Nghiên cứu sự lưu hành các typ huyết thanh và gen kháng kháng sinh của streptococcus pneumoniae gây bệnh bằng kỹ thuật PCR đa mồi tại một số địa phương ở việt nam

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ Tiếng anh/Tiếng việt ANSORP Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens Mạng lưới giám sát về kháng kháng sinh khu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-   -

TỐNG THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH CÁC TYP HUYẾT THANH

VÀ GEN KHÁNG KHÁNG SINH CỦA Streptococcus pneumoniae GÂY BỆNH BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI

TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-   -

TỐNG THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH CÁC TYP HUYẾT THANH VÀ

GEN KHÁNG KHÁNG SINH CỦA Streptococcus pneumoniae

GÂY BỆNH BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI TẠI MỘT SỐ ĐỊA

PHƯƠNG Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 62 42 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS TS Đặng Đức Anh

2 GS TS Phạm Văn Ty

Hà Nội - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Một số kết quả

có sự trợ giúp của đồng nghiệp Các số liệu, kết quả trong luận án này là trung thực

và chưa từng công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác

Hà nội, ngày tháng năm 201

Nghiên cứu sinh

Tống Thị Hà

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin trân trọng cảm ơn đến Ban Lãnh đạo - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Khoa Sinh học và Phòng Sau đại học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại Học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình làm việc, học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS TS Đặng Đức Anh và GS TS Phạm Văn Ty đã không chỉ giúp tôi định hướng nghiên cứu mà còn tận tình truyền đạt những kiến thức và những kinh nghiệm quý báu cho tôi Các Thầy đã và luôn khuyến khích tôi bước về phía trước, tiếp cận với những kiến thức nâng cao và mở rộng để tôi có thể hoàn thành được luận án này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến ThS Nguyễn Thị Hiền Anh - Trưởng phòng thí nghiệm Phế cầu, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, nơi tôi thực hiện đề tài nghiên cứu ThS Hiền Anh đã trực tiếp hướng dẫn các kỹ thuật phòng thí nghiệm cho tôi và luôn là người động viên tôi trong lúc khó khăn Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Vũ Thị Thu Hường đã dành nhiều thời gian thảo luận làm sáng tỏ các phương pháp nghiên cứu sử dụng trong luận án Tôi xin cảm ơn ThS Lê Huy Hoàng, ThS Lê Thị Kim Anh cùng các cán bộ phòng thí nghiệm Phế cầu đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn GS TS Yoshida Lay Myint - Trường Đại học Nagasaki, Nhật Bản đã luôn động viên và hỗ trợ nguồn lực, hóa chất sinh phẩm để thực hiện nội dung nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các Thầy Cô Bộ môn Vi sinh vật học và Khoa Sinh học

- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình học Đại học, Thạc sĩ và Nghiên cứu sinh Từ tận đáy lòng tôi luôn biết ơn và trân trọng những kiến thức và những tình cảm của các Thầy Cô dành cho tôi,

đó là hành trang theo tôi trong suốt quá trình công tác cũng như trong cuộc sống

Tôi xin gửi lời biết ơn tới Lãnh đạo Trung tâm Đào tạo và Quản lý khoa học, nơi tôi công tác, đã luôn động viên và tạo điều kiện tối đa cho tôi trong công việc cũng như trong học tập Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy Cô, cùng toàn thể các bạn Đồng nghiệp trong Trung tâm Đào tạo và Quản lý khoa học đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong công việc để tôi có thể tập trung vào thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn tới Ban Giám đốc và các cán bộ Bệnh viện đa khoa Khánh Hòa, Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện đa khoa Hải Dương đã phối hợp và giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn Gia đình, Bố, Mẹ, cảm ơn Chồng cùng các Con, cảm ơn Bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa vô cùng to lớn cả về vật chất lẫn tinh thần trong quá trình thực hiện luận án này, cũng như trong suốt cuộc đời tôi

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

NCS Tống Thị Hà

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 7

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH 9

MỞ ĐẦU 13

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 17

1.1 VI KHUẨN Streptococcus pneumoniae, KHẢ NĂNG GÂY BỆNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC 17

1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Streptococcus pneumoniae 17

1.1.2 Đặc điểm sinh bệnh học 18

1.1.3 Các bệnh gây ra bởi vi khuẩn Streptococcus pneumoniae 19

1.1.3.1 Viêm đường hô hấp cấp tính (Acute Respiratory Infections-ARI) 19

1.1.3.2 Viêm phổi 20

1.1.3.3 Viêm màng não mủ 21

1.1.3.4 Viêm tai giữa 22

1.1.3.5 Nhiễm khuẩn huyết 23

1.1.4 Dịch tễ học bệnh do phế cầu khuẩn 23

1.1.4.1 Tình hình mắc bệnh do phế cầu khuẩn trên thế giới 23

1.1.4.2 Tình hình mắc bệnh do phế cầu khuẩn tại Việt Nam 25

1.1.5 Dự phòng và điều trị 27

1.1.5.1 Vắc xin phòng bệnh do phế cầu khuẩn 27

1.1.5.2 Điều trị 30

1.2 YẾU TỐ ĐỘC LỰC VÀ TYP HUYẾT THANH CỦA VI KHUẨN Streptococcus pneumoniae 30

1.2.1 Độc tố vi khuẩn và cấu trúc kháng nguyên 30

1.2.1.1 Độc tố protein 31

1.2.1.2 Độc tố polysaccharide 32

1.2.1.3 Cấu trúc kháng nguyên 34

1.2.2 Các typ huyết thanh của vi khuẩn S pneumoniae 34

1.2.2.1 Vai trò của lớp vỏ polysaccharide 35

1.2.2.2 Điều hòa sinh tổng hợp các CPS 35

1.2.2.3 Cơ sở khoa học của phân loại typ huyết thanh 37

1.2.2.4 Các typ huyết thanh phổ biến gây bệnh phế cầu xâm lấn (IPD) 38

1.3 KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Streptococcus pneumoniae 40

1.3.1 Phương thức tác dụng của kháng sinh 41

1.3.2 Gen kháng kháng sinh và cơ chế đề kháng của vi khuẩn S pneumoniae 42

1.3.2.1 Các gen pbp và cơ chế kháng kháng sinh họ Beta-lactam 43

1.3.2.2 Các gen ermB, mefA và cơ chế kháng kháng sinh họ Macrolide 45

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng kháng sinh của S pneumoniae 47

