Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật macrodilution và microdilution trong xác định mức độ nhạy cảm với colistin của một số chủng vi khuẩn gram âm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- TỐNG THỊ KIM TUYẾN ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT MACRODILUTION VÀ MICRODILUTION TRONG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHẠY CẢM VỚI COLIS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TỐNG THỊ KIM TUYẾN

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT

MACRODILUTION VÀ MICRODILUTION TRONG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHẠY CẢM VỚI COLISTIN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN GRAM ÂM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TỐNG THỊ KIM TUYẾN

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT

MACRODILUTION VÀ MICRODILUTION TRONG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHẠY CẢM VỚI COLISTIN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN GRAM ÂM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Vũ Trung PGS.TS Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - Năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Là một Học viên Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với chương trình học Cao học 2 năm, luận văn tốt nghiệp này

là dấu mốc quan trọng, đánh dấu cho sự hoàn thành chương trình học Thạc sỹ của

em tại trường Để thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, em đã nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ cũng như quan tâm, động viên từ nhiều cơ quan, tổ chức và cá nhân Nghiên cứu khoa học cũng được hoàn thành dựa trên sự tham khảo, học tập kinh nghiệm từ các kết quả nghiên cứu liên quan, các sách, báo chuyên ngành của nhiều tác giả ở các trường Đại học, các tổ chức nghiên cứu trong và ngoài nước

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS Nguyễn Vũ Trung, Cô PGS TS Bùi Thị Việt Hà – người trực tiếp hướng dẫn khoa học đã luôn dành nhiều thời gian, công sức đối với em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học Em cũng xin cảm ơn TS Nguyễn Thị Tâm, Trung tâm nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình nghiên cứu tại Trung tâm

Em xin trân trọng cảm ơn Khoa Sinh học, Ban giám hiệu trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô giáo công tác trong trường đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu, giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Và với lòng biết ơn, em cũng muốn gửi đến lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới bà, bố mẹ, chồng, con gái, những người thân và bạn bè đã yêu thương, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Tuy có nhiều cố gắng, nhưng trong đề tài nghiên cứu khoa học này không tránh khỏi những thiếu sót Em kính mong Quý thầy cô, các chuyên gia, những người quan tâm đến đề tài, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè tiếp tục có những ý kiến đóng góp, giúp đỡ để đề tài được hoàn thiện hơn

Một lần nữa em xin chân thành cám ơn!

Học viên Tống Thị Kim Tuyến

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Ý nghĩa

1 ADN Acid Deoxyribonucleic

2 ATCC American type culture collection

3 CA Độ tin cậy

4 CAMHB Canh thang Mueller Hinton có điều chỉnh nồng độ cation

5 CFU Số lượng vi khuẩn tính trên một đơn vị thể tích huyền dịch

vi khuẩn

6 CLSI Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm (Hoa Kỳ)

7 CTĐTT Chưa thay đổi thể tích

14 MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

15 MHM Canh thang Muller Hinton

16 R Ức chế

17 S Nhạy cảm

18 TĐTT Thay đổi thể tích

19 VME Sai số chính

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tổng quan về kháng sinh, sự kháng kháng sinh 3

1.1.1 Tổng quan về kháng sinh 3

1.1.2 Sự kháng kháng sinh 6

1.1.3 Tình hình kháng kháng sinh hiện nay 8

1.1.4 Tính kháng kháng sinh của một số vi khuẩn Gram âm 9

1.2 Tổng quan về kháng sinh colistin 11

1.2.1 Cấu trúc hóa học 11

1.2.2 Lịch sử ra đời và sử dụng 12

1.2.3 Phổ tác dụng 13

1.2.4 Cơ chế tác dụng 14

1.2.5 Cơ chế đề kháng 15

1.2.6 Dược động học, liều dùng 16

1.2.7 Chống chỉ định và tác dụng không mong muốn 18

1.3 Các kỹ thuật xét nghiệm định danh và xác định nồng độ ức chế tối thiểu của vi khuẩn 18

1.3.1 Các kỹ thuật định danh vi khuẩn 18

1.3.2 Các kỹ thuật kháng sinh đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu bệnh phẩm 28

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 28

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 28

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 28

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 28

2.3 Vật liệu nghiên cứu 28

2.3.1 Trang thiết bị, dụng cụ 28

2.3.2 Hóa chất 29

2.3.3 Môi trường 30

2.4 Phương pháp nghiên cứu 30

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 30

2.4.2 Cỡ mẫu 30

2.4.3 Các kỹ thuật nghiên cứu 30

2.5 Các chỉ tiêu nghiên cứu 42

2.6 Đạo đức nghiên cứu 43

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44

KẾT LUẬN 64

KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các thông số dược động học 5 Bảng 1.2 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học 6

Bảng 3.1 Kết quả MIC colistin của P aeruginosa bằng kỹ thuật macrodilution (có

thay đổi thể tích và không thay đổi thể tích) và kỹ thuật microdilution 44

Bảng 3.2 Kết quả MIC colistin của A baumannii bằng kỹ thuật macrodilution (có

thay đổi thể tích và không thay đổi thể tích) và kỹ thuật microdilution 46 Bảng 3.3 Kết quả MIC colistin của Enterobacteriaceae bằng kỹ thuật macrodilution

(có thay đổi thể tích và không thay đổi thể tích) và kỹ thuật microdilution 49 Bảng 3.4 Tổng hợp EA và CA giữa kỹ thuật macrodilution và kỹ thuật microdilution 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sự lan truyền vi khuẩn đề kháng 7

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của colistin bao gồm ba phần 11

Hình 1.3 B polymyxa 12

Hình 1.4 Cơ chế tác động của colistin lên tế bào vi khuẩn 14

Hình 1.5 Cơ chế đề kháng colistin của vi khuẩn 15

Hình 1.6 Một số dạng bào chế của colistin 16

Hình 1.7 API 19

Hình 1.8 Hệ thống định danh VITEK2 19

Hình 1.9 Quy trình thực hiện kháng sinh đồ xác định MIC bằng phương pháp sử dụng E-test 21

Hình 1.10 E-test và xác định MIC bằng E-test 22

Hình 1.11 Hệ thống định danh VITEK 2 22

Hình 1.12 Quy trình xác định MIC bằng kỹ thuật microdilution 24

Hình 1.13 Quy trình xác định MIC bằng kỹ thuật macrodilution 24

Hình 2.1: Hóa chất định danh MALDI-TOF 34

Hình 2.2: Hóa chất chuẩn - BTS 35

Hình 2.3: Hệ thống máy định danh MALDI-TOF 35

Hình 2.4: Sơ đồ định danh bằng máy MALDI-TOF 36

Hình 2.5 Kỹ thuật microdilution 41

Hình 3.1: Một số lưu ý khi cho mẫu vào giếng nhựa bằng pipet đa kênh 59

Hình 3.2: Khay 96 giếng với 12 chủng vi khuẩn thử nghiệm ở 8 nồng độ khác nhau của kháng sinh colistin 60

Hình 3.3 Bản nhựa đơn 8 giếng 0,2 ml có nắp 61

Hình 3.4: Kỹ thuật macrodilution tiến hành ở 1 chủng với 5 nồng độ kháng sinh khác nhau 62

Hình 3.5: Chuẩn bị dung dịch kháng sinh colistin với các nồng độ khác nhau 63

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, các nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm đa kháng

kháng sinh, đặc biệt là Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii và

Klebsiella pneumoniae đã và đang gia tăng mạnh mẽ Khi mà các kháng sinh nhóm

beta-lactam, aminoglycoside hoặc quinolone không còn hiệu quả nữa thì kháng sinh nhóm polymyxin đặc biệt là colistin thường được xem là lựa chọn thích hợp Kháng sinh colistin khi kết hợp với một hoặc vài kháng sinh khác sẽ làm tăng hiệu quả trong điều trị Tuy nhiên, khi điều trị bằng colistin cho bệnh nhân, thuốc có thể gây độc trên thận, độc tính tăng khi tăng liều colistin tích lũy Chính vì vậy, để sử dụng colistin an toàn và hiệu quả, cần chỉ định liều lượng thuốc dựa trên dược động học

và kết quả nồng độ ức chế tối thiểu của xét nghiệm kháng sinh đồ để đảm bảo hoạt tính kháng khuẩn tối đa và độc tính tối thiểu

