Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây thảo quả đồng (amomum koenigii) của việt nam

Đồng thời em cũng gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo, các anh chị cao học, nghiên cứu sinh và các em sinh viên trong Phòng thí nghiệm Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã tạo

ĐỒNG (AMOMUM KOENIGII) CỦA VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: PGS TS Phan Minh Giang

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Phan Minh Giang đã tin tưởng giao đề tài, tận tình hướng dẫn

và tạo các điều kiện nghiên cứu thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Đồng thời em cũng gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo, các anh chị cao học, nghiên cứu sinh và các em sinh viên trong Phòng thí nghiệm Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã tạo một môi trường nghiên cứu thuận lợi trong suốt thời gian em thực hiện luận văn này Đặc biệt xin gửi lời cám ơn các em sinh viên Lê Thu Ngọc và Trần Thị Quỳnh đã cùng làm việc trong nhóm nghiên cứu Amomum koenigii

Em xin chân thành cảm ơn anh chị, các bạn và các em trong Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu, Bộ Y tế đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Tạ Thị Thủy

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ 5

MỞ ĐẦU 7

TÓM TẮT 8

Chương 1: TỔNG QUAN 10

1.1 TỔNG QUAN VỀ HỌ GỪNG - ZINGIBERACEAE 10

1.1.1 Họ Gừng (Zingiberaceae) 10

1.1.2 Chi Amomum 10

1.2 CÂY THẢO QUẢ ĐỒNG (Amomum koenigii J F Gmelin) 23

1.2.1 Thực vật học 25

1.2.2 Phân bố và môi trường sống 25

1.2.3 Công dụng trong Y học cổ truyền 25

Chương 2: THỰC NGHIỆM 25

2.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1.1 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 25

2.1.2 Các phương pháp xác định cấu trúc 28

2.1.3 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm 29

2.1.4 Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa 30

2.2 NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 31

2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY THẢO QUẢ ĐỒNG 32

2.3.1 Điều chế các phần chiết từ thân rễ 32

2.3.2 Điều chế các phần chiết từ quả 32

2.4 PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 33

2.4.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết n-hexan (AKRH và AKFH) 33

2.4.2 Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết dichlometan (AKRD và AKFD) 33

2.5 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 33

2.5.1 Phân tách phần chiết gộp n-hexan và dichlometan từ thân rễ (AKRHD) 33 2.5.2 Phân tách phần chiết n-hexan từ quả (AKFH) 37

2.5.3 Phân tách phần chiết dichlometan từ quả (AKFD) 39

2.5.4 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất được phân lập 39

2.5.5 Phân tích định lượng các flavonol AKRHD7.1, AKRHD7.3.2 và AKRHD7.4.2.4 bằng RP-HPLC 43

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 45

3.2 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY THẢO QUẢ ĐỒNG 45

3.3 PHÂN TÁCH SẮC KÝ CÁC PHẦN CHIẾT 47

3.3.1 Phân tách phần chiết n-hexan và dichlometan (AKRHD) từ thân rễ 47

3.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (AKFH) và dichlometan (AKFD) từ quả 50 3.4 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP 52

3.4.1 Các hợp chất được phân lập từ thân rễ 52

3.4.2 Các hợp chất được phân lập từ quả 58

3.4.3 Phân tích định lượng flavonol bằng RP-HPLC 61

3.5 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP 63

3.5.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật của các hợp chất được phân lập 63

3.5.2 Hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất được phân lập 64

3.6 CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY THẢO QUẢ ĐỒNG 65

KẾT LUẬN 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

PHẦN PHỤ LỤC 75

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TLC (Thin-layer Choromatography): Sắc ký lớp mỏng

CC (Column Choromatography): Sắc ký cột

FC (Flash Choromatography): Sắc ký cột nhanh

Mini-C (Mini-column Choromatography): Sắc ký cột tinh chế

HPLC (High Performance Liquid Choromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao

RP-HPLC: (Reversed-Phase High Performance Liquid Choromatography): Sắc ký

lỏng hiệu năng cao pha đảo

IR (InfraRed Spectroscopy): Phổ hồng ngoại

ESI-MS (ElectroSpray Ionization Spectrometry): Phổ khối lượng ion hóa phun bụi

điện

NMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy): Phổ cộng hưởng từ

hạt nhân proton

13C-NMR (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy): Phổ cộng hưởng

từ hạt nhân carbon-13

DEPT (Distortionless Enhancemnt by Polarization Transfer): Phổ DEPT

TMS (Tetramethyl silane): Tetramethyl silan

δ: Độ chuyển dịch hoá học (ppm)

J: Hằng số tương tác (Hz)

MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu

Bảng 2: Hàm lƣợng AKRHD7.1, AKRHD7.2.3, AKRHD7.4.2.4

trong các phần chiết methanol thân rễ

62

Bảng 3: Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 64

Sơ đồ 1: Quy trình điều chế các phần chiết từ cây Thảo quả đồng 47

Sơ đồ 2: Phân tách sắc ký phần chiết gộp n-hexan và dichlometan

Phụ lục 15: Phổ 1H-NMR của AKRHD10.(80-90).5

Phụ lục 16: Phổ 1H-NMR (dãn) của AKRHD10.(80-90).5 Phụ lục 17: Phổ ESI-MS (+) của AKFH1.2.1.1

Phụ lục 18: Phổ ESI-MS (-) của AKFH1.2.1.1

Phụ lục 19: Phổ 1H-NMR của AKFH1.2.1.1

Phụ lục 20: Phổ ESI-MS (+) của AKFH1.2.1.2

Phụ lục 21: Phổ ESI-MS (-) của AKFH1.2.1.2

Phụ lục 22: Phổ 1H-NMR của AKFH1.2.1.2

Phụ lục 23: Phổ ESI-MS (+) của AKFH1.2.1.3

Phụ lục 24: Phổ ESI-MS (-) của AKFH1.2.1.3

Phụ lục 25: Phổ 1H-NMR của AKFH1.2.1.3

Phụ lục 26: Phổ 1H-NMR của AKFH1.4.2.1

Phụ lục 27: Phổ 1H-NMR của AKFH2

Phụ lục 28: Phổ 13C-NMR của AKFH2

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật vô cùng phong phú và đa đạng với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao Thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn cung cấp các hoạt chất trong nhiều bài thuốc Y học cổ truyền quý Trong khoa học hiện đại các sản phẩm từ thiên nhiên có vai trò quan trọng trong việc phát triển thuốc mới Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất được phân lập là cơ sở phát hiện các hoạt chất cho nghiên cứu các cấu trúc thuốc mới

Họ Gừng (danh pháp khoa học Zingiberaceae) là một họ lớn của thực vật có

hoa với 50 chi và khoảng 1600 loài phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới Amomum là

một chi lớn của họ Zingiberaceae mọc chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam và Nam

Á Các loài Amomum có nhiều ứng dụng trong y dược và gia vị như Thảo quả (A

tsao-ko), Đậu khấu (A cardamomum), Dương xuân sa (A villosum) và Sa nhân (A xanthioides) Các nghiên cứu hóa học của các loài Amomum của Việt Nam còn chưa

nhiều, chủ yếu là thành phần hóa học các tinh dầu Các nghiên cứu thành phần hóa học các phần chiết chủ yếu là của Phan Minh Giang và cộng sự với một số loài

Amomum như A muricarpum, A maximum Cây Thảo quả đồng (Amomum koenigii

J F Gmelin) của Việt Nam chưa được nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu xác định các thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, chống oxi hóa) của các hợp chất được phân lập từ cây Thảo quả đồng của Việt Nam

Nội dung nghiên cứu được đặt ra trong luận văn này là:

- Xây dựng quy trình chiết các hợp chất từ cây Thảo quả đồng

- Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết, phân tách các phần chiết và phân

lập các hợp chất bằng các phương pháp sắc ký điều chế

- Xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập bằng các phương pháp phổ

