Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể nấm magnaporthe oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa ở miền bắc và miền trung việt nam bằng chỉ thị SSR

Kết quả của nghiên cứu sẽ cung cấp mức độ đa dạng di truyền của quần thể tác nhân gây bệnh, qua đó là cơ sở cho việc xây dựng chương trình chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn hiệu quả v

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HÀ THỊ LOAN

ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM

MAGNAPORTHE ORYZAE GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA Ở MIỀN BẮC

VÀ MIỀN TRUNG VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ SSR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HÀ THỊ LOAN

ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM

MAGNAPORTHE ORYZAE GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA Ở MIỀN BẮC

VÀ MIỀN TRUNG VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ SSR

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS HOÀNG THỊ GIANG

2 TS LÊ QUỲNH MAI

HÀ NỘI - 2018

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan tất cả những số liệu, thông tin và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực, khách quan, chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học

vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2018

Tác giả luận văn

Hà Thị Loan

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các cán bộ tại Phòng thí nghiệm liên kết quốc tế Nghiên cứu chức năng gen, công nghệ sinh học thực vật và sự tương tác với vi sinh vật(LMI RICE-2), Viện Di truyền Nông nghiệp

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị Giang, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và dành nhiều thời gian giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm LMI RICE-2 - Viện Di truyền Nông nghiệp để hoàn thành luận văn

Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Lê Quỳnh Mai, giảng viên Bộ mônHóa sinh và Sinh học phân tử của trường Đại học Khoa học tự nhiên

Hà Nội Cô đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và sự giúp đỡ quý báu trong suốt quá trình tôi học tập tại trường

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sâu sắc ThSLê Thị Liễu - nghiên cứu viên tại Viện di truyền Nông nghiệp đã chỉ dẫn tận tình cho tôi từ những bước đi cơ bản trong nghiên cứu tại Viện Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới cô Elisabeth Fournier và bác Henri Adreit – hai chuyên gia từ Pháp đã hỗ trợ nhóm nghiên cứu

về kĩ thuậtchuyên môn sâu trong nghiên cứu quần thểsuốt quá trình thực hiện đề tài này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới tất cả các nghiên cứu viên, kĩ thuật viên, đồng nghiệp tại Phòng thí nghiệm Việt Pháp LMI RICE-2 - Viện Di truyền Nông nghiệp

và gia đình đã luôn ủng hộ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2018

Học viên

Hà Thị Loan

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh đạo ôn hại lúa do nấm M oryzae gây ra 3

1.1.1 Giới thiệu về nấm M oryzae gây bệnh đạo ôn 3

1.1.2 Triệu chứng, điều kiện phát sinh và phát triển bệnh 5

1.1.3 Cơ chế tương tác giữa nấm M oryzae và cây lúa 6

1.1.4 Tình hình bệnh đạo ôn hại lúa ở Việt Nam và trên thế giới 7

1.2 Các kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm M oryzae 9

1.2.1 Những nghiên cứu trong nước 9

1.2.2 Những nghiên cứu ở nước ngoài 11

1.3 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn 14

1.3.1 Chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn bằng chỉ thị phân tử 14

1.3.2 Sử dụng QTL trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu nghiên cứu 18

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

2.3 Nội dung nghiên cứu 18

2.4 Các phương pháp được nghiên cứu 18

2.4.1 Thu thập mẫu bệnh và phân lập chủng nấm đạo ôn gây bệnh trên lúa tại một số tỉnh miền Bắc và miền Trung 18

2.4.1.1 Phương pháp thu thập mẫu bệnh 18

2.4.1.2 Phương pháp phân lập mẫu bệnh 19

2.4.2 Đánh giá đa dạng di truyền các dòng nấm đạo ôn bằng chỉ thị SSR 20

iv

2.4.2.2 Phương pháp PCR 21

2.4.2.3 Phương pháp điện di 24

2.4.3 Phân tích kết quả 25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả thu thập mẫu bệnh và phân lập nấm đạo ôn M oryzaegây bệnh trên lúa 26

3.1.1 Kết quả thu thập mẫu lúa bị bệnh đạo ôn 26

3 1.2 Kết quả phân lập nấm đạo ôn M oryzae gây bệnh trên lúa 30

3.2 Kết quả tách chiếtDNA và kiểm định các chủng nấm đạo ônM oryzae đã phân lập bằng chỉ thị phân tử 32

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA của các chủng phân lập 32

3.2.2 Kết quả kiểm định các chủng phân lập bằng chỉ thị phân tử 34

3.3 Kết quả giải trình tự và xây dựng cây phân loại di truyền quần thể nấm Magnaporthe oryzae 35

3.3.1 Kết quả giải trình tự sản phẩm phản ứng PCR với SSR 35

3.3.2 Cây phân loại di truyền và mức độ đa dạng di truyền của quần thể nấm Magnaporthe oryzae 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

Kết luận 47

Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần môi trường bột gạo……… 20

Bảng 2.2 Thành phần môi trường lỏng để nuôi nấm tách DNA 20

Bảng 2.3 Danh sách các cặp mồi SSR được sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 2.4 Thành phần của một phản ứng PCR 5 µl 24

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu bệnh được thu thập trong nghiên cứu 27

Bảng 3.2 Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR (bp) với 11 cặp mồi SSR của 58 chủng nấm 36

Bảng 3.3 Số locus đa hình thu được từ 58 chủng nấm đạo ôn phân tích với 11 chỉ thị SSR 39

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vòng đời của nấm đạo ôn Magnaporthe oryzae 4

Hình 1.2 Triệu chứng vết bệnh đạo ôn trên cây lúa 5

Hình 3.1 Quá trình thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng 30

Hình 3.2 Quá trình nuôi cấy mẫu bệnh cho hình thành bào tử nấm 31

Hình 3.3 Quá trình phân lập bào tử đơn và nuôi cấy 32

Hình 3.4 Kết quả điện di DNA tổng số của một số chủng nấm đạo ôn 33

Hình 3.5 Kết quả PCR một số chủng phân lập bằng cặp mồi ITS5/ITS4 34

Hình 3.6 Cây phân loại di truyền theo tên chủng của 57 chủng nấm đạo ôn nghiên cứu 45

Hình 3.7 Cây phân loại theo tên giống lúa ký chủ của 57 chủng nấm đạo ôn nghiên cứu 45

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Thuật ngữ tiếng anh

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

Arv

BGPI

Avirulence Biologie et Génétique des Interactions Plante-Parasite CIRAD The French Agricultural Reseach Centre for international

Development ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

DNA Deoxyribonucleic acid

ETI Effector triggered immunity

MAS Marker assisted selection

PAMP Pathogen associated molecular pattern

PCR Polymerase Chain Reaction

PTI PAMP - Triggered immunity

QTL Quantitative trait locus

SSR Simple Sequence RepeateshayMicrosatellite

ITS Internal Transcribed Spacer

Để phòng trừ bệnh đạo ôn, biện pháp chính được áp dụng hiện nay là sử dụng thuốc hóa học, tuy nhiên biện pháp này chưa thực sự mang lại hiệu quả khi bùng phát dịch bệnh.Hơn nữa còn gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng tới sức khỏe con người và tăng khả năng kháng thuốc của nấm bệnh Phát triển các giống lúa kháng bệnh được coi là định hướng an toàn và hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh đạo