Có nhiều phương pháp giúp xác định nồng độ ức chế tối thiểu đối với colistin, trong đó phương pháp đang sử dụng phổ biến trong vi sinh lâm sàng ở nước ta là E-test Tuy nhiên, do trọng lượng phân tử colistin lớn, hơn nữa chúng lại có xu hướng bị hấp thụ trên các bề mặt môi trường thử nghiệm, dẫn đến ảnh hưởng đối với kết quả của thử nghiệm Theo khuyến cáo của CLSI và EUCAST, không nên sử dụng E-test trong xét nghiệm này nữa vì có thể dẫn đến sai số rất lớn, không thể chấp nhận Có rất nhiều các nghiên cứu của các tác giả nước ngoài đã chỉ ra phương pháp E-test không đủ độ chính xác và tin cậy để sử dụng trong lâm sàng trong việc xác định nồng

độ ức chế tối thiểu của colistin với vi khuẩn Gram âm EUCAST khuyến cáo, chỉ có duy nhất kỹ thuật vi pha loãng (microdilution) được sử dụng với vai trò là phương pháp tham chiếu trong xác định nồng độ ức chế tối thiểu của colistin đối với các vi khuẩn Mặc dù, kỹ thuật microdilution là kỹ thuật cổ điển trong xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đối với vi khuẩn nhưng trên thực tế, rất ít các phòng xét nghiệm vi sinh sử dụng kỹ thuật microdilution trong quy trình xét nghiệm thường quy

do yêu cầu thao tác kỹ thuật tỉ mỉ, chính xác Như vậy, việc tìm ra một phương pháp chính xác và phù hợp để áp dụng trong thực tế lâm sàng là vô cùng cần thiết Đã có

những nghiên cứu của nước ngoài tiến hành so sánh và chỉ ra sự tương đồng trong hiệu quả của phương pháp macrodilution (pha loãng trong ống nghiệm) và microdilution (xem khái niệm về các phương pháp này tại mục 1.3.2) trong xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn Gram âm đa kháng với kháng sinh colistin Phương pháp macrodilution và microdilution hiện tại chưa được đưa vào sử dụng ở các phòng xét nghiệm và cũng chưa có nghiên cứu nào về vấn đề so sánh hai kỹ thuật này được công bố ở Việt Nam Do vậy, nghiên cứu về sự phù hợp giữa hai phương pháp này trong xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh colistin là vô cùng cần thiết Khi có được kết quả nghiên cứu này, chúng ta sẽ có cơ sở để khuyến cáo triển khai trên lâm sàng kỹ thuật microdilution và macrodilution trong xác định nồng độ ức chế tối thiểu của vi khuẩn với colistin, hạn chế tối đa các sai sót trong kết quả MIC

đối với colistin Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Đánh giá hiệu quả

của kỹ thuật macrodilution và microdilution trong xác định mức độ nhạy cảm với

So sánh kỹ thuật macrodilution và microdilution trong xác định mức độ nhạy cảm với colistin của một số chủng vi khuẩn Gram âm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan về kháng sinh, sự kháng kháng sinh

1.1.1 Tổng quan về kháng sinh

Thuốc kháng sinh là những chất kháng khuẩn có nguồn gốc tổng hợp hoặc được tạo ra bởi các chủng vi sinh vật có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật hoặc tiêu diệt vi sinh vật [2] (từ đây, trong luận văn gọi tắt là “Kháng sinh”)

+ Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh:

- Ức chế tổng hợp vách tế bào

Vách tế bào của vi khuẩn (đặc biệt là các vi khuẩn Gram dương) được cấu tạo bởi các phức hợp peptidoglycan, phức hợp này được trùng hợp bởi các enzyme transpeptidases Các kháng sinh nhóm betalactam gắn chọn lọc vào các transpeptidase này làm cho vách tế bào của vi khuẩn bị tan rã khiến vi khuẩn bị tiêu diệt

- Ức chế chức năng màng bào tương

Kháng sinh gắn lên màng bào tương, làm thay đổi tính thấm chọn lọc khiến một số chất cần thiết cho vi khuẩn (nucleotid, pyrimidin, purin…) lọt ra ngoài, gây

ức chế và làm chết vi khuẩn Các kháng sinh nhóm polymycin, aminosid tác động lên vi khuẩn theo cơ chế này

- Ức chế sinh tổng hợp protein

Nhóm phenicol, macrolid có khả năng gắn vào phần 50S của ribosom vi khuẩn, phong bế enzyme transferase (enzyme chuyển acid amin từ ARN vận chuyển) làm quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn bị ngừng

Tetracyclin và aminoside có khả năng gắn vào phần 30S của ribosom vi khuẩn, gây nên đọc sai mã của ARN - thông tin khiến protein được tạo ra bất thường, vô dụng đối với đời sống của vi khuẩn

- Tác động vào acid nucleic

Các quinolon ức chế enzyme ADN-gyrase khiến ADN sợi kép của vi khuẩn không thể duỗi xoắn, quá trình tổng hợp ADN của vi khuẩn bị ngừng hoàn toàn

- Cạnh tranh đối kháng

Đây là kiểu tác dụng của các sunfonamit Acid folic giữ vai trò cần thiết trong quá trình tổng hợp acid nucleic Để tổng hợp ra acid folic, một số vi khuẩn phải sử dụng acid paraaminobenzoic (PAB) có trong môi trường Sunfonamit có cấu trúc hóa học tương tự PAB nên đã cạnh tranh thay thế PAB, dẫn đến ngừng tổng hợp acid nucleic của vi khuẩn

+ Nguyên lý sử dụng kháng sinh

Điều trị kháng sinh dựa trên sự khác biệt sinh hóa giữa người và vi sinh vật Thuốc kháng sinh có hiệu quả trong điều trị nhiễm trùng bởi chúng có “độc tính chọn lọc”, tức là các kháng sinh có khả năng kìm hãm, tiêu diệt vi khuẩn ký sinh mà không làm tổn thương tế bào cơ thể Trong hầu hết các trường hợp, “độc tính chọn lọc” của kháng sinh chỉ mang tính tương đối, nồng độ thuốc khi sử dụng phải đảm bảo đủ để kiểm soát nhiễm khuẩn và cơ thể bệnh nhân vẫn dung nạp được [30] Để lựa chọn một kháng sinh thích hợp nhất trong điều trị cần phải dựa vào: Loại vi khuẩn gây bệnh, độ nhạy cảm của vi khuẩn với các kháng sinh, vị trí nhiễm khuẩn,

cơ địa bệnh nhân, tính an toàn của kháng sinh được chọn và chi phí điều trị Việc chia liều kháng sinh dùng trong ngày dựa trên dược động học (mối liên hệ giữa nồng độ và tác dụng diệt khuẩn) và dược động học của thuốc (quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ thuốc) Tác dụng diệt khuẩn của kháng sinh phụ thuộc nồng độ hay thời gian, thuốc có tác dụng kéo dài hay không Nắm rõ các đặc tính này giúp tối ưu hóa việc chia liều kháng sinh, từ đó giúp cải thiện hiệu quả điều trị, giảm sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc [30]

C max Nồng độ thuốc tối đa đạt được trong máu sau khi dùng 1 liều đơn độc

C min Nồng độ thuốc tối thiểu trong máu

T max Thời gian để đạt nồng độ tối đa

Vd Thể tích phân bố, thể hiện sự phân bố của thuốc trong cơ thể Vd > 3 L

chứng tỏ thuốc phân bố cả ngoài huyết tương

AUC Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian

t 1/2 Thời gian bán thải, là thời gian cần thiết để nồng độ thuốc trong máu

giảm đi một nửa

T>MIC Thời gian duy trì nồng độ thuốc trên MIC để có tác dụng kìm khuẩn/diệt

khuẩn, chỉ áp dụng cho kháng sinh

MIC là một trong những chỉ số quan trọng liên quan đến chiến thuật hiệu chỉnh liều lượng kháng sinh sử dụng Vì vậy, việc xác định chỉ số này là rất quan trọng [30]

