Nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen GS1 vào cây xoan ta (melia azedarach) tam bội bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Các nghiên cứu cải tạo giống xoan ta Theo QĐ số 16/2005/QĐBNN ngày 15/5/2005 của Bộ trưởng Bộ NN&PTNT, cây xoan ta đứng đầu trong danh mục cây trồng được ưu tiên phát triển bởi nhiều ưu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

VŨ THỊ KHÁNH HÕA

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CHUYỂN GEN GS1 VÀO CÂY XOAN TA

(MELIA AZEDARACH) TAM BỘI BẰNG VI KHUẨN

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

VŨ THỊ KHÁNH HÕA

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CHUYỂN GEN GS1 VÀO CÂY XOAN TA

(MELIA AZEDARACH) TAM BỘI BẰNG VI KHUẨN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và cùng cộng tác với các cộng sự, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Nguyễn Văn Phong và TS Hoàng Thị Mỹ Hạnh Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả Phần kết quả còn lại của luận văn chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ

Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn

Học viên

Vũ Thị Khánh Hòa

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Phong - Trung tâm xúc tiến đào tạo và du học - Đại học Lâm nghiệp và TS Hoàng Thị Mỹ Hạnh - Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN đã tận tình chỉ bảo

và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản luận văn thạc sĩ này Xin được cảm ơn đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước “Nghiên cứu chọn tạo và đánh giá các dòng xoan ta biến đổi gen sinh trưởng nhanh có triển vọng” do TS Nguyễn Văn Phong chủ nhiệm đã hỗ trợ tôi về mọi phương diện để thực hiện nghiên cứu này

Tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn các anh chị và các em sinh viên Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp đã luôn bên cạnh giúp đỡ, khích lệ, động viên trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại phòng

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Học viên

Vũ Thị Khánh Hòa

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung về cây xoan ta 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố của cây xoan ta 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây xoan ta 3

1.1.3 Đặc điểm sinh thái của cây xoan ta 4

1.1.4 Giá trị sử dụng của cây xoan ta 4

1.2 Các nghiên cứu cải tạo giống xoan ta 5

1.2.1 Các nghiên cứu về xoan ta trên thế giới 6

1.2.2 Các nghiên cứu trên đối tượng xoan ta tại Việt Nam 6

1.3 Kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 7

1.3.1 Các phương pháp chuyển gen thực vật 7

1.3.2 Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 8

1.4 Hệ thống tái sinh cây thông qua tạo mô sẹo xoan ta tam bội 11

1.5 Gen GS1 và ứng dụng chuyển gen GS1 trong tạo giống cây trồng 11

1.5.1 Vai trò của nitơ đối với thực vật 11

1.5.2 Gen GS1 13

1.5.3 Ứng dụng chuyển gen GS1 trong tạo giống cây trồng 14

1.6 Các phương pháp phân tích đánh giá cây chuyển gen in vitro và in vivo 15

1.6.1 Đánh giá chọn lọc cây chuyển gen in vitro 15

1.6.2 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử 15

1.6.3 Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây chuyển gen 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 18

2.1.1 Vật liệu thực vật 18 2.1.2 Vật liệu di truyền 19_Toc534147740

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Nuôi cấy tạo mô sẹo xoan ta tam bội 21

2.3.2 Chuyển gen GS1 vào mô sẹo xoan ta tam bội 22

2.3.3 Chọn lọc thể nhận gen bằng kháng sinh kanamycin 23

2.3.4 Xác định cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 25

2.3.5 Xác định cây chuyển gen bằng phương pháp Southern blot 27

2.3.5 Phương pháp đánh giá sinh trưởng của các dòng xoan ta tam bội chuyển gen 29

2.3.5.1 Huấn luyện và trồng cây con trong điều kiện nhà lưới 29

2.3.5.2 Đánh giá các chỉ tiêu sinh lý của cây chuyển gen 30

2.3.6 Phương pháp thu thập và xử lí số liệu 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp NAA và BAP đến khả năng tạo mô sẹo xoan ta tam bội 32

3.2 Chọn lọc thể nhận gen bằng kháng sinh kanamycin 35

3.2.1 Đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng kháng sinh kanamycin đến khả năng sống của mô sẹo 35

3.2.2 Chọn lọc thể nhận gen GS1 in vitro 36

3.3 Đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng kháng sinh kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen 39

3.4 Kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 42

3.5 Kết quả phân tích các dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 bằng kĩ thuật Southern blot 44

3.6 Phương pháp đánh giá sinh trưởng của các dòng xoan ta tam bội chuyển gen 48

3.6.1 Đánh giá ảnh hưởng của thành phần giá thể đến tỉ lệ sống dòng xoan ta tam bội 48

3.6.2 Đánh giá khả năng sinh trưởng về chiều cao của các dòng xoan ta tam bội

chuyển gen GS1 49

3.6.3 Đánh giá khả năng sinh trưởng về đường kính của các dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 51

KẾT LUẬN 54

KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái cây xoan ta 4

Hình 1.2 Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens 9

Hình 1.3 Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens 10

Hình 2.1 Biểu đồ phân tích dòng chảy tế bào của các dòng xoan ta [44] 18

Hình 2.2 Cây xoan ta tam bội in vitro 19

Hình 2.3 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/GS1 20

Hình 2.4 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 27

Hình 2.5 Mô hình trồng xoan ta trong điều kiện cách ly vật lý 30

Hình 3.1 Mô sẹo xoan ta tam bội 32

Hình 3.2 Mô sẹo tái sinh qua ba lần chọn lọc 38

Hình 3.3 Ảnh hưởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội không chuyển gen 40

Hình 3.4 Ảnh hưởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen 41

Hình 3.5: Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng cây trên gel agarose 1% 42

Hình 3.6: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR các dòng cây chuyển gen GS1 43

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số 44

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt DNA tổng số bằng enzyme XbaI 45

Hình 3.9 Kết quả Southern blot các mẫu xoan ta tam bội chuyển gen GS1 46

Hình 3.10 Sinh trưởng của các dòng xoan ta tam bội 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn A.tumefaciens 23

Bảng 2.2 Trình tự các mồi tham gia phản ứng PCR 26

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 26

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt DNA 28

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo 33

Bảng 3.2 Kết quả tạo mô sẹo xoan ta tam bội 34

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến khả năng sống của mô sẹo 36

Bảng 3.4 Kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1 vào mô sẹo 37

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội không chuyển gen 39

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen 41

Bảng 3.7 Nồng độ DNA của các mẫu sau tinh sạch 44

Bảng 3.8 Tổng hợp kết quả phân tích Southern blot các dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 47

Bảng 3.10 Sinh trưởng về chiều cao của cây xoan ta (Hvn) 50

Bảng 3.11 Sinh trưởng về đường kính gốc của cây xoan ta (D00) 51

Bảng 3.12 Sinh trưởng về đường kính ngang ngực của cây xoan ta (D1,3) 51

DANH MỤC BIỂU ĐÕ

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến khả năng sống của mô sẹo 36

Biểu đồ 3.2 Hiệu quả chọn lọc mô sẹo chuyển gen GS1 38

Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của giá thể lên tỉ lệ sống của cây con sau 3 tháng 48

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1 A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

