeck (g/l): NaNO3: 3,5; K2HPO4: 1,5; MgSO4.7H2O: 0,5; FeSO4: 0,01; Saccharose: 30; agar: 20; pH 6,0

Môi trường PDA (g/l): nước chiết khoai tây: 200; dextrose: 20; agar: 20; pH 6,0

Bộ kit tinh sạch phẩm PCR, Invitrogen, Mỹ Các đoạn mồi khuếch đại gen ITS1 và ITS4 do Invitrogen (Hồng Kông) cung cấp

Dung dịch TAE 50X (g/l): Trisbase - 24,2%; glacial axetic axit - 57,1ml; EDTA 0,5M - 100ml

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Cam bị bệnh được thu thập tại các vườn trồng tại Tuyên Quang Các triệu chứng bệnh đã biểu hiện rõ ràng và có thể nhận thấy bằng mắt thường

Vật liệu nano Ag và Cu nhận từ Viện Công nghệ môi trường, có các đặc điểm được mô tả trong Bảng 2:

Bảng 2 Tính chất của các nano Ag và Cu sử dụng trong nghiên cứu

AgH Hình cầu H2O2 30% + nano Ag với tỷ lệ 1:1

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập nấm từ cam bệnh

Chọn ngẫu nhiên 10 quả nhiễm nấm Các trái cây này được rửa sach bằng nước, khử trùng bề mặt bằng natri hypochlorite (NaClO) 0,5% trong 2 ÷ 5 phút Mẫu vỏ quả được cắt bằng dụng cụ tiệt trùng từ ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh (3 ÷ 5 mm) và đặt trên môi trường phân lập PDA ủ ở 25 ± 1oC trong 5 ngày Các dòng nấm phân lập được làm sạch và giữ trên môi trường PDA để nghiên cứu sâu hơn [48]

2.3.2 Xác định đặc điểm nuôi cấy và phân loại nấm dựa trên phân tích trình tự gen ITS

Xác định đặc điểm sinh học của nấm Penicillium [14, 16, 30] và

Colletotrichum [46] thông qua sự phát triển của sợi nấm, hình dạng khuẩn lạc nấm,

đặc điểm cơ quan sinh sản và bào tử phân sinh

DNA tổng số nấm được tách chiết dựa trên phương pháp tách chiết theo phương pháp của Sambrook [36] Vùng gen ITS-rDNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ DNA tổng số, sử dụng cặp mồi ITS1 (5‟-TCC GTA GGTGAA CCT GCG G-3‟) và ITS4 (5‟-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3‟) theo Ni và cộng

sự [25]

Tính nhạy cảm của nấm ở giai đoạn bào tử đối với nano được xác định theo MIC (Minimum Inhibitory Concentration) và MFC (Minimum Fungal Concentration) Trong đó, MIC là nồng độ ức chế tối thiểu, và MFC là nồng độ tối thiểu diệt nấm Sử dụng phương pháp pha loãng ½ để thu được các nồng độ nano khảo sát, với mật độ bào tử nấm nghiên cứu là 106 CFU/ml Sau 72 giờ nuôi lắc ở 25ᵒ C, quan sát sự phát triển của vi sinh vật Nồng độ nano thấp nhất không phát hiện bằng mắt thường sự phát triển của nấm được xác định là MIC Hút 100 μl từ các thí nghiệm có nồng độ nano ≥ MIC để trang đĩa và ủ ở 25ᵒ C MFC được định nghĩa là nồng độ thấp nhất có <3 khuẩn lạc nấm xuất hiện [4]

2.3.4 Khảo sát khả năng ức chế của nano kim loại đối với nấm ở giai đoạn sinh

dưỡng

Hoạt động của nano kim loại kháng nấm ở giai đoạn sinh dưỡng được đánh giá trên đĩa thạch Petri Môi trường đĩa thạch PDA được bổ sung nano kim loại ở các nồng độ khác nhau:

Tỷ lệ ức chế (%) = x 100

Trong đó R: đường kính khuẩn lạc nấm trên đĩa đối chứng và r là đường kính khuẩn lạc nấm trên đĩa thí nghiệm [22]