Nồng độ ức chế tối thiều (MIC - The minimum inhibitory concentration) là nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong 24h ở điều kiện nuôi cấy Điều này giúp xác định tính nhạy cảm (invitro) của vi khuẩn và thường được dùng trong thực hành lâm sàng nhằm nâng cao hiệu quả điều trị [30] Phân loại thuốc kháng sinh theo cấu trúc hóa học:

Bảng 1.2 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học (nguồn [2])

1.1.2 Sự kháng kháng sinh

Có rất nhiều cơ chế liên quan đến sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

- Phát triển hệ enzyme phá hủy thuốc kháng sinh Ví dụ: Staphylococci kháng

penicillin bằng cách sản sinh ra β-lactamase phá hủy cấu trúc của thuốc Nhóm vi khuẩn Gram âm có khả năng kháng với aminoglycosides (nhờ gen plasmid) sản sinh ra được enzym adenyl hoá, phosphoryl hoá, acetyl hoá

+ Vi khuẩn biến đổi làm thay đổi tính thấm màng với các hoạt chất trong thuốc Ví dụ như tetracycline có thể tích tụ trong tế bào vi sinh vật nhưng không tích tụ trong các tế bào vi khuẩn kháng thuốc

+ Vi khuẩn phát triển con đường trao đổi chất thứ cấp bỏ qua các bước phản ứng bị ảnh hưởng bởi thuốc kháng sinh

+ Vi khuẩn phát triển hệ enzym thứ cấp có chức năng trao đổi chất bình thường nhưng lại không bị ảnh hưởng bởi thuốc kháng sinh

Nguồn gốc của sự kháng thuốc kháng sinh (từ đây, trong luận văn gọi tắt là

“kháng kháng sinh”)

Đề kháng tự nhiên: một số loài vi khuẩn nhất định không chịu tác dụng của

một số kháng sinh nhất định, ví dụ Pseudomonas không chịu tác dụng của penicillin

G hoặc tụ cầu không chịu tác dụng của colistin Những vi khuẩn không có vách như

Mycoplasma không chịu tác dụng của các kháng sinh ức chế sinh tổng hợp vách, ví

dụ beta-lactam

Đề kháng thu đƣợc:

+ Khả năng đề kháng liên quan đến di truyền

Hầu hết, sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn là kết quả của sự thay đổi về mặt di truyền và quá trình chọn lọc tự nhiên dưới tác động của thuốc kháng sinh

Hình 1.1 Sự lan truyền vi khuẩn đề kháng (nguồn [18])

+ Kháng thuốc liên quan đến di truyền nhiễm sắc thể

Là kết quả của đột biến trên locus kiểm soát độ nhạy cảm của vi sinh vật với thuốc kháng sinh Sự xuất hiện của thuốc có tác dụng như cơ chế chọn lọc loại bỏ những chủng vi khuẩn nhạy cảm và kích thích sự phát triển của các chủng kháng thuốc Trong tự nhiên, đột biến có thể xảy ra với tần suất 10-12 đến 10-7, đó là nguyên nhân dẫn đến sự xuất hiện của hiện tượng kháng thuốc trong điều trị

Đột biến nhiễm sắc thể phổ biến nhất là đột biến gây thay đổi trong cấu trúc thụ thể của thuốc kháng sinh Ví dụ, protein P12 (thụ thể để gắn streptomycin) trên tiểu đơn vị 30S của riboxom vi khuẩn, đột biến ở gen mã hóa cấu trúc protein trên

có tác dụng kháng thuốc streptomycin Đột biến tương tự cũng có thể gây mất thụ thể đặc hiệu của penicillin khiến cho vi sinh vật có thể kháng các nhóm thuốc β-lactam

+ Kháng thuốc liên quan đến di truyền ngoài nhiễm sấc thể

Đề kháng giả: Vi khuẩn có biểu hiện là đề kháng nhưng không phải là bản

chất, tức là không do nguồn gốc di truyền Có thể chỉ do một trong ba yếu tố nói trên hoặc có thể kết hợp hai hay thậm chí cả ba: (i) do yếu tố kháng sinh: ví dụ kháng sinh kém chất lượng, mất hoạt tính,… Hoặc do chọn sai phổ tác dụng; (ii) do yếu tố cơ thể: hệ thống miễn dịch bị suy giảm hoặc vị trí ổ nhiễm khuẩn hạn chế kháng sinh khuếch tán tới đó; (iii) do yếu tố vi khuẩn: vi khuẩn đang ở trạng thái nghỉ - không nhân lên, không chuyển hóa nên không chịu tác dụng của kháng sinh,

ví dụ vi khuẩn lao ở trong các “hang” lao

1.1.3 Tình hình kháng kháng sinh hiện nay

Trong vài thập kỷ gần đây, đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh đã trở thành mối lo ngại hàng đầu trong lĩnh vực y tế của nhiều quốc gia Theo thống kê của Cơ quan Quản lý Dược phẩm Châu Âu (EMA), ước tính hàng năm có khoảng

25000 trường hợp tử vong do nhiễm khuẩn vi khuẩn đa kháng thuốc và gánh nặng kinh tế của đề kháng kháng sinh lên đến 1,5 tỷ Euro mỗi năm [25] Đầu năm 2017,

báo động, trong đó có 3 vi khuẩn có mức cảnh báo cao nhất là Pseudomonas

aeruginosa, Acinetobacter baumannii và họ Enterobacteriaceae kháng carbapenem

[64] Trên thế giới, nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh đã trở nên ngày càng kháng thuốc kháng sinh Hầu hết các chủng vi khuẩn gây bệnh đã kháng lại một hoặc nhiều loại kháng sinh [14] Một số nghiên cứu chỉ ra rằng: 70% các chủng vi khuẩn gây bệnh trong bệnh viện đã kháng lại ít nhất một loại kháng sinh thường

dùng trong điều trị Đặc biệt, một số chủng vi khuẩn như Escherichia coli,

Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii đã

kháng lại hầu hết các loại kháng sinh bao gồm cả các kháng sinh mạnh nhất hiện nay như cephalosporin và carbapenem [39, 16, 40, 36]

1.1.4 Tính kháng kháng sinh của một số vi khuẩn Gram âm

Vi khuẩn Gram âm là một nhóm vi khuẩn có lớp màng kép, có nhiều gen quan trọng nằm trên những ADN vòng tách biệt, rải rác trong nguyên sinh chất của

vi khuẩn gọi là các plasmid Plasmid thường chứa các gen sản xuất kháng sinh, một

số gen sản xuất các loại độc tố và các protein cho vi khuẩn Plasmid là công cụ giúp vận chuyển ADN từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác thông qua hiện tượng truyền gen ngang nên chúng đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực y, sinh, nông, dược và môi trường

Tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm có thể bắt nguồn từ hai yếu tố: yếu tố di truyền quy định tính đề kháng của vi sinh vật và hoạt tính của kháng sinh đã ức chế các vi khuẩn nhạy và chọn lọc những vi khuẩn kháng Tính đề kháng

sẽ phát triển khi có mặt đồng thời 2 yếu tố này trong môi trường hoặc vật chủ Các gen quy định đặc tính kháng và tế bào vi khuẩn sẽ cùng nhân lên và lan rộng dưới

áp lực chọn lọc của kháng sinh có trong môi trường

Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm thường được phân thành 3 nhóm cơ chế chính: làm giảm sự hấp thụ kháng sinh vào bên trong tế bào vi khuẩn, thay đổi đích tác động của kháng sinh và sản sinh ra các enzyme để ức chế hoặc biến đổi kháng sinh

Kháng sinh nhóm carbapenem được xem là “sự lựa chọn cuối cùng”, thường được chỉ định điều trị các trường hợp nhiễm trùng nặng hoặc nhiễm trùng do vi khuẩn kháng kháng sinh phổ rộng