12 GS1 Cytosolic glutamine synthetase

21 Ti-plasmid Tumor inducing-plasmid

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

1 Vũ Thị Khánh Hòa, Trần Mạnh Tuấn, Trần Ngọc Hải, Ong Xuân Phong, Bùi Thị Mai Hương, Phạm Bích Ngọc, Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Văn Phong, Đánh giá

khả năng sinh trưởng của một số dòng xoan ta chuyển gen GS1 mã hóa glutamine

synthetase, Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2018, 1689 - 1694

MỞ ĐẦU

Xoan ta (Melia azedazach L.) là loài cây đa tác dụng, có giá trị cao Xoan ta

mục đích chủ yếu là lấy gỗ dùng trong trang trí nội thất, xây dựng, điêu khắc Lá xoan ta còn được dùng làm phân xanh, thuốc trừ sâu, chữa trị các bệnh ngoài da như ghẻ, các vết bỏng; than củi xoan ta cho nhiệt lượng cao Do đó, xoan ta được khuyến khích trồng và mở rộng diện tích Tuy nhiên, trong tự nhiên cây xoan ta có tốc độ sinh trưởng khá chậm, sau 12 - 15 năm mới có thể khai thác gỗ Vì vậy, nghiên cứu tạo ra các dòng xoan ta biến đổi gen sinh trưởng nhanh đang là một hướng nghiên cứu mới và thiết thực đáp ứng nhu cầu sản xuất

Đến nay, có hai hướng chính đang được áp dụng: (i) chuyển các gen liên quan đến sinh tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng dạng hoạt động; (ii) chuyển các gen liên quan đến việc nâng cao hiệu quả sử dụng nitơ, phốt pho, … Trong đó chuyển gen liên quan đến quá trình đồng hóa nitơ đang được đánh giá cao với nhiều

triển vọng Gen cytosolic glutamine synthetase (GS1) mã hóa cho octamer

protein/enzyme glutamine synthetase (GS; EC 6.3.1.2) là một enzyme chìa khóa tham gia vào quá trình sinh tổng hợp glutamine từ glutamic acid và NH3 Đồng thời protein GS còn tham gia vào quá trình tái đồng hóa amoni giải phóng ra từ quá trình quang hô hấp và các quá trình trao đổi chất khác từ đó tăng cường khả năng hấp thu

và tái sử dụng hiệu quả nguồn nitơ Chuyển gen GS1 vào cây trồng bước đầu cũng

đã thu được kết quả rất khả quan về cải thiện khả năng sinh trưởng của cây trồng

Cho đến nay đã có nhiều công trình trong và ngoài nước nghiên cứu về tái

sinh cây xoan ta, tuy nhiên các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc tái sinh in vitro phục vụ nhân giống vô tính, chọn lọc biến dị Chính bởi những lí do này,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen GS1 vào cây xoan ta (Melia azedarach) tam bội bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” với mục tiêu cụ thể như sau:

+ Tạo được lượng mẫu mô sẹo đủ lớn để làm nghiên cứu tiếp theo

+ Thử nghiệm chuyển gen GS1 vào Xoan ta tam bội từ vật liệu mô sẹo

+ Xác định đƣợc các dòng Xoan ta tam bội chuyển gen GS1 thông qua sàng

lọc kháng sinh kanamycin và phân tích sự có mặt của gen bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về cây xoan ta

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố của cây xoan ta

Cây xoan ta (Melia azedarach.L) được A juss miêu tả đầu tiên năm 1830, có nguồn gốc ở Ấn Độ, miền nam Trung Quốc và Úc Cây xoan ta thuộc loài M azedarach, chi Melia, họ Meliaceae, bộ Bồ hòn (Sapindales), ngành Ngọc lan

(Magnoliophyta) [38] Cây Xoan ta hay còn được gọi với các tên khác: xoan nhà, xoan trắng, sầu đông, …

Họ Meliaceae có khoảng 50 chi và 550 loài, phân bố tại các khu vực nhiệt đới và bán nhiệt đới Ở Việt Nam, xoan ta được trồng thành rừng hoặc phân tán ở hầu hết các tỉnh từ Bắc tới Nam, từ đồng bằng, trung du đến miền núi, mọc tự nhiên nhiều ở các vùng biên giới Việt Lào [39]

1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây xoan ta

Xoan ta là cây gỗ, chiều cao của cây trưởng thành từ 20 đến 25 m Cây xoan

ta là cây thân thẳng có các đặc điểm: tán lá thưa; vỏ ngoài màu nâu xám, nứt hoặc rạn dọc, lúc non thường có đốm xếp vòng quanh thân; cành non có lông; lá kép lông chim lẻ 2 - 3 lần, mọc cách, lá nhỏ hình mũi mác, cuống lá có lông Cụm hoa xoan

ta hình chùy mọc ở nách lá, hoa đều, lưỡng tính, màu tím nhạt, có mùi thơm hắc, bầu nhụy có 5 - 6 ô Quả xoan ta là dạng quả hạch dài 1 - 2 cm, chín vào mùa thu và sang mùa xuân quả mới rụng, khi chín quả có màu vàng, vỏ trong hóa gỗ cứng có 5

- 6 ô, mỗi ô chứa một hạt [21, 32][2] Hạt xoan ta có hình thái và kích thước giống như hạt lúa, phôi hạt có hai lá mầm và được bao bọc bởi hạt cứng màu đen

Hình 1.1 Hình thái cây xoan ta

A Thân; B Lá; C Hoa; D Quả [39]

1.1.3 Đặc điểm sinh thái của cây xoan ta

Cây xoan ta sống được trên nhiều loại đất khác nhau nhưng cây thích hợp sống ở nơi có độ phì nhiêu, đất tơi xốp và độ ẩm cao như các loại đất đá vôi, đá kiềm, đất cát pha, đất phù sa ven sông, suối [33] Cây xoan ta có thể chịu được trong điều kiện mặn, lượng muối trong đất từ 0,4 - 0,5% Cây xoan ta không thích hợp những nơi đất bạc màu, khô hạn và ngập úng Trong điều kiện đất cằn cỗi, ngập nước cây sinh trưởng kém

Cây xoan ta ưa khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng, ẩm có hai mùa rõ rệt và chịu được giá lạnh Lượng mưa càng nhiều thì cây mọc càng tốt, rụng lá mùa khô, khi có mưa phùn thì cây bắt đầu nẩy lộc, ra hoa Xoan ta là cây tiên phong, ưa ánh sáng hoàn toàn, tái sinh rất mạnh trên đất bỏ hoá sau nương rẫy; ở độ cao trên 1000 m so với mực nước biển cây giảm khả năng sinh trưởng [3]

