Nghiên cứu đặc điểm kháng khuẩn của vi khuẩn lactic phân lập từ một số thực vật ở việt nam

Chúng có khả năng kháng các vi sinh vật gây hỏng trong thực phẩm như Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella… Do tính chất an toàn đối với con người

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Quỳnh Uyển

TS Lê Hồng Điệp

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quỳnh Uyển, cán bộ Viện

Vi sinh học và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm, giúp tôi hoàn thành luận văn theo đúng định hướng ban đầu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

TS Lê Hồng Điệp, cán bộ tại Bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

CN Hoàng Thu Hà, CN Lê Hồng Anh cùng toàn thể cán bộ, sinh viên tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình làm thực nghiệm

Đề tài “Đánh giá nguồn gen vi khuẩn lactic bản địa định hướng ứng

dụng trong thực phẩm, dược phẩm và thức ăn chăn nuôi” - Bộ khoa học và

Công nghệ đã hỗ trợ hóa chất, dụng cụ thí nghiệm trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè và các anh chị đồng học luôn ở bên giúp đỡ, động viên, khích lệ tôi vượt qua những khó khăn trong thời gian học tập suốt 2 năm vừa qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Mỹ Lệ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Sơ lược về các loài thực vật dùng trong nghiên cứu 2

1.2 Vi khuẩn lactic (Acid lactic Bacteria - LAB) 4

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 4

1.2.2 Trao đổi chất của vi khuẩn lactic 6

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic 7

1.2.4 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 9

1.3 Bacteriocin 10

1.3.1 Định nghĩa 11

1.3.2 Phân loại 11

1.3.3 Cơ chế hoạt động của bacteriocin 13

1.3.4 Phương pháp tinh sạch bacteriocin 14

1.3.5 Lợi ích và hạn chế của bacteriocin 16

1.3.6 Ứng dụng của bacteriocin 17

1.3.7 Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ LAB 19

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguyên liệu 23

2.1.1 Nguồn phân lập 23

2.1.2 Nguồn vi sinh vật 23

2.1.3 Môi trường, hóa chất và thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 26

2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 27

2.2.3 Xác định hoạt tính và hoạt độ bacteriocin 27

2.2.4 Phương pháp định danh vi sinh vật bằng sinh học phân tử 28

2.2.5 Nghiên cứu điều kiện phù hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 30

2.2.6 Một số tính chất của bacteriocin 30

2.2.7 Tinh sạch bacteriocin 31

2.2.8 Phương pháp thống kê sinh học 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh bacteriocin và định danh 34

3.1.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 34

3.1.2 Hoạt độ bacteriocin của chủng UL830 36

3.1.3 Định danh chủng UL830 37

3.2 Nghiên cứu điều kiện phù hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng vi khuẩn L plantarum UL830 37

3.2.1 Thời gian nuôi cấy 37

3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy 38

3.3 Một số tính chất của bacteriocin từ chủng vi khuẩn L plantarum UL830 39

3.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 39

3.3.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin từ chủng UL830 42

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin từ chủng UL830 43

3.3.4 Ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến hoạt tính bacteriocin từ chủng UL830 44

3.4 Tinh sạch bacteriocin 45

3.4.1 Kết quả tinh sạch bacteriocin bằng sắc ký trao đổi cation 45

3.4.2 Kết quả tinh sạch bacteriocin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 47

KẾT LUẬN 49

KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(High-Performance Liquid Chromatography)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tác dụng y học của 10 loài thực vật 2

Bảng 1.2 Một số bacteriocin quan trọng sinh tổng hợp bởi Lactobacilli [83] 12

Bảng 1.3 Tinh sạch một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi LAB [60] 15

Bảng 2.1 Các chủng vi khuẩn kiểm định 23

Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật gây bệnh 24

Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập 34

Bảng 3.2 Khả năng kháng vi khuẩn kiểm định của các chủng lựa chọn 35

Bảng 3.3 Hoạt độ bacteriocin sinh tổng hợp bởi chủng UL830 36

Bảng 3.4 Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn 41

Bảng 3.5 Tinh sạch bacteriocin của chủng L plantarum UL830 bằng sắc ký trao đổi cation 46

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cơ chế hoạt động của bacteriocin [82] 14 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm 26 Hình 2.2 Cách pha loãng mẫu theo hệ số 2 27 Hình 3.1 Kết quả điện di DNA genome của chủng UL830 (A) và điện di sản phẩm

PCR khuếch đại gen 16S rDNA (B) 37

Hình 3.3 Hoạt tính bacteriocin của chủng L plantarum UL830 tại các nhiệt độ nuôi

cấy khác nhau 39 Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của chủng UL830 40

Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin từ chủng L plantarum

UL830 42

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin từ chủng L plantarum

UL830 43 Hình 3.7 Ảnh hưởng của trypsin (A) và chymotrypsin (B) đến hoạt tính bacteriocin

từ chủng L plantarum UL830 44

Hình 3.8 Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng UL830 qua cột Hitrap SP FF 1 mL 45 Hình 3.9 Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn rửa giải 46 Hình 3.10 Sắc ký phân tích HPLC của bactericoin sinh tổng hợp bởi chủng UL830 47 Hình 3.11 Kết quả kiểm tra hoạt tính bacteriocin các đỉnh HPLC 48

MỞ ĐẦU

Thực phẩm chứa mầm bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người và là nguyên nhân chính gây ra các dịch bệnh Mặc dù các tiến bộ kỹ thuật trong công nghệ và nguyên tắc về vệ sinh an toàn thực phẩm (GMP, HACCP,…) đã được áp dụng, nhưng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế biến thực phẩm ngày càng tăng Chính vì thế, các chất bảo quản hóa học được sử dụng tràn lan Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các chất phụ gia trong thực phẩm gây ra tác dụng không mong muốn cho người tiêu dùng Do đó, việc tìm ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ nguồn gốc tự nhiên, an toàn và đặc hiệu đang được quan tâm