- Đánh giá một số hoạt tính sinh học (kháng vi sinh vật, chống oxi hóa) của

một số hợp chất được phân lập từ cây Thảo quả đồng

TÓM TẮT

Amomum koenigii J F Gmelin là một loài thực vật có hoa trong họ Gừng

(Zingiberaceae) Trên thế giới chi Amomum được nghiên cứu ở một số nước với các

mục tiêu ứng dụng khác nhau, như nghiên cứu phát triển các phương pháp sắc ký phân tích và điều chế, phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh sinh học nguồn gốc thiên nhiên mới Trong chương trình nghiên cứu các hợp chất hóa học từ các loài

Amomum của Việt Nam nhằm mục đích xác định các giá trị ứng dụng của các loài

cây này, cây Thảo quả đồng (Amomum koenigii J F Gmelin) đã được lựa chọn làm

đối tượng nghiên cứu của luận văn này Ở Việt Nam, cây thuốc này chưa được nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học

Luận văn đã nhận được các kết quả sau:

1 Đã chiết phân bố các hợp chất hữu cơ từ thân rễ và quả cây Thảo quả đồng

theo độ phân cực tăng dần vào các phần chiết n-hexan, dichlometan và ethyl

acetat

2 Đã áp dụng các kỹ thuật phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết này và

xác định các hệ dung môi thích hợp cho phân tách sắc ký cột các phần chiết

3 Bằng kỹ thuật sắc ký cột điều chế đã phân lập được 7 hợp chất từ các phần

chiết thân rễ cây và 4 hợp chất từ các phần chiết quả cây Thảo quả đồng

4 Đã xác định được cấu trúc của các hợp chất được phân lập bằng các phương

pháp phổ (NMR, MS) là hydroxy-(4-hydroxyphenyl)eicosan-3-on, hydroxy-3,7,4-trimethoxyflavon, β-sitosterol, 5-hydroxy-3,7,3,4-tetramethoxyflavon, 3,5-dihydroxy-7,3,4-trimethoxyflavon, 7-hydroxy-

5-3,5,4-trimethoxyflavon, 3,7-dihydroxy-5,3,4-trimethoxyflavon,

p-hydroquinon Các hợp chất này lần đầu tiên được xác định có trong thân rễ

và quả cây Thảo quả đồng phân bố ở Việt Nam Hợp chất β-sitosterol, hydroxy-(4-hydroxyphenyl)eicosan-3-on, p-hydroquinon lần đầu tiên được phân lập từ Amomum koenigii

5-5 Phân tích định lượng HPLC đã xác định được 3 hợp chất flavonoid thành phần chính 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavon (AKRHD7.1) và 5-hydroxy- 3,7,3′,4′-tetramethoxyflavon (retusin) (AKRHD7.3.2) và 3,5-dihydroxy-

7,3,4-trimethoxyflavon (AKRHD7.4.2.4) có trong thân rễ cây Thảo quả

đồng với hàm lượng tương ứng là 1,81%, 1,38% và 1,76%

6 Thử nghiệm hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm với một số

chủng vi sinh vật kiểm định và chống oxi hóa qua hoạt tính quét gốc tự do DPPH của nhóm các hợp chất flavonoid được methyl hóa bước đầu cho thấy

sự giảm hoạt tính so với quercetin và kaempferol với các nhóm hydroxy tự

do Trong số các hợp chất được phân lập 5-hydroxy-3,7,3,4

-tetramethoxyflavon (AKRHD7.3.2) thể hiện khả năng kháng nấm A niger

với giá trị MIC 100 g/ml

Họ Gừng (Zingiberaceae) thuộc loại cây nhiệt đới Châu Á và châu Úc có khoảng 150 loài Ở nước ta, họ Gừng phân bố nhiều ở vùng Tây Bắc, Tây Nguyên và một số tỉnh Miền Trung Ðặc biệt ở các tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, Nghệ An, Gia Lai, Quảng Bình, Quảng Trị, Ninh Thuận Trong bộ Gừng (Zingiberales) ở Việt Nam, họ Gừng là họ có số lượng loài nhiều nhất Nhiều loài được sử dụng làm cây cảnh, gia vị, hay cây thuốc quan trọng Các chi quan trọng nhất của họ này bao gồm

chi Zingiber (chi Gừng), Curcuma (chi Nghệ), Alpinia (chi Riềng), Amomum (chi Sa

nhân),

1.1.2 Chi Amomum

1.1.2.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật chí Đông Dương [21], chi Amomum được

phân loại trong giới thực vật như sau:

1.1.2.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

Chi Sa nhân (danh pháp khoa học: Amomum Roxb.) là một chi thực vật một lá

mầm, với các loài đậu khấu, thảo quả, sa nhân Chi thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Các loài của chi này đáng chú ý vì có tính hăng và mùi thơm của chúng

Chi Sa nhân (Amomum Roxb.) phân bố ở vùng nhiệt đới Đông Nam và Nam Á

với khoảng 150 loài Ở Việt Nam chi Sa nhân hiện biết có 21 loài được trồng hoặc sống dưới tán rừng, ven suối, rừng nguyên sinh, rừng thứ sinh,

Các loài chi Amomum được mô tả: là cây thân thảo Thân rễ khỏe Lá có lưỡi

nhỏ, bẹ lá xếp sít vào nhau tạo thành một thân giả Cụm hoa mọc từ thân rễ, cuống hoa có vảy Hoa thường dày đặc đôi khi thưa Lá bắc cấp một lớn hơn các lá bắc mang hoa (lá bắc con) Đài hình ống, có 3 răng Tràng hình ống có 3 thùy, thùy lưng thường rộng hơn Bao phấn không có mào hay có mào biến thiên về hình dạng Bao phấn liền hoặc 3 thùy, các ô bao phấn xếp song song hoặc phân kỳ; liên kết vượt ra ngoài đỉnh của bao phấn Chỉ nhị ngắn Nhị lép giảm còn 2 răng, ngắn hay bằng không, hay không phân biệt với cánh môi mà có dính liền Cánh môi nguyên, lõm, hình chữ V hay 3 thùy, rộng, ít khi hình dải hay dài Bầu có 3 ô, noãn đính ở góc ô, đảo Quả nang hình cầu, hình trứng hay hình nón, không mở, hơi nạc, nhẵn, có lông,

có cánh hay có gai Các hạt thường nhiều, có áo hạt Vòi nhụy mảnh, đầu nhụy hình phễu hoặc hình đầu mở [21]

Một số loài Amomum thường gặp [26]:

 Amomum aculeatum (Roxb.) (Sa nhân cựa)

 Amomum aromaticum (Roxb.) hay Amomum subulatum (Roxb.) (Đậu

khấu thơm)

 Amomum austrosinense (D Fang) (Đậu khấu ba lá)

 Amomum cevuga (Seemann) (Đậu khấu Fiji)

 Amomum chinense (Chun ex T L Wu) (Giả sa nhân Hải Nam)

 Amomum compactum Sol ex Maton hay Amomum kepulaga Sprague & Burkill hay Amomum cardamomum auct non L (Bạch đậu khấu Trảo Oa)

 Amomum cardamomum L hay Elettaria cardamomum (L.) Maton (Bạch

đậu khấu)

 Amomum dealbatum (Roxb.) (Sa nhân quả dài)

 Amomum dolichanthum (D Fang) (Đậu khấu hoa dài)

 Amomum gracile (Blume)

 Amomum guixiense (D Fang)

 Amomum koenigii (J F Gmelin) (Thảo quả đồng)

 Amomum korarima (Pareira, ined.) (Đậu khấu Korarima)

 Amomum krervanh Pierre ex Gagnep (syn Amomum testaceum Ridl., Amomum cardamomum auct non L.) (Bạch đậu khấu)

 Amomum kwangsiense (D Fang et X X Chen) (Đậu khấu Quảng Tây)

 Amomum lappaceum (Ridl.)

 Amomum longiligulare (T L Wu) (Sa nhân tím, sa nhân lưỡi dài)

 Amomum masticatorium (Thw.) (Đậu khấu Ceylon)

 Amomum maximum (Roxb.) (Đậu khấu chín cánh hay Đậu khấu Java)

 Amomum medium (Lour.)