Tại Việt Nam, vi khuẩn Gram âm đã kháng lại kháng sinh nhóm carbapenem

ở mức độ cao Tại 6 bệnh viện vào năm 2008 đã ghi nhận mức độ kháng

carbapenem của các chủng P aeruginosa là 20% và của các chủng A baumannii là

gần 50% Theo một nghiên cứu mới nhất ở bệnh nhân nhi thuộc Khoa hồi sức cấp cứu tại 3 bệnh viện tuyến đầu của Việt Nam đã cho thấy tỉ lệ kháng carbapenem ở

các chủng K pneumoniae, P aeruginosa và A baumannii lần lượt là 55%, 71% và

65% Các nghiên cứu về cơ chế kháng carbapenem tại Việt Nam cho thấy sự xuất hiện của các gen NDM-1, KPC, OXA-23, OXA-51 và OXA58 ở các chủng vi

khuẩn đường ruột và A baumannii phân lập tại một số bệnh viện lớn Tỉ lệ vi khuẩn

kháng kháng sinh nhóm carbapenem đang có xu hướng tăng và ngày càng lan rộng

ở Việt Nam

Cơ chế tác động của kháng sinh nhóm carbapenem là gắn và bất hoạt protein gắn penicillin (PBP), qua đó ức chế quá trình hình thành peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn Cơ chế đề kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram

âm Ba cơ chế đề kháng carbapenem phổ biến ở vi khuẩn Gram âm bao gồm: các gen nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid mã hóa sinh tổng hợp các enzyme carbapenemase phân giải phân tử carbapnenem; tạo ra các đột biến làm giảm tính thấm của màng tế bào thông qua việc thay đổi biểu hiện và/ hoặc hoạt động của các

lỗ màng và phân tử PBP và sử dụng bơm đẩy để bơm kháng sinh ra ngoài tế bào vi khuẩn Trong các cơ chế này, cơ chế sinh tổng hợp carbapenemase là cơ chế phổ biến và được nghiên cứu sâu rộng nhất Các enzyme carbapenemase được phát hiện chủ yếu thuộc nhóm A (ví dụ như enzyme KPC và GES), nhóm B metallo-β-lactamase (ví dụ như enzyme VIM, IMP và NDM) và nhóm D (ví dụ các enzyme họ OXA như OXA-23, OXA-48, OXA-51, OXA-58, OXA-181) Đối với các vi khuẩn

đường ruột Enterobacteriaceae, các carbapenemase có ý nghĩa lâm sàng nhất bao

gồm KPC (nhóm A), VIM, IMP, NDM (nhóm B) và OXA-48 (nhóm D) [5]

Nghiên cứu của Pokharel K và cộng sự về tính kháng carbapenem của vi khuẩn, tiến hành trên 1055 chủng vi khuẩn đường ruột (tháng 2/2018 đến tháng 5/2018) Kết quả cho thấy, có 27% số chủng này đề kháng với carbapenem [54] Đây chính là lý do, chúng tôi lựa chọn các chủng vi khuẩn đường ruột

Enterobacteriaceae, A baumannii và P aeruginosa để tiến hành nghiên cứu này Có

nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các chủng Enterobacteriaceae, A baumannii và P

aeruginosa chính là các chủng thường gặp nhất trong nhiễm trùng bệnh viện [4, 7]

1.2 Tổng quan về kháng sinh colistin

1.2.1 Cấu trúc hóa học

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của colistin bao gồm ba phần: (A) đuôi acyl kỵ nước, (B)

đoạn tripeptide tuyến tính (C) đầu ưa nước, vòng heptapeptide [49]

Colistin là kháng sinh thuộc nhóm polypeptide, được phát hiện lần đầu năm

1947 Colistin có trọng lượng phân tử khoảng 1200 Dalton (Da), đây là một kháng sinh polypeptide cation đa thành phần Colistin là sự kết hợp của ít nhất 85% colistin A (polymyxin E1) và khoảng 15% colistin B (pPolymyxin E2) [28, 33]

1.2.2 Lịch sử ra đời và sử dụng

Hình 1.3 B polymyxa [58]

Colistin được sản xuất bởi Bacillus polymyxa, một loại vi khuẩn ban đầu được

phân lập từ đất Trước đây, kháng sinh nhóm polymyxin đã được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới trong điều trị nhãn khoa, tuy nhiên, đến những năm 1980, polymyxin dần bị bỏ qua khi người ta nghiên cứu được độc tính trên thận của chúng Kể từ đó đến nay, polymyxin rất ít được sử dụng trên lâm sàng trừ trong điều trị nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm đa kháng thuốc (MDR) ở bệnh nhân xơ nang Ngày nay, sự xuất hiện của vi khuẩn gram âm đa kháng thuốc ngày một tăng, dẫn đến việc quay trở lại của polymyxin như sự lựa chọn cuối cùng Chính vì vậy, chúng ta cần cân nhắc giữa lợi ích và nguy cơ trong việc sử dụng colistin, xác định liều lượng chính xác để hạn chế tối đa tác dụng phụ của thuốc trên bệnh nhân [3, 17,

28, 33]

Colistin được lựa chọn để điều trị các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng do các

vi khuẩn đa kháng thuốc như A baumannii, Enterobacteriaceae như viêm phổi,

nhiễm khuẩn huyết, nhiễm trùng xương khớp, nhiễm trùng đường tiết niệu và viêm màng não [50]

Colistin có thể được sử dụng trong điều trị viêm phổi ở các bệnh nhân có thở máy Một số nghiên cứu so sánh về hiệu quả của liệu pháp colistin điều trị viêm

phổi thở máy gây ra do A baumannii và P aeruginosa đã cho thấy kết quả ngang

bằng hoặc tốt hơn so với liệu pháp carbepenem độc lập Một nghiên cứu khác từ Bệnh viện đa khoa Singapore của Kwa và cộng sự năm 2005 đã chỉ ra, việc điều trị bằng colistin cho các bệnh nhân viêm phổi do thở máy bởi các vi khuẩn đa kháng

(A baumannii và P aeruginosa) cho tỷ lệ đáp ứng khoảng 57,1% và 85,7%

Trong những trường hợp nhiễm trùng huyết nghiêm trọng đe dọa tính mạng, sự kết hợp của carbapenem và colistin có thể được chỉ định Một nghiên cứu về

nhiễm trùng huyết do K pneumoniae của Karabinis và cộng sự tiến hành năm

2004 cho thấy, các trường hợp bệnh nhân bị sốc nhiễm khuẩn đã được điều trị thành công với colistin [50]

1.2.3 Phổ tác dụng

Phổ kháng khuẩn và cơ chế tác dụng của colistin tương tự như polymyxin B, tuy nhiên, tác dụng kém hơn polymyxin B Các polymyxin có tác dụng ngay cả đối với các tế bào ở trạng thái nghỉ, do cơ chế làm thay đổi tính thấm chọn lọc của màng tế bào, gây chết tế bào [3]

Colistin có tác dụng tiêu diệt hầu hết các loài vi khuẩn Gram âm hiếu khí,

ngoại trừ Neisseria, Proteus, Serratia, Providencia, Brucella và Edwardsiella,

Pseudomonas mallei, và Burkholderia cepacia Colistin diệt vi khuẩn nhanh chóng,

thời gian diệt khuẩn phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh Colistin có hoạt tính invitro

chống lại một số tác nhân gây bệnh đa kháng thuốc (MDR), bao gồm Pseudomonas

aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae và Stenotrophomonas maltophilia Colistin không có hoạt tính đối với vi khuẩn Gram dương, các cầu khuẩn

và vi khuẩn kỵ khí Đã có báo cáo cho rằng, colistin có khả năng diệt khuẩn đối với

một số loài Mycobacteria, bao gồm cả Mycobacterium tuberculosis [17]

1.2.4 Cơ chế tác dụng

Hình 1.4 Cơ chế tác động của colistin lên tế bào vi khuẩn (nguồn: EUCAST)