1.3.3.1 Các yếu tố liên quan đến tác nhân gây bệnh 47

1.3.3.2 Các yếu tố liên quan đến kháng sinh 49

1.3.3.3 Các yếu tố liên quan đến vật chủ cảm nhiễm 50

1.4 CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ CƠ SỞ KHOA

HỌC CỦA VIỆC LỰA CHỌN KỸ THUẬT TRONG NGHIÊN CỨU 51

1.4.1 Xét nghiệm chẩn đoán Streptococcus pneumoniae 51

1.4.1.1 Kỹ thuật nhuộm soi và nuôi cấy, định danh 52

1.4.1.2 Kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán S pneumoniae 53

1.4.1.3 Kỹ thuật xét nghiệm kháng nguyên, kháng thể 53

1.4.1.4 Lựa chọn kỹ thuật cho nghiên cứu chẩn đoán xác định 54

1.4.2 Kỹ thuật định typ huyết thanh vi khuẩn Streptococcus pneumoniae 55

1.4.2.1 Thử nghiệm “Quellung” 55

1.4.2.2 Kỹ thuật PCR đa mồi xác định đồng thời nhiều typ huyết thanh 55

1.4.2.3 Kỹ thuật nanofruidic xác định đồng thời nhiều typ huyết thanh 57

1.4.2.4 Lựa chọn kỹ thuật cho nghiên cứu xác định typ huyết thanh 57

1.4.3 Kỹ thuật xác định tính kháng kháng sinh của vi khuẩn S pneumoniae 58

1.4.3.1 Kỹ thuật PCR đa mồi xác định gen kháng kháng sinh 58

1.4.3.2 Kỹ thuật xác định kiểu hình kháng kháng sinh 59

1.4.3.3 Lựa chọn kỹ thuật xác định tính kháng kháng sinh 60

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 61

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 61

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 61

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 62

2.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ và vật tư tiêu hao 63

2.1.4 Hóa chất, sinh phẩm và chủng chuẩn vi sinh vật 64

2.1.5 Chủng chuẩn vi sinh vật 65

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 65

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 65

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 65

2.2.3 Các biến số nghiên cứu 66

2.2.4 Phương pháp thu thập thông tin 66

2.2.5 Sơ đồ nghiên cứu 67

2.2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 67

2.2.7 Xử lý và phân tích số liệu 68

2.2.8 Các kỹ thuật phòng thí nghiệm sử dụng trong nghiên cứu 67

2.2.8.1 Kỹ thuật định danh lại vi khuẩn bằng nuôi cấy phân lập 68

2.2.8.2 Kỹ thuật khẳng định phế cầu khuẩn bằng PCR 71

2.2.8.3 Thử nghiệm "Quellung" xác định typ huyết thanh 73

2.2.8.4 Kỹ thuật PCR đa mồi phát hiện đồng thời nhiều typ huyết thanh 74

2.2.8.5 Kỹ thuật PCR phát hiện kiểu gen kháng kháng sinh 80

2.2.8.6 Kỹ thuật Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) xác định tình trạng kháng kháng sinh 82

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 86

3.1 ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 86

3.1.1 Đặc điểm phân lập của đối tượng nghiên cứu 86

3.1.2 Khẳng định vi khuẩn S pneumoniae bằng PCR 88

3.2 ÁP DỤNG VÀ CẢI TIẾN QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT VÀ GEN KHÁNG KHÁNG SINH 90

3.2.1 Áp dụng và cải tiến quy trình PCR xác định typ huyết thanh 90

3.2.2 Áp dụng và cải tiến quy trình PCR xác định gen kháng kháng sinh 95

3.3 XÁC ĐỊNH SỰ PHÂN BỐ CÁC TYP HUYẾT THANH PHẾ CẦU GÂY BỆNH

TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG Ở VIỆT NAM 97

3.3.1 Kết quả phân bố các typ huyết thanh của vi khuẩn S pneumoniae 97

3.3.2 Kết quả phân bố typ huyết thanh của vi khuẩn S pneumoniae theo khu vực 100

3.3.3 Kết quả phân bố typ huyết thanh chủ yếu trong vắc xin 102

3.3.4 Tỷ lệ bao phủ các typ huyết thanh bởi vắc xin 103

3.4 TÌNH TRẠNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Streptococcus pneumoniae 106

3.4.1 Kết quả tỷ lệ phân bố gen kháng kháng sinh bằng PCR đa mồi 106

3.4.2 Kết quả tình trạng kháng kháng sinh theo kiểu hình bằng kỹ thuật nồng độ ức chế tổi thiểu 109

3.4.2.1 Tình trạng kháng kháng sinh ở cả 3 bệnh viện thuộc khu vực nghiên cứu 109

3.4.2.2 So sánh tình trạng kháng kháng sinh giữa các bệnh viện 116

3.4.3 Kết quả xác định mối liên quan giữa kiểu hình và gen kháng kháng sinh 119

3.4.3.1 Mối liên quan giữa kháng sinh nhóm beta-lactam và gen pbp 119

3.4.3.2 Mối liên quan giữa kháng sinh nhóm macrolide và gen mefA, ermB 122

3.4.4 Tình trạng đa kháng kháng sinh của các chủng S pneumoniae bằng kỹ thuật nồng độ ức chế tối thiểu 126

3.5 MỐI LIÊN QUAN GIỮA TYP HUYẾT THANH VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH 128

3.5.1 Mối liên quan giữa typ huyết thanh và gen kháng kháng sinh 129

3.5.2 Mối liên quan giữa typ huyết thanh và kiểu hình kháng kháng sinh (MIC) 131

KẾT LUẬN 138

KIẾN NGHỊ 139

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 140 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tên đầy đủ Tiếng anh/Tiếng việt

ANSORP Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens

Mạng lưới giám sát về kháng kháng sinh khu vực châu Á

ATCC American Type Culture Collection

Bảo tàng giống chuẩn quốc tế Mỹ

ARI Acute Respiratory Infection

Viêm đường hô hấp cấp tính

Viêm phổi mắc phải trong cộng đồng

CPS Capsular Polysaccharide

Vỏ polysaccharide

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

Viện nghiên cứu các tiêu chuẩn xét nghiệm và lâm sàng

Dịch não tủy

CWPS Cell Wall Polysaccharide

Polysaccharide thành tế bào

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym

ENSP Erythromycin Non-Susceptible Pneumococci

Chủng phế cầu không nhạy cảm erythromycin

Erm Erythromycin Ribosomal Methylase

Methyl hóa ribosom bởi kháng sinh erythromycin

Bơm đẩy kháng sinh macrolide

Đa kháng kháng sinh

MIC Minimum Inhibition Concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

Từ viết tắt Tên đầy đủ Tiếng anh/Tiếng việt

NIPs National Immunization Programs

Chương trình tiêm chủng quốc gia

IPD Invasive Pneumococcal Disease

Bệnh viêm phổi xâm lấn

PspA Pneumococcal surface protein A

Phản ứng khuếch đại gen

PCV7 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine

Vắc xin cộng hợp phế cầu 7 giá

PCV10 10-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine

Vắc xin cộng hợp phế cầu 10 giá

PCV13 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine

Vắc xin cộng hợp phế cầu 13 giá

PPSV23 23-valent Pneumococcal Polysaccharide Vaccine

Vắc xin polysaccharide phế cầu 23 giá

PNSP Penicillin Non-Susceptible Pneumococci

Chủng phế cầu không nhạy cảm penicillin

PBP Penicillin-binding Protein

Protein gắn penicillin

WHO World Health Organization

Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

Danh mục các bảng

Bảng 1.1 Các typ huyết thanh được bao phủ trong vắc xin 29

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị, dụng cụ, vật tư tiêu hao được sử dụng trong nghiên cứu 63