ôn trên lúa Các gen kháng (R) được đưa vào giống lúa có năng suất cao nhưng dễ

bị nhiễm bệnh bằng phương pháp lai tạo Tuy nhiên, hầu hết các giống kháng chỉ có hiệu lực trong vòng 2-3 năm do nấm hình thành những chủng gây bệnh mới có độc tính cao [12, 30] Nguyên nhân được xác định là do các tác nhân gây bệnh tiến hóa nhanh chóng và làm vô hiệu hóa các gen kháng ở thực vật[37, 57] Muốn chọn tạo giống có tính kháng bền vững cần phải liên hệ chặt chẽ với nghiên cứu về đặc tính

di truyền của quần thể tác nhân gây bệnh Chính vì vậy, việc hiểu biết về mức độ đa

dạng di truyền và sự tiến hóa của quần thể nấm M oryzae trong một vùng sinh thái

cụ thể rất cần thiết cho chương trình chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn hiệu quả và

bền vững Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá sự đa

dạng di truyền của quần thể nấm Magnaporthe oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa

ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam bằng chỉ thị SSR”

Kết quả của nghiên cứu sẽ cung cấp mức độ đa dạng di truyền của quần thể tác nhân gây bệnh, qua đó là cơ sở cho việc xây dựng chương trình chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn hiệu quả và bền vững Đề tài góp phần chuẩn hóa và hoàn thiện

2

quy trình kỹ thuật về nghiên cứu quần thể nấm bệnh đạo ôn ở Việt Nam Kết quả của đề tài sẽ góp phần định hướng để phát triển chiến lược kiểm soát bệnh đạo ôn lúa hiệu quả hơn

3

Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh đạo ôn hại lúa do nấm M oryzae gây ra

1.1.1 Giới thiệu về nấm M.oryzae gây bệnh đạo ôn

Lúa (Oryzae sativa L.) là cây trồng đóng vai trò quan trọng trong nền an ninh

lương thực toàn cầu Tuy nhiên, sản xuất lúa gạo luôn bị đe dọa bởi các dịch bệnh

nguy hiểm, trong đó có bệnh đạo ôn do nấm M oryzae gây ra Ở Việt Nam, bệnh

đạo ôn là một trong những bệnh gây hại chính và ngày càng trở nên nghiêm trọng đối với nền nông nghiệp sản xuất lúa gạo, làm giảm tới 20% tổng sản lượng lúa gạo hàng năm [40] Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Italia năm 1560, sau đó là ở Trung Quốc năm 1637, Nhật Bản năm 1760, Mỹ năm 1906, Ấn Độ năm 1913… Ở Việt Nam, bệnh được Vincens phát hiện vào năm 1921 ở Nam Bộ, năm 1951 Rogen đã xác định

sự xuất hiện và gây hại của bệnh ở vùng Bắc Bộ [9]

Nấm M Oryzae ngoài tấn công cây lúa, còn tấn công các loại cây trồng khác hoặc cỏ dại thuộc họ hòa thảo Poaceae: nấm M oryzae là loài đa kí chủ, bao gồm

nhiều phân dòng (lineage) đặc hiệu loài kí chủ và phân rẽ di truyền [15, 17, 55] Nấm có thể gây nhiễm trên lá, thân, nốt thân và cổ bông bằng các công cụ xâm nhiễm như bào tử, giác bám và cọc xâm nhiễm để tấn công tế bào của cây lúa nhằm lấy chất dinh dưỡng cho sự tồn tại và phát triển của chúng [23]

Nấm M oryzae thường sinh ra các cụm cành từ 3-5 bào tử Bào tử phân sinh

hình quả lê hoặc hình nụ sen phía dưới phình to, phía trên hơi nhọn, thường có 2-3 vách ngăn ngang, bào tử không màu kích thước trung bình của bào tử nấm 19-23 x

10-12 µm [4, 8] Cơ quan sinh trưởng của nấm M oryzae là sợi nấm không màu đa

bào, phân nhiều nhánh, sống kí sinh trong mô thực vật Cành bào tử phân sinh hình trụ, đa bào không phân nhánh, đầu cành thon và hơi gấp khúc, thường mọc thành chùm ở khí khổng, có 2-4 vách ngăn ngang, mang một hay nhiều bào tử phân sinh (1-20 bào tử) Cành bào tử phân sinh là cơ quan sinh ra bào tử vô tính tạo thành một lớp mốc mịn màu xám trên bề mặt vết bệnh ở lá, ở cổ bông và đốt thân.[1]

4

Vòng đời của nấm đạo ôn được thể hiện trong Hình 1.1 Nấm đạo ôn bắt đầu chu kì xâm nhiễm khi bào tử đơn tiếp xúc với bề mặt của cây chủ Bào tử đơn gắn vào phần kị nước của lớp biểu bì và nảy mầm, tạo ra một ống mầm nhỏ, phần này sau đó sẽ tạo thành móc trước khi phân tách thành giác bám Quá trình xâm nhập bắt đầu xảy ra khi giác bám trưởng thành tạo thành một cái “chốt” trương phồng lên tạo ra áp suất giúp nó có khả năng đâm xuyên qua bề mặt vật chủ Sự tổn thương xảy ra trong khoảng 72 đến 96 giờ sau khi xâm nhiễm và sự hình thành bào tử xảy

ra trong điều kiện ẩm, có sương [45]

Hình 1.1Vòng đời của nấm đạo ôn Magnaporthe oryzae [45]

Đến nay, bộ gen của nấm đạo ôn M oryzae đã được giải trình tự đầy đủ do

nhóm nghiên cứu của [19], có 11.109 gen được dự đoán với kích thước khoảng 3,5

kb cho mỗi gen trong hệ genome của nấm M oryzae Các nghiên cứu trước đây cho thấy nấm đạo ôn M oryzae có mức độ đa dạng di truyền cao và khả năng tiến hóa nhanh chóng trong tự nhiên M oryzae có thể thích nghi với các gen kháng mới và

áp lực chọn lọc trong vòng vài năm sau khi bùng phát [18, 24] Sự thích nghi của nấm thường liên quan đến các đột biến và tái tổ hợp di truyền thúc đẩy quá trình tiến hóa trong quần thể nấm đạo ôn và làm vô hiệu hóa các gen kháng của thực vật [37, 57]

Hình 1.2.Triệu chứng vết bệnh đạo ôn trên cây lúa

A: đạo ôn trên lá, B: đạo ôn cổ lá, C: đạo ôn cổ bông, D: đạo ôn trên hạt

+ Trên lá: Lúc đầu vết bệnh chỉ nhỏ như đầu mũi kim, màu xám xanh, sau chuyển sang màu nâu, rồi lan rộng dần ra thành hình thoi, xung quanh màu nâu đậm, giữa màu xám trắng Nếu nặng, nhiều vết liên kết lại với nhau tạo thành mảng lớn, có thể làm lá bị khô cháy, cây lúa lụi tàn, gây thất thu năng suất nghiêm trọng

+ Trên cổ lá: Vết bệnh hình khum theo chiều cong giữa cổ lá và phiến lá, từ

cổ lá vết bệnh sẽ lan ra bẹ lá và phiến lá làm cho lá lúa bị khô lụi và gãy gục Nấm sản sinh ra các bào tử ngay trên các tổn thương này

+ Trên cổ bông và bông: Gây thiệt hại nghiêm trọng nhất, trên cổ bông và gié lúa ban đầu xuất hiện các đốm nhỏ sau lan ra theo chiều dài làm cả đoạn cổ bông có màu nâu xám, khô tóp Làm cho bông nhỏ, có nhiều hạt lép lửng, dễ gãy, gié dễ gãy rụng làm giảm năng suất, giảm chất lượng hạt gạo