Trước những yêu cầu trên, vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn được tập trung nghiên cứu nhiều nhất do chúng có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn như acid lactic, hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl, bacteriocin, reuterin và reutericyclin Trong đó, bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn thu hút được nhiều sự quan tâm Chúng có khả năng kháng các vi sinh vật gây hỏng trong thực phẩm như

Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella… Do

tính chất an toàn đối với con người và cả động vật, LAB đã được ứng dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm và là đối tượng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong những năm qua

Việt Nam là nước nhiệt đới gió mùa với nguồn động thực vật phong phú Nguồn thực vật dồi dào, gần gũi với đời sống con người như lá lô hội, ngải cứu, rau muống, lá sung… không chỉ là thực phẩm hàng ngày mà còn có tác dụng

trong y học Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm

kháng khuẩn của vi khuẩn lactic phân lập từ một số thực vật ở Việt Nam”

Mục tiêu ban đầu là phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và định danh Qua đó, xác định ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, enzyme tiêu hóa đến hoạt tính bacteriocin và sơ bộ tinh sạch bacteriocin nhằm góp phần làm phong phú thêm những thông tin cũng như tiềm năng ứng dụng từ bacteriocin được sinh tổng hợp từ vi khuẩn LAB

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Sơ lược về các loài thực vật dùng trong nghiên cứu

Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật rất phong phú và đa dạng Thống kê cho thấy ở Việt Nam có đến 12000 loài thực vật có mạch bậc cao, sinh trưởng trong các điều kiện sinh thái và hình thành các kiểu thảm thực vật khác nhau [2] Từ trước đến nay có rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu các cây thuốc và vị thuốc

để chữa trị các bệnh như: GS Đỗ Tất Lợi (1999) trong cuốn “Những cây thuốc và vị

thuốc Việt Nam” giới thiệu 800 cây để làm thuốc; sách “Cây thuốc Việt Nam” của

lương y Lê Trần Đức (1997) có ghi 830 cây thuốc; TS Võ Văn Chi (1997) với cuốn

“Từ điển cây thuốc Việt Nam” có ghi 3200 cây thuốc trong đó có cả các loài cây thuốc nhập ngoại… Theo tài liệu của Viện dược liệu (2000) thì Việt Nam có đến

3820 loài cây làm thuốc Nhưng qua điều tra tìm hiểu thì con số này có thể được nâng lên vì kiến thức sử dụng cây thuốc của người dân còn chưa đầy đủ Ngoài công dụng làm thực phẩm trong cuộc sống hàng ngày thì một số tác dụng y học của mười loài thực vật được chọn làm đối tượng nghiên cứu được trình bày trong Bảng 1.1 dưới đây:

3

Rau muống

Ipomoea aquatica Forssk, họ

Khoai lang Convolvulaceae

- Thanh nhiệt, giải các chất độc xâm nhập vào cơ thể (nấm độc, sắn độc, cá thịt độc,

lá ngón, khuẩn độc hoặc do côn trùng, rắn rết cắn ), mưng nhọt, quai bị, lở ngứa, loét ngoài da; rôm sẩy, sởi, thủy đậu…[2]

- ruột, tiêu hóa kém, đau nhức xương khớp, sốt rét [12]

Artemisia vulgris L, họ Cúc

- Chữa trị các bệnh như kinh nguyệt không đều, bụng lạnh đau, tử cung lạnh

Asteraceae không thể có thai, trị mụn trứng cá, mẩn

ngứa, tẩy tế bào chết, giúp máu lưu thông mạnh hơn, các cơ đang bị đau và chỗ bị sưng hay viêm [5]

10

Húng quế

Ocimum basilicum L., họ

Hoa môi Lamiaceae

- Chữa cảm cúm, ho, kinh nguyệt không đều, thấp khớp, dùng ngoài da trị rắn cắn

và sâu bọ đốt, viêm da, giảm đau, chữa đau dạ dày, kém tiêu hóa, chữa đau sâu răng [1]

1.2 Vi khuẩn lactic (Acid lactic Bacteria - LAB)

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (Acid lactic Bacteria - LAB) là nhóm thu nhận năng lượng

nhờ quá trình phân giải carbohydrate kị khí và sinh ra acid lactic Chúng thuộc họ

Lactobacteriaceae, không hình thành bào tử, Gram dương, hình que hoặc hình cầu,

không di động, phản ứng oxidase và catalase âm tính [17] Vi khuẩn lactic bao gồm

các chi: Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,

Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus Symbiobacterium, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella và Bifìdobacterium

[31,51] Trong đó, các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus, Lactococcus và

Enterococcus được ứng dụng nhiều trong lên men thực phẩm Những vi sinh vật

này góp phần tạo hương vị cho sản phẩm và ức chế vi khuẩn gây bệnh bằng cách tạo các hợp chất kháng khuẩn như acid lactic cùng với các acid hữu cơ khác, hydrogen, peroxide, peptide kháng khuẩn và bacteriocin [26,28,35]

 Lactobacillus

Lactobacillus là chi lớn nhất trong bộ Lactobacillales với hơn 80 loài và phân loài

được công nhận [61] Các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus là Gram dương, không sinh bào tử, không di động và catalase âm tính Các chủng Lactobacillus có thể thực hiện trao

đổi chất theo cả hai con đường lên men đồng hình và dị hình Nhiệt độ tăng trưởng dao động từ 2 đến 53oC và chúng có thể phát triển trong khoảng pH từ 3 đến 8 nhưng điều kiện tăng trưởng tối ưu thường là 30 - 40oC và pH 5,5 - 6,2 [64] Chúng phân bố rất nhiều trong tự nhiên và nhiều loài đã được ứng dụng trong thực phẩm do chúng có mặt trong cơ thể người (khoang miệng, đường tiêu hóa, ) và trong một số thực phẩm lên men như thịt, sữa, rau quả, ngũ cốc [42]

 Lactococcus

Chi Lactococcus được phát sinh từ một nhánh của chi Streptococcus Những nghiên cứu gần đây cho thấy chi này có 5 loài, gồm L lactis, L garviae, L plantarum,