Bảng 2.2 Danh mục hóa chất, sinh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu 64

Bảng 2.3 Trình tự các mồi của gen lytA và cpsA 72

Bảng 2.4 Thành phần của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi lytA và cpsA 72

Bảng 2.5 Trình tự các cặp mồi dùng để xác định typ huyết thanh phế cầu 74

Bảng 2.6 Tổ hợp các mồi của quy trình PCR xác định typ huyết thanh áp dụng ở các khu vực khác nhau 78

Bảng 2.7 Bảng ký hiệu các mồi được sử dụng trong các nhóm phản ứng 79

Bảng 2.8 Thông tin về mồi phát hiện các kiểu gen kháng kháng sinh của S.pneumoniae 80

Bảng 2.9 Bảng so sánh tối ưu hoá nhóm phản ứng PCR xác định gen kháng kháng sinh 81

Bảng 2.10 Các kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu và ngưỡng đọc kết quả MIC 83

Bảng 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn S pneumoniae từ bệnh phẩm 86

Bảng 3.2 Số lượng các typ huyết thanh phân bố ở các nhóm phản ứng 92

Bảng 3.3 Phân bố các typ huyết thanh chủ yếu trong vắc xin PCV10 theo tuổi, giới 102

Bảng 3.4 Tỷ lệ bao phủ các typ huyết thanh trong vắc xin theo theo giới và tuổi 104

Bảng 3.5 Tỷ lệ phân bố gen kháng kháng sinh 107

Bảng 3.6 Tình trạng kháng sinh của các chủng S pneumoniae 110

Bảng 3.7 Số lượng các chủng S pneumoniae theo nồng độ kháng sinh ức chế tối

Bảng 3.12 Mối liên quan giữa tình trạng kháng kháng sinh nhóm macrolide và

tetracyclin và mang gen mefA, ermB 123 Bảng 3.13 Tỷ lệ phân bố gen mefA, ermB theo nồng độ kháng sinh erythromycin 124 Bảng 3.14 Tỷ lệ phân bố gen mefA, ermB theo nồng độ kháng sinh tetracycllin 124 Bảng 3.15 Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của vi khuẩn S pneumoniae 126

Bảng 3.16 Tỷ lệ phân bố các gen kháng kháng sinh theo typ huyết thanh có và không

có trong vắc xin PCV10 129 Bảng 3.17 Tỷ lệ phân bố các chủng kháng kháng sinh (MIC) theo nhóm typ huyết thanh PCV10 và non-PCV10 131 Bảng 3.18 Tỷ lệ phân bố số lượng chủng kháng kháng sinh theo typ huyết thanh vắc xin PCV10 132 Bảng 1 - Phụ lục Tỷ lệ phân bố các typ huyết thanh theo các bệnh viện

Bảng 2 - Phụ lục Phân bố số lượng chủng đa kháng kháng sinh và mang đa gen kháng

Bảng 3 - Phụ lục Tỷ lệ phân bố số lượng chủng kháng kháng sinh theo typ huyết thanh non-PCV10

Bảng 4 - Phụ lục Các biến số sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 5 - Phụ lục Danh sách thông tin bệnh nhân (kèm theo bản chấp thuận sử dụng mẫu chủng vi khuẩn)

Danh mục các hình

Hình 1.1 Các bệnh phổ biến gây ra bởi phế cầu khuẩn 19

Hình 1.2 Mười nước có số lượng trẻ dưới 5 tuổi chết do phế cầu khuẩn lớn nhất 25

Hình 1.3 Yếu tố độc lực của S pneumoniae 31

Hình 1.4 Sự tổng hợp vỏ CPS bằng con đường phụ thuộc 36

Hình 1.5 Trình tự phân bố các gen trên locus cps của nhóm typ huyết thanh 9 37

Hình 1.6 Các typ huyết thanh phổ biến gây IPD ở trẻ trên toàn thế giới giai đoạn tiền vắc xin (1980-2007) 39

Hình 1.7 Các typ huyết thanh phổ biến gây IPD ở trẻ tại Đông Nam Á và Việt Nam giai đoạn tiền vắc xin 39

Hình 1.8 Phương thức tác động của kháng sinh lên tế bào vi khuẩn 41

Hình 1.9 Cấu trúc phân tử của các kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam 45

Hình 1.10 Cơ chế hoạt động của kháng sinh nhóm penicillin lên sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn 45

Hình 1.11 Cơ chế tác động của kháng sinh erythromycin lên quá trình dịch mã 46

Hình 1.12 PCR đa mồi xác định typ huyết thanh của vi khuẩn S pneumoniae 56

Hình 2.1 Bản đồ địa lý 3 khu vực tiến hành nghiên cứu 62

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tại phòng thí nghiệm 67

Hình 2.3 Khuẩn lạc một số vi khuẩn trên môi trường thạch máu 69

Hình 2.4 Thử nghiệm optochin và tan trong muối mật 70

Hình 2.5 Sơ đồ phân lập định danh vi khuẩn S pneumoniae 70

Hình 2.6 Hình ảnh phồng vỏ của phế cầu độ phóng đại 400X 74

Hình 2.7 Sơ đồ pha loãng kháng sinh bậc 2 84

Hình 2.8 Sơ đồ chấm huyền dịch vi khuẩn trên đĩa môi trường thạch máu 85

Hình 2.9 Hình ảnh vi khuẩn mọc trên môi trường thạch máu chứa kháng sinh 85

Hình 3.1 Tỷ lệ phân lập S pneumoniae và H influenzae 88

Hình 3.2 Ảnh điện di xác định typ huyết thanh bằng kỹ thuật PCR đa mồi 91

Hình 3.3 Ảnh điện di xác định typ huyết thanh với các mồi của nhóm 1 94

Hình 3.4 Ảnh điện di xác định typ huyết thanh với các mồi của nhóm 2 94

Hình 3.5 Ảnh điện di xác định typ huyết thanh với các mồi của nhóm 3 94

Hình 3.6 Ảnh điện di tối ưu hóa quy trình xác định gen kháng kháng sinh 96

Hình 3.7 Ảnh điện di xác định các gen kháng kháng sinh pbp1a, pbp2x và pbp2b 96

Hình 3.8 Ảnh điện di xác định các gen kháng kháng sinh mefA và ermB 96

Hình 3.9 Tỷ lệ phân bố các typ huyết thanh tại 3 bệnh viện thuộc phạm vi nghiên cứu 98