 Amomum microcarpum (C F Liang et D Fang) (Sa nhân hạt nhỏ)

 Amomum muricarpum (Elm) (Sa nhân quả bướu)

 Amomum odontocarpum (D Fang) (Đậu khấu cánh sóng)

 Amomum ovoideum (Pierre ex Gagnep.)

 Amomum racemosum (Lam.)

 Amomum spurium (Koen in Retz.) Gmel

 Amomum thyrsoideum (Gagnep.) (Sa nhân hoa dài)

 Amomum tomrey (Gagnep.) (Mè tré bà)

 Amomum tsaoko (Crevost & Lemarié) Thảo quả

 Amomum hongtsaoko (C F liang & D Fang) Thảo quả hồng

 Amomum uliginosum (Koenig ex Retz.)

 Amomum villosum (Lour.) (syn Amomum echinosphaera (K Schum.) (Sa

nhân, sa nhân đỏ, sa nhân thầu dầu)

 Amomum villosum (Lour.) giống nanum (H T Tsai et S W Zhao) (Sa

nhân lùn)

 Amomum villosum (Lour.) giống villosum

 Amomum villosum (Lour.) giống xanthioides (Wall ex Bak.) (T L Wu & Senjen) hay Amomum xanthioides Wall ex Bak (Sa nhân vỏ xanh)

1.1.2.3 Công dụng trong Y học cổ truyền

Sa nhân là vị thuốc quý, được sử dụng khá phổ biến trong y học cổ truyền ở Việt Nam Kết quả nghiên cứu của Lê Thị Hương [3] cho thấy chi Sa nhân

(Amomum) thuộc 4 nhóm giá trị sử dụng:

- Nhóm cho tinh dầu: Đậu khấu chín cánh (Amomum maximum Roxb.), Sa nhân

quả có mỏ (Amomum muricarpum Elmer), Sa nhân (Amomum villosum

Lour.), Sa nhân ké (Amomum xanthioides Wall ex Baker),

- Nhóm cây làm thuốc: Đậu khấu chín cánh (Amomum maximum Roxb.), Sa

nhân quả có mỏ (Amomum muricarpum Elmer), Sa nhân (Amomum villosum Lour.), Sa nhân ké (Amomum xanthioides Wall ex Baker), Sa nhân tím (Amomum longiligulare T L Wu) Dược liệu Sa nhân có tác dụng trợ hô hấp,

làm ấm bụng, giúp tiêu hóa, giảm đau, an thần, chống nôn mửa và an thai Dùng chữa các chứng bệnh: Bụng đầy trướng ăn không tiêu, đau bụng, nôn mửa, tả lỵ do lạnh, động thai

- Nhóm cây ăn được: Sa nhân khế (Amomum mengtzense H T Tsai ex P S

Chen), Sa nhân thầu dầu (Amomum vespertilio Gagnep.),

- Nhóm cây làm gia vị: Sa nhân (Amomum villosum Lour.), Sa nhân ké

(Amomum xanthioides Wall ex Baker),

1.1.2.4 Thành phần hóa học chi Amomum

Năm 1995, tác giả Đào Lan Phương đã nghiên cứu tinh dầu của các loài mang

tên Sa nhân ở miền Bắc Việt Nam: Amomum aurantiacum H T Tsai & S.W.Zhao,

Amomum ovoideum Pierre, Amomum lappaceum Ridl,… bằng kỹ thuật sắc ký khí kết

hợp khối phổ (GC-MS) xác định được thành phần trong tinh dầu hạt, tinh dầu lá, thân

rễ của một số loài thuộc chi Amomum [5]

Quả Sa nhân chủ yếu chứa tinh dầu, hàm lượng khoảng 2-3% Tinh dầu Sa nhân là chất lỏng trong suốt không màu hay màu vàng nhạt, mùi thơm, vị nồng và đắng, nhẹ hơn nước Dược điển Việt Nam III quy định hàm lượng tinh dầu trong hạt

sa nhân ít nhất là 1,5% Dưới đây là thành phần tinh dầu của một số loài Amomum

1

Amomum longiligulare

T L Wu (Sa nhân tím) [6]

Tinh dầu quả (1,7-3%): borneol (19%), dcamphor (33%), bornyl acetat (26,5%), d-

-limonen (7%), phellandren (2.3%), paramethoxycinnamat (1%), α-pinen (1,8%),

2 Amomum villosum Lour

(Dương xuân xa) [6]

d-camphor (33,2%), d-bornyl acetat (26,5%), borneol (19,4%), d-limonen (7%), camphen (7%), trans-paramethoxycinnamat,

phellandren (2,3%), pinen (1,1%)

3

Amomum gagnepainii

T L Wu (Sa nhân lưỡi lá ngắn) [6]

Tinh dầu lá: α-pinen, β-pinen, sabinen

Tinh dầu hạt: camphor, borneol, bornyl acetat

Amomum ovoideum Tinh dầu quả: camphor (47,1%), bornyl

Tinh dầu lá: β-elemen (20,3%), germacren D

Tinh dầu quả: 1,8-cineol (45,2%), ρ‐

propylbenzaldehyd (6,04%), geraniol (5,11%), geranial (4,52%), α‐terpineol

8 Amomum villosum Lour

Ngoài các thành phần tinh dầu, các loài thuộc chi Amomum còn có chứa các

hợp chất thuộc các nhóm chính như sau [35]:

- Các monoterpenoid và sesquiterpenoid: được phân lập từ quả cây Amomum

kravanh Pierre [31], Amomum tsao-ko Crevost & Lemarie [23] và A testaceum Ridl [41], hạt cây Amomum xanthioides Wall ex Baker [12], cây Amomum medium Lour [31], thân rễ cây Amomum uliginosum J Koenig [35]

- Các labdan diterpenoid: được phân lập từ quả cây A kravanh [50], rễ cây

Amomum maximum Roxb [32], thân rễ cây Amomum uliginosum J Koenig

[35]

- Các hợp chất flavonoid: được phân lập từ quả cây Amomum koenigii J F

Gmel [15] và Amomum tsao-ko Crevost & Lemarie [23], thân rễ Amomum

villosum Lour [17] và cây Amomum xanthioides Wall.ex Baker [12]

- Các hợp chất diarylheptanoid: được phân lập từ thân rễ cây Amomum

muricarpum Elmer [19], quả cây Amomum subulatum Roxb [30] và Amomum tsao-ko Crevost & Lemarie [23]

- Các hợp chất oxadispiroketal: được tìm thấy trong lá và thân rễ cây Amomum

- Các acid phenolic và acid béo: được phân lập từ quả cây Amomum tsao-ko

Crevost et Lemaire [23], thân rễ cây Amomum villosum Lour [17] và cây

Amomum xanthioides Wall.ex Baker [12]

Năm 2014, H Ying và cộng sự đã nghiên cứu thành phần quả Sa nhân tím

(Amomum longiligulare T L Wu) bằng phương pháp HSCCC và HPLC 17 hợp

chất đã được phân lập: 3,5-dihydroxy-7,4-dimethoxyflavon (1), 3,5,37,4-dimethoxyflavon (2), 3,5,7-trihydroxy-4-methoxyflavon (3), 3-hydroxy-7-(4-

dihydroxyphenyl)1-(4-hydroxyphenyl) heptan (5) 3,5-dihydroxy-7-(4-hydroxy-3methoxyphenyl)1-(3,4-dihydroxyphenyl) heptan (6), 7-(4-hydroxyphenyl)-1-(4-

-hydroxyphenyl)-5-hepten-3-on (7), 7-(4-hydroxyphenyl)-1-(4-hydroxyphenyl)-3-

heptanon (8), 3,5-dihydroxy-7-(4-hydroxyphenyl)-1-(3,4-dihydroxyphenyl)heptan

(9), 7-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-(4-hydroxyphenyl)-5-hepten-3-on (10), diacetoxy-7-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-(3,4- dihydroxyphenyl) heptan (11), acid 4-

3,5-methoxybenzoic (12), 4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanon (13), genistein-7-O-β-D