+ Trên hạt: Các vết bệnh không đặc trưng về hình dạng, màu nâu đen hoặc xám Nấm có thể kí sinh cả ở vỏ trấu và bên trong hạt, làm hạt lúa bị lép, nếu bị

6

bệnh sớm, hạt lúa có thể bị lép hoàn toàn Hạt giống bị bệnh là nguồn truyền bệnh sang vụ khác

Điều kiện phát sinh và phát triển bệnh

Nấm đạo ôn sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 25-28oC và độ ẩm không khí là 93% trở lên, bào tử nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 24-28oC, và có giọt nước Ở điều kiện thời tiết âm u trong vụ lúa đông xuân, độ ẩm không khí bão hoà thuận lợi nhất cho nấm bệnh phát sinh, dễ xâm nhập vào cây Ngoài ra, với biên độ nhiệt ngày và đêm chênh lệch nhau cũng làm gia tăng sự phát triển nấm bệnh.Một số nguyên nhân khác có thể từ giống lúa, đặc tính của giống lúa nhiễm bệnh (giống mẫn cảm) cũng

là điều kiện cho bệnh phát sinh và dễ dàng lây lan trên diện rộng làm bùng phát dịch bệnh [8]

1.1.3 Cơ chế tương tác giữa nấm M.oryzae và cây lúa

Bệnh đạo ôn do nấm M oryzae gây ra là một ví dụ điển hình về loại tác nhân

gây bệnh có khả năng tiến hóa nhanh, là sinh vật mô hình được quan tâm nghiên cứu trong bệnh lý thực vật [2, 52]

Nghiên cứu di truyền ở mức độ phân tử về bệnh ở thực vật, theo các nghiên cứu của [21, 22, 36] cho thấy hệ thống miễn dịch bẩm sinh của thực vật có hai lớp Lớp đầu tiên được điều chỉnh bởi các thụ thể ngoại bào, màng tế bào hoặc các thụ thể nhận dạng mẫu (pattern recognition receptors: PRRs) Khi tác nhân gây bệnh thâm nhập vào thành tế bào, các thụ thể ngoại bào sẽ nhận ra các mẫu phân tử của mầm bệnh (PAMPs: pathogen-associated molecular patterns) PRRs kích hoạt phản ứng miễn dịch yếu gọi là PTI (PAMP - Triggered immunity) làm ức chế sự xâm nhiễm của mầm bệnh Tuy nhiên, tác nhân gây bệnh đã phát triển các effector (chất hiệu ứng) nhằm né tránh và ngăn chặn các PTI Do vậy, thực vật tiếp tục khởi động phản ứng miễn dịch thứ hai được kích hoạt bởi tác nhân (ETI -Effector-triggered immunity) Khi đó, các protein của gen kháng bệnh (R) là các thụ thể (receptor) trong tế bào ở cây sẽ kích hoạt ETI và sẽ ngăn chặn sự xâm nhiễm của mầm bệnh Phản ứng miễn dịch loại này diễn ra nhanh chóng, gây đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, thường được gắn kết với phản ứng siêu nhạy cảm (hypersensitive reaction: HR) [21,

7

22, 36] Ở nấm đạo ôn Magnaporthe oryzae, đến nay đã có 15 loại tác nhân gây

bệnh đã được xác định, bao gồm 9 tác nhân Avr (PWL1, PWL2, AvrPi-ta, AvrPiz-t, Avr-Pia, AvrPii, Avr-Pik/km/kp, Avr1-CO39, and ACE1) và 6 tác nhân mới được xác định là các protein: BAS1, BAS2, BAS3, BAS4, Slp1 và MC69 [35] Theo [54], ở lúa đã có hơn 100 gen kháng đạo ôn R được xác định, trong đó có 35 gen đã được nhân dòng

Sự tương tác giữa gen R của cây và gen Avr của tác nhân gây bệnh rất đặc hiệu nên một chủng gây bệnh cụ thể (mang gen Avr cụ thể) có thể lây nhiễm bệnh cho một tập hợp các giống cây trồng (không mang gen kháng R tương ứng) [43] Đây là mối tương tác gen-đối-gen, cụ thể các gen kháng R của cây mã hóa cho receptor giúp nhận diện các phân tử tác nhân effectordo các gen Avr mã hóa được tạo ra từ tác nhân gây bệnh Khi đó làm khởi động phản ứng phòng thủ ở cây ký chủ, giúp ngăn chặn sự tấn công của tác nhân gây bệnh Tuy nhiên, các gen Avr của tác nhân gây bệnh có thể biến đổi để né tránh sự kiểm soát của các gen R thông qua

sự đột biến hoặc tái tổ hợp loại bỏ các gen Avr tương ứng Bên cạnh đó, cây cũng

có thể đáp ứng với tác nhân gây bệnh bằng cách thay đổi gen kháng R nhằm nhận diện được các gen Avr mới Do vậy, sự đồng tiến hóa của gen kháng R và gen gây bệnh luôn tiếp diễn trong tự nhiên [26]

1.1.4.Tình hình bệnh đạo ôn hại lúa ở Việt Nam và trên thế giới

Tình hình bệnh đạo ôn hại lúa ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh đạo ôn đã xuất hiện ở cả ba miền: Bắc, Trung, Nam Do điều kiện khí hậu thời tiết nước ta nóng ẩm mưa nhiều tạo điều kiện thuận lợi cho nấm đạo ôn phát triển Và kết hợp thêm việc lạm dụng thuốc hóa học trong công tác phòng trừ càng làm cho dịch bệnh thêm nghiêm trọng, khó kiểm soát

Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, vụ đông xuân 2003-2004 tổng diện tích lúa bị nhiễm đạo ôn ở miền Bắc là 202.998 ha, trong đó diện tích bị nhiễm đạo

ôn lá là 178.147 ha (diện tích bị nặng là 4.348 ha), diện tích bị nhiễm đạo ôn cổ bông

là 24.752 ha Hầu hết các giống phổ biến trong sản xuất đều bị nhiễm đạo ôn với mức

độ khác nhau: Khang dân18, Q5, Bắc thơm, VN10, DT10, DT11 v.v Đồng bằng sông

8

Cửu Long (ĐBSCL) là vùng trồng lúa lớn nhất Việt Nam, khi bị nhiễm bệnh đạo ôn thiệt hại cho năng suất lúa ước tính giảm tới 20% Một vài năm trở lại đây, trước những biến đổi bất lợi của điều kiện ngoại cảnh bệnh đạo ôn có nguy cơ bùng phát trên diện rộng và có thể phát triển thành dịch nếu không được phát hiện kịp thời, hầu hết các giống chất lượng đang trồng phổ biến (OM149, OMCS2000) đều bị nhiễm đạo ôn với các mức độ khác nhau Trong vụ đông xuân 2005-2006, bệnh gây thiệt hại lớn ở hầu hết các địa phương (An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ) trên giống lúa OM1490, thiệt hại cho năng suất ước tính giảm từ 20-80%[7] Trong những năm gần đây, bệnh đạo ôn thường xuất hiện gây hại lúa ở nước ta Năm 2011, diện tích nhiễm bệnh đạo ôn lá

là 243.803ha trong đó diện tích nhiễm nặng là 5234ha, diện tích nhiễm bệnh đạo ôn

cổ bông là 51681ha trong đó diện tích nhiễm nặng là 653ha Vụ xuân 2012, diện tích nhiễm bệnh đạo ôn lá là 133.459,62ha trong đó diện tích nhiễm nặng là 5.218,4

ha, diện tích nhiễm bệnh đạo ôn cổ bông là 32.584,5ha trong diện tích nhiễm nặng

là 746,4ha (Cục Bảo vệ thực vật, 2011)