Hình 3.10 Tỷ lệ phân bố các typ huyết thanh tại BVĐK Khánh Hòa 101

Hình 3.11 Tỷ lệ phân bố các typ huyết thanh tại BVĐK Hải Dương 101

Hình 3.12 Tỷ lệ phân bố các typ huyết thanh tại BVĐK Bạch Mai 101

Hình 3.13 Tỷ lệ bao phủ các typ huyết thanh trong vắc xin theo theo giới và tuổi 104

Hình 3.14 Mức độ kháng kháng sinh hoàn toàn và kháng trung gian 113

Hình 3.15 Tỷ lệ kháng kháng sinh hoàn toàn ở mỗi Bệnh viện 118

Hình 3.16 Mối liên quan giữa đa kháng kháng sinh và mang đa gen kháng kháng sinh 127

Hình 3 17 Phân bố các chủng phế cầu kháng kháng sinh theo typ huyết thanh chủ yếu không thuộc vắc xin PCV10 134

MỞ ĐẦU

Phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae) là tác nhân vi khuẩn chủ yếu gây bệnh

nghiêm trọng ở trẻ em và người già như viêm phổi, viêm màng não mủ và nhiễm khuẩn huyết Viêm màng não do phế cầu có tỷ lệ tử vong cao hơn hẳn so với viêm màng não do các căn nguyên khác Ước tính có khoảng 0,7 - 1 triệu trường hợp tử vong hàng năm xảy

ra ở trẻ nhỏ dưới 5 tuổi được xác định do phế cầu khuẩn gây ra Hơn nữa, di chứng để lại

sau viêm màng não do phế cầu rất nặng nề Vi khuẩn Streptococcus pneumoniae là song

cầu khuẩn Gram dương, tan huyết alpha, kỵ khí tùy tiện, có thể có vỏ hoặc không có vỏ

polysaccharide Kháng nguyên vỏ là kháng nguyên quan trọng để phân loại S.pneumoniae,

đồng thời kháng nguyên này đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh và lan truyền bệnh trong cộng đồng Dựa trên sự khác biệt tính kháng nguyên vỏ, người ta phân

loại vi khuẩn S pneumoniae thành trên 90 typ huyết thanh khác nhau Kháng thể kháng

vỏ thường là kháng thể đặc hiệu và có hiệu lực bảo vệ Vắc xin phế cầu đang sử dụng là vắc xin cộng hợp, bao gồm một số loại kháng nguyên vỏ polysaccharide của vi khuẩn

S.pneumoniae [92]

Phương pháp kinh điển cho chẩn đoán typ huyết thanh của vi khuẩn Streptococcus

pneumoniae là phản ứng phồng vỏ Quellung Phương pháp này thường rất tốn kém, mất

nhiều thời gian, dễ gây dương tính giả do phản ứng chéo giữa các kháng huyết thanh Ngoài ra, phương pháp nuôi cấy kinh điển khó phát hiện các trường hợp đồng nhiễm

nhiều typ huyết thanh của vi khuẩn S pneumoniae, là yếu tố góp phần dẫn đến hiện tượng

chuyển đảo typ huyết thanh sau sử dụng vắc xin phòng phế cầu Trong vài năm gần đây, nhiều nước trên thế giới đã phát triển kỹ thuật PCR để định typ huyết thanh có ưu điểm là nhanh, nhạy, ít tốn kém, có tỉ lệ phát hiện và tỉ lệ đồng nhiễm các typ huyết thanh cao hơn

so với phương pháp thông thường [10] Tuy nhiên, các kỹ thuật PCR đã công bố thường chỉ phù hợp cho từng khu vực nghiên cứu cụ thể và còn hạn chế về số lượng các typ huyết thanh được phát hiện Việc tìm ra một quy trình xét nghiệm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho chẩn đoán phần lớn các typ huyết thanh lưu hành của phế cầu ở mỗi khu vực, mỗi quốc gia là vấn đề hết sức cần thiết

Nhiễm trùng do S pneumoniae có thể dự phòng bằng vắc xin và điều trị bằng

kháng sinh thích hợp Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh đã làm xuất hiện và lan truyền gen kháng thuốc gây cản trở tiến trình và hiệu quả điều trị Mặc dù tình hình kháng kháng sinh có thể thay đổi theo từng khu vực hay từng quốc gia, nhưng nghiên cứu đã chỉ ra châu Á là một tâm điểm của kháng kháng sinh Tỷ lệ các chủng kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh đã tăng lên nhanh chóng Tuy nhiên, nguồn lực cũng như cơ sở hạ tầng cho giám sát y tế cộng đồng còn rất nghèo nàn ở nhiều quốc gia [77] Với hơn 70% dân số trên thế giới sống ở khu vực châu Á Thái Bình Dương thì kháng kháng sinh ở khu vực này trở thành một vấn đề toàn cầu Tổ chức Y tế thế giới xếp Việt Nam vào nhóm các nước có tỉ lệ kháng kháng sinh cao nhất thế giới Theo số liệu của Bộ Y tế, có tới 88% kháng sinh tại thành thị được bán ra mà không cần kê đơn, ở nông thôn tỉ lệ này lên đến 91%, dẫn đến việc tạo ra những chủng vi khuẩn có sức đề kháng mạnh Sử dụng kháng sinh không hợp lý, không hiệu quả đang là vấn đề có phạm vi ảnh hưởng rộng khắp ở mọi cấp độ chăm sóc y tế, là nguyên nhân làm tăng đáng kể chi phí khám chữa bệnh WHO dự tính đến năm 2050, trên thế giới, cứ 3 giây sẽ có 1 người tử vong do các siêu vi khuẩn kháng thuốc, tương đương với khoảng 10 triệu người mỗi năm Việc giám sát vi khuẩn kháng thuốc để có biện pháp phòng ngừa sự gia tăng đề kháng là hết sức cần thiết Mô hình bệnh tật và xu hướng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể thay đổi khác nhau giữa các quốc gia, các khu vực, các vùng địa lý, thậm chí khác nhau giữa các bệnh viện

và các khoa điều trị Vì vậy, mỗi địa phương cần phải có được các số liệu về mức độ đề kháng kháng sinh của riêng mình