-glucosid (14), quercetin-3-O-β-D-glucopyranosid (15), luteolin-8-C-α-L-arabinosid

(16), kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosid (17) [22]

OH

Năm 2018, H Liu và cộng sự đã phân lập từ quả cây Amomum tsao-ko thu

đƣợc 2 acid béo mới: acid (2E,7Z,10Z,13Z)-hexadeca-2,7,10,13-tetraenoic (18) và acid (2E,7Z)-tetradeca-2,7-dienoic (19) và 10 hợp chất đã biết: acid (E)-tetradec-2- enoic (20), acid (E)-dodec-2-enoic (21), (+)-hannokinol (22), meso-hannokinol (23), coronadien (24), acid 3-O-methylgallic (25), acid vanillic (26), acid p- hydroxybenzoic (27), acid 3,4-dihydroxybenzoic (28) và acid (E)-p-coumaric (29)

[23]

Ở Việt Nam, các loài thuộc chi Amomum chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều về

thành phần hóa học của các phần chiết Năm 2006, Phan Minh Giang và cộng sự đã

phân lập 2 hợp chất mới từ thân rễ cây Amomum muricarpum muricarpon A (30),

muricarpon B (31) và 3 hợp chất diarylheptanoid đã biết: 1,7-di-(3,4dihydroxyphenyl)-4-hepten-3-on (32), 1-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-(4-

-hydroxyphenyl)-4-hepten-3-on (10) và 1,7-bis(p hydroxyphenyl)-4-hepten-3-on (7)

[20]

Năm 2012, Phan Minh Giang và cộng sự tiếp tục phân lập từ thân rễ cây

Amomum muricarpum một diarylheptanoid mới, muricarpin (33), cùng với 4

diarylheptanoid đã biết 1,7-bis(3,4-dihydroxyphenyl)heptan-3-yl acetat (34), 1-(4hydroxyphenyl)-7-(3,4-dihydroxyphenyl)heptan-3-yl acetat (35), 1-(3,4-

-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)heptan-3-on (36) và

(5R)-5-hydroxy-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)-3-heptanon (37) [19]

Cho đến nay chƣa có nhiều nghiên cứu về hóa thực vật loài Amomum koenigii

Một số ít nghiên cứu đã phân lập đƣợc các eicosenon và flavonol methyl ether từ quả

cây Amomum koenigii nhƣ 5-hydroxy-3,7,4-trimethoxyflavon (38) [29],

5-hydroxy-3,7,3,4-tetramethoxyflavon (39), 3,7-dihydroxy-5,4-dimethoxyflavon (40) [15],

3-hydroxy-5,7,4-trimethoxyflavon (41) [45], 5,4-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavon (42)

[25], 3,5,7,4-tetramethoxyflavon (43) [21], 3,7-dihydroxy-5,3,4-trimethoxyflavon

(44) [34], 5,3-dihydroxy-3,7,4-trimethoxyflavon (45) [33], 3,5-dihydroxy-7,3,4

-trimethoxyflavon (46), 3,5,3-trihydroxy-7,4-dimethoxyflavon (47) [46], 3,5,7,4

-tetramethoxyflavon (48) [28], eicosenoid 1-methoxy-E-4-eicosen-3-on (49) và 1-(4

-hydroxyphenoxy)-E-4-eicosen-3-on (50) [15]

R5

OR4

OR1O

1.1.2.5 Nghiên cứu hoạt tính sinh học của chi Amomum

Tinh dầu Sa nhân (Amomum xanthioides Wall.) chứa nhiều hợp chất hóa học

có giá trị như camphen, α-pinen, β-pinen, limonen, β-cubeben, borneol Bên cạnh khả

năng kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxi hóa với hiệu lực ức chế cao, tinh dầu Sa nhân còn được chứng minh có tác dụng kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư [13] Năm 2017, Choi Y A và cộng sự đã nghiên cứu mô hình viên da dị ứng trên

chuột Kết quả cho thấy dịch chiết từ cây Amomum xanthioides cho thấy có tác dụng

điều trị viêm da dị ứng, đặc biệt là viêm da mãn tính [14]

Hai hợp chất nerolidol (51) và spathulenol (52) được phân lập từ cây Sa nhân

tím (Amomum xanthioides) thể hiện độc tính với tế bào ung thư ở người được thử nghiệm trên in vitro Trong đó nerolidol biểu hiện độc tính trung bình chống lại SK-

OV-3 (ung thư buồng trứng) và SK-MEL-2 (u ác tính dưới da) với ED50 lần lượt là

26,81 và 9,36 µM Hợp chất spathulenol biểu hiện độc tính tế bào yếu đối với A549

(ung thư tế bào biểu mô ở phổi), SK-OV-3, SK-MEL-2 và HCT15 (tế bào ung thư đại tràng) với ED50 tương ứng là 26,93; 27,46; 10,75 và 32,93 µM [11]

Hạt Amosum villosum được sử dụng để điều trị các bệnh đường tiêu hóa ở

Trung Quốc Nó giàu các polysaccharid góp phần vào các tác dụng chống oxi hóa và chống ung thư [49]

Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire có hợp chất spiroketal aculeatin, periterit

diterpen có tác dụng chữa sốt rét Phần chiết methanol của quả cây A tsaoko có

trycophyton mentagrophyt có hoạt tính kháng nấm Các hợp chất thuộc nhóm diarylheptanoid 2,3-dihydro-2-(4-hydroxy-phenylethyl)-6-[(3″,4″-dihydroxy-5″-methoxy)phenyl]-4-pyron và 4-dihydro-2-(4-hydroxy-phenylmethyl)-6-[(3″,4″-dihydroxy-5″-methoxyphenyl)methylen]-pyran-3,5-dion được phân lập từ quả cây

Amomum tsao-ko có tác dụng bảo vệ thần kinh và chống viêm [38]

Tinh dầu từ cây Amomum tsao-ko có tác dụng kháng khuẩn với năm chủng vi

khuẩn Gram dương và hai vi khuẩn Gram âm với MIC trong khoảng 2,94-5,86

mg/ml [13] Theo nghiên cứu này, tinh dầu nhận được từ cây Amomum tsao-ko sử

dụng để bảo quản thuốc kháng sinh và là chất chống oxi hóa trong ngành thực phẩm

Amomum kravanh Pierre ex Gagnep là cây nhiệt đới có nguồn gốc từ

Campuchia, Thái Lan, Việt Nam và cũng được trồng ở phía Nam Trung Quốc Quả cây được sử dụng như một loại thuốc cổ truyền Trung Quốc để điều trị các bệnh về

dạ dày và rối loạn tiêu hóa Theo nghiên cứu của Diao W R và cộng sự, tinh dầu cây

Amomum kravanh có hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis (vi khuẩn Gram dương)

và Escherichia coli (vi khuẩn Gram âm) [14]

Các flavonol như 3,7-dihydroxy-5,3′,4′-trimethoxyflavon, trimethoxyflavon, 3,7-dihydroxy-5,4′-dimethoxyflavon và 5-hydroxy-3,7,3′,4′-

5-hydroxy-3,7,4′-tetramethoxyflavon (retusin) được phân lập từ cây Amomum koenigii có tác dụng

kháng nấm, kháng khuẩn, ức chế sinh tổng hợp ATP, gây độc tế bào, kháng sốt rét, chống nôn và bảo vệ gan [37]

1.2 CÂY THẢO QUẢ ĐỒNG (Amomum koenigii J F Gmelin)

1.2.1 Thực vật học

Cây Thảo quả đồng có tên khoa học là Amomum koenigii J F Gmelin thuộc

họ Gừng (Zingiberaceae) Loài này được J F Gmel mô tả khoa học lần đầu tiên năm

1791

Cây cao từ 1-3 m, chỉ với 2-5 nhánh trên mỗi cụm, thân rễ tăng trưởng mọc sâu 10-15 cm trong đất, đường kính 1-1,5 cm, trắng sau đó có màu nâu đỏ, rễ móng rỗng không trắng sau đó có màu nâu đỏ, rễ móng rỗng không Lá ở trên mỗi nhánh cây, lá trở nên nhỏ hơn về phía đỉnh Cuống lá rất ngắn, dài 0,1-0,5 cm, màu xanh lá cây, keo, lưỡi lá dài, 35-40 × 6-7 cm, thấp hơn bề mặt nhợt nhạt, tĩnh mạch chính nỗi bật bên dưới [29]