1.1.4 Giá trị sử dụng của cây xoan ta

Cây xoan ta trồng chủ yếu để lấy gỗ, gỗ xoan ta thuộc nhóm VI, có lõi màu hồng hoặc nâu nhạt, dác xám trắng, gỗ nhẹ và mềm Loại gỗ này có đặc điểm chịu nhiệt, chịu nén, chịu lực tốt Gỗ có khả năng chống được mối mọt và ít bị cong vênh hay bị nứt nẻ Trong xây dựng hay thiết kế nội thất, gỗ xoan ta sau khi ngâm dưới

nước trong thời gian từ sáu đến mười hai tháng giảm khả năng bị mối mục và vỡ [4] Do đó gỗ xoan ta có giá trị kinh tế cao và đang rất được ưa chuộng trên thị trường Gỗ xoan ta được dùng đóng nhiều đồ dùng sinh hoạt trong gia đình như cửa

gỗ, bàn ghế, tủ bếp Hiện nay gỗ xoan ta còn được dùng làm ván lót sàn, kệ bếp, đồ nội thất cao cấp hay gỗ xoan được dùng làm cột, kèo trong xây dựng nhà gỗ

Ngoài mục đích chủ yếu là lấy gỗ, các bộ phận khác của cây xoan ta cũng đều có nhiều công dụng và ứng dụng trong đời sống thực tế Lá xoan ta được sử dụng làm phân xanh, thuốc trừ sâu Lá non và vỏ cây có thể dùng để chiết xuất tinh dầu Quả xoan ta độc nên được dùng làm thuốc sát trùng Hiện nay lá và quả xoan ta còn được dùng làm nguyên liệu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

Than của cây xoan ta được được dùng làm thuốc súng hay các hoạ sĩ thường

sử dụng để vẽ tranh Đặc biệt, trong cây xoan ta chứa chất theraupic có tác dụng diệt côn trùng [24] Một số hợp chất triterpenoid trong cây xoan ta được sử dụng trong sản xuất thuốc ức chế một số loại ung thư ở người [29, 45, 46]

Đặc biệt, cây xoan ta còn được tận dụng trồng trên đất trống, đồi trọc với mục đích cải tạo đất, góp phần hạn chế sự rửa trôi, xói mòn ở vùng đầu nguồn, tạo việc làm và góp phần xóa đói giảm nghèo cho người dân miền núi Đây là một trong những mục tiêu lớn trong chiến lược phát triển lâm nghiệp ở nước ta

Trong điều kiện hiện nay, trước tình hình ngày càng xấu đi của môi trường thì xoan ta là một loài rất có tiềm năng trồng trọt và khai thác trong tương lai, đặc biệt với các giống xoan ta chuyển gen nâng cao tính chống chịu cũng như chất lượng gỗ

1.2 Các nghiên cứu cải tạo giống xoan ta

Theo QĐ số 16/2005/QĐBNN ngày 15/5/2005 của Bộ trưởng Bộ NN&PTNT, cây xoan ta đứng đầu trong danh mục cây trồng được ưu tiên phát triển bởi nhiều ưu điểm: cây xoan ta phân bố rộng từ Bắc đến Nam, là cây mọc nhanh,có tốc độ sinh trưởng phát tốt trên các loại đất đồi có hàm lượng dinh dưỡng thấp, là cây chịu hạn, tái sinh hạt hoặc phục hồi sau nương rẫy, có nhiều tác dụng và giá trị kinh tế cao nên nhân dân ta thường gây trồng phổ biến Tuy nhiên ngày nay xã hội

ngày càng phát triển dẫn đến diện tích đất thu hẹp, giảm số lượng cây xoan ta Bên cạnh đó, trong tự nhiên loài cây này sinh trưởng chậm, từ mười hai đến mười lăm năm mới thu được gỗ Vì vậy các nghiên cứu cải tạo giống xoan ta sinh trưởng nhanh, rút ngắn thời gian thu lấy gỗ là việc làm vô cùng cần thiết

1.2.1 Các nghiên cứu về xoan ta trên thế giới

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu trên đối tượng xoan ta phần lớn

tập trung vào nhân giống in vitro, chọn lọc cây trội nhằm phục vụ sản xuất cung cấp

giống cây lâm nghiệp hay các nghiên cứu ứng dụng chiết xuất hoạt chất của xoan ta sản xuất các chế phẩm sinh học Các nghiên cứu về tạo lập các dòng xoan ta mới cụ

thể như dòng xoan ta chuyển gen (GS1, GA20, 4CL1…), dòng xoan ta tam bội

không nhiều Một số nghiên cứu kể đến như:

Sharry và cộng sự (2006) đã tiến hành nghiên cứu tái sinh in vitro xoan ta

thông qua cảm ứng tạo phôi soma, tỉ lệ phôi tái sinh cao đạt 93% và tỉ lệ cây sống khi đưa ra trồng ở nhà lưới là 100% [40]

Indieka và cộng sự (2007) nghiên cứu tái sinh xoan ta thông qua phôi soma,

sử dụng phôi hạt và mảnh lá mầm từ cây mầm in vitro để tái sinh cây, mẫu cấy được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS có bổ sung BAP; NAA và 2,4-D Sau 4 tuần nuôi cấy có trên 60% mẫu cây cảm ứng tạo phôi soma [25]

Mroginski và cộng sự (2013) đã nghiên cứu nhân giống cây xoan ta từ chồi nách Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra: chồi tái sinh tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,1 mg/l GA và ra rễ trên môi trường 0,1 mg/l IBA [31]

1.2.2 Các nghiên cứu trên đối tượng xoan ta tại Việt Nam

Ở Việt Nam, những năm gần đây tập trung chú trọng việc tạo giống cây trồng mới nhằm đáp ứng nhu cầu giống cả trong và ngoài nước, mục tiêu tăng năng suất cũng như chất lượng để đáp ứng nhu cầu phát triển của xã hội là vô cùng quan trọng Vì thế các hướng đi về chọn tạo giống bằng các phương pháp truyền thống, hiện đại đang được triển khai

Đoàn Thị Mai và cộng sự (2003) nghiên cứu chọn và nhân giống cho xoan ta

và tếch có năng suất cao Kết quả đã chọn lọc được 79 cây trội xoan ta từ các phần

rừng trồng tại các tỉnh Hòa Bình, Điện Biên, Sơn La, Vĩnh Phúc Phú Thọ, Yên Bái, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Đồng Nai Các cây trội này có độ vượt

về chiều cao đạt từ 1,46 đến 2,75 lần độ lệch chuẩn [8]

Đỗ Xuân Đồng và cộng sự (2008) đã nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan

ta ( Melia azedarach L.) thông qua phôi soma từ thân mầm phục vụ chuyển gen

Theo đó, mẫu thân mầm được nuôi cấy trên môi trường bổ sung 1 mg/l BAP và 3 mg/l NAA có tỉ lệ hình thành mô sẹo là 92,2% Trên môi trường cảm ứng tạo phôi

có trung bình 12,7 phôi hình thành trên một đoạn thân ban đầu [5]

Bùi Văn Thắng và cộng sự (2013) đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển

gen vào cây xoan ta (Melia azedazach L.) bằng Agrobacterium đạt hiệu suất chuyển

gen cao (18,15%) và có độ ổn định và độ lặp lại Theo đó nghiên cứu sử dụng đoạn thân mầm của cây hạt 12 ngày tuổi làm thể nhận gen [12]

Nguyễn Văn Phong và cộng sự (2016) nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan

ta in vitro từ chồi cây xoan ta trội Kết quả cho thấy chồi cây xoan ta trội sau khi vô

trùng được nuôi cấy trên môi trường nhân nhanh có bổ sung 0,3 mg/l BAP và 0,2 mg/l kinetin cho hệ số nhân chồi đạt 4,86 0,03 chồi trên một mẫu [9]