Dựa vào áp lực chọn lọc của kháng sinh và áp lực chọn lọc vắc xin, những typ huyết thanh không được bao phủ trong vắc xin hoặc các chủng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh sẽ tồn tại và gia tăng về số lượng, gây hậu quả nghiêm trọng Việc phân tích mối liên quan giữa tình trạng kháng kháng sinh và các typ huyết thanh ở nhóm typ được bao phủ trong vắc xin và các typ không có trong vắc xin cho thấy được hiệu quả của vắc xin trong việc làm giảm sự lưu hành các gen kháng kháng sinh Bên cạnh đó còn dự đoán được xu hướng các typ huyết thanh nổi trội trong tương lai sẽ biến đổi như thế nào sau khi

triển khai tiêm chủng vắc xin cộng hợp cho trẻ để có biện pháp thay đổi chiến lược dự phòng trong tương lai

Chương trình giám sát về tỉ lệ mắc, sự lưu hành các typ huyết thanh và tính kháng kháng sinh của các tác nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính trong đó có

S.pneumoniae đã được thiết lập ở nhiều nước trên thế giới nhưng chưa có ở Việt Nam

Phương pháp xác định typ huyết thanh sử dụng cho hầu hết các nghiên cứu trước đây ở Việt Nam cũng chỉ là những kỹ thuật nuôi cấy kinh điển Thêm vào đó, thông tin về tính kháng thuốc và cơ chế gen gây kháng thuốc còn hạn chế Đặc biệt, chưa có một nghiên cứu nào phân tích về mối liên quan giữa các typ huyết thanh và tính kháng kháng sinh cũng như xu hướng dịch chuyển typ huyết thanh ưu thế Xuất phát từ tính cần thiết và ý

nghĩa thực tiễn của vấn đề, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu sự lưu hành các typ

huyết thanh và gen kháng kháng sinh của Streptococcus pneumoniae gây bệnh bằng

kỹ thuật PCR đa mồi tại một số địa phương ở Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Xác định được sự phân bố các typ huyết thanh của các chủng phế cầu gây bệnh tại một số địa phương ở Việt Nam;

2 Xác định được tình trạng kháng kháng sinh của các chủng phế cầu gây bệnh tại một số địa phương ở Việt Nam;

3 Phân tích được mối liên quan giữa typ huyết thanh và tính kháng kháng sinh

của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae

Để phục vụ mục tiêu này, nội dung của luận án bao gồm:

- Định danh lại vi khuẩn S pneumoniae bằng kỹ thuật nuôi cấy và sinh học phân tử

- Áp dụng và cải tiến quy trình PCR đa mồi xác định typ huyết thanh và gen kháng kháng sinh

- Xác định sự phân bố typ huyết thanh của các chủng phế cầu bằng kỹ thuật PCR đa mồi

- Xác định tình trạng kháng kháng sinh của phế cầu gây bệnh bằng kỹ thuật PCR đa mồi và kỹ thuật nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

- Xác định mối liên quan giữa typ huyết thanh và tính kháng kháng sinh của phế cầu gây bệnh

Tính mới của luận án:

Nghiên cứu đã áp dụng và cải tiến được quy trình PCR đa mồi xác định typ huyết

thanh của vi khuẩn Streptoccus pneumoniae phù hợp với điều kiện tại Việt Nam Kỹ thuật

này có ưu điểm là nhanh, nhạy, ít tốn kém, có tỉ lệ phát hiện và tỉ lệ đồng nhiễm các typ huyết thanh cao hơn so với phương pháp thông thường

Đưa ra được số liệu tổng quan về các typ huyết thanh lưu hành và tình trạng kháng

kháng sinh của vi khuẩn Streptoccus pneumoniae làm cơ sở cho việc hoạch định chiến

lược triển khai vắc xin dự phòng và lựa chọn kháng sinh thích hợp Cung cấp số liệu cho

các chương trình giám sát của vi khuẩn Streptoccus pneumoniae trong nước và các nước

trong khu vực

Hiện nay chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam có những phân tích về mối liên quan giữa typ huyết thanh và gen kháng kháng sinh Phân tích này bên cạnh việc cho thấy được hiệu quả của vắc xin trong việc làm giảm sự lưu hành các gen kháng kháng sinh, còn dự đoán được xu hướng các typ huyết thanh nổi trội sau khi triển khai tiêm vắc xin cho trẻ để có biện pháp thay đổi chiến lược dự phòng Điểm mới trong phân tích tình trạng kháng kháng sinh theo nồng độ kháng sinh giúp dự báo xu hướng dịch chuyển mức

độ đề kháng kháng sinh trong tương lai

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 VI KHUẨN Streptococcus pneumoniae, KHẢ NĂNG GÂY BỆNH VÀ ĐẶC ĐIỂM

DỊCH TỄ HỌC

1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Streptococcus pneumoniae

Vi khuẩn Streptococcus pneumoniae (S pneumoniae), thuộc họ Streptococaceae,

bộ Lactobacillales, còn gọi là phế cầu khuẩn, là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí tuỳ tiện,

tan huyết alpha, thuộc nhóm liên cầu khuẩn, có khả năng tan trong muối mật và không sinh enzym catalase Phế cầu khuẩn là một tác nhân quan trọng gây bệnh ở người được phát hiện là nguyên nhân chủ yếu gây viêm phổi vào cuối thế kỷ 19 Bởi vậy

S.pneumoniae là đối tượng của nhiều nghiên cứu bệnh miễn dịch học và cơ chế bệnh sinh

Ngoài viêm phổi, phế cầu còn là nguyên nhân gây nhiều căn bệnh xâm lấn khác như viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, viêm xương, viêm tai giữa, viêm phế quản, viêm xoang cấp, viêm tai giữa, viêm nội mạc tử cung, viêm màng ngoài tim, viêm màng não và áp xe não [139] Phế cầu là nguyên nhân phổ biến nhất gây viêm màng não mủ và viêm tai giữa

ở các nước công nghiệp Viêm phổi do S pneumoniae gây ra thường gặp ở trẻ nhỏ và

người già [32]

S pneumoniae nhạy cảm với optochin, có thể sử dụng khoanh giấy optochin để

phân biệt được với các liên cầu Streptococcus viridans tan huyết alpha khác Vi khuẩn

S.pneumoniae bắt màu Gram dương, đứng thành cặp hoặc có thể đứng thành chuỗi ngắn,

hiếm khi đứng riêng rẽ Phế cầu có thể có vỏ hoặc không vỏ Vỏ polysaccharide là yếu tố độc lực của tế bào, kháng lại thực bào, đến nay đã phát hiện được trên 90 typ huyết thanh

vỏ khác nhau Chủng mang các typ huyết thanh khác nhau về độc lực, tỷ lệ lưu hành theo từng vùng địa lý và tính kháng kháng sinh [57]