Hoa đơn phát sinh gần gốc, khi trưởng thành thì dài, dựng đứng cuống Phần đài, thường nở 2 bông cùng một lúc Cuống 20-30 × 0,4-0,5 cm, có màu nâu đỏ, có vân Tràng hoa dài 3-3,2 cm, trắng hồng, tràng hoa thường 1,5-1,6 × 0,3 cm, có tròng, bề mặt trong mỏng Thùy tràng hoa thường 1,5-1,6 × 0,6-0,7 cm, màng, thùy, đỉnh nhú Thùy tràng trung tâm 1,5-1,6 × 1-1,2 cm Có sọc trung tâm màu vàng với các đường chấm màu hồng chiều vào rìa, màng, tại gốc và dọc theo phần trung tâm, đỉnh được làm tròn

Quả mọng, hình bán nguyệt Mỗi chùm quả thường có đến 20 quả, mỗi quả thường 1-1,5 × 1,5-2 cm màu tím sẫm, màu nâu Hạt giống tròn, đường kính 0,3 cm, rậm, đến 15-20 trên mỗi ruột

Hình 1: Cây Thảo quả đồng (Amomum koenigii J F Gmelin)

1.2.2 Phân bố và môi trường sống

Amomum koenigii J F Gmelin được phân bố ở Trung Quốc, Lào, Myanmar,

Thái Lan Ở Việt Nam, cây được gọi dưới tên Thảo quả đồng và được tìm thấy ở Cao Bằng, Đắk Lắk, Đồng Nai, Kon Tum

Môi trường sống và sinh thái: Amomum koenigii sống trong nhiều loại rừng và

môi trường sống, như rừng thường xanh núi, rừng rụng lá xen kẽ, rừng rậm, ở độ cao 400-1300 m so với mặt đất

Loài cây này khá phổ biến, tuy nhiên đang có nguy cơ bị đe dọa

1.2.3 Công dụng trong Y học cổ truyền

Trong dân gian, Thảo quả đồng được dùng để trị sốt rét, trị đau bụng, bụng đầy do hàn thấp tích trệ, trị tiêu hóa rối loạn do ăn uống, không tiêu, tích thực, gây đau vùng thượng vị [27]

Quả của Amomum koenigii đã được sử dụng như một chất thơm dạ dày ở các

khu vực phía nam của Trung Quốc [15]

Chương 2: THỰC NGHIỆM

2.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

2.1.1.1 Phương pháp chiết hai pha lỏng

Phương pháp dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha lỏng không hòa trộn (một pha nước và một pha hữu cơ) Các hợp chất hữu cơ sẽ được chuyển từ một pha nước sang một pha hữu cơ còn các chất nền phân cực sẽ ở lại trong pha nước Quá trình chiết có thể được thực hiện ở các điều kiện được kiểm soát

ví dụ như pH, độ phân cực của dung môi chiết, tỷ lệ thể tích pha hữu cơ/pha nước, nhiệt độ,…

2.1.1.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng trên silica gel là phương pháp thích hợp cho phân tích các hợp chất hữu cơ Vì sự phân tích TLC trên silica gel là một quá trình hấp phụ các hợp chất được phân tách theo độ phân cực theo cách tương tự như trong sự phân tách sắc

ký cột Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích để lụa chọn các hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột Để định tính các hợp chất, các giá trị Rf và màu sắc của các vệt

chất được phát hiện trên bản mỏng TLC cần được mô tả Dựa vào sắc ký đồ TLC có thể đánh giá định tính số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với chiều dày lớp silica gel là 0,2

DC-mm

Đưa mẫu phân tích lên bản mỏng:

Hòa tan mẫu thử trong dung môi thích hợp (1 mg/ml), sau đó dùng capilla đưa dung dịch mẫu thử lên bản mỏng (10 l)

Dung môi triển khai

Các dung môi dùng trong TLC đều được làm khan và chưng cất lại trước khi

sử dụng Các hệ dung môi được trộn theo tỷ lệ phù hợp với từng mẫu phân tích Sau khi pha phải lắc kỹ cho các dung môi trong hệ trộn đều nhau rồi cho vào bình triển khai sắc ký đáy bằng, có nút nhám kín đến chiều cao 0,5 cm Để yên đến khi bình được bão hòa dung môi mới tiến hành triển khai bản mỏng

Triển khai bản mỏng

Bản mỏng được cắt với kích thước phù hợp với tuyến xuất phát của dung môi, dung môi có chiều cao 1 cm Dùng kẹp sắt đưa nhanh bản mỏng đã được tẩm mẫu vào bình triển khai sắc ký, đậy kín nắp, để yên và quan sát Khi quan sát thấy dung môi đã chạy đến tuyến dung môi trên, dùng kẹp sắt lấy bản mỏng ra khỏi bình và tiến hành phát hiện vệt chất trên bản mỏng

Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp lực không khí nén để dung môi rửa giải đi qua cột nhanh hơn

Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được thực hiện với các cột có kích thước nhỏ để tinh chế lượng nhỏ các mẫu chất

Chất hấp phụ dùng cho CC và FC là silica gel (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với các cỡ hạt 200-500 m, 63-200 m và 40-63 m, cho Mini-C là cỡ hạt 15-

40 m

Dung môi hữu cơ dùng cho sắc ký cột được làm khan, chưng cất lại và bảo quản trong bình kín trước khi sử dụng

Hình 2: Sơ đồ hệ sắc ký cột (CC)

Nhồi cột sắc ký: Phương pháp nhồi cột ướt

Một lượng silica gel ứng với cột sắc ký có đường kính thích hợp, có chiều cao

là 30 cm được khuấy đều thành bột nhão trong một lượng vừa đủ n-hexan khan Bột

nhão này được đuổi hết bọt khí và được nhồi vào cột sắc ký Có thể dùng bơm nén

hoặc trọng lực dung môi n-hexan đi qua cột nhiều lần cho đến khi lớp silica gel hoàn toàn ổn định

Đưa mẫu lên cột sắc ký: Phương pháp tẩm mẫu trên silica gel

Mẫu được hòa tan trong một lượng vừa đủ dung môi dễ bay hơi thích hợp Trộn dung dịch thu được với silica gel (cỡ hạt 40-63 m) với tỷ lệ là 1 g chất /1,2 g đến 1,5 g silica gel Hỗn hợp này được làm bay hơi dung môi đến khi khô kiệt thu được bột mịn của mẫu chất hấp phụ trên silica gel Bột này được đưa lên cột sắc ký phía trên lớp chất hấp phụ silica gel

Triển khai sắc ký cột

Mở khóa dưới cột sắc ký để cho dung môi chảy ra khỏi cột sắc ký, cho đến khi

bề mặt dung môi cách bề mặt silica gel khoảng 2 mm Cho từ từ mẫu tẩm trên silica

gel lên cột Khi đưa mẫu lên cột cần phải chú ý đảm bảo cho bề mặt của lớp chất phía trên cột sắc ký tạo thành mặt phẳng ngang Rắc một lớp cát lên phía trên để tránh các chất bột bị hòa tan ngược

Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi được xác định nhờ vào các khảo sát thăm

dò TLC, tốc độ rửa giải 20 giọt/phút, thu các phân đoạn theo thể tích 150 ml, 50 ml

và 20 ml (CC, FC) Với cột sắc ký tinh chế (Mini-C) các phân đoạn được thu theo thể tích 3-5 ml

Khảo sát sắc ký các phân đoạn

Tiến hành khảo sát các phân đoạn nhận được bằng TLC, gộp các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau lại, sau đó cất loại kiệt dung môi để thu được các nhóm phân đoạn

2.1.1.4 Phương pháp kết tinh lại

Phương pháp này được sử dụng để tách và làm sạch chất rắn Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu và của tạp chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã chọn