Cơ chế diệt khuẩn của colistin vẫn chưa được biết rõ, tuy nhiên, có một số nghiên cứu chỉ ra rằng, đích tác động ban đầu của colistin là thành phần lipopolysaccharide (LPS) của màng ngoài tế bào vi khuẩn Các polymyxin có điện tích dương mạnh, có chuỗi acyl kỵ nước làm cho cho chúng mối liên kết cao với các phân tử lipopolysaccharide Chúng tương tác tĩnh điện với các phân tử LPS này và thay thế cạnh tranh cation hóa trị hai, hệ quả là chúng làm phá vỡ màng tế bào Kết quả của quá trình này là làm tăng tính thấm của vỏ tế bào, rò rỉ các thành phần của

tế bào, làm chết tế bào [17] EUCAST cũng chỉ ra cơ chế kháng khuẩn của colistin tương tự như trên, cụ thể như sau: Thay thế các cation hóa trị hai có vai trò ổn định LPS bằng các cấu trúc polycationic lớn hơn [45], dẫn đến:

+ Mất ổn định tổ chức cấu trúc của LPS

+ Mất ổn định của màng ngoài vi khuẩn

+ Tăng tính thấm của màng tế bào chất

+ Rò rỉ các thành phần trong tế bào chất gây chết tế bào [45]

Tuy nhiên, lại có những ý kiến cho rằng, sự gia tăng tính thấm màng tế bào là một hệ quả tác động của polymyxin nhưng không phải là nguyên nhân gây chết tế bào Cơ chế tác động của polymyxin vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu [17]

1.2.5 Cơ chế đề kháng

Trước đây, do colistin ít được sử dụng nên tỷ lệ kháng colistin tương đối thấp Tuy nhiên, gần đây, tỷ lệ kháng colistin đã xuất hiện và ngày càng gia tăng ở một số

chủng vi khuẩn A baumannii, bên cạnh đó là K pneumoniae và P aeruginosa Sự

đề kháng của P aeruginosa với colistin ngày càng gia tăng, được mô tả chủ yếu ở

các bệnh nhân bị xơ nang và có sử dụng liệu pháp colistin theo con đường khí dung

Hình 1.5 Cơ chế đề kháng colistin của vi khuẩn [45]

Cơ chế đề kháng colistin vẫn đang được nghiên cứu, tuy nhiên, có một vài nghiên cứu đã tiến hành chỉ ra rằng, cơ chế đề kháng colistin của vi khuẩn liên quan

đến sự biến đổi LPS Các phân loài Paenibacillus polymyxa colistinus đươc cho là

có thể tạo ra colistinase, làm bất hoạt colistin Tuy nhiên, giả thuyết này còn gây nhiều tranh cãi Gần đây, sự kháng colistin qua trung gian do sự mất hoàn toàn sản

xuất LPS đã được mô tả trong các chủng A baumannii [17]

Các vi khuẩn đề kháng tự nhiên với colistin: Vi khuẩn Gram dương, cầu khuẩn

Gram âm, Proteus, Providecia, Mycobacteria và vi khuẩn kỵ khí [3]

1.2.6 Dƣợc động học, liều dùng

Trên thị trường, hiện nay colistin có hai dạng chính: colistin sulphate và natri colistimethate Trong dung dịch, natri colistimethate trải qua quá trình thủy phân tự phát để trở thành colistin dạng hoạt động Natri colistimethate thường được dùng đường tiêm tĩnh mạch, dạng này ít độc hơn colistin sulphate Colistin có thể được dùng theo đường tiêm bắp, tuy nhiên, tiêm bắp ít được sử dụng trong lâm sàng vì có thể gây đau dữ dội tại vị trí tiêm và có thể thuốc sẽ bị biến đổi trong quá trình hấp phụ Colistin sulphate thường được dùng đường uống (đối với nhiễm trùng đường tiêu hóa) hoặc dùng tại chỗ (điều trị nhiễm trùng da) Cả colistin sulphate và natri colistimethate đều có thể dùng trong trường hợp nhiễm trùng đường hô hấp, tuy nhiên colistin sulphate thường dẫn đến tần suất co thắt phế quản cao hơn so với natri colistimethate [17]

Hình 1.6 Một số dạng bào chế của colistin [45]

+ Dạng thuốc và hàm lượng:

Viên nén: 500000 IU colistin sulfat (tương đương với 50mg colistin)

Siro: 250000 IU (colistin sulfat)

Thuốc tiêm dạng bột 500000 IU/lọ (tương đương với 40 mg colistin methansulfonat hoặc 16,66 mg colistin), dung môi để pha kèm theo 3ml dung dịch natri clorid 0,9%

Thuốc dùng tại chỗ: Thuốc nhỏ tai, thuốc nhỏ mắt, thuốc mỡ tra mắt [3]

Dùng colistin sulfat đường uống để điều trị nhiễm khuẩn đường tiêu hóa và dùng kết hợp với một số thuốc khác để chống nhiễm khuẩn có chọn lọc ở đường tiêu hóa đối với các bệnh nhân có nguy cơ cao bị nhiễm khuẩn nội sinh

Colistin có thể dùng ở dạng thuốc nhỏ hoặc thuốc bôi ngoài da đối với các trường hợp điều trị viêm tai ngoài, bội nhiễm vết bỏng, vết loét

Đối với các bệnh nhân có nhiễm khuẩn đường hô hấp, đặc biệt đối với bệnh nhân xơ nang, có thể dùng colistin dạng khí dung

Cũng giống như bất kỳ kháng sinh nào, chỉ định dùng colistin phải dựa trên kháng sinh đồ [3]

Colistin sulfat và natri colistimetat hấp thu kém qua đường uống (chỉ khoảng 0,5%), không được hấp thu qua niêm mạc hoặc da lành Sau khi uống, thuốc đào thải qua phân dưới dạng không đổi

Sau khi tiêm bắp với liều tương đương 150mg colistin, từ 2 – 3 giờ, thuốc đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương Khi dùng đường tiêm tĩnh mạch, nồng độ đỉnh cao hơn nhưng giảm nhanh hơn so với đường tiêm bắp Invitro, có một tỷ lệ nhỏ natri colismetat có thể tự thủy phân và trở thành dạng colistin hoạt động Colistin gắn lỏng lẻo vào các mô còn colismetat thì không kết gắn

Thời gian bán thải của colistin là khoảng 2 – 3 giờ Colistin natri colistimetat đào thải chủ yếu qua quá trình lọc cầu thận dưới dạng ban đầu hoặc dạng chuyển hóa Trong vòng 24 giờ, có thể tới 80% liều thuốc đã bài xuất vào nước tiểu Ở trẻ

em, thuốc đào thải nhanh hơn ở người lớn, thuốc đào thải chậm ở những người có suy giảm chức năng thận

Colistin không qua hàng rào máu – não và xuất hiện rất ít trong dịch nhãn cầu, dịch ổ khớp, dịch màng phổi Colistin gắn 50% với protein huyết tương Colistin có thể qua được nhau thai và có thể bài tiết qua sữa mẹ [3]

1.2.7 Chống chỉ định và tác dụng không mong muốn [3]

+ Chống chỉ định: Người bệnh dị ứng với polymyxin hoặc các thành phần khác của thuốc, trẻ sơ sinh, người bị bệnh nhược cơ (chống chỉ định dùng đường tiêm bắp), người bệnh bị suy thận nặng, người bệnh đang dùng thuốc khác độc đối với thận, người bệnh gây mê có dùng hydroxydion

+ Tác dụng không mong muốn

- Gây độc trên thận

- Phản ứng dị ứng, sốt do thuốc

- Gây độc cho hệ thần kinh

- Tiêu hóa: Rối loạn tiêu hóa, viêm ruột kết màng giả

- Phản ứng tại chỗ: Đau tại chỗ tiêm

- Kích ứng màng não (Trong trường hợp tiêm thuốc vào ống tủy)