1.3 Kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1.3.1 Các phương pháp chuyển gen thực vật

Cho đến nay đã có hơn 150 loài thực vật khác nhau được chuyển gen thành công Trong đó có ba phương pháp được thực hiện phổ biến: chuyển gen bằng phương pháp phi sinh học, chuyển gen bằng tế bào trần và chuyển gen gián tiếp nhờ

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chuyển gen bằng phương pháp phi sinh học

sử dụng súng bắn gen có ưu điểm là không phải phân hủy thành tế bào bằng enzyme

và theo lý thuyết thì có thể biến nạp vào mọi tế bào và mô Phương pháp này cho hiệu quả biểu hiện gen tạm thời ở hành, đậu tương, lúa và ngô, hiệu quả thấp, chỉ một số tế bào được biến nạp [7] Chuyển gen bằng tế bào trần, phương pháp có thể biến nạp vào bất kỳ loài thực vật nào, tuy nhiên lại gặp khó khăn trong việc tái sinh tạo cây hoàn chỉnh Cho nên phương pháp này ít được sử dụng trong chuyển gen

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có

những ưu điểm vượt trội: đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi các trang thiết bị hiện đại, ít tốn kém nhưng tạo ra được cây biến đổi gen mang đặc tính mới và DNA ngoại lai khi đưa vào tồn tại bền vững trong hệ gen Mặc dù hệ thống chuyển gen

gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium đã được kiểm chứng là có hiệu quả cao đối

với một số loài nhưng không phải tất cả thực vật có thể được biến nạp gen bằng con đường này Đặc biệt là đối với lớp thực vật một lá mầm bao gồm các loài cây ngũ

cốc như lúa, lúa mì, ngô…, việc chuyển gen thông qua Agrobacterium được đánh

giá là khá khó khăn Rivera và cộng sự thống kê đã có 1038 công trình khoa học

công bố sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium trong giai

đoạn từ 1985 - 1999 và 3604 công trình nghiên cứu trong giai đoạn từ 2000 - 2011

1.3.2 Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Năm 1970, các nhà khoa học đã phát hiện ra vi khuẩn A.tumefaciens có khả

năng kích thích tạo nên khối u tại vị trí vết thương của cây hai lá mầm Việc gây ra khối u này liên quan đến sự có mặt của một plasmid lớn gọi là Ti-plasmid (tumor

inducing-plasmid) cần thiết trong việc tạo khối u của vi khuẩn A.tumefaciens plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A.tumefaciens gây độc, kích thước

Ti-khoảng 200 – 250 kb Kết quả phân tích di truyền cho thấy Ti-plasmid bao gồm: đoạn T-DNA (transfer-DNA) mang những gen tạo khối u, tổng hợp auxin, cytokinin

và tổng hợp opine; hai vùng bờ trái (LB) và bờ phải (RB) chứa trình tự lặp lại dài 25bp là trình tự nhận biết cắt T-DNA; vùng phân giải opine; vùng khởi đầu sao

chép (ori); vùng vir bao gồm nhiều gen vir liên quan đến hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp và phân giải opine Cấu trúc của Ti-plasmid được miêu tả như hình 1.2

Hình 1.2 Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens [27]

Khi thực vật bị thương, các tế bào thực vật tiết ra các hợp chất phenol

(acetosyringone và hydroxyl acetosyringone) Các chất này sẽ thu hút A.tumefaciens tập trung vào vùng vết thương do Ti-plasmid chứa vùng vir (virulence) mã hóa một chất nhận biết acetosyringone đồng thời hoạt hóa tất cả gen vir Protein mã hóa bởi gen virD2 có vai trò là endonuclease, nhận biết và cắt tại bờ trái và bờ phải của T- DNA Sau đó, một sản phẩm khác của gen virE2 gắn vào sợi đơn T-DNA ngăn cản

sự gắn lại với Ti-plasmid Bằng cơ chế tổng hợp sửa chữa DNA, từ sợi đơn còn lại trong Ti-plasmid xuất hiện lại một T-DNA hoàn chỉnh Ngoài ra, một protein virD2 gắn vào đầu 5’ của T-DNA sợi đơn đã được cắt ra bằng liên kết đồng hóa trị Bằng cách này xuất hiện một phức hệ DNA-protein và được chuyển vào tế bào thực vật Khi đến tế bào thực vật phức hệ này đi vào nhân tế bào Protein virD2 và virE2 chứa trình tự định vị nhân đặc hiệu cho phép phức hệ đi qua màng nhân và gắn vào DNA thực vật một cách ngẫu nhiên ở những vị trí đứt gãy trên sợi DNA của tế bào thực vật [7] Quá trình lây nhiễm được mô tả cụ thể ở hình 1.3

Hình 1.3 Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens [22]

1 A.tumefaciens nhận dạng và tấn công tế bào chủ; 2 Tổ hợp tín hiệu VirA/VirG của A.tumefaciens cảm nhận những tín hiệu thực vật đặc trưng; 3 Sự hoạt hóa của vùng gen vir; 4 T-DNA được tách ra khỏi plasmid nhờ phức hợp protein

VirD1/D2; 5 Sự tạo thành phức hợp VirD2-DNA (T-complex chưa trưởng thành), cùng với một vài protein Vir khác, đi vào tế bào chất của tế bào chủ; 6 Sự kết hợp của VirE2 với T-strand tạo thành T-complex trưởng thành và đi xuyên qua tế bào chất của tế bào chủ; 7 T-complex trưởng thành chủ động đi vào nhân của tế bào chủ; 8 T-DNA bị hấp dẫn tới vị trí hợp nhất; 9 T-DNA tách khỏi các protein bảo vệ; 10 T-DNA hợp nhất vào genome tế bào chủ

Trong kỹ thuật chuyển gen, vi khuẩn A.tumefaciens được sử dụng như một

vector đặc biệt để chuyển các DNA ngoại lai vào thực vật nhằm tạo ra những thực

vật mang gen có đặc tính mong muốn Phương pháp chuyển gen thông qua A

tumefaciens đang được áp dụng trên một số đối tượng cây trồng lâm nghiệp và

mang lại những kết quả khả quan [4,5]

Nguyên liệu để tiến hành chuyển gen thông qua A tumefaciens rất đa dạng,

có thể là đoạn thân, mảnh lá, khối mô sẹo, phôi hạt… Tuy nhiên, phương pháp này cũng giống như phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen đó là đòi hỏi

có một hệ thống tái sinh và chọn lọc hiệu quả

1.4 Hệ thống tái sinh cây thông qua tạo mô sẹo xoan ta tam bội

Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng khá phổ biến, tạo sinh khối, sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học Các ứng dụng về nuôi cấy mô tế bào thưc vật nói riêng và công nghệ tế bào thực vật nói chung đang trở thành công cụ có hiệu quả trong việc tạo ra sản phầm đặc thù phục vụ con người Trong đó, mô sẹo (callus) là khối tế bào mô mềm không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do sự xáo trộn trong quá trình sinh cơ quan, nhất là

trong sự tạo rễ Trong nuôi cấy in vitro, từ một trong các cơ quan của thực vật như

thân, lá, rễ, hoa… dễ cho mô sẹo trong môi trường nuôi cấy bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin hay phối hợp với nhóm cytokinin và điều kiện nuôi cấy thích hợp [11,7]