2.1.2 Các phương pháp xác định cấu trúc

Các phương pháp phổ hiện nay là các phương pháp hiện đại và hữu hiệu nhất

để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Các phương pháp được sử dụng để xác

định cấu trúc các hợp chất trong luận văn này bao gồm:

- Phổ khối lượng phun bụi điện (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100

LC-MSD Trap;

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) được đo trên máy Bruker Avance 500 MHz NMR spectrometer với chất chuẩn nội TMS (tetramethyl silan);

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) được đo trên máy Bruker Avance 500 MHz NMR spectrometer;

- Phổ DEPT;

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR) bao gồm các phổ HSQC,

HMBC để xác định cấu trúc khung và NOESY để xác định cấu hình tương đối

2.1.3 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in vitro được thử nghiệm trên phiến vi

lượng 96 giếng theo hai bước [đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm,

và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)] theo phương pháp vi pha loãng của D

A Vanden Berghe và A J Vlietinck [44]

Phương pháp đánh giá

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện trên các phiến vi lượng

96 giếng Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm các chủng vi khuẩn Gram (-)

Escherichia coli (ATCC 25922) và Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923), vi

khuẩn Gram (+) Bacillus subtilis (ATCC 27212) và Staphylococcus aureus (ATCC 12222), nấm sợi Aspergillus niger (439) và Fusarium oxysporum (M42), và nấm men

Candida albicans (ATCC 7754) và Saccharomyces cerevisiae (SH 20)

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB, Sigma, Hoa Kỳ) cho nấm men và nấm mốc, Trypcase Soya Broth (TSB, Sigma) cho vi khuẩn

Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Hoa Kỳ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Hoa Kỳ) cho vi nấm

Tiến hành thử nghiệm

Các chủng kiểm định được hoạt hoá và pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm Mẫu thử được hoà tan hoàn toàn trong dung dịch DMSO 100% bằng máy Vortex với nồng độ thích hợp rồi lọc qua màng lọc microfilter (0,02 μm), thu được dung dịch gốc Nhỏ dung dịch gốc vào phiến vi lượng 96 giếng, nhỏ dịch chứa vi sinh vật đã được hoạt hoá vào mỗi giếng đã có mẫu sẵn Đối chứng dương là ampicilin cho vi khuẩn Gram (+), tetracylin cho vi khuẩn

Gram (–), nystatin hoặc amphotericin B cho nấm sợi và nấm men Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: ampicilin: 50 mM, tetracylin: 10 mM,

nystatin: 0,04 mM Các giá trị MIC của đối chứng: ampicilin 21,83 μg/ml, tetracylin 6,87 μg/ml, nystatin 1,44 μg/ml (nấm men) và 2,89 μg/ml (nấm mốc) Đối chứng âm

là vi sinh vật không trộn kháng sinh và chất thử

Đọc kết quả

Kết quả được đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37 oC/24 giờ cho

vi khuẩn và 30 oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men Kết quả dương tính là nồng

độ mà ở đó không có vi sinh vật phát triển Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi

trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU < 5

Tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, Minimum Inhibitory Concentration)

Các mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ban đầu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5-10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó vi

sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn Mẫu thô có MIC ≤ 200 μg/ml; mẫu chất tinh khiết có MIC ≤ 50 μg/ml là có hoạt tính

2.1.4 Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hoá

Thử nghiệm quét gốc DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

Đây là phương pháp đã được công nhận để xác định nhanh hoạt tính chống oxi hóa dựa trên khả năng bẫy các gốc tự do tạo bởi DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) [8, 40] Chất thử được hòa trong dimethyl sulfoxide (DMSO 100%)

và DPPH được pha trong ethanol 96% Sự hấp thụ của DPPH ở bước sóng  = 515

nm được xác định bằng máy đọc ELISA sau khi nhỏ DPPH vào dung dịch mẫu thử trên phiến vi lượng 96 giếng Kết quả các thử nghiệm được thể hiện là giá trị trung

bình của ít nhất 3 phép thử lặp lại ± độ lệch chuẩn (p ≤ 0,05)

Khả năng trung hòa các gốc tự do (Scavenging Capacity, SC%)

- Giá trị trung bình của SC (%) ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình

xử lý số liệu Excel theo công thức:

- Độ lệch tiêu chuẩn  tính theo công thức của Ducan như sau:

Xác định giá trị SC 50 (g/ml)

Mẫu (chất thử) được pha loãng thành các nộng độ giảm dần, lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ Hiệu quả bẫy gốc tự do tạo bởi DPPH của mỗi mẫu được tính dựa trên

% trung hòa gốc tự do so với mẫu trắng (blank) và chứng âm tính Mẫu có biểu hiện

hoạt tính chống oxi hóa trên hệ DPPH được thực hiện các bước tiếp theo để tìm giá trị SC50 (µg/ml) Giá trị SC50 là nồng độ của chất thử mà tại đó trung hòa được 50%

các gốc tự do, được xác định bằng phần mềm TableCurve AISN Sofware (Jandel

Scientific) qua giá trị SC% và dãy các nồng độ chất thử tương ứng

2.2. NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

Mẫu thực vật được thu thập và giám định bởi TS Nguyễn Quốc Bình, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phần thân rễ cây

- Thân rễ tươi (16 kg) cây Thảo quả đồng (Amomum koenigii J F Gmelin) được

thu thập vào tháng 7 năm 2016 tại Krông Bông, Đắk Lắk

- Mẫu được phơi khô trong bóng râm, cắt lát mỏng, sau đó được sấy tiếp trong

tủ sấy ở nhiệt độ 40-50oC Mẫu khô sau đó được xay thành bột

Phần quả cây

- Quả cây (3 kg) Thảo quả đồng (Amomum koenigii J F Gmelin) được thu hái

vào tháng 7 năm 2016 tại Krông Bông, Đắk Lắk

- Quả được rửa sạch, phơi nửa khô trong bóng râm, nghiền nhỏ

2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY THẢO QUẢ ĐỒNG

2.3.1 Điều chế các phần chiết từ thân rễ

Bột thân rễ khô (2,7 kg) được ngâm chiết với MeOH ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày, quy trình được lặp lại 3 lần Phần dịch chiết MeOH được cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không

Các phần chiết MeOH sau khi cô lại được hòa bằng nước cất sau đó được

chiết riêng rẽ lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan,

dichlometan và ethyl acetat cho các dịch chiết hữu cơ tương ứng Các dịch chiết này

được cất loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm cho các phần chiết tương ứng n-hexan

(AKRH), dichlometan (AKRD) và ethyl acetat (AKRE) Dịch nước còn lại sau khi chiết được cất loại nước cho một phần chiết nước (AKRW)

2.3.2 Điều chế các phần chiết từ quả

Quả cây (3 kg) được ngâm trong methanol ở nhiệt độ phòng 5 lần, mỗi lần 3 ngày Dịch chiết thu được sau quá trình ngâm chiết được gộp lại và cất lại dung môi dưới áp suất thấp thu được phần chiết metanol Phần chiết này được hòa với nước cất

và chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần từ n-hexan, dichlometan,

ethyl acetat cho các dịch chiết tương ứng Sau khi được làm khan bằng Na2SO4, các

dịch chiết được cất loại dung môi cho phần chiết n-hexan (AKFH), dichlometan

(AKFD) và ethyl acetat (AKFE) Dịch nước còn lại sau khi chiết được cất loại nước cho một phần chiết nước (AKFW)

Hiệu suất thu nhận các phần chiết từ thân rễ (so với khối lượng khô) và quả cây Thảo quả đồng (nguyên liệu tươi) được trình bày trong Bảng 1

Bảng 1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ cây Thảo quả đồng

STT Phần chiết Khối lượng (g) Hiệu suất (%)

1 n-hexan (AKRH) 110,85 4,1

3 ethyl acetat (AKRE) 25,0 0,9

2.4.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết n-hexan (AKRH và AKFH)