2.3.5 Xác định tác dụng của nano kim loại ở các nồng độ khác nhau lên nấm

gây bệnh trên cam

Thí nghiệm bố trí gồm 6 công thức với các nồng độ nano kim loại Mỗi công thức lặp 3 quả

Quy trình xâm nhiễm cam: Rửa nước sạch → Khô bề mặt → Tạo vết thương

trên bề mặt quả → Nhiễm nấm bệnh với mật độ nghiên cứu 106 bào tử nấm → Nhúng vào dung dịch nano kim loại → Khô bề mặt → Đóng thùng carton → Lưu trữ ở 25oC

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh theo thời gian

Tỷ lệ bệnh (%) =

Số quả bị bệnh

x 100 Tổng số quả thí nghiệm

2.3.6 Đánh giá chất lượng của quả cam bảo quản sau xử lý nano ở quy mô

phòng thí nghiệm

Quy trình xử lí cam: Cắt tỉa cuống → Rửa nước sạch → Khô bề mặt → Bọc

màng có bổ sung nano kim loại → Khô bề mặt → Đóng thùng carton → Bảo quản

lệ thối hỏng (%), tỷ lệ hao hụt khối lượng (%), tỷ lệ mốc cuống (%), hàm lượng vitamin C (mg/100g)

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập nấm Penicilium và Colletotrichum gây bệnh trên cam Hàm Yên

-Tuyên Quang

3.1.1 Phân lập nấm Penicillium

Trên các mẫu quả cam thu thập tại Tuyên Quang, triệu chứng ban đầu của nấm mốc xanh là sự xuất hiện của những vết mềm từ 1 ÷ 2 cm và bị mất màu Vết bệnh nhanh chóng lan rộng tỏa tròn, có đường kính 3 ÷ 5 cm sau 1 đến 2 ngày Khi

hệ sợi nấm trên bề mặt quả đạt kích thước 2 ÷ 3 cm, bắt đầu xuất hiện các bào tử màu xanh Các ngày tiếp theo, toàn bộ bề mặt trái cây nhanh chóng được bao phủ bởi các bào tử màu xanh lá (Hình 2a)

Từ mẫu quả bệnh điển hình, đã phân lập và thuần khiết được chủng nấm N11 Khuẩn lạc nấm N11 phát triển trên môi trường Czapek khá nhanh, đường kính đạt 4 ÷ 5 cm/ 7 ngày ở nhiệt độ 24 ÷ 26°C Mặt khuẩn lạc bằng phẳng, dạng nhung, vùng mép dị thường Hệ sợi nấm thường mờ, thành mỏng, ráp nhẹ Mặt trái màu vàng nhạt đến nâu, không sinh giọt tiết và sắc tố (Hình 2c)

Cơ quan sinh bào tử được sinh ra từ bề mặt hoặc từ hệ sợi khí sinh Dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần, quan sát được cuống kích thước 70,0 ÷ 150,0 x 5,0 ÷ 7,0 μm, với thành mỏng và nhẵn, mang các chổi khi phát triển tốt nhất là ba vòng thể bình, nhưng thường là hai vòng hoặc dị thường Nhánh 20,0

÷ 30,0 x 5,0 ÷ 6,0 μm, nhẵn; metulae thường có 2 ÷ 3 cái, kích thước 15,0 ÷ 25,0 x 5,0 ÷ 6,0 μm; thể bình trên một vòng thường 3 ÷ 5 cái, hình trụ tròn đầu, kích thước 10,0 ÷ 20,0 x 4,0 ÷ 5,0 μm; bào tử trần hình elip đến trụ tròn, 6,0 ÷ 15,0 x 2,5 ÷ 6,0

μm, nhẵn, tạo thành chuỗi dài đặc trưng cho các đặc điểm của nấm Penicillium

digitatum (Hình 2d)

Dựa trên các triệu chứng, mô tả hình thái học của nấm, chủng N11 được xác

định là P digitatum