Như vậy, bệnh đạo ôn thường xuyên xảy ra với mức độ gây hại ngày càng nặng, trên nhiều vùng trồng lúa khắp cả nước Đặc biệt ở những nơi diễn biến thời tiết phức tạp, thuận lợi cho bệnh đạo ôn phát sinh, phát triển, gây hại và lây lan trên diện rộng Ở hầu hết các giống thương mại, các giống có năng suất và chất lượng

gạo ngon đều bị nhiễm bệnh với mức độ thiệt hại khác nhau

Tình hình bệnh đạo ôn hại lúa trên thế giới

Trong các stress sinh học, bệnh đạo ôn trên lúa do nấm M oryzae gây ra là

một trong những mối đe dọa nghiêm trọng nhất đối với nền an ninh lương thực thế giới Theo ước tính đến năm 2030, sản xuất lúa gạo phải tăng sản lượng hơn 40% để đáp ứng nhu cầu của dân số toàn cầu [27] Theo ước tính, với sản lượng lúa gạo bị thiệt hại do nấm đạo ôn gây ra (10-30%) có thể đủ để nuôi sống khoảng 60 triệu người trên thế giới mỗi năm [44]

Ở Trung Quốc, trong vòng 30 năm qua đã có hơn 3 vụ dịch bệnh đạo ôn bùng phát, thiệt hại khoảng 2,5 triệu tấn mỗi vụ Ở một số nước sản xuất lúa gạo, ước tính dịch đạo ôn bùng phát với mức độ thiệt hại lên tới trên 50% ở Ấn Độ,

9

42,5% ở Nhật Bản và Indonesia là 70% tổng sản lượng [54] Tại Nhật Bản, mặc dù

đã áp dụng biện pháp trồng các giống địa phương mang nhiều gen kháng đạo ôn nhưng do sự xuất hiện những chủng mới có độc lực mạnh nên năng suất lúa gạo bị giảm đáng kể từ 20-100% Theo New Strait Times (2012), tại Malaysia có gần 1.000ha lúa ở bang Kedah bị ảnh hưởng bởi dịch nấm đạo ôn Mức độ ảnh hưởng

đã giảm xuống trong năm 2004, nhưng sau đó bị tăng trở lại trong năm 2009 Đến năm 2011, có 30 ha ruộng lúa ở bang này đã bị thiệt hại nặng nề ngay trong thời kì lúa mới gieo trồng [39]

Mặc dù cây lúa là vật chủ của nấm đạo ôn, nhưng theo nhiều nghiên cứu đã

chỉ ra rằng, nấm M oryzae còn có thể lây nhiễm sang các loại cây ngũ cốc khác và

là tác nhân gây ra bệnh đạo ôn ở lúa mì–bệnh lần đầu tiên được báo cáo năm 1985 tại Paran của Brazil Tháng 3 năm 2016, dịch bệnh đạo ôn trên lúa mì đã xuất hiện ở Bangladesh và phá hủy hơn 15.000 ha lúa mì Bệnh đã tái phát trong năm 2017 và hiện đang đe dọa nền sản xuất lúa mì trên khắp Nam Á [38]

1.2 Các kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm M.oryzae

1.2.1 Những nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, bệnh đạo ôn thường xuyên xảy ra và gây khó khăn, thiệt hại cho ngành trồng lúa Nhưng cho đến nay chỉ có một số ít nghiên cứu về di truyền

quần thể M oryzae được thực hiện Hiểu biết về cơ chế kháng của cây lúa, cũng như mức độ đa dạng di truyền của quần thể nấm M oryzae trong một khu vực địa lý

cụ thể là rất quan trọng

[32] đã sử dụng kỹ thuậtDNA fingerprinting xác định được 5 phân dòng đặc hữu với tổng số 15 nhóm di truyền từ 78 chủng thu thập tại hai tỉnh thuộc ĐBSHlà Thái Bình và Hà Tây và ba tỉnh Long An, Tiền Giang và Hậu Giang thuộc ĐBSCL Trong số 5 nhóm di truyền thì có 4 nhóm đặc thù cho vùng ĐBSH và chỉ có một nhóm

di truyền được phát hiện ở ĐBSCL, nhưng không tìm thấy nhóm di truyền nào chung cho cả hai vùng đồng bằng Hơn nữa, không có mối liên hệ nào được tìm thấy giữa các nhóm di truyền và khả năng gây bệnh khi thử nghiệm trên các dòng lúa đẳng gen sử

10

dụng trong nghiên cứu này Sự khác biệt này có thể do sự khác nhau giữa các giống lúa

và điều kiện khí hậu ở hai vùng

Năm 2006, nhóm nghiên cứu của [42] đã sử dụng 160 chỉ thị AFLP để nghiên cứu mức độ đa dạng và tính gây bệnh của 123 mẫu nấm đạo ôn thu thập tại nhiều tỉnh thuộc ĐBSH Kết quả cho thấy quần thể nấm đạo ôn tại ĐBSH rất đa dạng về di truyền, gồm ít nhất 7 nhóm, đại diện các nhóm có tính gây bệnh khác nhau trên các giống chỉ thị mang gen kháng Các quần thể nấm phân lập trên các giống lúa nếp (nhóm japonica) khác với quần thể nấm phân lập trên các giống lúa tẻ (nhóm indica)

Lần đầu tiên ứng dụng kĩ thuật Rep-PCR tại Việt Nam để phân tích mức độ

đa dạng di truyền của các mẫu nấm đạo ôn được thu thập tại ĐBSH Nhóm của [2] chỉ ra rằng phân tích Rep-PCR chứng tỏ quần thể nấm đạo ôn tại khu vực ĐBSH rất

đa dạng về di truyền giống như các công bố trước đây Nghiên cứu này đã xác định

được 8 chủng sinh lý nấm M oryzae và không có mối liên hệ rõ rệt giữa các cụm

nấm được xác định bởi Rep-PCR với nguồn gốc địa lý, đặc điểm màu sắc tản nấm

và chủng nấm

Ngoài ra, theo như [31] đã nghiên cứu về mức độ đa dạng di truyền của quần thể nấm đạo ôn ở đồng bằng sông Mê Kông Bằng kỹ thuật Rep-PCR với bộ mồi

Pot2 đặc hiệu nấm đạo ôn, kết quả chỉ ra rằng quần thể nấm đạo ôn tại đây cũng rất

đa dạng và đang tiến hóa nhanh chóng Sử dụng kỹ thuật RFLP với dò đa locus,ở nghiên cứu của [33] cho thấy quần thể nấm đạo ôn ở ĐBSH đa dạng hơn và khác với quần thể nấm đạo ôn ở đồng bằng Sông Mê Kông Tuy nhiên, cả hai nghiên cứu này đều cho thấy không có mối liên quan rõ rệt giữa các nhóm nấm được xác định dựa trên kết quả phản ứng với bộ giống chỉ thị của Nhật Bản [31, 33]

Năm 2015, [6] đã tiến hành nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và độc tính của các chủng nấm gây bệnh đạo ôn ở Nam Trung Bộ Nhóm đã sử dụng 12 chỉ thị

RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền của 18 chủng M oryzae đại diện cho các vùng

sinh thái khác nhau ở Nam Trung Bộ Dựa vào mức độ tương đồng về di truyền, 18 chủng nấm chia thành bốn nhóm chính Nhóm A gồm bốn chủng nấm có hệ số tương

11

đồng di truyền dao động từ 0,58-0,77, trong đó chia thành hai nhóm nhỏ Nhóm B gồm

4 chủng nấm, chia thành hai nhóm nhỏ và có hệ số tương đồng di truyền 0,58-0,76 Nhóm C gồm 8 chủng được chia thành 3 nhóm nhỏ và có hệ số tương đồng di truyền là 0,63-0,74 Nhóm D gồm hai chủng có hệ số di truyền khá cao là 0,74 Kết quả củanghiên cứu này có thể sử dụng làm cơ sở trong công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn tại các tỉnh Nam Trung Bộ

Tất cả những kết quả trên cho thấy sự biến đổi phức tạp và tiến hóa nhanh chóng của quần thể nấm đạo ôn, tiềm ẩn nguy cơ trong quá trình sản xuất lúa tại các vùng trồng lúa ở Việt Nam Chính vì vậy, việc nâng cao kiến thức về đa dạng di

truyền và tiến hóa của quần thể nấm M.oryzae ở Việt Nam là điều cần thiết và quan

trọng trong chương trình chọn tạo giống kháng đạo ôn bền vững, hiệu quả

1.2.2 Những nghiên cứu ở nước ngoài

Trên thế giới đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về đa dạng di

truyền của quần thể nấmM oryzae Nhóm các nghiên cứu đặt nền móng đầu tiên đã

sử dụng kỹ thuật DNA fingerprinting (giám định vân tay di truyền) dựa vào trình tự lặp lại rải rác trong DNA Ví dụ, tại Philippines, [13] đã giám định vân tay di truyền của 1.156 chủng thu được trên 38 giống lúa trồng trong hai vụ, kết quả cho thấy các chủng phân cụm lại vào 10 nhóm di truyền Một số nghiên cứu khác cũng sử dụng cách tiếp cận này đã xác định được 2-10 nhóm di truyền ở Nhật Bản [31] và Việt Nam [32] Ở Ấn Độ [29], Trung Quốc [14] và Thái Lan [56] phát hiện được hơn 50 phân dòng vô tính cho mỗi quốc gia

Năm 2007, [47] đã phân tích sự đa dạng di truyền của 55 chủng nấm đạo ôn

Magnaporthe grisea thu thậpở Burkina Faso bằng cách sử dụng 108 chỉ thị RAPD

Kết quả của nghiên cứu đã xác định 5 nhóm di truyền chính (Mg-1, Mg-2, Mg-3 Mg-4 và Mg-5), trong đó Mg-1, Mg-2 và Mg-3 là các nhóm đại diện lớn nhất tương ứng với 30,9, 25,5 và 30,9% trong số 55 chủng được phân lập Mg-4 và Mg-5 chiếm tỉ lệ tương ứng là 9,1% và 3,6% Kết quả của nhóm khẳng định rằng RAPD PCR cung cấp một phương tiện nhanh chóng và tiết kiệm để phân tích cấu trúc di truyền quần thể nấm đạo ôn

12

Năm 2007, [10] đã phát triển 9 chỉ thị microsatellite (SSR) mới cho các nghiên cứu về quần thể nấm đạo ôn trên lúa gồm pyrms07-08, pyrms37-38, pyrms43-

44, pyrms47-48, pyrms63-64, pyrms77-78, pyrms83-84, pyrms99-100 và

pyrms101-102 Ngoài ra, nhóm nghiên cứu còn sử dụng thêm 9 chỉ thị SSR đã có trước đó, tổng cộng là 18 marker được sử dụng trong PCR để mô tả 6 quần thể từ các vùng có nguồn gốc địa lí khác nhau Kết quả là số lượng alen trung bình trên mỗi locus ở các quần thể dao động từ 1,2 đến 7 và tổng số alen được phát hiện từ 2 đến 19 Dựa trên tính đa hình này, bộ chỉ thị được kỳ vọng sẽ hữu ích cho nghiên cứu về các quần thể nấm đạo ôn khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau

Nhóm nghiên cứu của [51] đã sử dụng 10 chủng đạo ôn để đánh giá hình thái, bệnh học, độc lực và đặc tính di truyền bằng marker RAPD Các chủng nấm được phân loại thành 3 nhóm dựa trên cơ chế gây bệnh là gây bệnh ở mức độ nặng, vừa phải và nhẹ, theo 4 nhóm PG-I, PG-II, PG-III và PG-IV dựa trên các đặc điểm hình thái Sự đa hình giữa các chủng nấm đạo ôn được phân tích bằng kĩ thuật RAPD-PCR, hệ số tương đồng giữa các chủng phân lập được tối đa là 80% và tối thiểu là 35%

Năm 2014, nghiên cứu của [46] đã sử dụng chỉ thị phân tử SSR phân tích 55 quần thể nấm đạo ôn thu thập từ 15 quốc gia Nghiên cứu này đã ghi nhận vùng Đông Nam Á chính là trung tâm xuất xứ của bệnh đạo ôn hại lúa và là khu vực đại diện cho sự đa dạng di truyền của hầu hết quần thể nấm đạo ôn trên toàn thế giới Nghiên cứu này cũng xác định được bốn phân dòng nấm đạo ôn hại lúa chính, trong

đó có một phân dòng đặc hữu (endemic) cho vùng Châu Á và có dấu vết tái tổ hợp

di truyền, trong khi những phân dòng còn lại hoàn toàn sinh sản vô tính (clonal) và xuất hiện ở khắp nơi (pandemic)

Các nghiên cứu trên cho thấy mức độ đa dạng di truyền thấp nhưng bệnh đạo

ôn là mối nguy hại cho tất cả hệ thống canh tác, sản xuất lúa do khả năng thích nghi nhanh chóng với tính kháng của giống [56] Do đó, những hiểu biết chi tiết về mức

độ di truyền quẩn thể của các loài nấm bệnh vô tính như M oryzae sẽ cung cấp

những cái nhìn quan trọng về quá trình tiến hóa hệ gen Đồng thời, quá trình tiến

13

hóa sinh thái còn có thể liên quan đến sự xuất hiện mầm bệnh và khả năng thích nghi của tác nhân gây bệnh với những thay đổi của con người

Như vậy, trên thế giới cũng như Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã sử dụng các

chỉ thị DNA phân tử để đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể nấm M.oryzae

gây bệnh đạo ôn trên lúa Trong đó,kĩ thuật microsatellites hay chuỗi lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeats-SSR) là công cụ hữu ích, đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể SSR có các ưu điểm nổi trội như:

là DNA vô nghĩa, là các đoạn lặp lại ngắn liên tiếp, mỗi đơn vị lặp lại có từ 2-6 nucleotide và số lần lặp lại có thể đến vài chục lần Chúng phân bố rộng rãi trên toàn hệ gen và có tính đa hình cao và sự biến đổi thường không có tính chất rõ rệt

Do đó mà các chỉ thị SSR rất hữu ích để đánh giá sự đa dạng di truyền một cách hiệu quả [20]