L raffinolactis, L piscum; trong đó loài L lactis có 3 dưới loài là L lactis subsp lactis;

L lactis subsp cremoris và L lactis subsp hordniae [74] Chúng làvi khuẩn Gram dương, hình cầu, dị dưỡng, ưa ẩm và không sinh bào tử Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là

30oC nhưng chúng có thể tồn tại ở 10oC và không sống sót ở 45oC Ngoài ra các chủng

Lactococcus có khả năng tăng trưởng trong môi trường có pH từ 3,5 - 9,2 nhưng bị

chết ở pH 9,6 cũng như tồn tại được trong môi trường có nồng độ NaCl thấp hơn 6,5% Chúng được ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa, sản xuất protein tái tổ hợp và mới nhất hiện nay là sử dụng trong các liệu pháp điều trị chống lại các bệnh truyền nhiễm và không truyền nhiễm [71]

 Enterococcus

Chi Enterococcus thuộc Gram dương, không bào tử, catalase âm tính, oxidase âm tính và kị khí Theo Foulquie´ Moreno và cộng sự, đến năm 2006, có 28

loài là E asini, E avium, E canis, E casseliflavus, E cecorum, E columbae, E

dispar, E durans, E faecalis, E faecium, E flavescens, E gallinarum, E gilvus, E haemoperoxidus, E hirae, E malodoratus, E moraviensis, E mundtii, E pallens,

E phoeniculicola, E pseudoavium, E raffinosus, E ratti, E saccharolyticus, E saccharominimus, E solitarius, E sulfureus và E villorum đã được phát hiện Nhiệt

độ sinh trưởng dao động từ 10 đến 45oC, nhưng tối ưu là ở 35oC Ngoài ra, các

chủng Enterococcus cũng có thể phát triển trongmôi trường chứa NaCl 6,5%, ở pH 9,6 và chúng tồn tạiở -60oC trong 30 phút [39]

1.2.2 Trao đổi chất của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic được chia thành hai nhóm dựa trên đặc điểm lên men:

 Lên men đồng hình: sản xuất hơn 85% acid lactic từ glucose

Các vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP (Embden - Meyerhof - Parnas Pathway)

Phương trình tóm tắt của quá trình lên men đồng hình như sau:

C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3CHOHCOOH + 2ATP

Glucose Acid lactic

Một số vi khuẩn lactic lên men đồng hình thường gặp là Lactococus lactis,

L.casei, L delbrueckii, Streptococcus cermoris… [40,43]

 Lên men dị hình: sản xuất chỉ 50% acid lactic và một lượng ethanol,

acid acetic và CO2

Phương trình tóm tắt của quá trình lên men dị hình như sau:

C6H12O6 CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + CO2 + xKcal

Glucose Acid lactic Ethanol

Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình thường gặp là L amylovorus, L

reuteri, L manihotivorans, Leucnostoc, Oenococcus, Weissella [40,43]

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic

1.2.3.1 Carbohydrate

Carbohydrate là nguồn cung cấp carbon và năng lượng chính cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic bằng cách tạo ra các hợp chất khác nhau (chủ yếu là acid lactic) thông qua quá trình lên men Ngoài ra, carbon cũng có thể được lấy từ protein, acid amin và glycerol Vi khuẩn lactic sử dụng được hầu hết các loại đường, nhưng glucose là nguồn carbon thích hợp nhất và tùy từng loại LAB khác

nhau mà nguồn carbon phù hợp được lựa chọn Ví dụ, L acidophilus đã cho thấy tăng trưởng tốt hơn khi glucose được thay thế bằng maltose; S thermophilus thường

sử dụng đường lactose không phải glucose Sự khác biệt về nhu cầu đường có thể được sử dụng để phân lập và nhận dạng các chủng LAB MRS được bổ sung

fructose thích hợp cho việc tuyển chọn chủng L bulgaricus và MRS có maltose để lựa chọn chủng L acidophilus Nồng độ đường cũng có thể ảnh hưởng đến sự tăng

trưởng của LAB [43]

1.2.3.2 Amino acid và peptide

Nito ở dạng amino acid hoặc peptide là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng cho sự phát triển sinh khối của vi khuẩn lactic Amino acid và peptide có thể thu nhận qua quá trình phân giải protein bởi các proteinase và peptidase Tiếp đó, dưới tác dụng của các peptidase thì peptide sẽ được chuyển hóa thành peptide ngắn hơn

và amino acid tự do Amino acid có thể được tiếp tục chuyển đổi thành các hợp chất khác nhau, chẳng hạn như aldehyde, rượu và este Quá trình sinh trưởng của LAB phụ thuộc vào nguồn cung cấp nito hữu cơ do vi khuẩn này ít có khả năng sinh tổng hợp amino acid từ nguồn nito vô cơ Nhu cầu amino acid của LAB khác nhau tùy theo chủng, loài [43]

1.2.3.3 Vitamin

Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic có thể phân chia thành 3 nhóm: vitamin thiết yếu, vitamin kích thích và vitamin không thiết yếu Sự sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn lactic có thể giảm từ 34 - 67% nếu không có các nhóm vitamin này trong môi trường dinh dưỡng Trong đó, acid pantothenic (vitamin B5), acid riboflavin (vitamin B2) và acid nicotinic (vitamin B3 hay vitamin PP)

là những loại vitamin rất cần thiết cho hầu hết các chủng LAB Khi thiếu

riboflavin, sự sinh trưởng L plantarum bị ức chế hoàn toàn Một số vitamin (như

vitamin H, vitamin C,…) có thể là yếu tố kích thích cho sự tăng trưởng của một

số chủng LAB nhưng lại không có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của một số chủng LAB khác Nhu cầu vitamin của LAB khác nhau tùy chủng và một số vitamin có thể thay thế lẫn nhau [43]