Phế cầu khuẩn (S pneumoniae) là loại cầu khuẩn thường xếp nối nhau tạo hình cặp

“mắt kính”, bắt màu Gram dương, có vỏ và không di động ở môi trường lỏng hay trong các tổ chức, bệnh phẩm có thể xếp thành chuỗi ngắn và hãn hữu có thể đứng riêng rẽ một mình (thường ở trong điều kiện và môi trường kém dinh dưỡng hoặc có nồng độ thấp của

ion Mg++) [5] Hầu hết phế cầu bắt màu Gram dương, nhưng đôi khi trong quá trình thay đổi môi trường nuôi cấy có thể trở thành Gram âm, do vi khuẩn bị tự ly giải hoặc do các hoạt tính bề mặt bị tác động bởi muối mật (sodium deoxycholate hoặc sodium dodecylsulfat) Phế cầu có thể tồn tại trong đờm khô vài ngày đến vài tháng, trong môi trường canh thang có 20% glycerin và ở nhiệt độ âm sâu (-70o) phế cầu tồn tại 1 - 2 năm, nhưng dễ bị diệt bởi các chất sát khuẩn thông thường và ở nhiệt độ 60oC trong 30 phút Trong thời gian ngắn, nhiệt độ giữ chủng thích hợp là 18 - 30oC

1.1.2 Đặc điểm sinh bệnh học

S pneumoniae cư trú lành tính ở vùng hầu họng Người lớn khỏe mạnh có 5-10%

mang vi khuẩn, trong khi đó có 20-40% trẻ bình thường mang vi khuẩn [58] Tỷ lệ này cao hơn ở những vùng dân cư đông đúc như trường học, quân đội [82]

Phế cầu khuẩn tấn công vào các tế bào hầu họng thông qua sự tương tác của các chất bám dính bề mặt của vi khuẩn Tình trạng xâm lấn thông thường này trở nên gây bệnh nếu như vi khuẩn xâm lấn tới ống vòi nhĩ, xoang mũi, nơi có thể gây viêm tai giữa, viêm xoang [142]

Viêm phổi xảy ra khi vi khuẩn di chuyển xuống phổi Các yếu tố như tuổi (trẻ em hoặc người già), sự nhiễm vi rút trước đó, hoặc hút thuốc là các yếu tố nguy cơ làm tăng khả năng mắc viêm phổi Ngay khi vi khuẩn di chuyển đến nơi ẩn nấp, nó sẽ hoạt hoá hệ thống bổ thể, kích thích tổng hợp cytokine và tấn công vào tế bào bạch cầu (đặc biệt là tế bào bạch cầu trung tính) [94] Vỏ polysaccharide bao xung quanh giúp vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào, nếu không có kháng thể kháng vỏ thì các đại thực bào của phế nang không thể giết được tế bào phế cầu khuẩn Vi khuẩn có thể tràn vào máu gây nhiễm khuẩn huyết và lên não, tới các vùng khác, xương và khoang phúc mạc, dẫn đến các tình trạng viêm nhiễm xâm lấn nghiêm trọng, như viêm màng não, áp xe não, viêm khớp hoặc viêm tủy xương [18]

Nguy cơ nhiễm phế cầu khuẩn tăng lên ở những người có hệ thống miễn dịch suy giảm do thiếu hụt IgG, giảm bạch cầu hoặc hệ thống đào thải phế cầu khuẩn suy yếu Đặc biệt ở những người không biểu hiện chức năng của lách do không có lách bẩm sinh, do

phẫu thuật cắt lách hoặc biến chứng của bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm làm tăng mức độ nhiễm trùng nặng hơn Ngoài ra, một số yếu tố như dân tộc thiểu số (thổ dân châu Mỹ, người eskimos và thổ dân da đỏ) dễ mắc các bệnh phế cầu khuẩn mắc phải cộng đồng [130, 155]

1.1.3 Các bệnh gây ra bởi vi khuẩn Streptococcus pneumoniae

Phế cầu xâm nhập vào cơ thể và thường trở thành một thành viên của hệ vi khuẩn chí ở đường hô hấp trên, khi có điều kiện chúng có thể trở thành tác nhân gây bệnh quan trọng ở người, phế cầu gây viêm tai giữa, viêm xoang, viêm phổi cấp (điển hình là viêm phổi thuỳ và viêm tiểu thuỳ phổi ), nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não

Hình 1.1 Các bệnh phổ biến gây ra bởi phế cầu khuẩn [62]

1.1.3.1 Viêm đường hô hấp cấp tính (Acute Respiratory Infections-ARI)

Viêm đường hô hấp cấp tính (ARI) bao gồm nhiễm trùng đường hô hấp trên (upper respiratory tract infection-URI) hoặc nhiễm trùng đường hô hấp dưới (lower respiratory tract infection-LRI) Đường hô hấp trên bao gồm đường thở từ mũi đến thanh quản, xoang mũi và tai giữa Đường hô hấp dưới nối tiếp của đường hô hấp từ khí quản và phế quản đến các nhánh tiểu phế quản và phế nang ARI không chỉ giới hạn ở đường hô hấp

Nhiễm khuẩn huyết Viêm tai giữa

mà còn có thể bị ảnh hưởng cả hệ thống do nhiễm trùng có thể xâm nhập tới các cơ quan khác hoặc do độc tố vi khuẩn, gây viêm và làm giảm chức năng phổi [39]

Trừ trẻ sơ sinh, ARI là nguyên nhân phổ biến nhất gây bệnh và tử vong ở trẻ em dưới 5 tuổi Trung bình mỗi trẻ mắc ARI từ ba đến sáu lần mỗi năm ở bất kể vùng địa lý cũng như điều kiện kinh tế nào Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh từ nhẹ đến trầm trọng khác nhau giữa các quốc gia có thu nhập cao và thấp do sự khác biệt về nguyên nhân và yếu tố nguy

cơ, mức độ nghiêm trọng ở trẻ em dưới 5 tuổi viêm đường hô hấp dưới cao hơn ở các nước đang phát triển, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao hơn Mặc dù việc chăm sóc y tế có thể làm giảm nhẹ mức độ nghiêm trọng và tử vong, song nhiều trường hợp LRI nghiêm trọng không đáp ứng với pháp đồ điều trị, hoặc chất lượng thuốc điều trị không hiệu quả Khoảng 10,8 triệu trẻ em chết mỗi năm Ước tính năm 2000, có 1,9 triệu người chết do ARI, 70% ở châu Phi và Đông Nam Á Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính rằng mỗi năm có tới 2 triệu trẻ em tử vong do viêm phổi [39]