- Điếc, tổn thương ống tai (khi nhỏ thuốc qua màng nhĩ bị thủng)

- Gây ức chế thần kinh – cơ

- Độc tính trên gan

- Giảm bạch cầu hạt

1.3 Các kỹ thuật xét nghiệm định danh và xác định nồng độ ức chế tối thiểu của vi khuẩn

1.3.1 Các kỹ thuật định danh vi khuẩn

Định danh bằng phương pháp API 20: API 20 là một hệ thống chuẩn để định

danh những trực khuẩn ngoài đường ruột, và các Gram Âm dễ nuôi cấy (ví dụ:

Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, vv )

kết hợp giữa 8 test thường quy, 12 test đồng hóa, các thử nghiệm này nhằm xác định các tính chất lên men và xác định các enzyme có mặt trong vi khuẩn Dựa vào kết quả

của các thử nghiệm và cơ sở dữ liệu của hệ thống API, ta xác định đươc căn nguyên cần tìm

Hình 1.7 API [20]

Định danh bằng máy tự động VITEK2-compact

Dùng phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh vật hoá học của

vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu của các giếng môi trường có sẵn trong card định danh; máy sẽ giám sát sự phát triển và hoạt tính của vi sinh vật bên trong các giếng của thẻ xét nghiệm Bộ phận quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để đánh giá trực tiếp sự phát triển của vi sinh vật Bộ phận quang học này dựa trên đọc ánh sáng ban đầu của mỗi giếng trước khi bắt đầu có sự phát triển Máy đọc 15 phút/lần để đo sự phát triển của vi khuẩn trong mỗi giếng Phần mềm so sánh kết quả thu được với cơ sở dữ liệu để đưa ra kết quả

Hình 1.8 Hệ thống định danh VITEK2 [48]

Định danh vi khuẩn bằng máy MALDI Biotyper

Nguyên lý: Mỗi loài sinh vật đều có thành phần các protein trong ribosome rất

đặc trưng cho riêng loài đó, gọi là dấu ấn phân tử (molecular fingerprint) của loài Máy MALDI Biotyper sử dụng công nghệ MALDI-TOF MS để gây ion hóa và thu nhận các protein/peptide từ mẫu cần định danh, sau đó biểu diễn chúng ở dạng một phổ khối lượng (hay còn gọi là khối phổ) Bằng cách so sánh khối phổ thu được với các phổ tham chiếu có sẵn trong thư viện dữ liệu, máy MALDI Biotyper sẽ cho kết quả định danh chính xác loài vi sinh vật

Phương pháp định danh MALDI TOF MALDI BIOTYPER giúp nâng cao độ chính xác của kết quả xét nghiệm và rút ngắn thời gian định danh từ 8 giờ - 24 giờ xuống còn hơn vài chục giây

1.3.2 Các kỹ thuật kháng sinh đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu [67, 68]

Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được thực hiện bằng một

số phương pháp như sau: Pha loãng kháng sinh trong môi trường lỏng (macrodilution và microdilution), pha loãng kháng sinh trong thạch, khuếch tán kháng sinh từ E-test… Bên cạnh đó, còn có thể xác định bằng các hệ thống máy tự động như VITEK2-compact, Phoenic,…

Nguyên tắc chung của xác định MIC là cho vi khuẩn thử nghiệm tiếp xúc với các nồng độ kháng sinh giảm dần trong môi trường dinh dưỡng rồi xác định nồng

độ thấp nhất của kháng sinh mà tại đó vi khuẩn bị ức chế hoàn toàn

Kháng sinh đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu bằng E-test

E-test là que giấy bằng nitrocellulose, trên đó có tẩm kháng sinh thành một dãy

có hàm lượng giảm dần Khi đặt que E-test lên mặt môi trường đã trải vi khuẩn, kháng sinh từ E-test sẽ khuếch tán ra môi trường cũng theo nồng độ giảm dần, nhờ vậy mà sự phát triển của vi khuẩn xung quanh E-test sẽ bị ức chế hình thành một vùng vô khuẩn

có hình elip Điểm cắt của vùng vô khuẩn khi tiếp giáp với E-test cho biết giá trị MIC của kháng sinh và được đọc bằng giá trị ghi trên điểm giao cắt này

Hình 1.9 Quy trình thực hiện kháng sinh đồ xác định MIC bằng phương pháp

sử dụng E-test [67]

Quy trình thực hiện kháng sinh đồ bằng E-test cụ thể như sau:

+ Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn thử nghiệm

+ Môi trường làm kháng sinh đồ bằng phương pháp E-test

+ Kỹ thuật dàn vi khuẩn lên môi trường

+ Đặt E-test lên mặt môi trường kháng sinh đồ đã trải vi khuẩn

Thanh E-test được giữ trong các hộp hoặc các túi kín có chất hút ẩm và được lấy khỏi tủ lạnh khoảng 1 giờ trước khi thực hiện kỹ thuật để đảm bảo nhiệt độ thanh E-test bằng với nhiệt độ phòng, khi đó sẽ tránh được hiện tượng nước ngưng

tụ trên thanh E-test và làm giảm hàm lượng kháng sinh trong thanh Dùng kẹp vô trùng gắp và đặt thanh E-test trên bề mặt môi trường thử nghiệm Khi đặt, cần để mặt số ở trên và ấn thật nhẹ để đảm bảo E-test tiếp xúc đều với mặt thạch Que E-test đặt xong không được di chuyển vị trí Với đĩa thạch đường kính 90mm thì có thể đặt tối đa 2 thanh ngược chiều nhau

+ Nuôi ủ và đọc kết quả

Sau khi đã đặt que E-test lên mặt môi trường, đặt môi trường nuôi ủ trong nhiệt độ 350C trong tủ ấm, khí trường thích hợp

Hình 1.10 E-test và xác định MIC bằng E-test (MP: Ký hiệu của kháng meropenem, vùng vô khuẩn cắt E-test tại giá trị 0,125 nên MIC của meropenem

đối với vi khuẩn 0,125µg/ml) Nguồn: NK-BIOTEK [67]

Kỹ thuật kháng sinh đồ bằng máy VITEK2-compact

Xác định mức độ kháng kháng sinh bằng máy tự động VITEK 2 – compact

dựa trên nguyên lý: hệ thống quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để theo dõi trực tiếp sự phát triển của vi sinh vật thông qua việc đo cường độ ánh sáng bị chặn lại (hay sự suy giảm cường độ ánh sáng) khi ánh sáng đi qua giếng; Dùng phương pháp

đo độ đục của vi khuẩn bằng việc sử dụng card kháng sinh đồ để xác định MIC - nồng độ ức chế tối thiểu, bằng máy VITEK 2 – compact

Hình 1.11 Hệ thống định danh VITEK 2 [nguồn: 22]

Xác định MIC bằng phương pháp pha loãng kháng sinh trong thạch

Đây là một trong những phương pháp cổ điển nhất trong xác định nồng độ ức chế tối thiểu của vi khuẩn với kháng sinh Các kháng sinh sẽ được pha loãng ở các nồng độ pha loãng bậc hai khác nhau trong từng đĩa petri Ưu điểm của phương pháp này là khả năng thử nghiệm đồng thời nhiều chủng với một nồng độ kháng sinh nhất định trong một lần thử nghiệm, kỹ thuật này cũng có thể áp dụng đối với các vi khuẩn khó phát triển trong môi trường canh thang (ví dụ: Vi khuẩn kỵ khí, vi

khuẩn N gonorrhoeae) Nhược điểm của kỹ thuật này là tốn thời gian

Kháng sinh đồ xác định MIC của bằng phương pháp pha loãng kháng sinh trong thạch được áp dụng để có thể thực hiện kháng sinh đồ hoàng loạt chủng cho một hay nhiều kháng sinh Phương pháp này hiếm khi được thực hiện để trả lời kết quả cho lâm sàng mà thường chỉ được tiến hành trong nghiên cứu phục vụ mục tiêu giám sát nhiễm khuẩn, điều tra dịch tễ hay các nghiên cứu theo dõi đề kháng và khuynh hướng đề kháng của các vi khuẩn phân lập từ lâm sàng có khuynh hướng đề kháng nổi trội