1.2.3.4 Khoáng chất

Các khoáng chất đóng vai trò quan trọng cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic như là chất kích hoạt hoặc cofactor của nhiều loại enzyme, tham gia vận chuyển màng và cấu tạo nên các hợp chất phân tử Một số ion thiết yếu có thể kể đến như K+, Na+, Mg2+, Mn2+, Fe2+ và Cl- Trong đó, Mg2+ kích thích sự tăng trưởng, trao đổi chất và khả năng sống của LAB Mn2+ có tác dụng sinh học lên cấu trúc và kích hoạt nhiều enzyme như glutamine synthetase, RNA polymerase, lactate dehydrogenase và phosphatase kiềm Mg2+ là khoáng chất thiết yếu cho sự phát

triển của vi khuẩn L delbrueckii, S thermophilus, L plantarum, L casei, L lactis,

L helveticus và L acidophilus; còn Mn2+ kích thích Leuconostoc mesenteroides, L

plantarum [43]

1.2.3.5 Nhiệt độ

Nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng từ 15 - 40oC Trong đó, 24 -

30oC là khoảng nhiệt độ tối ưu nhất cho sự phát triển của LAB cũng như quá trình lên men để tạo ra acid lactic Các loài có nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 40 -

45oC được gọi là vi khuẩn ưa nhiệt; trong khoảng 20 - 40oC là vi khuẩn ưa ấm Những loài vi khuẩn lactic sống trong đường ruột của người và động vật hầu hết thuộc loại ưa ấm [56]

1.2.3.6 pH

Vi khuẩn lactic hoạt động trong dải pH rộng Khả năng điều chỉnh pH trong

tế bào chất là một trong những đặc điểm sinh lý quan trọng nhất giúp cho vi khuẩn này có khả năng chịu acid thấp hơn so với nhiều loài vi khuẩn khác Đa số các vi

khuẩn lactic có dải pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5 - 6,2 (Lactobacilus); 6 - 6,5 (L

plantarum); 5,5 - 6,5 (Pediococcus) và 6,3 - 6,5 (Leuconostoc) [79]

1.2.4 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp, nông nghiệp, y dược… và nhiều nhất là chế biến và bảo quản thực phẩm Trong những năm gần đây, vi khuẩn lactic được quan tâm nghiên cứu như là nguồn vi sinh vật hữu ích với vai trò probiotic cho người và vật nuôi

1.2.4.1 Trong công nghiệp

Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu acid lactic Acid này có vị chua

dễ chịu và có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt, acid hóa rượu vang và hoa quả nghèo acid Đặc biệt, chúng

có ý nghĩa quan trọng đối với ngành công nghiệp sữa Chủng lên men thường sử

dụng nhất là S thermophilus, S lactis, L acidophilus, L bulgaricus [3,4,49,81]

1.2.4.2 Trong nông nghiệp và môi trường

Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium, loại nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây

yếu đi và đây là cơ hội gây bệnh cho cây trồng

Chế phẩm EM (Effective Microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường

1.2.4.3 Trong y dược

Gần đây, người ta đã phát hiện vai trò lớn của vi khuẩn lactic đối với sức khỏe con người cũng như các động vật nuôi Một số vi khuẩn lactic sinh “kháng sinh” được sử dụng làm chế phẩm “men tiêu hóa sống” probiotic để chữa một số bệnh rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy và phục hồi cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột

Trong đó, nổi bật là chi Axitophilus, khi được bổ sung vào đường tiêu hóa, nó ức

chế một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột Nhờ khả năng sinh acid lactic và chất

kháng khuẩn trong đường ruột, Lactobacillus cải thiện được tình trạng tiêu chảy,

tăng nhu động đường ruột, chữa được chứng táo bón Các chế phẩm chứa

Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị các bệnh rối loạn và viêm

nhiễm, bao gồm: viêm ruột kết, đầy hơi, ung bướu, làm hạ cholesterol trong máu, đau đầu, viêm âm đạo không điển hình và cải thiện được tình trạng không sử dụng được lactose

1.2.4.4 Trong bảo quản chế biến thực phẩm

Vi khuẩn lactic sử dụng để làm dưa chua, làm chua hoa quả mà không làm mất màu tự nhiên của quả, trong sản xuất tương, đậu phụ, nem chua…

1.3 Bacteriocin

Báo cáo đầu tiên và lâu đời nhất là công trình của André Gratia và cộng sự vào năm 1925 Họ đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của “colicin” được sinh tổng hợp

bởi E coli Năm 1928, khả năng ức chế của một số chủng Lactococci với các chủng

LAB khác đã được báo cáo; sau đó, vào năm 1947, Mattick và Hirsh nghiên cứu một

chất kháng khuẩn được phân lập từ chủng Lactococcus lactis subsp lactis, được gọi là

nisin Bacteriocin này ban đầu được tinh chế và tiêu thụ trên thị trường ở Anh (1953) và sau đó ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm vào năm 1969 Năm 1983, ở châu Âu, nisin đã được thêm vào danh sách các chất phụ gia thực phẩm Đến năm 1988, Cục Quản

lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho phép sử dụng phô mai có bổ sung

nisin Bên cạnh nisin thì pediocin được sinh tổng hợp từ các chủng Pediococcus

acidilactici, P parvulus và L plantarum WHE92, cũng đã được sử dụng làm chất bảo

quản trong công nghiệp thực phẩm.Từ những ứng dụng đó, những hướng nghiên cứu

về bacteriocin đã bắt đầu phát triển [27,34]

nisin, được sản xuất bởi một số chủng Lactococcus lactis subsp lactis (chứa 34

amino acid) Nisin là bacteriocin duy nhất được ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm do Tổ chức thực phẩm và nông nghiệp và Tổ chức Y tế Thế giới (FAO/WHO) công nhận vào năm 1969 [31]

1.3.2.2 Lớp II

Lớp II còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng lượng phân tử <10 kDa, tương đối bền nhiệt và không chứa lanthionine Đây là nhóm bacteriocin lớn nhất trong hệ thống phân loại này Các peptide có thể chia

thành 3 phân lớp là IIa (nhóm pediocin hoạt động chống lại Listeria spp.), IIb (chứa