Trong nghiên cứu này, áp dụng phương pháp nghiên cứu di truyền quần thể

cơ bản nhưng sử dụng các chỉ thị phân tử SSR cho hai ưu điểm nổi trội so với những phương pháp đãđược thực hiện ở Việt Nam cho đến nay Thứ nhất, các chỉ thị SSR phân bố trên toàn hệ gen và có hiệu quả về mặt chi phí Và thường được sử dụng trong các nghiên cứu khác đã thực hiện ở quy mô châu Á và trên toàn thế giới [46], cho phép dễ dàng phân tích so sánh đối chiếu Ưu điểm thứ 2 có được nhờ tận dụng khả năng khai thác cơ sở dữ liệu từ phía đối tác là đơn vị nghiên cứu BGPI (CIRAD, Pháp) Bằng các phương pháp phân tích tin sinh đơn giản có thể thu thập

được rất nhiều thông tin cơ bản quan trọng về di truyền và cấu trúc quần thể nấm M oryzae

Chính vì vậy, chúng tôi đã sử dụng bộ chỉ thị gồm 13 cặp mồi SSR đã được nghiên cứu và phát triển riêng cho việc đánh giá đa dạng di truyền của nấm đạo ôn

M oryzae và đã được sử dụng thành công tại đơn vị nghiên cứu BGPI [10].Từ đó,

đánh giá kiểu gen của chủng nấm nghiên cứu bằng phương pháp giải trình tự sử dụng chỉ thị SSR nhằm bước đầu dự đoán về sự đa dạng di truyền củaquần thể nấm đạo ôn ở Việt Nam

14

1.3 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn

1.3.1 Chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn bằng chỉ thị phân tử

Xác định các gen kháng đạo ôn

Khả năng kháng bệnh đạo ôn của lúa do các gen kháng chịu trách nhiệm và

được đặt tên theo tên gọi cũ của nấm đạo ôn là Pyricularia (Pi) Tính kháng đạo ôn

của gen R trên lúa dựa trên mối tương tác gen-đối-gen và gen kháng R đầu tiên là

Pi-a từ giống lúa japonica do Kiyosawa tìm ra năm 1966 Cho đến nay, đã có hơn

100 gen kháng bệnh đạo ôn được xác định, trong đó có 45% là từ giống japonica, 51% từ giống indica và còn lại 4% là từ các loài lúa hoang dại [48]

Các kết quả nghiên cứu cho thấy gen kháng R được định vị xuyên suốt trên

bộ gen cây lúa, trong đó trên nhiễm sắc thể 11 chứa đa số các gen kháng Trong khoảng 100 gen kháng bệnh đạo ôn đã được xác định và lập bản đồ thì có gần một nửa trong số này định vị trên nhiễm sắc thể số 11, 12 và 6 (chiếm xấp xỉ 64% trên tổng số gen đã được xác định) [11] Cụ thể, có 27 gen kháng nằm trên nhiễm sắc thể

số 11, 22 gen nằm trên nhiễm sắc thể số 12, 19 gen trên nhiễm sắc thể số 6 Số gen kháng còn lại nằm trên nhiễm sắc thể số 2 có 10 gen, trên nhiễm sắc thể số 5 có 3

gen (Pi23, Pi26(t) và Pi10), trên nhiễm sắc thể số 10 có 2 gen (Pi28(t), PiGD-2(t)),

và chỉ có 1 gen kháng Pi17(t) nằm trên nhiễm sắc thể số 7

Năm 2009, nhóm nghiên cứu của [41] đã tạo ra sáu tổ hợp lai, gồm OM24/IR64, IR24/OM2514, C53/IR64, C53/OM2514, OM1308/TeTep và IR36/C53 Trong số đó, có bốn tổ hợp lai đã được lập bản đồ với các gen kháng di truyền trội và nằm trên nhiễm sắc thể 6, 8 và 11 Ngoài ra, nguồn vật liệu có giá trị tạo ra các giống kháng bền vữngnhư P(OM1), OMP2, OMP4, OMP5 và OMP6 đã được sàng lọc thành công.Để góp phần vào việc quản lý bệnh đạo ôn thông qua chọn tạo giống kháng, [5] đã tiến hành xác định khả năng kháng bệnh của một số giống lúa IRRI với 23 chủng nấm đạo ôn thu thập ở các vùng sinh thái của Việt

Nam Kết quả cho thấy, gen Pi-1 ở giống lúa C101LAC có khả năng kháng rộng nhất đạt tỉ lệ kháng là 82% và giống Moroberekan mang gen Pi-5 có tỉ lệ kháng là

15

78% Các gen kháng nói trên có tiềm năng sử dụng để qui tụ vào giống/dòng lúa để

cải tạo tính kháng

Nghiên cứu của [49] đã sử dụng 10 marker SSR để sàng lọc 10 gen kháng

điển hình là Pi-9, Piz-5, Pi-1, Pi5-(t), Pi-b, Pi-ta, Pi33, Pi-27(t), Pitp(t), Pi-k h

trong

bộ 192 giống lúa khác nhau Hệ số di truyền của 10 gen kháng này dao động trong

khoảng 19,79% đến 54,69% Kết quả chỉ ra rằng có 7 giống lúa là IC337593, IC346002, IC346004, IC346813, IC356117, IC356422 và IC383441 có tối đa 8 gen kháng đạo ôn Các giống FR13B, Hourakani, Kala Rata 1–24, Lemont, Brown Gora, IR87756-20-2-2-3, IC282418, IC356419, PKSLGR-1 và PKSLGR-39 có tối

đa 7 gen kháng 20 giống có 6 gen kháng, 36 giống có 5 gen kháng, 41 giống có 4 gen kháng, 38 giống có 3 gen kháng, 26 giống có 2 gen kháng và 13 giống có 1 gen kháng đơn và chỉ có 1 giống IC438644 không có gen kháng nào

Quy tụ gen kháng vào các giống lúa

Trong nhiều nghiên cứu, khả năng kháng bệnh của một số gen với các chủng nấm bệnh của Việt Nam đã được xác định và quy tụ hiệu quả vào các giống lúa thương mại phục vụ sản xuất Trong đó, một số gen kháng tiềm năng đã được xác

định như: Pi1, Pi5(t), Pi, Pi4(t), Piz và Pik-m,… [3] Tuy nhiên, những giống lúa

kháng đơn gen (có tính kháng dọc) thường bị mất hiệu lực rất nhanh sau khi các chủng mới xuất hiện.Việc quy tụ gen (gene pyramiding) là đưa gen kháng vào giống/dòng lúa có năng suất và phẩm chất tốt để nâng cao khả năng kháng bệnh và đồng thời không làm mất đi những đặc tính quý của giống Phương pháp lai hồi quy (backcross) sẽ đưa trở lại dần những đặc tính quý của cây vào các thế hệ con cháu.Sau đó sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với gen để chọn lựa những cây mang gen kháng, tiếp đó sử dụng để phát triển các thế hệ tiếp theo

Kết quả quy tụ đa gen kháng vào các giống lúa nhằm tạo ra các giống có khả năng kháng nhiều chủng nấm cùng lúc, kháng bền vững đã được tiến hành ở Việt Nam và đạt được những hiệu quả nhất định Nhóm nghiên cứu của [3] đã quy tụ hai

gen kháng Pi-1 và Pi-5 vào giống Bắc Thơm số 7, đồng thời tiến hành sử dụng chỉ

thị phân tử để chọn lựa được dòng có triển vọng (đồng hợp tử 2 gen kháng đạo ôn)

16

từ việc tiến hành tự thụ cá thể F1 (mang 2 gen kháng Pi-1 và Pi-5) Hai gen này đã