Mô sẹo có thể được duy trì liên tục trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển định kỳ Khi cấy chuyển mô sẹo lên môi trường thích hợp có thể phát sinh chồi trực tiếp hoặc tạo phôi soma và phát triển thành cây hoàn chỉnh Đây là hệ thống nuôi cấy có thể được sử dụng để biến nạp gen đạt hiệu quả cao và cây chuyển gen phát sinh từ một tế bào mô sẹo không bị thể khảm [1]

Hơn nữa, mô sẹo làm cho tế bào được trẻ hóa rất cao, dễ dàng cho quá trình khuẩn xâm nhiễm vào trong mô sẹo mang các gen cần chuyển tái tạo lại bộ máy di truyền của tế bào thực vật Do đó, ứng dụng vật liệu mô sẹo trong các nghiên cứu chuyển gen vào xoan ta tam bội sẽ là hướng nghiên cứu mới mang lại hiệu quả cao

1.5 Gen GS1 và ứng dụng chuyển gen GS1 trong tạo giống cây trồng

1.5.1 Vai trò của nitơ đối với thực vật

Nitơ là một trong những nguyên tố dinh dưỡng khoáng thiết yếu của thực vật Nitơ có mặt trong rất nhiều hợp chất hữu cơ có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất, trao đổi năng lượng và các hoạt động sinh lý của cây Nitơ tham gia cấu trúc các đại phân tử (DNA, RNA, protein), ATP và tham gia cấu thành nên

tế bào và các bào quan của thực vật [10] Bên cạnh đó, nitơ cũng có mặt trong các chất điều hòa sinh trưởng của thực vật như 6-Benzylaminopurine, kinetin, indol butyric acid Do đó, nitơ tác động đến một loạt các quá trình sinh lý của thực vật như quá trình quang hướng động, địa hướng động; thay đổi giới tính của hoa; sự phân chia tế bào, sự nảy mầm, sự phát triển cơ quan của thực vật (nụ, chồi, quả); sự lão hóa (rụng lá) và trao đổi chất, vận chuyển chất dinh dưỡng trong cây [17] Vì vậy, trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển cây rất nhạy cảm với nitơ Trong trường hợp thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp đầy

đủ, lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, hoạt động quang hợp suy giảm dẫn tới giảm năng suất cây trồng

Nitơ cung cấp cho cây bắt nguồn từ nitơ trong không khí và trong đất Trong khí quyển nitơ tồn tại ở dạng nitơ phân tử (N2), chiếm tới 75,6% khối lượng không khí Tuy nhiên, cây không thể hút được nitơ dạng phân tử mà chỉ sử dụng được nitơ

ở dạng liên kết nhờ hoạt động của các vi sinh vật cố định nitơ [37] Ngoài ra, nguồn nitơ cung cấp cho thực vật còn tồn tại ở dạng các hợp chất vô cơ (NH4+, NO3-) trong đất và hợp chất hữu cơ trong xác động, thực vật, vi sinh vật

Trong cây, nitơ có thể được đồng hóa hoặc tái sử dụng thông qua các cơ chế đồng hoá nitơ từ môi trường và nitơ giải phóng từ quá trình quang hô hấp và các quá trình trao đổi chất khác như quá trình sinh tổng hợp phenyl propanoid và sự huy động nitơ trong một vài protein

Việc cải thiện hiệu quả sử dụng nitơ đối với thực vật nói chung và xoan ta tam bội nói riêng là một mục tiêu chính trong cải tiến cây trồng, giúp thực vật sử dụng nitơ tốt hơn đồng thời tăng năng suất, chất lượng cây trồng

Các nghiên cứu hóa sinh cho thấy trong tế bào, protein GS tồn tại ở hai dạng isozymes: glutamine synthetase tế bào chất (GS1) và glutamine synthetase lục lạp (GS2) GS1 có khối lượng phân tử trong khoảng từ 38 – 41 kDa và được tìm thấy trong tế bào chất của lá và các cơ quan không quang hợp; GS2 có khối lượng khoảng 44 kDa và chỉ xuất hiện trong lục lạp của các mô tham gia quang hợp và

plastid của rễ [16] Trên các loài thực vật bậc cao GS2 được mã hóa bởi một gen

trong khi GS1 được mã hóa bởi một họ gen [42] Gần đây, các nghiên cứu về họ

gen GS1 được nghiên cứu trên các đối tượng ngô, lúa, lúa mì, khoai tây và mía

đường Cây đậu Medicago truncatula chứa ba gen GS1 (MtGSa, MtGSb và MtGSc),

trong đó gen MtGSc không được biểu hiện, gen MtGSa biểu hiện cao trong các nốt sần, gen MtGSb biểu hiện cao hơn ở rễ và hạt [41] Trong cây Arabidopsis, GS1

được mã hóa bởi bốn gen GLN1;1, GLN1;2, GLN1;3 và GLN1;4 Trong rễ cây

Arabidopsis, các gen này chức năng bổ trợ cho nhau: GLN1;1 là isoenzyme có ái lực cao với NH3, được tích lũy trên bề mặt rễ trong điều kiện nguồn nitơ hạn chế và lượng NH3 dư; GLN1;2 xuất hiện trong mô mạch và có ái lực thấp với NH3, GLN1;4 có vai trò tương tự như GLN1;1 nhưng chỉ biểu hiện ở cây có lượng nitơ thấp hơn 1µM [26] Các gen trong họ gen GS1 đã được điều hòa để đáp ứng lại nguồn nitơ, tín hiệu stress từ môi trường Diana Bauer năm 2006 đã thực hiện các

nghiên cứu northern blot và phân tích miễn dịch trên cây cà chua (Lycopersicon esculentum L.) trong điều kiện khô hạn cho thấy biểu hiện của gen GS1 tăng cường

vận chuyển nitơ tạo ra glutamin để ứng phó với điều kiện khô hạn trong khi biểu

hiện của gen GS2 không thấy có sự thay đổi [13] Các nghiên cứu di truyền và phân

tử khác cũng đã đều cho thấy rằng GS1 có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình chuyển hóa nitơ và sử dụng hiệu quả nitơ ở cây cao hơn so với GS2 [23, 43] [14, 35] Việc tăng cường hoạt động của GS1 trong cây chuyển gen sẽ giúp cây sử dụng hiệu quả nguồn nitơ, tăng khả năng sinh trưởng và sinh khối của thực vật ngay

cả trong điều kiện nguồn nitơ hạn chế [36] Khi nghiên cứu vai trò của gen GS1 cho

thấy gen này còn tham gia quá trình tổng hợp prolin trong điều kiện khô hạn [15]

1.5.3 Ứng dụng chuyển gen GS1 trong tạo giống cây trồng

Cho đến nay, các nghiên cứu chọn tạo giống thông qua chuyển gen GS1 đã

có những tín hiệu tích cực về nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng Nghiên cứu Oliveira cho thấy cây thuốc lá chuyển gen GS1 có sự tăng trưởng về trọng lượng tươi, trọng lượng khô cao gấp 2 - 3 lần so với đối chứng và tăng trưởng tỉ lệ thuận

với nồng độ protein GS1 [36] Cây dương chuyển gen GS1 sinh trưởng nhanh hơn

so với cây đối chứng là 76% (cây 2 tháng tuổi); 21,3% (cây 6 tháng tuổi) [20]