2 loại peptide nhƣ lactocin G, Plantaricin EF, Plantaricin JK) và IIc (các bacteriocin

có liên kết cộng hóa trị giữa đầu C và N nhƣ Lactococcin 972) [27,36,57,78]

1.3.2.3.Lớp III

Lớp III bao gồm những peptide lớn, có trọng lƣợng phân tử > 30 kDa và không bền nhiệt Hầu hết các bacteriocin lớp này đƣợc sinh tổng hợp từ các vi

khuẩn thuộc chi Lactobacillus Đại diện cho lớp III là helveticin J đƣợc sản xuất bởi

vi khuẩn L helveticus 481 và enterolysin sinh tổng hợp từ Enterococcus faecium

[57,78,83] Các loại bacteriocin phổ biến nhất sản xuất bởi LAB đƣợc tóm tắt trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số bacteriocin quan trọng sinh tổng hợp bởi Lactobacilli [83]

Plantaricin EF, Plantaricin W

1.3.2.4 Lớp IV

Hiện nay có rất ít nghiên cứu về lớp này Một cách tổng quát, các bacteriocin lớp IV đƣợc định nghĩa là các bacteriocin phức tạp có chứa các nhóm chức lipid hoặc carbohydrate Ví dụ về bacteriocin của lớp này là các glycoprotein (lactocin

27), lipoprotein (lacstrepcins)…[31,57,78] Tuy nhiên, bacteriocin trong lớp này

chưa được định nghĩa và mô tả đầy đủ về các đặc điểm sinh hóa [24]

1.3.3 Cơ chế hoạt động của bacteriocin

1.3.3.1 Phạm vi hoạt động

Hầu hết các bacteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm có hoạt tính ức chế các loài cùng họ hàng Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương có hoạt tính ức chế các loài vi khuẩn Gram dương nhưng đôi khi nó cũng ức chế một số loài vi khuẩn Gram âm [70]

1.3.3.2 Cơ chế hoạt động

Các bacteriocin có thể hoạt động thông qua các cơ chế khác nhau để phát huy tác dụng kháng khuẩn Hầu hết các bacteriocin hoạt động bằng cách tạo kênh hay lỗ trên màng làm phá hủy năng lượng hữu ích của tế bào sống Lớp lipid tích điện âm của màng tế bào chất là receptor đầu tiên để bacteriocin bám vào và bắt đầu hình thành lỗ trên màng Các bacteriocin của vi khuẩn Gram dương thường không

có receptor bám đặc hiệu mặc dù vẫn có những ngoại lệ Chúng hoạt động khác với

vi khuẩn Gram âm ở 2 điểm chính [44]:

 Bacteriocin tạo ra không gây chết cho vi sinh vật sản xuất Sự khác biệt này là do cơ chế vận chuyển để giải phóng bacteriocin Ở vi khuẩn Gram dương có

sự điều hòa đặc hiệu cho bacteriocin nên các bacteriocin chỉ dựa vào hệ thống điều hòa của tế bào chủ

 Hầu hết các bacteriocin kích thước nhỏ, hoạt động trong phạm vi pH rộng từ 3 - 9, thậm chí acidocin B có thể hoạt động ở pH 11 Điểm đẳng điện cao cho phép chúng tương tác với bề mặt điện tích âm của màng tế bào vi khuẩn Sau

đó, các phân tử bacteriocin liên kết với nhau sẽ tạo thành những lỗ xuyên màng làm mất gradient và gây chết tế bào

Các cơ chế hoạt động khác nhau như thay đổi hoạt động của enzyme, ức chế sự nảy mầm của bào tử và ngừng hoạt động của các chất mang anion thông qua sự hình thành các lỗ đã được đề xuất đối với các bacteriocin [13] Để phát huy

tác dụng kháng khuẩn, các bacteriocin của LAB hoạt động thông qua các cơ chế rất đa dạng nhưng màng tế bào thường là đích được nhắm đến Sự tương tác tĩnh điện ban đầu giữa màng tế bào và bacteriocin được cho là bước đầu tiên cho các tác động tiếp theo [30] Các bacteriocin có thể có tính kháng khuẩn hoặc diệt khuẩn và tác động này chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi một số yếu tố như: lượng bacteriocin và độ tinh khiết của nó, tình trạng sinh lý của các tế bào sử dụng và các điều kiện thí nghiệm [25]

Hình 1.1 Cơ chế hoạt động của bacteriocin [82]

1.3.4 Phương pháp tinh sạch bacteriocin

Quá trình tinh sạch là bước cần thiết để nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc phân

tử, trình tự amino acid, cơ chế hoạt động, các đặc tính của bacteriocin cũng như xác định những thông tin về trọng lượng phân tử Một số phương pháp tinh sạch bacteriocin là kết tủa ammonium sulfate, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC,… Trong đó, HPLC là kỹ thuật được áp dụng phổ biến nhất bởi mức độ tinh sạch cao và chính xác Kết quả tinh sạch một số bacteriocin sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic được trình bày trong Bảng 1.3

Bảng 1.3 Tinh sạch một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi LAB [60]

Bacteriocin Phương pháp tinh sạch Các bước

tinh sạch

Hiệu suất thu hồi bacteriocin (%)

Plantaricin ST31

Kết tủa ammonium sulfate -

Nisin Z Expanded bed, sắc ký trao đổi ion

Bacteriocin chưa

xác định tên

Kết tủa ammonium sulfate - kết tủa

Pediocin PA-1 Kết tủa ethanol - điện di đẳng điện

Michiganin A

Kết tủa ammonium sulfate - sắc ký trao đổi cation - cột RPC - cột pepRPC HR 5/5 - cột μRPC

C2/C18

Piscicocin

CS526

Kết tủa ammonium sulfate - lọc gel

- sắc ký trao đổi cation - C18 -

HPLC

Propionicin F Kết tủa ammonium sulfate - sắc ký

Pediocin PD-1

Kết tủa ammonium sulfate - thẩm tách - đông khô - methanol - chiết chloroform - trao đổi cation