được đánh giá có khả năng kháng rất cao và rộng với các chủng nấm Việt Nam, đặc biệt là với các nòi nấm ở những vùng sinh thái nông nghiệp miền Bắc với tỷ lệ kháng lần lượt là 82%và 78% Kết quả đã chọn tạo được giống NB-01 có tiềm năng năng suất cao hơn giống Bắc thơm 7, sức chống chịu tốt, kháng đạo ôn và chống chịu sâu

1.3.2 Sử dụng QTL trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn

Tính kháng đạo ôn ở lúa được chia làm 2 loại chính là tính kháng hoàn toàn

và kháng không hoàn toàn Tính kháng hoàn toàn được kiểm soát bởi các gen kháng đơn R có thể kháng đặc hiệu cho một hoặc một vài chủng nấm gây bệnh cụ thể[25,50].Các nhà chọn giống đã áp dụng biện pháp quy tụ gen để tích lũy nhiều gen kháng đơn này vào một giống, đây được coi là biện pháp mang lại hiệu quả lâu dài đối với bệnh đạo ôn hại lúa Tuy nhiên, rủi ro có thể xảy ra khi chính các gen được quy tụ này có thể làm cho tác nhân gây bệnh phát sinh ra các “siêu chủng” mới có khả năng khắc phục và làm xói mòn các gen R đã được quy tụ, và do đó gây

ra hậu quả khó lường trước được

Tính kháng không hoàn toàn không đặc hiệu cho từng chủng gây bệnh và do QTL đặc trưng chi phối, có khả năng kháng lâu dài trong trường hợp xuất hiện thêm chủng nấm mới [28] Tính kháng không hoàn toàn cho phản ứng như nhau đối với đồng thời các chủng gây bệnh khác nhau.Và ở các giống kháng không hoàn toàn có mức độ kháng bệnh trung bình, không kháng riêng rẽ từng chủng bệnh cụ thể nên loại kháng này được coi là bền vững và có phổ kháng bệnh rộng hơn trong điều kiện

tự nhiên[50] Do đó, chọn tạo giống lúa dựa vào QTL tiềm năng có tính kháng không hoàn toàn là hướng đi quan trọng cho các nhà chọn tạo giống trong việc kiểm soát bệnh đạo ôn hiệu quả và bền vững Đến nay đã xác định được khoảng 500 QTL cho tính kháng không hoàn toàn với bệnh đạo ôn trên lúa[11] Trong số đó chỉ có

vài QTL chính có thể xác định bằng các chỉ thị phân tử, như là Pb1, pi21, Pi34, Pif, Pikur1 và Pikur2, Pi-se1, Pi35 và Pikahei-1(t) [34]

17

Năm 2017, kết quả nghiên cứu của [16] đã xác định tính kháng phổ rộng của giống lúa Jao Hom Nin (JHN) có khả năng chống lại các chủng nấm đạo ôn ở giống

lúa Thái Lan và Philippines do sự kết hợp của 2 gen kháng Pish-J và Pi7-J Trước

đó, QTL1 thể hiện tính kháng một phần đã được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 1 bởi các marker SSR là RM319 và RM212, QTL11thể hiện tính kháng hoàn toàn đã được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 11 bởi các marker SSR là RM144 và RM224

Theo nghiên cứu này, QTL1 kiểm soát gen kháng Pish-J, QTL11 kiểm soát gen kháng Pi7-J trong giống lúa JHN Đây là các gen ứng viên tiềm năng, sự kết hợp

của hai gen này tạo ra tính kháng phổ rộng và duy trì bền vững trong thời gian dài đối với các chủng nấm đạo ôn ở các giống lúa gạo Thái Lan và Philippines

Như vậy, việc xác định, mô tả các nguồn gen mới cho các gen R kháng hoàn toàn và các QTL cho tính kháng không hoàn toàn sẽ tạo ra hướng tiếp cận mới, hiệu quả cho các nhà chọn tạo giống cũng như cung cấp chiến lược để kiểm soát bệnh đạo ôn một cách bền vững

18

Chương 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Nguồn nấm: Các chủngnấm bệnh M.oryzae được phân lập từ các mẫu lúa

nhiễm bệnh đạo ôn thu thập tại một số tỉnh miền Bắc và miền Trung của Việt Nam

- Chỉ thị phân tử: Để đánh giá sự đa đạng di truyền của các dòng nấm

M.oryzae đã phân lập,sử dụng13 chỉ thị SSRđược phát triển bởi Đơn vị nghiên cứu

BGPI (Biologie et Génétique des Interactions Plante), Trung tâm Hợp tác quốc tế Nghiên cứu nông nghiệp vì sự Phát triển (CIRAD, Pháp)

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Từ tháng 3 đến tháng 11 năm 2018

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Việt Pháp LMI RICE-2, thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Bắc Từ Liêm, Hà Nội

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập mẫu bệnh và phân lậpchủng nấm đạo ôn gây bệnh trên lúa tại một

số tỉnh miền Bắc và miền Trung

- Bước đầu đánh giá đa dạng di truyền của một bộ chủng nấm đạo ôn đã phân lập bằng 13 chỉ thị SSR

2.4 Các phương pháp được nghiên cứu

2.4.1 Thu thập mẫu bệnh và phân lập chủng nấm đạo ôn gây bệnh trên lúa tại một số tỉnh miền Bắc và miền Trung

2.4.1.1 Phương pháp thu thập mẫu bệnh

Các mẫu lá và cổ bông mang triệu chứng điển hình của bệnh đạo ôn sẽ được thu thập từ các ruộng lúa bị nhiễm bệnh,tạimột số tỉnh tại miền Bắc và miền Trung Việc thu thập mẫu bệnh tại các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam là bước đầu tiên quan trọng, tạo nguồn vật liệu phục vụ nghiên cứu đánh giá mức độ đa dạng di

19

truyền của quần thể nấm đạo ôn hại lúa M oryzae Ba vùng sinh thái chính được

chọn gồm: miền Trung, đồng bằng sông Hồng (đồng bằng Bắc Bộ), miền núi phía Bắc, là nơi có điều kiện canh tác khác nhau, từ truyền thống đến thâm canh Các mẫu bệnh được lưu giữ trong phong bì giấy có ghi rõ các thông tin về địa điểm thu thập, giống lúa, sau đó được làmkhô và bảo quản ở nhiệt độ phòng.Quá trình thu mẫu sẽ được tổ chức vào thời điểm sau khi trỗ và trước khi thu hoạch lúa.Vị trí thu mẫu và tên của các giống lúa lấy mẫu sẽ được ghi chép theo hệ thống

2.4.1.2 Phương pháp phân lập mẫu bệnh

Từ các mẫu bệnh đã được làm khô sẽ tách lấy một bào tử đơn dưới kính hiển

vi bằng kỹ thuật phân lập bào tử đơn M oryzae, được gọi là chủng phân lập (isolate) Trước tiên, đoạn lá lúa hoặc cổ bông có vết bệnh được cắt ra, cho vào ống

falcon 15 ml để tiến hành khử trùng:

 Ngâm mẫu trong javel 1% trong thời gian 3 phút;

 Rửa sạch mẫu 4-5 lần bằng nước cất khử trùng;

 Chuẩn bị đĩa petri có đặt giấy thấm, bổ sung nước cất đã khử trùng cho thấm ướt giấy thấm, sau đó cấy mẫu vào đĩa