Kết quả thu được tương tự đối với cây thân thảo [19, 30, 36] Từ đó, chỉ ra rằng chuyển gen GS1 có thể là cách tiếp cận thích hợp để nâng cao năng suất và cải thiện tăng trưởng của các loài cây rừng Fuentes và cộng sự (2001) cũng đã nghiên

cứu chuyển gen GS1 với sự điểu khiển promoter 35S vào cây thuốc lá, kết quả cho

thấy mức độ phiển mã và tổng hợp enzyme glutamine synthetase trong cây tăng cao Hoạt tính enzyme GS1 ở lá cây chuyển gen tăng cao hơn 6 lần so với cây đối chứng Dưới điều kiện có nguồn nitơ bình thường thì không ảnh hưởng lớn tới quang hợp và phát triển của cây chuyển gen Nhưng trong điều kiện nguồn nitơ bị hạn chế, cây chuyển gen phát triển phần thân tăng 70%, ở phần rễ tăng 100%, ở phần lá tăng 50% so với cây đối chứng không chuyển gen [19] Điều này hết sức có

ý nghĩa đối với cây nông nghiệp và đặc biệt là cây lâm nghiệp vì phần lớn các vùng đất được quy hoạch để trồng rừng chủ yếu là đồi núi trọc, đất bạc màu nghèo dinh

dưỡng Bên cạnh đó việc áp dụng các biện pháp canh tác tích cực đối với cây lâm nghiệp là rất khó khăn, những yếu tố hạn chế này làm cho năng suất rừng trồng

không cao Từ những kết quả nghiên cứu trên đây cho thấy gen GS1 là gen tiềm

năng để sử dụng cho việc chuyển gen vào cây xoan ta tam bội nhằm mục đích tạo ra các dòng xoan ta tam bội cải thiện được đặc tính sinh trưởng, cây sinh trưởng nhanh

và nâng cao được năng suất rừng trồng

1.6 Các phương pháp phân tích đánh giá cây chuyển gen in vitro và in vivo 1.6.1 Đánh giá chọn lọc cây chuyển gen in vitro

Các vector chuyển gen đều được thiết kế hệ thống gen chọn lọc kèm theo gen đích cho phép chọn lọc các mô, cây mang gen ở giai đoạn sớm bằng biểu hiện kháng của gen đó với các chất chọn lọc Các gen chọn lọc có thể là các gen kháng kháng sinh, kháng thuốc diệt cỏ, gen chỉ thị màu hoặc gen chuyển hóa các cơ chất chọn lọc Thực chất phân tích tính kháng của chất chọn lọc (kháng sinh, chất diệt cỏ) là chọn dòng tế bào, mô và cây mang tính kháng với chất chọn lọc thông qua hoạt động của gen chuyển Chất chọn lọc có thể là kháng sinh như kanamycin khi

dùng gen nptII hay hygromycine khi dùng gen hpt hoặc thuốc diệt cỏ basta khi dùng gen bar Bước phân tích này có thể áp dụng cho mọi giai đoạn sau khi biến nạp từ

trạng thái đơn bào đến mô sẹo, chồi tái sinh, cây hoàn chỉnh hay cây non gieo từ hạt

và có thể tiến hành in vitro hoặc in vivo

Cách thức tiến hành: Bổ sung chất chọn lọc theo nồng độ nhất định vào môi trường nuôi cấy sau đó quan sát ảnh hưởng lên đối tượng chọn lọc là mô hoặc cây Đối với các mô không mang gen chuyển biểu hiện thường thấy là mất khả năng tạo lục lạp, mô chuyển nâu đen và chết Đối với các chồi không mang gen chuyển sẽ không tạo được rễ dù được chuyển sang môi trường có nồng độ chất kích thích ra rễ cao do bộ rễ rất nhạy cảm với chất chọn lọc

1.6.2 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Khi được biến nạp vào tế bào, gen ngoại lai có thể tồn tại trong tế bào chủ ở

ba trạng thái: trạng thái tạm thời ở dạng DNA tự do; trạng thái lâu dài dưới dạng một thể plasmid có khả năng nhân lên độc lập hoặc trạng thái ổn định như một đoạn

DNA của genome tế bào chủ Khi tạo cây trồng biến đổi gen trạng thái được mong muốn nhất chính là trạng thái ổn định của gen ngoại lai trong tế bào chủ bởi tính bền vững của nó Khi gen ngoại lai tồn tại ổn định trong genome tế bào chủ và được phiên mã, dịch mã cùng genome tế bào để biểu hiện tính trạng mong muốn thì quá trình chuyển gen tạo sinh vật biến đổi gen mới được coi là thành công Chính vì thế, việc sử dụng các biện pháp sinh học phân tử nhằm kiểm tra sự có mặt cũng như mức độ biểu hiện của gen đó trong tế bào là bước làm cần thiết và quan trọng trong quá trình tạo sinh vật biến đổi gen nói chung và cây trồng biến đổi gen nói riêng

1.6.2.1 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

Trong phân tích cây chuyển gen, gen chuyển đã được biết trình tự vì vậy chỉ cần sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen đó và tách chiết DNA từ mẫu thực vật cần xác định làm khuôn là có thể tiến hành PCR (Polymerase chain reaction) Sử dụng plasmid mang gen chuyển làm đối chứng dương, nếu sản phẩm PCR khi điện di có kích thước đúng như dự kiến và bằng với đối chứng thì mẫu phân tích được coi là dương tính

Tuy nhiên, kết quả PCR dương tính không đồng nghĩa với việc quá trình chuyển gen đã thành công, do trong một số trường hợp mà gen không được chuyển vào genome tế bào chủ nhưng vẫn xuất hiện trong DNA tổng số của mẫu phân tích:

(1) Có thể do vi khuẩn A tumefaciens mang gen mục tiêu vẫn còn tồn tại trong khối

mô hay trong gian bào của các mẫu phân tích, gen mục tiêu hoàn toàn chưa được chuyển vào hệ gen vật chủ Hiện tượng này gọi là hiện tượng dương tính giả Nếu mẫu phân tích là của loài thực vật đã trải qua nhân giống hữu tính thì trường hợp này được loại trừ (2) Gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất tức có thể biến mất qua sinh sản hữu tính, gen chuyển không được di truyền lại nên quá trình chuyển gen không có ý nghĩa (3) Gen chuyển tuy đã gắn vào genome tế bào nhưng lại không được biểu hiện do nhiều lý do, do đó cây không thể hiện được tính trạng mong muốn Vì các lý do trên mà kết quả của phản ứng PCR chỉ có giá trị định hướng ban đầu cho quá trình đánh giá, phân tích cây trồng biến đổi gen Tuy nhiên,

nó vẫn một kỹ thuật hữu ích trong việc phân tích cây chuyển gen nhờ khả năng nhân nhanh một cách chính xác các đoạn DNA quan tâm