1.3.5 Lợi ích và hạn chế của bacteriocin

1.3.5.1 Lợi ích của bacteriocin

Ngày nay, bacteriocin được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực phẩm và

so với việc sử dụng những chất bảo quản hóa học nó đã mang đến những lợi ích nhất định như:

 Bacteriocin chứng minh tính an toàn của chúng trong chuỗi thực phẩm dành cho con người vì chúng là các phân tử được sản sinh tự nhiên bởi vi sinh vật lên men trong thực phẩm lên men truyền thống [62]

 Không gây tác động đến môi trường vì bị thoái biến nhanh chóng

 Bacteriocin tác dụng đối với các vi sinh vật gây bệnh mà không làm ảnh hưởng đến vi khuẩn có lợi [58]

 Bacteriocin không làm thay đổi các tính chất cảm quan của thực phẩm [62]

 Chi phí cao trong việc đáp ứng các tính năng kỹ thuật

 Chỉ có hiệu quả chống lại một số loại vi khuẩn nào đó

Trên thực tế, có những rào cản pháp lý yêu cầu sự công nhận và chấp thuận

cụ thể với việc sử dụng bacteriocin ở dạng tinh khiết và bán tinh khiết [62]

1.3.6 Ứng dụng của bacteriocin

Bacteriocin ngày càng thu hút nhiều sự quan tâm của giới khoa học nhờ những công dụng quan trọng của chúng trong nhiều lĩnh vực Những ứng dụng tiềm năng của bacteriocin gồm: ứng dụng trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm, ứng dụng trong bảo vệ sức khỏe con người và y tế…

1.3.6.1 Ứng dụng trong công nghệ chế biến sữa

Nisin là chế phẩm bacteriocin được thương mại hóa và sử dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm Trong công nghệ chế biến sữa, nisin có thể được sử dụng theo một trong hai cách là: bổ sung chế phẩm nisin trực tiếp vào sữa bột hay vào nguyên liệu sữa trước khi lên men chế biến phomat hoặc phối hợp sử dụng các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nisin trong quá trình lên men phomat, nhằm khắc phục hiện tượng lên men gây mùi khó chịu và kiểm soát quá trình lên men butyric

do vi khuẩn Clostridium gây ra Do đặc thù độ acid thấp nên sản phẩm sữa

chocolate có nguy cơ nhiễm vi sinh vật khác khá cao Bên cạnh đó, nhiệt độ thanh trùng quá cao sẽ gây ảnh hưởng đến mùi vị và chất lượng sản phẩm Sử dụng nisin cho phép hạ thấp nhiệt độ thanh trùng và giữ mùi vị sản phẩm Nồng độ nisin khoảng 80 IU/mL cho phép ngăn ngừa sự lên men thối sản phẩm sữa chocolate ở nhiệt độ thường trong vòng 6 tháng [32]

1.3.6.2 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

 Công nghệ chế biến đồ hộp

Sau quá trình thanh trùng, bào tử của một số loại vi khuẩn bền nhiệt vẫn còn

(ví dụ như Clostridium perfringens, Clostridium thermocaccharolyticum hay

Bacillus stearothermophilus) nên việc sử dụng nisin nhằm 2 mục đích là giảm khả

năng chịu nhiệt của vi khuẩn và kìm hãm, ngăn ngừa quá trình thối rữa Nhóm sản phẩm thường áp dụng là: cà chua nghiền, cà rốt nghiền, các sản phẩm từ nấm, đậu quả đóng hộp [44]

 Công nghệ chế biến các sản phẩm thịt

Trong công nghệ chế biến các sản phẩm thịt (thịt hun khói, xúc xích, dăm bông ) các giải pháp công nghệ đang được nỗ lực tìm kiếm để thay thế cho việc sử dụng nitrite và nisin hiện đang thu hút được sự quan tâm của các nhà sản xuất Hướng phối hợp nisin-nitrite cho hiệu quả rất tích cực và đang được tiếp tục thử nghiệm [24]

 Bảo quản các loại hải sản

Năm 2001, Katla và cộng sự đã so sánh khả năng ức chế kháng lại Listeria

monocytogenes trong cá hồi hun khói đông lạnh của sakacin P và môi trường có

chứa Lactobacillus sake Mẫu cá hồi đã được đóng gói bằng chân không và được ủ

ở 10°C trong vòng 4 tuần Sakacin P đã có hiệu quả ức chế ngay sự phát triển ban

đầu của Listeria monocytogenes trong khi môi trường có Lactobacillus sake chỉ có hiệu quả kìm hãm Tác dụng tiêu diệt Listeria monocytogenes đã được quan sát ngay khi bổ sung dung dịch có chứa Lactobacillus sake cùng với sakacin P [48]

 Chế tạo màng đóng gói thực phẩm

Việc kết hợp bacteriocin vào màng thực phẩm giúp kiểm soát được quá trình gây hỏng thực phẩm Trong quy trình này, màng đóng gói phải tiếp xúc với bề mặt thực phẩm để bacteriocin có thể khuếch tán vào bề mặt Bacteriocin được giải phóng từ màng đóng gói thực phẩm giúp tăng hiệu quả hơn so với cách ngâm hoặc vẩy bacteriocin lên thực phẩm

1.3.6.3 Ứng dụng trong bảo vệ sức khỏe con người, trong y học

Khi các vi khuẩn gây bệnh tăng nhanh thì cần phải có phương pháp loại bỏ

sự lây nhiễm Một trong những giới hạn trong việc sử dụng kháng sinh là chúng có phổ ức chế rộng nên có khả năng tiêu diệt luôn các vi khuẩn có lợi cho sức khỏe con người Do đó, bacteriocin được sử dụng như một giải pháp thay thế Chúng có phổ

ức chế hẹp nên có thể xem như “thuốc độc thiết kế” có tác dụng đặc hiệu với các vi khuẩn gây bệnh [73]