Đặt đĩa petri vào phòng sáng ở nhiệt độ 26oC cho nấm đạo ôn phát triển bào

tử Sau 1-2 ngày sử dụng kính hiển vi để tách bào tử đơn Dùng que thủy tinh quết nhẹ vào bề mặt vết bệnh để bào tử bám vào, sau đó đưa sang cấy vào đĩa môi trường agar 3,5% Sau khoảng 24h, bào tử đơn bắt đầu nảy mầm, dưới kính hiển vi

sử dụng dao nhọn để cắt lấy 3 bào tử đơn cấy vào đĩa môi trường bột gạo có bổ sung kháng sinh penicilline 500000 UI/l để được mẫu nấm thuần

Sau 7-10 ngày, các bào tử nấm sẽ phát triển hệ sợi Chọn 1 bào tử đơn phát triển tốt nhất trong số 3 bào tử đơn được cấy,tách sợi nấm chuyển sang môi trường nuôi cấy lỏng có kháng sinh, sau 4 ngày sử dụng mẫu cấy để tách chiết DNA (tối,

25oC) Đồng thời với quá trình cấy sợi nấm vào môi trường lỏng để tách DNA, từ cùng một isolate sợi nấm cũng được cấy vào môi trường rắn có đặt giấy thấm trên

bề mặt để nuôi mẫu phục vụ lưu trữ

20

Bảng 2.1 Thành phần môi trường bột gạo

Bảng 2.2 Thành phần môi trường lỏng để nuôi nấm tách DNA

2.4.2 Đánh giá đa dạng di truyền các dòng nấm đạo ôn bằng chỉ thị SSR

2.4.2.1 Phương pháp tách chiết DNA

Để thu được DNA tổng số của các chủng nấm phân lập, DNA được tách chiết từ sợi nấm theo phương pháp phân giải tế bào bằng enzyme Extralyse Phương pháp này được cung cấp từ nhóm đối tác, CIRAD, Pháp Sovới phương pháp nghiền mẫu trong nitơ lỏng, phương pháp này rất hiệu quả và tiết kiệm công sức trong việc tách chiết DNA từ sợi nấm dựa trên việc phá vỡ thành tế bào bằng enzyme Ngoài

ra, quy trình tách chiết này còn dễ dàng thực hiện và rất phù hợp đối với các loại

nấm sợi khác có đặc điểm phát triển tương tự như nấm đạo ôn M oryzae

Quy trình thực hiện được mô tả ngắn gọn như sau:

B1: Ủ mẫu

- Hút 1,5ml dịch chiết(easy-extract: 100 ml chứa 70ml NaCl 1M, extralyse 1,5g, pH = 6) vào ống eppendorf Sau đó chuyển sợi nấm từ môi trường nuôi dưỡng có kháng sinh vào ống

- Ủ mẫu 1,5 giờ

B2: Ly tâm 14.000 rpm trong 5-7 phút

- Đổ bỏ dịch trong

21

B3: Bổ sung 600 μl dung dịch đệm hòa tan tế bào đãđược đặt trong tủ nhiệt

65oC Đệm hòa tan tế bào (100ml: 2ml Triton 100X, 5ml SDS 20%, 10ml NaCl 1M, 1ml Tris HCl pH8 10mM, 500μl EDTA 0,2M)

- Ủ mẫu 30 phút đến 1 giờ ở 65oC

B4: Tinh lọc (chloroform:isoamylalcohol 24:1)

- Bổ sung 600 μl chloroform:isoamylalcohol

- Trộn đều bằng cách đảo ngược cho đến khi đồng nhất từ 2-3 phút

- Ly tâm 20 phút, 14.000 rpm, T >15oC, chuyển pha lỏng ở trên sang ống eppendorf mới

- Ly tâm 10 phút, 14.000rpm sau đó, loại bỏ cồn

- Làm khô dưới tủ hút cho đến khi cồn bay hơi hoàn toàn (khoảng 1 giờ)

B6: Đo nồng độ DNA và pha loãng thành nồng độ20ng/µl

Nồng độ DNA được đo bằng máy Nanodrop (NanoDrop 8000-Thermo scientific) Nồng độ DNA và chỉ số OD là các thông số quan trọng để kiểm soát chất lượng DNA chiết được (Phụ lục 2)

2.4.2.2 Phương pháp PCR

DNA sau khi tách được pha loãng ở nồng độ 20 ng để sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng PCR Trước tiên, mẫu được phân tích bằng cặp mồi đối chứng

dương (ITS5/ITS4) nhằm đảm bảo đúng DNA được phân lập từ nấm M oryzae Do

vùng ITS (Internal Transcribes Spacer) có đặc điểm vừa có trình tự bảo thủ, vừa có trình tự biến đổi nên rất có hiệu quả trong việc phân biệt các loài khác nhau hoặc

Bước tiếp theo, các mẫu DNA được chạy multi-PCRvới 13 cặp mồi SSR có gắn các tín hiệu huỳnh quang[10] Sự khếch đại gen các chủng nấm đạo ôn với các cặp mồi SSR sẽ được thực hiện trong phòng thí nghiệm LMIRICE-2, sau đó các đĩa sản phẩm PCR sẽ được gửi đến BGPI (Pháp) để giải trình tự Thông tin về các chỉ thị phân tử được trình bày ở Bảng 2.3

- Bước 2: Khuếch đại PCR theo chu kì nhiệt như sau:

 Biến tính tách mạch đôi DNA ở 95o

- Bước 3: Sản phẩm PCR được gửi sang Đơn vị nghiên cứu BGPI (CIRAD) để giải trình tự bằng máy Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer

2.4.2.3 Phương pháp điện di

Sau phản ứng PCRđối với cặp mồi ITS5/ITS4, sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% ở 100V trong 40 phút, nhuộm ethidiuum bromide, marker 1 kb (Fermentas, 1 kb DNA ladder)

Hóa chất sử dụng: Agarose 1%, dung dịch đệm TAE 1X, ethidium bromide nồng độ 0,5 µg/ml (EtBt)

Thao tác tiến hành:

- Tra mẫu và điện di: Sản phẩm PCR được tra vào giếng sau khi đã đổ đệm TAE 0,5X vào khuôn điện di cho ngập bản gel Mẫu được trộn với loading dye 6X với tỉ lệ mẫu:loading dye là 5:1 và được đưa vào giếng, điện di cùng với thang DNA 1kb để kiểm tra kích thước

- Nhuộm bản gel: Quá trình điện di kết thúc khi băng màu chạy được 2/3 bản gel agarose, bản gel được lấy ra từ khuôn, ngâm khoảng 20-30 phút trong dung dịch nước có chứa ethidium bromide nồng độ 0,5 µg/ml, rồi rửa lại bằng nước cất

- Quan sát và chụp ảnh: Bản gel sau khi nhuộm với ethidium bromide được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 302 nm trên máy soi DNA, ảnh được chụp bằng máy soi gel

2.4.3 Phân tích kết quả

Các sản phẩm PCR sẽ được giải trình tự trên hệ thống giải trình tự DNA mao quản Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer Sản phẩm giải trình tự sau đó sẽ được phân tích bằng phần mềm GeneMapper 4.0, sẵn có tại đơn vị BGPI và cho phép dễ dàng kết nối sử dụng tại phòng LMI RICE-2

Sau đó dữ liệu được sử dụng để xây dựng cây di truyền bằng phần mềm Darwin 6 Phương pháp xây dựng cây phân loại bao gồm cây phân cấp với các tiêu chí tập hợp khác nhau dựa trên mức độ đa hình của các trình tự gen thu được