1.6.2.2 Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp Southern blot

Trong xác định cây chuyển gen, kỹ thuật lai Southern blot là phương pháp tin cậy và thông dụng nhất và được ứng dụng nhằm xác định số bản copy trong cây chuyển gen Ngoài việc khẳng định sự tồn tại của gen chuyển trong genome cây nhận thông qua lai DNA tổng số của mẫu phân tích với DNA mẫu dò, lai Southern còn cho biết số lượng bản sao đã được đưa vào cây nhận thông qua số lượng băng vạch dương tính trên phim

1.6.3 Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây chuyển gen

Để đánh giá một quá trình nhân giống cũng như chọn tạo các dòng thực vật mới chuyển gen có thành công hay không, đòi hỏi cây con phải thích nghi được với điều kiện tự nhiên, sinh trưởng phát triển tốt Tùy thuộc vào đặc tính tính trạng của gen chuyển mà các phương pháp phân tích có thể khác nhau Đối với tính kháng virus, kháng vi khuẩn hay kháng nấm được thử bằng cách lây nhiễm nhân tạo tại các phòng thí nghiệm về bệnh học thực vật với các chủng virus, vi khuẩn hoặc nấm Sau đó, để khẳng định chính xác tính kháng cần thực hiện bước tiếp theo là kiểm tra tính kháng trên đồng ruộng có lây nhiễm nhân tạo Đối với tính trạng là tính chống chịu thường được kiểm tra bằng thí nghiệm gây điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhân tạo, tuy nhiên đây là việc làm tương đối khó khăn, bởi vì điều kiện bất lợi ngoài tự nhiên luôn đan xen, dễ thay đổi và khó dự báo trước Đối với các gen cải tiến chất lượng cây trồng hoặc gen sinh trưởng nhanh các phân tích được tiến hành tương đối

dễ dàng Khi quan tâm đến tính trạng chất lượng nào và chuyển những gen phù hợp thì sẽ tiến hành các phân tích về chỉ tiêu chất lượng đó, ví dụ tăng hàm lượng β-carotene thì phân tích trực tiếp hàm lượng chất này bằng khối phổ, tăng chất lượng tinh bột, tăng độ dẻo của hạt gạo thì xác định hàm lượng amylose Đối với gen GS1 tăng cường hiệu quả đồng hóa và tái sử dụng nitơ giúp cây sinh trưởng nhanh các chỉ tiêu sinh trưởng như đường kính thân, chiều cao cây, diện tích lá có thể coi là một thước đo so sánh giữa cây chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Cây xoan ta tam bội được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu nhờ các đặc điểm về tăng số lượng thể nhiễm sắc có thể làm tăng thêm các tổ hợp gen mới và tăng khả năng biến dị, tăng tính thích ứng với môi trường mới (Gill và Singhall, 1998) Cây xoan ta tam bội tạo được dòng bất thụ do quá trình phân bào giảm nhiễm diễn ra không bình thường, phần lớn các giao tử mang số nhiễm sắc thể trung gian n và 2n nên không có sức sống Vì thế, việc sử dụng cây xoan ta tam bội trong chọn giống cây trồng nhằm tạo những cây trồng mới có đặc điểm tốt và có khả năng sinh trưởng mạnh chất lượng tốt phù hợp với nhu cầu mà dòng bình thường không

có được đang là một phương pháp chọn giống rất độc đáo và có hiệu quả bởi những

đặc điểm của nó mang lại Đối tượng cây xoan ta tam bội in vitro đã được chọn tạo

thành công và cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp (hình 2.2)[44]

Hình 2.1 Biểu đồ phân tích dòng chảy tế bào của các dòng xoan ta [44]

A Cây xoan ta nhị bội, B Cây xoan ta tam bội

Cây xoan ta tam bội in vitro được nuôi cấy trong môi trường nhân nhanh tạo

đa chồi MS + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l kinetin + 3% sucrose + 6,8 g aga, pH 5,8, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 20

C

Hình 2.2 Cây xoan ta tam bội in vitro

2.1.2 Vật liệu di truyền

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen

pBI121/GS1 được phòng thí nghiệm công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam cung cấp Vector pBI121

mang gen chuyển GS1 có kích thước khoảng 13 kb và gen chỉ thị chọn lọc nptII

(neomycine phospho transferase gene) được điều khiển bởi NOS promoter, do đó, chỉ có những thể biến nạp gen mới sống được trên môi trường có bổ sung thêm

kháng sinh kanamycin

Hình 2.3 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/GS1

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Phòng thí nghiệm Công nghệ gen và Di truyền phân tử, Vườn ươm cây giống, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp NAA và BAP đến khả năng tạo mô sẹo

và xác định môi trường thích hợp cho tạo mô sẹo;

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh kanamycin đến khả năng chọn lọc và xác định nồng độ kháng sinh thích hợp cho chọn lọc;

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh kanamycin đến khả năng ra

rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen

- Xác định cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR, kỹ thuật Southern blot và phương pháp điện di gel agarose

- Đánh giá sinh trưởng của các dòng cây chuyển gen ở giai đoạn vườn ươm

và nhà lưới

+ Đánh giá sinh trưởng về chiều cao của các dòng cây chuyển gen;

+ Đánh giá sinh trưởng về đường kính của các dòng cây chuyển gen

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nuôi cấy tạo mô sẹo xoan ta tam bội

Cây xoan ta tam bội in vitro được sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm như sau: Thân cây xoan ta tam bội in vitro được cắt thành từng đoạn ngắn, có chiều dài từ 0,5 - 1 cm Sau đó các đoạn thân in vitro được nuôi cấy trên môi trường MS +

20g/l sucrose + 6 g/l aga, bổ sung thêm NAA và BAP ở các nồng độ khác nhau để đánh giá khả năng tạo mô sẹo Thí nghiệm được bố trí trên các công thức thí nghiệm:

ĐC: MS

- Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo = X 100%

- Chất lượng mô sẹo: đánh giá các chỉ tiêu hình dạng, màu sắc, độ xốp,… Thời gian thu thập: Sau 4 tuần nuôi cấy

2.3.2 Chuyển gen GS1 vào mô sẹo xoan ta tam bội

Dựa theo quy trình chuyển gen vào cây xoan ta (Melia azedazach L.) đạt hiệu suất cao thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được nghiên cứu

hoàn chỉnh [12], chúng tôi tiến hành chuyển gen vào mô sẹo xoan ta tam bội theo quy trình dưới đây

2.3.2.1 Chuẩn bị vi khuẩn A tumefaciens cho chuyển gen

Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: Chủng vi khuẩn A tumefaciens LBA4404 chứa

vector chuyển gen pBI121-GS1 được bảo quản trong glycerol ở - 850C Nuôi hoạt hóa khuẩn bằng cách cấy trải lên môi trường LB đặc bổ sung 100 mg/l rifamycin và

50 mg/l kanamycin Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 280C trong 48 giờ

Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A tumefaciens: Chọn một khuẩn lạc cho vào

2ml môi trường LB lỏng bổ sung 100 mg/l rifamycin và 50 mg/l kanamycin Nuôi lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 280C, trong 14 - 16 giờ Sau đó tiến hành hút 1ml dịch

vi khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng Nuôi lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 280C, trong 4