Các nhà khoa học đã chứng minh rằng lanbiotic có tác dụng trong việc ngăn ngừa sâu răng và viêm lợi Nisin khi cho thêm vào nước súc miệng thể hiện hoạt tính kháng sinh với các vi khuẩn dịch hạch và viêm lợi Lactic 3147 ngăn chặn sự

phát triển của Streptococcus mutans có liên quan đến sâu răng [22]

1.3.7 Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ LAB

Với sự kết hợp các phương pháp hiện đại, bacteriocin được nghiên cứu ngày càng nhiều Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, những nghiên cứu về bacteriocin rất đa dạng nhưng chủ yếu tập trung vào bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic

Vào những năm 1998-2000, từ chủng Lactobacillus sake (L45, MI401,

LB706 và LB674) đã tinh sạch được các bacteriocin như lactocin S (lớp I); bavaricin A; sakacin A và sakacin P (phân lớp IIa) Các bacteriocin có khả năng

chống lại sự phát triển của nhiều loài khác nhau như Enterococcus, Lactobacillus,

Lactococcus, Pediococcus, L monocytogenes, L innocua, Staphylococcus…

Lactococcin MMFII (khoảng 4,143 kDa) sinh tổng hợp bởi L lactis MMFII đã

được Ferchichi và cộng sự nghiên cứu với đặc điểm như bacteriocin giữ nguyên hoạt tính ở 70oC trong 30 phút, hoạt động trong khoảng pH khá rộng (pH 5 - 8), nhạy với proteinase K, trypsin và papain, bền với glucoamylase, lipase, amylase và lysozyme Rodriguez và cộng sự đã thành công khi tìm ra pediocin PA-1 với trọng lượng khoảng 4,624 kDa năm 2002 Pediocin PA-1 rất bền nhiệt (ổn định ở 80°C trong 60 phút hoặc 100°C trong 10 phút), pH 4 - 6 (kém ổn định hơn khi pH tăng), nhạy với trypsin, papain, ficin, α-chymotrypsin, protease IV, XIV, XXIV và proteinase K, không bị tác động bởi phospholipase C, catalase, lysozyme, DNA, RNA và lipase [24]

Nhóm tác giả Todorov S D và Dicks K M (2007) đã nghiên cứu thành công

khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ

được phân lập từ boza (đồ uống ngọt lên men từ lúa mì ở Thổ Nhỹ Kỳ) Bacteriocin

ST712BZ (kích thước 14 kDa) ức chế sự phát triển của L casei, E.coli, P

aeruginosa, E faecalis, K pneumoniae và L curvatus [76]

Trong một nghiên cứu khác của Satish Kumar R., Arul V (2009), bacteriocin

phocaecin PI80 đã được sinh tổng hợp bởi chủng Streptococus phocae PI80 phân lập từ

tôm thẻ chân trắng Ấn Độ Chất kháng khuẩn này nhạy với trypsin, proteinase, pepsin,

chymotrypsin và ức chế một số tác nhân gây bệnh quan trọng như: Listeria

monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, V fischeri [67] Nhóm tác giả Todorov S D

và cộng sự thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch, Nam Phi đã nghiên cứu thành

công khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng L plantarum ST13BR phân lập từ bia Barley Chủng L plantarum ST13BR sinh bacteriocin có kích thước phân tử 10 kDa và ức chế sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus casein, Pseudomonas

aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae và E coli [75] Bacteriocin

AMA-K ức chế sự phát triển của E faecalis, E mundtii, E coli, K pneumoniae, L

lactis subsp lactis, L casei, L curvatus, L sakei, E faecium, L innocua, L monocytogenes và L ivanovii subsp ivanovii Sự sinh trưởng của chủng L plantarum

AMA-K tối ưu trong môi trường MRS có pH 5,5 - 6,0 [77] Vào những năm gầy đây (2016), Hu và cộng sự đã tách chiết bacteriocin 163-1 (khối lượng phân tử là 0,825

kDa) được sinh tổng hợp bởi chủng vi khuẩn L plantarum 163 phân lập từ củ cải muối

Bacteriocin này rất bền nhiệt và hoạt động ổn định trong phạm vi pH rộng (pH 3 - 6), nhạy với protease K, pepsin, đồng thời ức chế các tác nhân gây bệnh gồm vi khuẩn Gram dương và Gram âm [45]

Borrero và đồng tác giả (2017) đã thành công khi tách chiết Plantaricyclin A

(PlcA) (khoảng 5,57 kDa) từ chủng L plantarum NI326 phân lập từ ô liu PlcA cho

thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại các chủng khác nhau, bao gồm cả

Alicyclobacillus acidoterrestris - một loại vi khuẩn gây hỏng phổ biến, gây ra tổn

thất kinh tế đáng kể trong ngành công nghiệp nước giải khát Quá trình tinh sạch và giải trình tự gen PlcA đã được nghiên cứu chuyên sâu [20] Bacteriocin LBP102

được sinh tổng hợp từ L plantarum NTU 102, ổn định ở pH 1 - 4, có hoạt tính kháng khuẩn chống lại Vibrio parahaemolyticus BCRC 12864 và Cronobacter

sakazakii BCRC 13988 Điều này cho thấy tiềm năng của nó như là một chất bảo

quản tự nhiên ứng dụng trọng sản xuất phụ gia thực phẩm [50] Một loại bacteriocin

sản xuất bởi Lactobacillus acidophilus KS400 có hoạt tính kháng khuẩn chống lại

các mầm bệnh sinh dục đã được Gaspar và cộng sự nghiên cứu Trọng lượng phân

tử của bacteriocin này xấp xỉ 7,5 kDa và ức chế sự phát triển của Gardnerella

vaginalis, Streptococcus agalactiae, Pseudomonas [41] Pediococcus acidilactici

kp10 sinh tổng hợp một loại bacteriocin có ký hiệu là BLIS Với sự sinh trưởng cao nhất khi được nuôi trong môi trường M17, BLIS có khả năng ức chế sự phát triển