1.1.3.2 Viêm phổi [5, 142]

Viêm phổi do phế cầu là một trong những bệnh viêm đường hô hấp dễ mắc phải ở trẻ em dưới 5 tuổi và người lớn tuổi Thường xảy ra ở những người có số lượng cao phế cầu ở niêm mạc hầu họng Sự cảm nhiễm với phế cầu khuẩn gây viêm phổi tăng lên nếu

có bất cứ nguyên nhân nào gây tổn thương thực thể và chức năng đường hô hấp dưới, như cúm, phù phổi do các nguyên nhân hút đờm rãi sau ngộ độc rượu hoặc các nguyên nhân khác, bệnh phổi mạn tính hoặc tiếp xúc với các chất kích thích phản ứng đường thở trong không khí (khói, bụi…) Đối với trẻ dưới 1 tuổi, nhất là những trẻ hay mắc viêm họng, viêm phế quản phổi, vừa trải qua tiêu chảy thì rất dễ mắc bệnh và là một yếu tố khiến trẻ bị suy dinh dưỡng Nguy cơ nhiễm bệnh cũng tăng lên ở người già, người có các biểu hiện suy lách thực thể hay cơ năng, bệnh tim mạch, đái tháo đường, bệnh bạch cầu, đa u tủy xương, suy thận… Những bà mẹ mang thai bị viêm phổi do phế cầu khuẩn thì có nguy cơ sẽ sinh con thiếu tháng

Viêm phổi thuỳ thường xảy ra ở người trong độ tuổi 30-50 tuổi, viêm tiểu thùy phổi lại thường xảy ra ở trẻ nhỏ và người trên 50 tuổi, biểu hiện lâm sàng ban đầu thường là viêm mũi họng cấp tính trong một vài ngày đầu, vi khuẩn lan xuống phổi, xâm lấn vào

phế nang và nhân lên nhanh chóng, cơ thể đáp ứng bằng việc huy động nhiều bạch cầu đa nhân và cả hồng cầu tập trung ở những phế nang bị nhiễm trùng, nhưng vỏ của vi khuẩn phế cầu đã ức chế khả năng thực bào của bạch cầu đa nhân, kết quả là các phế nang chứa đầy dịch tiết và mủ

Bệnh khởi phát đột ngột với biểu hiện ớn lạnh, sốt cao, đau họng, ho có đờm rỉ sét, đau nhói trong quá trình viêm cấp tính (đau ngực, đau màng phổi), khó thở Ở trẻ em, biểu hiện đầu tiên thường là nôn và co giật, còn ở người già bệnh thường khởi phát từ từ Bệnh có thể diễn biến không có biến chứng trong vòng 7-10 ngày, trong thời gian đó phế cầu có thể vượt qua phế nang thông qua hệ thống tuần hoàn tới các tổ chức khác (nhiễm khuẩn huyết) gây nên viêm màng não cấp tính, viêm nội tâm mạc, viêm ngoại tâm mạc, hoặc gây apxe ở nhiều tổ chức khác trong cơ thể Cũng trong thời gian 7-10 ngày, kháng thể kháng vỏ xuất hiện và tăng lên trong cơ thể bệnh nhân, bệnh nhân có thể hồi phục dần nhờ có cơ chế bảo vệ của hàng rào miễn dịch nhưng cũng có thể tử vong vì đáp ứng miễn dịch bảo vệ yếu kém, không thích hợp và phác đồ điều trị không hiệu quả

Viêm phổi do phế cầu thường không phải là nhiễm trùng tiên phát mà là hậu quả của

sự sụt giảm sức đề kháng của cơ thể khi mắc bệnh viêm đường hô hấp trên do vi rút, do gây mê, suy dinh dưỡng, nghiện rượu Nếu được điều trị kháng sinh, tỷ lệ tử vong của viêm phổi do phế cầu vẫn có thể từ 5 - 10%, không điều trị kháng sinh tỷ lệ tử vong có thể cao tới 50% Các biến chứng của viêm phổi như sốc nhiễm độc, suy hô hấp cấp tính, xẹp phổi gây tím tái, nhịp tim nhanh, áp xe phổi, viêm phổi mạn tính, viêm màng phổi Ở trẻ

em, viêm phổi do nhiễm khuẩn dễ lây lan sang nơi khác gây nên các bệnh: viêm tai giữa, viêm xương chum, viêm màng não, viêm màng bụng (phúc mạc)

hoặc đi theo đường kế cận từ các ổ nhiễm trùng cạnh màng não Sự nhân lên của vi khuẩn rất nhanh vì trong dịch não tủy, nồng độ bổ thể cũng như kháng thể rất thấp không đủ để

ức chế sự sinh sản của chúng

Viêm màng não mủ có các triệu chứng lâm sàng như các bệnh viêm màng não mủ cấp tính khác, thường có tiền triệu chứng là các biểu hiện của viêm đường hô hấp trên như viêm tỵ hầu, viêm xoang hay viêm tai giữa Thậm chí ban đầu chỉ biểu hiện khó chịu nhẹ, hôn mê, các rối loạn thần kinh (như trạng thái kích thích) và sốt

Viêm màng não mủ thường xảy ra tiếp sau các nhiễm trùng khác do phế cầu như viêm tai giữa, viêm phổi Bệnh diễn biến nhanh và tỷ lệ tử vong khoảng 40% Các di chứng lớn có thể gặp như bại não, động kinh, não úng thủy, chậm phát triển tinh thần vận động

1.1.3.4 Viêm tai giữa

Viêm tai giữa được xếp vào nhóm bệnh viêm đường hô hấp trên thường gặp ở trẻ

em Ở trẻ, vòi nhĩ (nối hòm tai và họng mũi) ngắn hơn, khẩu kính lớn hơn ở người lớn nên vi khuẩn và các chất xuất tiết ở mũi họng rất dễ lan lên tai giữa, nhất là khi em bé nằm ngửa thì tai sẽ ở vị trí thấp hơn mũi họng, khi khóc, vòi nhĩ sẽ mở rộng thêm làm cho các chất xuất tiết ở mũi họng theo đó chảy vào hòm tai gây viêm Bên cạnh đó, hệ thống niêm mạc đường hô hấp (niêm mạc mũi họng, niêm mạc hòm tai, niêm mạc khí phế quản…) ở trẻ em rất nhạy cảm, rất dễ phản ứng gây hiện tượng xuất tiết dịch, làm cho dịch ứ đọng nhiều trong hòm tai gây viêm tai giữa