- 5 giờ Ly tâm vi khuẩn ở nhiệt độ 40C, tốc độ 4000 vòng/phút, trong 10 phút Loại

bỏ dịch nổi và hoà tan cặn vi khuẩn trong môi trường 1/2 MS, pha loãng cho tới khi dịch có OD600 đạt ≈ 0,5, sau đó bổ sung 200µM acetosyringone Dịch huyền phù này có thể dùng biến nạp ngay hoặc giữ ở 4o

C trong 1 - 2 giờ

Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn A.tumefaciens

LB đặc 5 g/l Yeast extract + 10 g/l NaCl + 10 g/l

Trypton + 15 g/l Bactor agar, pH =7

LB lỏng 5 g/l Yeast extract + 10 g/l NaCl + 10 g/l

Tryptone, pH = 7 Môi trường tạo dịch huyền phù

vi khuẩn Môi trường cơ bản ½ MS không đường

2.3.2.2 Chuyển gen và tái sinh chồi chuyển gen

a) Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy

Đặt mẫu mô sẹo chuẩn bị cho biến nạp vào bình chứa dịch huyền phù vi

khuẩn A tumefaciens và lắc nhẹ trong 30 phút Sau đó thấm khô mẫu bằng giấy

thấm vô trùng và chuyển mẫu sang môi trường đồng nuôi cấy: MS + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l kinetin + 3% sucrose + 6,8 g/l agar + 200 µM AS, pH=5,8) Đồng nuôi cấy ở nhiệt độ 250C, trong buồng tối 48 giờ để vi khuẩn xâm nhiễm và chuyển gen sang tế bào thực vật

b) Rửa khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen

Các mẫu sau khi đồng nuôi cấy được rửa sạch vi khuẩn bằng dung dịch 500mg/l cefotaxime Thấm khô mẫu rồi chuyển lên môi trường tái sinh chọn lọc

2.3.3 Chọn lọc thể nhận gen bằng kháng sinh kanamycin

Đối với quá trình chuyển gen, việc chọn lọc và xác định các cá thể mang gen

là việc vô cùng quan trọng Để công tác chọn lọc hiệu quả cần thiết lập được một môi trường chọn lọc với ngưỡng phù hợp để có thể loại bỏ phần lớn các cá thể

không mang gen chuyển đồng thời giữ lại được toàn bộ các cá thể đã được chuyển gen Do đó, vector chuyển gen pBI121/GS1 ngoài mang gen chuyển được điều

khiển bởi promoter 35S còn mang thêm gen kháng kháng sinh kanamycin (nptII)

dưới sự điều khiển của NOS-promoter, gen này được biểu hiện cùng với gen đích nên biểu hiện của gen này được đánh giá sơ bộ là mang gen đích Do đó gen kháng kanamycin được coi là yếu tố chọn lọc cá thể mang gen chuyển Vì vậy chúng tôi tiến hành xác định ngưỡng nồng độ của kháng sinh kanamycin để chọn lọc hiệu quả

cây xoan ta tam bội chuyển gen

2.3.3.1 Đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng kháng sinh kanamycin đến khả năng sống của mô sẹo

Các mẫu mô sẹo xoan ta tam bội chưa chuyển gen GS1 được cấy chuyển lên

môi trường tái sinh chọn lọc: MS + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l kinetin + 3% sucrose + 6,8 g/l agar + 300 mg/l cefotaxime, pH=5,8 bổ sung kanamycin với các hàm lượng khác nhau (0, 75, 100, 125, 150, 200, 250 mg/l) để xác định nồng độ kháng sinh chọn lọc phù hợp phục vụ cho quá trình chọn lọc mẫu chuyển gen

Nuôi trong điều kiện: thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng

2000 lux, nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 20C để mẫu tái sinh Trong ba tuần đầu tiên là lần chọn lọc 1 Các mẫu sống sót được chuyển sang môi trường chọn lọc lần 2, lần

3 trong thời gian ba tuần nuôi cấy tiếp theo Thí nghiệm được thực hiện lặp lại ba

lần, 150 mẫu nghiên cứu cho một nồng độ thử nghiệm

2.3.3.2 Chọn lọc thể nhận gen GS1 in vitro

Các mẫu mô sẹo sau đồng nuôi cấy với vi khuẩn mang gen GS1 (CG) và mẫu

mô sẹo không chuyển gen được chọn làm đối chứng (wt) được nuôi cấy trong môi trường tái sinh chọn lọc tối ưu từ phương pháp 2.4.3.1 và điều kiện nuôi cấy tương

tự nhằm chọn lọc được các mẫu mang gen GS1

2.3.3.3 Đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng kháng sinh kanamycin đến khả năng

ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen

Các chồi xoan ta tam bội không chuyển gen sống sót sau 9 tuần nuôi cấy chọn lọc với kháng sinh kanamycin được tách ra và nuôi cấy độc lập trên môi

trường nhân nhanh MS + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l kinetin + 3% sucrose + 6,8 g/l agar để tăng số lượng chồi Sau đó, tiến hành chọn lọc ra các chồi có chiều dài lớn hơn 2cm, cắt và nuôi cấy trên môi trường ra rễ chọn lọc (½ MSI* bổ sung 0,5 mg/l IBA + 1,5% sucrose + 6,8 g/l agar, pH=5,8) bổ sung kanmycin với hàm lượng khác nhau (0, 25, 50, 75, 100 mg/l), 20 chồi xoan ta tam bội không chuyển gen được đưa

ra thử nghiệm cho mỗi công thức thí nghiệm với 3 lần lặp lại

Điều kiện nuôi cấy: nuôi trong tối 5 ngày đầu sau đó chuyển ra nuôi dưới ánh sáng dàn đèn với cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ phòng nuôi cấy 25±20C Sau 3 tuần nuôi cấy thống kê kết quả

Sau khi tiến hành chọn lọc được công thức chọn lọc ra rễ tối ưu, tiến hành áp dụng cho chồi xoan ta tam bội chuyển gen (CG) để chọn lọc được những dòng xoan

ta tam bội có khả năng mang gen chuyển Đối chứng tương ứng là các chồi xoan ta tam bội không chuyển gen (wt)

2.3.4 Xác định cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

2.3.4.1 Phương pháp tách chiết DNA hệ gen từ mẫu lá xoan ta tam bội in vitro

- Hòa tan cặn trong 50µl nước deion và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%

- Bảo quản DNA tổng số ở -20oC

2.3.4.2 PCR với mồi đặc hiệu của gen GS1

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện PCR nhân các đoạn gen GS1 sử dụng cặp mồi của gen GS1 có 2 điểm bắt cặp đặc hiệu: 1 điểm bắt cặp bổ sung với trình tự của gen GS1, 1 điểm bắt cặp trên trình tự vector Trình tự các mồi được thể

hiện như được trình bày ở bảng 2.2, các thành phần cho phản ứng PCR được đưa ra

ở bảng 2.3 và theo chu kỳ nhiệt ở hình 2.4 Khi nhân dòng gen GS1 với cặp mồi này thì nếu kiểm tra dương tính với gen GS1 sẽ cho sản phẩm PCR với kích thước lý

thuyết là 528bp

Bảng 2.2 Trình tự các mồi tham gia phản ứng PCR