của ba vi sinh vật gây bệnh là L monocytogenes, E coli và Staphylococcus aureus

BLIS vẫn giữ nguyên hoạt tính bacteriocin ở 100°C và mất hoàn toàn hoạt tính ở 121°C; hoạt động trong khoảng pH rộng (pH 2 - 7); hoạt tính của BLIS vẫn không đổi ở -20°C và -80°C trong 1 tháng Tuy nhiên, sau 3 và 6 tháng bảo quản ở 4, -20

và -80°C hoạt tính giảm hơn 80% [68] Một bacteriocin mới, plantaricin LPL-1

(thuộc nhóm IIa) sản xuất bởi chủng L plantarum LPL-1 phân lập từ thực phẩm cá

lên men Plantaricin LPL-1 dễ dàng phân hủy bởi protease, hoạt động ở khoảng pH rộng (2 - 10), ổn định ở nhiệt độ cao (121◦C, 20 phút), có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi sinh vật gây bệnh và gây hỏng thực phẩm [80]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về bacteriocin đã được tiến hành Năm 2004,

TS Lê Thị Hồng Tuyết, TS Hoàng Quốc Khánh tại Viện Sinh học Nhiệt Ðới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã có những nghiên cứu sơ bộ về một số đặc tính

của bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Vi khuẩn L

acidophilus sản xuất bacteriocin có khả năng kháng một số vi khuẩn gây hỏng trong

thực phẩm như E coli, Salmonella và một số vi khuẩn lactic khác Điều kiện sinh

trưởng tối ưu của vi khuẩn này là nhiệt độ 30 - 37o

C và pH 5 - 7, bacteriocin nhạy với protease nhưng lại ổn định với các dung môi hữu cơ, pH và nhiệt độ [11] Một nghiên cứu khác của TS Phạm Thùy Linh là tạo chất diệt khuẩn enterocin P tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm Đây là nghiên cứu đầu tiên về tạo bacteriocin tái tổ hợp một cách có hệ thống tại Việt Nam Sản phẩm protein Hisent

P tái tổ hợp có hoạt tính kháng khuẩn và các đặc tính sinh hóa tương tự với enterocin P tự nhiên Protein này bước đầu đã có khả năng kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm và được tiếp tục nghiên cứu phát triển làm phụ gia sinh học dùng cho bảo quản [7] Với mục tiêu thu nhận bacteriocin để ứng dụng trong quá trình bảo quản thịt, tác giả Nguyễn Thúy Hương đã nghiên cứu việc cố định tế bào vi

khuẩn Lactococcus lactic trên chất mang cellulose của vi khuẩn (Bacterial Cellulose

- BC) [6]

Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn lactic, nhưng những công trình nghiên cứu về bacteriocin sinh tổng hợp từ LAB là định hướng còn rất mới ở

Việt Nam Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm kháng

khuẩn của vi khuẩn lactic phân lập từ một số thực vật ở Việt Nam” với mục đích sẽ

góp thêm nhiều thông tin về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi các chủng vi khuẩn LAB được phân lập từ nguồn thực vật tươi sống ở nước ta

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Nguồn phân lập

10 loài thực vật bao gồm: lô hội, sung, cải xanh, chanh, rau muống, ngải cứu,

lá lốt, húng quế, mồng tơi và càng cua được thu tại Hòa Lạc - Hà Nội

2.1.2 Nguồn vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật được cung cấp bởi phòng Công nghệ Enzyme - Protein

và Bảo tàng giống - Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội Các thông tin về môi trường nuôi cấy và nhiệt độ nuôi cấy của các chủng này được liệt kê trong Bảng 2.1 và 2.2

Nhiệt độ nuôi cấy

1 Micrococcus luteus IFO 12708 KĐ24 TSBYE 30oC

2 Lactococcus lactis subsp lactis ATCC

 Các chủng vi sinh vật gây bệnh

Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật gây bệnh

STT Vi sinh vật gây bệnh

Môi trường nuôi cấy

Nhiệt độ nuôi cấy

2.1.3 Môi trường, hóa chất và thiết bị

2.1.3.1 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

 Môi trường MRS (g/L)

Thành phần môi trường MRS thạch bao gồm: pepton (10,0 g); cao thịt (10,0 g); cao nấm men (5,0 g); glucose (20,0 g); CH3COONa.3H2O (5,0 g); K2HPO4 (2,0 g); triammonium citrate (2,0 g); MgSO4.7H2O (0,5 g); MnSO4.4H2O (0,28 g); CaCO3 (5,0 g) và agar (15,0 - 17,0 g)

 Môi trường TSBYE (g/L)

Thành phần môi trường TSBYE thạch bao gồm: cao nấm men (1,8 g); bột đậu tương (0,9 g); glucose (0,75 g); NaCl (1,5 g); K2HPO4 (0,75 g) và agar (15,0 - 17,0 g)

 Cân điện tử Sartorius, Đức

 Bốc cấy vô khuẩn Nuaire, Mỹ

 Máy PCR Eppendorf, Đức

 Tủ sấy Memmert, Tủ ấm Binder, Đức; Tủ lạnh Hitachi, Nhật Bản

 Lò vi sóng Delonghi, Ý

 Nồi hấp khử trùng Sturdy, Đài Loan

 Bể ổn nhiệt, Stuart, Anh

 Máy vortex, Stuart, Anh

 Máy đo pH, Hoa Kỳ

 Hệ thống tinh sạch protein AKTA (GE Healthcare)

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

 Máy quang phổ Beckman Coulter

 Máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417R, 5810R, Đức

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Sơ đồ thí nghiệm được trình bày trong Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm

Phân lập vi khuẩn lactic

Xác định hoạt tính và hoạt độ bacteriocin

Định danh vi khuẩn lactic

Nhiệt độ nuôi cấy

Thời gian

nuôi cấy

Tinh sạch bacteriocin (AKTA, HPLC)

Đánh giá

sự ảnh hưởng của

pH, nhiệt

độ và enzyme

Xác định hoạt tính kháng khuẩn