Môi trường làm kháng sinh đồ tốt nhất là MHA (Mueller-Hinton Agar) Kháng sinh được pha theo nồng độ giảm dần trên mỗi đĩa MHA Trên cùng một đĩa kháng sinh có thể thực hiện thử nghiệm đồng thời nhiều chủng

Pha loãng kháng sinh trong ống nghiệm và trong giếng (broth microdilution và broth microdilution)

Đây cũng là một trong những phương pháp cổ điển nhất nhằm xác định MIC

của vi khuẩn Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý vi khuẩn được phát triển trong môi trường canh thang với nồng độ kháng sinh giảm dần theo nồng độ pha loãng bậc hai Hai kỹ thuật này chỉ khác nhau ở cách thức tiến hành và thể tích môi trường nuôi cấy (macrodilution có thể tích môi trường nuôi cấy tối thiểu 2-5ml, trong khi

đó microdilution có thể tích môi trường nuôi cấy tối đa là 100µl) Chi tiết về kỹ thuật sẽ được đề cập đến trong phần Phương pháp nghiên cứu

Hình 1.12 Quy trình xác định MIC bằng kỹ thuật microdilution

(pha loãng trong giếng) [67]

Hình 1.13 Quy trình xác định MIC bằng kỹ thuật macrodilution

(pha loãng trong ống nghiệm) [67]

EUCAST và CLSI khuyến cáo, nên dùng kỹ thuật microdilution để thử nghiệm tính nhạy cảm của vi khuẩn với colistin Tuy nhiên, trên thực tế, rất ít các phòng xét nghiệm vi sinh sử dụng kỹ thuật này trong quy trình xét nghiệm thường quy Nghiên cứu của Matuschek E và cộng sự tiến hành năm 2017 trên 75 chủng vi

khuẩn Gram âm, kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu bằng kỹ thuật E-test với

kỹ thuật microdilution được sử dụng làm tham chiếu, cho kết quả EA là 43% Theo kết quả của nghiên cứu, tác giả khuyến cáo không nên sử dụng E-test trong việc xác định nồng độ ức chế tối thiểu của colistin [43] Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Janet A Hindler và cộng sự năm 2013, tiến hành trên 107 chủng vi khuẩn Gram âm đa kháng, EA là 47% [31]

Phương pháp khoanh giấy khuếch tán không đáng tin cậy để xác định tính nhạy cảm với colistin [21, 55]

Ở K pneumoniae, CA giữa E-test và BDM là 77%, VME là 31% và 28%,

tương ứng với colistin và polymyxin B Một nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra CA là 56%, VEM là 41,5% và ME là 2,4% giữa BMD và E-test Mặc dù, hệ thống VITEK

2 cho tỷ lệ CA cao (93-97%), tuy nhiên, VME lại cao (3-11%) Nghiên cứu này đã đưa ra kết luận, hệ thống VITEK 2 và E-test đều cho hiệu suất kém khi xác định MIC colistin của vi khuẩn Cần tiến hành kỹ thuật BMD [65] Chew KL và cộng sự

đã nghiên cứu trên 76 chủng đường ruột (EA) của kết quả xét nghiệm colistin giữa BMD và VITEK 2, Sensititre, và E-test lần lượt là 93,4%, 89,5% và 75,0% Tỷ lệ kết quả xét nghiệm EA của polymyxin B giữa BMD và VITEK 2, Sensititre và E-test lần lượt là 96,1%, 96,1% và 48,7% Mặc dù tương quan MIC dương tính (Spearman's ρ = 0,873) với phương pháp tham chiếu đã đạt được cho thử nghiệm colistin với VITEK 2, EA <90%, với tỷ lệ lỗi rất lớn là 36% Tương quan với E-test MIC thấp hơn, với tỷ lệ lỗi rất lớn là 12% (colistin) và 26,1% (polymyxin B) Thỏa thuận phân loại của MicroScan (colistin) là 88,2%, với tỷ lệ lỗi rất lớn là 4% Như vậy, đối với các kỹ thuật sử dụng hệ thống VITEK 2 và E-test, đều đặt ra vấn đề về tính chính xác của kết quả thử nghiệm [12, 37]

Nghiên cứu của T.Y Tan và cộng sự được đăng tải trên Pubmed đã chỉ ra rằng, hệ thống VITEK 2 không đáng tin cậy để phát hiện tính kháng colistin [61] Balaji Veeraraghavan đã nêu ra kỹ thuật khoanh giấy đối với kháng sinh polymyxin là không khả thi vì trọng lượng phân tử của chúng lớn dẫn đến sai sót rất

lớn trong kết quả CLSI khuyến cáo sử dụng kỹ thuật vi pha loãng CLSI cũng không chấp nhận việc sử dụng P-80 trong kỹ thuật xác định MIC của vi khuẩn do khả năng gây ra tác dụng diệt khuẩn hiệp đồng của P-80 và polymyxin Bên cạnh

đó, P-80 cũng là một chất hoạt động bề mặt và có tính kháng khuẩn nhẹ, như vậy khi sử dụng P-80 trong kỹ thuật vi pha loãng có thể làm ảnh hưởng đến giá trị MIC colistin đối với vi khuẩn [10]

Shelby Simar và cộng sự đã tiến hành so sánh kỹ thuật E-test với kỹ thuật vi pha loãng để xác định MIC polymyxin B và polymyxin E Kết quả, EA giữa E-test polymyxin E và polymyxin B với kỹ thuật vi pha loãng lần lượt là 59% và 61%, CA tương ứng là 89% và 88% [60]

Nghiên cứu của Shamina OV và cộng sự, tiến hành trên 119 chủng K

pneumoniae kháng carbapenem phân lập từ các bệnh nhân đến từ 3 bệnh viện ở

Moscow trong những năm 2012 – 2016, so sánh tỷ lệ kháng colistin của vi khuẩn sử dụng phương pháp E-test và VITEK 2 Compact, sử dụng phương pháp microdilution làm phương pháp tham chiếu Kết quả cho thấy CA, EA của cả hai phương pháp này so với microdilution đều nhỏ hơn 90% trong khi đó VME lần lượt

là 26% và 34% Kết quả của nghiên cứu này đưa ra lời cảnh báo với các bệnh viện nên thận trọng trong việc sử dụng E-test và VITEK 2 trong xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh colistin [59]

Như vậy, ta thấy, đã có rất nhiều nghiên cứu của nước ngoài chỉ ra rằng kỹ thuật E-test (mà hiện tại đang áp dụng trên lâm sàng tại Việt Nam) không thích hợp để xác định MIC của colistin đối với vi khuẩn Gram âm EUCAST và CLSI khuyến cáo, chỉ

có duy nhất kỹ thuật microdilution được sử dụng để làm tham chiếu trong xác định MIC của colistin với vi khuẩn, tuy nhiên kỹ thuật này lại yêu cầu khá tỉ mỉ, vì vậy việc tìm ra một phương pháp chính xác và phù hợp để áp dụng trong lâm sàng là vô cùng cần thiết Các nghiên cứu nói trên cũng đã chỉ ra sự tương đồng trong hiệu quả của phương pháp macrodilution và microdilution trong xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn Gram âm đa kháng với kháng sinh colistin [13, 42, 32, 22] và sự không phù hợp của các kỹ thuật khác (E-test, VITEK, Pha loãng kháng sinh trong thạch)

Hiện tại, chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này được công bố ở Việt Nam Phương pháp macrodilution và microdilution cũng chưa được đưa vào sử dụng ở các phòng xét nghiệm trong nước Do vậy, nghiên cứu về sự phù hợp giữa phương pháp macrodilution và phương pháp microdilution trong xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh colistin là vô cùng cần thiết Khi có được kết quả nghiên cứu này, chúng ta sẽ có cơ sở để khuyến cáo triển khai trên lâm sàng trong xác định nồng

độ ức chế tối thiểu của vi khuẩn với colistin, hạn chế tối đa các sai sót trong kết quả