- Hệ dung môi triển khai sắc ký lớp mỏng phần chiết hexan (AKRH) là

n-hexan-aceton với các tỷ lệ 15:1, 9:1, 5:1, 3:1 và 1:1 (v/v)

- Phân tách sắc kí lớp mỏng phần chiết quả n-hexan (AKFH) là

dichlometan-MeOH với các tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1 (v/v)

2.4.2 Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết dichlometan (AKRD và AKFD)

- Hệ dung môi triển khai sắc ký lớp mỏng phần chiết dichlometan (AKRD) là

n-hexan-aceton với các tỉ lệ 5:1, 3:1 và 1:1 (v:v)

- Phân tách sắc kí lớp mỏng phần chiết quả n-hexan (AKFH) cho các kết quả

phân giải tốt với hệ dung môi dichlometan-metanol với các tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1

2.5 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

2.5.1 Phân tách phần chiết gộp n-hexan và dichlometan từ thân rễ (AKRHD)

Các phần chiết n-hexan và dichlometan được gộp lại do có sắc ký đồ TLC

tương tự nhau Phần chiết gộp n-hexan (13,85 g) và dichlometan (6,34 g) (AKRHD)

(20,19 g) được phân tách trên cột sắc ký thường (CC) trên silica gel (Merck, cỡ hạt

200-500 µm) Cột sắc ký được nhồi theo phương pháp nhồi ướt trong n-hexan và

mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel

Cột sắc ký được rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan-aceton với các tỷ

lệ 19:1, 15:1, 9:1, 5:1 và 1:1 (v:v) cho 85 phân đoạn, mỗi phân đoạn 20 ml Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 11

nhóm phân đoạn: AKRHD1 (1-11), AKRHD2 (12-15), AKRHD3 (16-22), AKRHD4 (23-26), AKRHD5 (27-29), AKRHD6 (30-36), AKRHD7 (37-50), AKRHD8 (51-54), AKRHD9 (55-66), AKRHD10 (67-72), AKRHD11 (73-85) Khối lượng từng nhóm phân đoạn: AKRHD1 (0,86 g), AKRHD2 (0,83 g), AKRHD3 (0,27 g), AKRHD4 (0,32 g), AKRHD5 (0,45 g), AKRHD6 (3,79 g), AKRHD7 (1,73 g), AKRHD8 (2,36 g), AKRHD9 (0,79 g), AKRHD10 (2,41 g), AKRHD11 (5,69 g)

Nhóm phân đoạn AKRHD2 (0,8 g) được phân tách trên cột sắc ký tinh chế

(Mini-C) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 µm), rửa giải với hệ dung môi gradient

n-hexan-EtOAc 49:1, 29:1, 19:1, 9:1 và 6:1 (v:v) cho 45 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5

ml Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại cho 3 nhóm phân đoạn:

AKRHD2.1 (1-2) , AKRHD2.2 (3-30), AKRHD2.3 (31-45 ) Nhóm phân đoạn

AKRHD2.2 được rửa bằng n-hexan cho chất AKRHD2.2 (5-hydroxy-3,7,4trimethoxyflavon) (112 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng Kết quả kiểm tra

-sắc ký TLC cho thấy AKRHD2.2 = AKRHD7.1 Nhóm phân đoạn AKRHD2.3

được rửa bằng n-hexan cho chất AKRHD2.3 (β-sitosterol) ( 20,1 mg) dưới dạng tinh

thể hình kim màu trắng

Các nhóm phân đoạn AKRHD4 và AKRHD5 được gộp lại (0,77 g) và được

phân tách CC trên silica gel hệ dung môi n-hexan-aceton (20:1, 15:1, 12:1, 9:1, 3:1)

cho 5 nhóm phân đoạn AKRHD45.1-AKRHD45.5 Nhóm phân đoạn AKRHD45.2

(0,32 g) được tinh chế bằng CC trên silica gel với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 29:1,

19:1, 12:1, 6:1 cho AKRHD45.2.1 (15 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng

Kết quả kiểm tra sắc ký TLC thấy AKRHD45.2.1 = AKRHD7.1 Nhóm phân đoạn AKRHD45.5 (56,5 mg) được tinh chế bằng CC trên silica gel với hệ dung môi

CH2Cl2-EtOAc cho AKRHD45.5.1 (5-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)eicosan-3-on) (2

mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng

Nhóm phân đoạn AKRHD7 (1,73 g) được phân tách bằng sắc ký cột tinh chế

(Mini-C) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 µm), rửa giải với hệ dung môi gradient

n-hexan-aceton 20:1, 15:1, 12:1, 9:1, 5:1, 1:1 (v:v) cho 42 phân đoạn, mỗi phân đoạn

10 ml Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại cho 4 nhóm phân đoạn:

AKRHD7.1 (3-16), AKRHD7.2 (18-25), AKRHD7.3 (26-29), AKRHD7.4 (30-42)

Nhóm phân đoạn AKRHD7.1 được rửa bằng n-hexan cho chất AKRHD7.1

(5-hydroxy-3,7,4-trimethoxyflavon) (36,9 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng

Nhóm phân đoạn AKRHD7.3 (0,2 g) được phân tách trên cột sắc ký tinh chế

(Mini-C) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 15-40 µm), rửa giải với hệ dung môi gradient

n-hexan-EtOAc 20:1, 12:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 (v:v) cho 40 phân đoạn, mỗi phân

đoạn 5 ml Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại cho 5 nhóm phân đoạn:

AKRHD7.3.1 (1-21), AKRHD7.3.2 (22-29), AKRHD7.3.3 (30-35), AKRHD7.3.4

(36-37), AKRHD7.3.5 (38-40) Nhóm phân đoạn AKRHD7.3.1 được rửa bằng

n-hexan cho chất AKRHD7.3.1 (7,8 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng Nhóm

phân đoạn AKRHD7.3.2 được rửa bằng n-hexan cho chất AKRHD7.3.2

(5-hydroxy-3,7,3,4-tetramethoxyflavon) (8,2 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt Kết quả kiểm tra sắc ký TLC thấy AKRHD7.3.1 = AKRHD7.1

Nhóm phân đoạn AKRHD7.4 (0,36 g) được phân tách trên cột sắc ký tinh chế

(Mini-C) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 15-40 µm), rửa giải với hệ dung môi gradient

n-hexan-EtOAc-HCO2H 40:10:1, 35:10:1, 25:10:1, 20:10:1 và 10:10:1 (v:v:v) cho 31 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5 ml Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại cho

3 nhóm phân đoạn: AKRHD7.4.1 (1-5), AKRHD7.4.2 (6-13), AKRHD7.4.3 31) Nhóm phân đoạn AKRHD7.4.2 (0,13 g) được phân tách trên cột sắc ký tinh chế

(14-(Mini-C) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 15-40 µm), rửa giải với hệ dung môi gradient

n-hexan-EtOAc 12:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 (v:v) cho 95 phân đoạn, mỗi phân đoạn 2

ml Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại cho 4 nhóm phân đoạn:

AKRHD7.4.2.1 (6-8), AKRHD7.4.2.2 (9-59), AKRHD7.4.2.3 (80-86),

AKRHD7.4.2.4 (87-95) Nhóm phân đoạn AKRHD7.4.2.2 được rửa bằng n-hexan

cho chất AKRHD7.4.2.2 (5-hydroxy-3,7,3,4-tetramethoxyflavon) (32 mg) dưới

dạng bột vô định hình màu vàng Nhóm phân đoạn AKRHD7.4.2.4 được rửa bằng

n-hexan cho chất AKRHD7.4.2.4 (3,5-dihydroxy-7,3,4-trimethoxyflavon) (21 mg) dưới dạng bột vô định màu vàng Kết quả kiểm tra sắc ký TLC cho thấy