MIC đối với colistin Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Đánh giá hiệu

quả của kỹ thuật macrodilution và microdilution trong xác định mức độ nhạy cảm

So sánh kỹ thuật macrodilution và microdilution trong xác định mức độ nhạy cảm với colistin của một số chủng vi khuẩn Gram âm

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu bệnh phẩm

Chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân của đề tài được lưu trữ tại Ngân hàng mẫu của Bệnh viện Bệnh nhiệt đới trung ương, thỏa mãn các tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ

Tiêu chuẩn lựa chọn:

+ Chủng vi khuẩn được lưu, có đầy đủ các thông tin cần thiết tại Ngân hàng mẫu

+ Là các chủng Enterobacteriaceae, A baumannii, P aeruginosa đa kháng

kháng sinh (kháng carbapenem) (Xem mục 1.1.4 về lý do chọn các chủng này) + Thời gian thu thập mẫu: Từ tháng 12 năm 2017 đến tháng 8 năm 2018

+ Đã được nuôi cấy, định danh và xác định lại tính đa kháng kháng sinh

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

+ Chủng vi khuẩn đã được lựa chọn bị chết hoặc biến đổi tính chất sinh vật hóa học, hoặc không đủ thông tin

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Khoa Xét Nghiệm – Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

+ Tủ lạnh thường, Alaska, LS -8B

+ Tủ lạnh âm sâu dạng đứng, Mỹ, U725 Eppendorf –NBS

+ Hệ thống máy định danh nhanh Maldi-biotyper, BRUKER

+ Máy định danh vi khuẩn VITEK2/VK2C 3606

+ Máy Vortex, 07604 Reax 2000

+ Máy đo độ đục, Densichek Plus Instrument, mã số 21250

+ Lò hấp tiệt trùng, MECOVI, HA1575L189

+ Bình cầu, đĩa petri, pipet tự động, ống Falcon, ống Eppendorf, BioMerieux, Mỹ + Que cấy, BioMerieux, Mỹ

+ Đèn cồn, Việt Nam lam kính

+ Pipet, đầu côn vàng, BioMerieux, Mỹ

+ Găng tay, khẩu trang, Việt Nam

+ Đĩa 96 giếng, BioMerieux, Mỹ

2.3.2 Hóa chất

+ Khoanh giấy kháng sinh colistin 10µg, Oxoid, Anh

+ NaCl 0.9%, Nam Khoa, Việt Nam

+ Colistin stock 25600 µg/mL, Oxoid, Anh

+ Hóa chất chuẩn: Bacterial Test Standard (BTS), BioMerieux, Pháp

+ Hóa chất định danh HCCA Matrix, BioMerieux, Pháp

+ Hóa chất dung môi Stock Solution: Acetonitrile (ACN) 100% và

Trifluoracetic acid 100% (TFA), BioMerieux, Pháp

+ API rapid, BioMerieux, Pháp

+ Bộ thuốc nhuộm Gram, Lavitec, Việt Nam

+ Thuốc thử dành cho API rapid, BioMerieux, Pháp

2.3.3 Môi trường

+ Môi trường thạch bột Blood agar base, BioMerieux, Pháp

+ Môi trường thạch bột Cation Adjusted Muller Hinton Broth, BioMerieux, Pháp + Môi trường thạch bột Nutrient Agar, BioMerieux, Pháp

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu hồi cứu

2.4.2 Cỡ mẫu

+ 69 mẫu vi khuẩn Enterobacteriaceae

+ 30 mẫu vi khuẩn A baumannii

+ 30 mẫu vi khuẩn P aeruginosa

(Cỡ mẫu tối thiểu yêu cầu đối với thử nghiệm này theo CLSI là 30 [57])

2.4.3 Các kỹ thuật nghiên cứu

2.4.3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy phân lập

Công thức pha môi trường thạch máu theo hướng dẫn của nhà sản xuất:

+ Blood agar base: 40g

Để nguội môi trường về nhiệt độ khoảng 45-50o

C, cho 50ml máu vào quay tròn bình cho máu hòa tan đều trong thạch Màu thạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn

0C đổ 20ml/ đĩa

Sau khi thạch đã được đóng gói, lấy 5% số môi trường vừa sản xuất cho vào tủ

ấm 37o

C để qua đêm để kiểm tra tính vô trùng của môi trường;

 Kiểm tra chất lượng đĩa môi trường thạch máu:

Kiểm tra môi trường để qua đêm trong tủ ấm 37oC

Kết quả: Đạt khi vi khuẩn không mọc, không đạt khi vi khuẩn mọc

Bảo quản thạch ở nhiệt độ 2-8oC trong tủ lạnh

+ Ghi chép vào sổ pha môi trường và sổ kiểm tra chất lượng môi trường Công thức pha môi trường thạch thường theo hướng dẫn của nhà sản xuất: Nutrient agar: 28g

Nước RO: 1000ml

Cân chính xác 28g bột nutrient agar, cho vào 1000 ml nước RO, đun nóng cho đến khi môi trường tan hoàn toàn

Hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút;

Để nguội môi trường về nhiệt độ khoảng 45-50oC, đổ 20ml/đĩa

Sau khi thạch đã được đóng gói, lấy 5% số môi trường vừa sản xuất cho vào tủ

ấm 37oC để qua đêm để kiểm tra tính vô trùng của môi trường;

+ Kiểm tra chất lượng đĩa môi trường thạch thường:

Kiểm tra môi trường để qua đêm trong tủ ấm 37oC

Kết quả: Đạt khi vi khuẩn không mọc, không đạt khi vi khuẩn mọc

Bảo quản thạch ở nhiệt độ 2-8oC trong tủ lạnh

+ Ghi chép vào sổ pha môi trường và sổ kiểm tra chất lượng môi trường Công thức pha môi trường Cation – Adjusted Mueller Hinton theo hướng dẫn của nhà sản xuất :

Cation – Adjusted Mueller Hinton: 21g

Nước RO: 1000ml

Cân chính xác 21g bột Blood agar base, cho vào 1000 ml nước RO, đun nóng cho đến khi môi trường tan hoàn toàn

Hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút;

+ Đo pH của dung dịch CAMB: đổ 5 – 10ml canh thang CAMB vào ống falcon 50ml để đo pH pH có giá trị 7,2 – 7,4 là đạt yêu cầu Nếu dung dịch có pH<7 cần bổ sung thêm NaOH 1M; nếu pH >7,5, cần thêm HCl 1M lắc đều rồi đo lại

+ Chia dung dịch CAMB vào các ống falcon 50ml, ghi tên môi trường và ngày sản xuất Bảo quản môi trường trong ngăn mát tủ lạnh

Để nguội đến khoảng 45 - 500C, chắt ra các ống để lưu trữ

Lấy 5% số môi trường vừa sản xuất cho vào tủ ấm 37oC để qua đêm để kiểm tra tính vô trùng của môi trường;

+ Kiểm tra chất lượng môi trường CAMHB bằng cách như sau: Lấy 3 ống môi trường ngẫu nhiên (1 ống lúc bắt đầu đổ, một ống giữa quá trình đổ và một ống cuối quá trình đổ), cấy vào thạch máu, để qua đêm trong tủ ấm 370C

Kết quả: Đạt khi vi khuẩn không mọc, không đạt khi vi khuẩn mọc

Bảo quản môi trường ở nhiệt độ 2-8oC trong tủ lạnh

+ Ghi chép vào sổ pha môi trường và sổ kiểm tra chất lượng môi trường

2.4.3.2 Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập các vi khuẩn trong thử nghiệm

+ Đặt môi trường thạch máu vào tủ ấm 37oC trước khi sử dụng 30 phút

+ Ghi mã nghiên cứu của vi khuẩn thử nghiệm

+ Cấy phân vùng các vi khuẩn thử nghiệm trên thạch máu

+ Các đĩa nuôi cấy được để tủ ấm 37°C

+ Định danh lại các loại khuẩn lạc mọc trên môi trường nuôi cấy bằng máy MALDI Biotyper