AKRHD7.4.2.2 = AKRHD7.3.2

Nhóm phân đoạn AKRHD10 (2,41 g) được phân tách trên cột sắc ký pha đảo

RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O 70%, 80%, 90% và 100% MeOH sau đó cất loại

dung môi dưới áp suất giảm cho 4 phân đoạn: AKRHD10.70 (70% MeOH), AKRHD10.80 (80% MeOH), AKRHD10.90 (90% MeOH), AKRHD10.100 (100% MeOH) Khối lượng từng phân đoạn: AKRHD10.70 (1,56 g), AKRHD10.80 (0,26 g), AKRHD10.90 (0,28 g), AKRHD10.100 (0,173 g) Hai phân đoạn AKRHD10.80

và AKRHD10.90 được gộp lại (AKRHD10.(80-90)) (0,54 g) được phân tách bằng

sắc ký cột tinh chế Mini-C trên silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 µm), rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan-EtOAc 12:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1 và 1:2 (v:v) cho 85 phân

đoạn, mỗi phân đoạn 3 ml Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại cho 5

nhóm phân đoạn: AKRHD10.(80-90).1 (3-14), AKRHD10.(80-90).2 (15-21), AKRHD10.(80-90).3 (22-31), AKRHD10.(80-90).4 (32-78), AKRHD10.(80-90).5 (79-85) Kiểm tra sắc ký TLC cho thấy AKRHD10.(80-90).2 = AKRHD7.3.2, AKRHD10.(80-90).3 = AKRHD7.4.2.4 Nhóm phân đoạn AKRHD10.(80-90).4

được rửa bằng n-hexan cho chất AKRHD10.(80-90).4 (7-hydroxy-3,5,4trimethoxyflavon) (7,3 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng Nhóm phân đoạn

-AKRHD10.(80-90).5 được rửa bằng n-hexan cho chất -AKRHD10.(80-90).5

(3,7-dihydroxy-5,3,4-trimethoxyflavon) (30,2 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng

2.5.2 Phân tách phần chiết n-hexan từ quả (AKFH)

Một nửa lượng phần chiết n-hexan (AKFH) (12,44 g) được phân tách sắc ký

cột (CC) Chất hấp phụ được dùng trong sắc ký cột là silica gel Merck cỡ hạt

200-500 µm

Phân tích sắc ký lớp mỏng TLC gộp các phân đoạn chạy cột thành 2 nhóm

phân đoạn AKFH1 (1-8) (4,7 g) và AKFH2 (9-15) (5 g)

Nhóm phân đoạn AKFH1 được đưa lên cột CC trên silica gel (cỡ hạt 63-200

µm) rửa giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 49:1, 29:1, 19:1, 15:1, 9:1, 6:1, 3:1,

1:1 Phân tích TLC gộp thành 4 nhóm phân đoạn AKFH1.1 (1-33) (1,33 g), AKFH1.2 (34-59) (1,8 g), AKFH1.3 (60-67) (150 mg), AKFH1.4 (67-80) (1,7 g)

Nhóm phân đoạn AKFH1.2 (1,8 g) được rửa tinh thể tách ra được tinh thể màu vàng AKFH1.2.1 (70 mg) và AKFH1.2.2 (1,6 g) Chất AKFH1.2.1 đưa lên cột

Mini-C trên silica gel (cỡ hạt 15-40 µm) rửa giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc

29:1, 19:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1 cho AKFH1.2.1.1 (8 mg) (5-hydroxy-3,7,4

-trimethoxyflavon) dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng, AKFH1.2.1.2

(5-hydroxy-3,7,3,4-tetramethoxyflavon) (6 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng và

AKFH1.2.1.3 (3,5-dihydroxy-7,3,4-trimethoxyflavon) (12 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng

Nhóm phân đoạn AKFH1.3 (150 mg) đưa lên cột Mini-C trên silica gel (cỡ

hạt 40-63 µm) rửa giải với hệ dung môi n-hexan-aceton 6:1, dichlometan-EtOAc

30:1, 9:1 Phân tích TLC gộp thành 3 nhóm phân đoạn AKFH1.3.1 (6-11), AKFH1.3.2 (12-13), AKFH1.3.3 (14-26) Nhóm phân đoạn AKFH1.3.2 đưa tinh

chế bằng cột Mini-C trên silica gel (cỡ hạt 15-40 µm), rửa giải với hệ dung môi

dichlometan-EtOAc 80:1 cho AKFH1.3.2.1 (5-hydroxy-3,7,3,4tetramethoxyflavon) (3 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng

-Nhóm phân đoạn AKFH1.4 (1,7 g) được đưa lên cột Mini-C trên silica gel (cỡ

hạt 40-63 µm) rửa giải với hệ dung môi dichlometan-EtOAc Phân tích TLC thu

được 2 phân đoạn AKFH1.4.1 và AKFH1.4.2 Nhóm phân đoạn AKFH1.4.1 được

tinh chế Mini-C trên silica gel (cỡ hạt 40-63 µm) rửa giải với hệ dung môi

dichlometan-EtOAc 20:1, 15:1, 9:1, 6:1 Phân tích TLC gộp thành 5 nhóm phân đoạn

AKFH1.4.1.1.1, AKFH1.4.1.1.2, AKFH1.4.1.2, AKFH1.4.1.3, AKFH1.4.1.4 Nhóm phân đoạn AKFH1.4.1.1.1 được tinh chế Mini-C trên silica gel (cỡ hạt 40-63

µm) rửa giải với hệ dung môi dichlometan-EtOAc 50:1 thu được 2 phân đoạn

AKFH1.4.1.1.1.1, AKFH1.4.1.1.1.2 AKFH1.4.1.1.1.1 được tinh chế cột Mini-C

trên silica gel (cỡ hạt 15-40 µm) rửa giải với hệ dung môi n-hexan-aceton 6:1 Phân

tích TLC gộp thành 3 phân đoạn AKFH1.4.1.1.1.1.1, AKFH1.4.1.1.1.1.2, AKFH1.4.1.1.1.1.3 Phân đoạn AKFH1.4.1.1.1.1.3 được tinh chế cột Mini-C trên

silica gel (cỡ hạt 15-40 µm) rửa giải với hệ dung môi dichlometan-aceton 150:1 cho

AKFH1.4.1.1.1.1.3.1 (3,5-dihydroxy-7,3,4-trimethoxyflavon) (3 mg) dưới dạng bột

vô định hình màu vàng

Nhóm phân đoạn AKFH1.4.2 đưa lên cột Mini-CC trên silica gel (cỡ hạt

40-63 µm) rửa giải với hệ dung môi dichlometan-EtOAc 20:1, 15:1, 9:1, 6:1 Phân tích

TLC gộp thành 5 nhóm phân đoạn AKFH1.4.2.1 (4-6), AKFH1.4.2.2 (7-8), AKFH1.4.2.3 (9-13), AKFH1.4.2.4 (14-24), AKFH1.4.2.5 (25-32) Nhóm phân

đoạn AKFH1.4.2.4 được rửa tinh thể bằng aceton cho AKFH1.4.2.4

(p-hydroquinon) (5 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng

Phân đoạn AKFH2 được hòa tan trong MeOH thu được chất AKFH2 (3,26 g)

tan trong MeOH AKFH2 được phân tách CC trên silica gel (cỡ hạt 63-200 µm) rửa

giải với hệ dung môi dichlometan-MeOH 90:1, 49:1, 30:1 Phân tích TLC gộp thành

3 nhóm phân đoạn AKFH2.1(3-9), AKFH2.1 (10-14) và AKFH2.3 (15-20) Nhóm

phân đoạn AKFH2.1 được tinh chế cột Mini-CC trên silica gel (cỡ hạt 40-63 µm) rửa

giải với hệ dung môi dichlometan-aceton 15:1, 9:1, 6:1, 3:1 Phân tích TLC gộp

thành 4 nhóm phân đoạn AKFH2.1.1 (1-5), AKFH2.1.2 (6-9), AKFH2.1.3 (10-15), AKFH2.1.4 (16-37) Phân đoạn AKFH2.1.2 được tinh chế cột Mini-CC trên silica

gel (cỡ hạt 15-40 µm) rửa giải với hệ dung môi dichlometan-EtOAc 6:1 thu được

AKFH2 (5 mg) Kiểm tra sắc ký TLC cho thấy AKFH2 = AKFH1.4.2.4