Phế cầu khuẩn là nguyên nhân của 40-50% số trường hợp viêm tai giữa cấp Viêm tai giữa với những triệu chứng thường gặp ở trẻ nhỏ là: bứt tai, sốt, khó chịu, lãng tai, đôi khi bị tiêu chảy và nôn Ở giai đoạn đầu, biểu hiện của bệnh viêm tai giữa không rõ rệt, trẻ không sốt, không đau tai, rất ít khi có ù tai, không chảy dịch ở tai Triệu chứng duy nhất là trẻ bị nghễnh ngãng nên các bà mẹ thường hay bỏ qua và cho rằng trẻ thiếu tập trung Khi chuyển sang giai đoạn mạn tính mới có hiện tượng chảy mủ tai Vì vậy, giai đoạn này trẻ sốt cao 39-40oC, quấy khóc nhiều, trẻ bé thường bỏ bú, kém ăn, nôn trớ, đi ngoài, co giật, lấy tay dụi vào tai…, cần đưa trẻ đi khám và điều trị Nếu được phát hiện

sớm, thầy thuốc sẽ chủ động chích rạch dẫn lưu hoặc sau khi vỡ mủ được điều trị cẩn thận thì bệnh sẽ khỏi sau 1-2 tuần, không để lại di chứng Viêm tai giữa cấp ở trẻ nhỏ có thể gây thủng màng nhĩ, làm tiêu xương, gián đoạn chuỗi xương con… ảnh hưởng đến sức nghe của trẻ Trẻ bị nghe kém, nhất là từ khi chưa phát triển lời nói, sẽ dẫn đến rối loạn ngôn ngữ (nói ngọng, nói không rõ âm, từ…) làm giảm sút nghiêm trọng chất lượng giao tiếp xã hội sau này của trẻ Nặng hơn nữa là những biến chứng nhiễm trùng, nhiều khi ảnh hưởng đến tính mạng: viêm tai giữa cấp có thể dẫn đến những biến chứng sọ não cực kỳ nguy hiểm như viêm màng não, áp xe não do tai, viêm tắc tĩnh mạch bên, do viêm nhiễm lan từ trần hòm tai lên não hoặc gây liệt dây thần kinh mặt (dây số VII) [5, 142]

1.1.3.5 Nhiễm khuẩn huyết

Nhiễm khuẩn huyết là một bệnh nhiễm khuẩn cấp tính Trong quá trình xâm nhập các tổ chức, phế cầu khuẩn có thể vào máu gây nhiễm khuẩn huyết dẫn tới viêm màng não Bệnh thường có triệu chứng đa dạng, sốt cao thành cơn, mạch nhanh, thở nhanh, huyết áp có xu thế giảm, biểu hiện tổn thương ở nhiều cơ quan phủ tạng, xuất huyết phủ tạng, rối loạn chức năng gan…Sau đó dễ chuyển sang nhiễm khuẩn huyết nặng gây nhiều biến chứng nguy hiểm như: nhiễm khuẩn lan tràn, sốc nhiễm khuẩn để lại hậu quả xấu có thể dẫn tới tử vong [5]

Các yếu tố nguy cơ: Người già, trẻ sơ sinh, đẻ non; Người sử dụng thuốc ức chế miễn dịch, như sử dụng corticoid kéo dài, các thuốc chống thải ghép, hoặc đang điều trị hóa chất và tia xạ; Người bệnh có bệnh lý mạn tính, như tiểu đường, HIV/AIDS, xơ gan, bệnh van tim và tim bẩm sinh, bệnh phổi mạn tính, suy thận mạn tính; Người bệnh cắt lách, nghiện rượu, có bệnh máu ác tính, giảm bạch cầu hạt; Người bệnh có đặt các thiết bị hoặc dụng cụ xâm nhập như đinh nội tủy, catheter, đặt ống nội khí quản…

1.1.4 Dịch tễ học bệnh do phế cầu khuẩn

1.1.4.1 Tình hình mắc bệnh do phế cầu khuẩn trên thế giới

Streptococcus pneumoniae là tác nhân hàng đầu gây ra các nhiễm khuẩn nghiêm

trọng ở trẻ em và người lớn như viêm phổi, viêm màng não mủ và nhiễm khuẩn huyết

[129] Ở Mỹ, Streptococcus pneumoniae là căn nguyên quan trọng nhất gây viêm màng

não mủ ở trẻ dưới 5 tuổi, đồng thời là tác nhân gây bệnh thường gặp nhất của nhiễm trùng đường hô hấp Ước tính của Trung tâm Kiểm soát và Phòng chống Bệnh tật Hoa Kỳ (CDC, Hoa Kỳ) cho thấy hàng năm, ở trẻ em, có 5 triệu trường hợp viêm tai giữa, 13.000 trường hợp nhiễm khuẩn huyết, 700 trường hợp viêm màng não mủ, và 200 ca tử vong do

vi khuẩn Streptococcus pneumoniae Ở người lớn, mỗi năm, có 175.000 bệnh nhân phải

nhập viện do viêm phổi phế cầu, 50.000 trường hợp nhiễm khuẩn huyết, 3.000 - 6.000

trường hợp viêm màng não mủ Vi khuẩn S pneumoniae được xác định là căn nguyên gây

bệnh của 36% các trường hợp viêm phổi cộng đồng và 50% các trường hợp viêm phổi bệnh viện Nhiễm khuẩn huyết xuất hiện kèm theo ở 25 - 30% các ca viêm phổi do phế cầu, trong khi một phần tư số bệnh nhân viêm màng não mủ do phế cầu có kèm theo viêm phổi Tỉ lệ chết mắc do viêm phổi phế cầu là 5 - 7%, nhiễm khuẩn huyết là 20%, viêm màng não mủ là 30%, thường cao hơn ở nhóm người lớn tuổi và trẻ nhỏ [168]

Phân tích tổng hợp từ 40 nghiên cứu trên thế giới cho thấy, hàng năm, có 150 triệu trẻ mắc viêm phổi, 11-20 triệu trẻ phải nhập viện và 2 triệu trẻ em tử vong do viêm phổi

Dữ liệu mới nhất của UNICEF chứng minh rằng vi khuẩn S pneumoniae đóng vai trò gây

ra 50% các trường hợp tử vong ở trẻ em, trong đó gần 70% trường hợp tử vong đến từ các nước đang phát triển, chủ yếu là khu vực châu Phi và Đông Nam Á [129]

Viêm phổi vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở trẻ em dưới 5 tuổi trên toàn thế giới, gây ra hơn 900.000 trường hợp tử vong ở trẻ nhỏ, chiếm 15% trong tổng số trẻ

em tử vong năm 2013 [96] Streptococcus pneumoniae, là căn nguyên vi khuẩn phổ biến

nhất gây viêm phổi nghiêm trọng, giết chết một nửa triệu trẻ em mỗi năm trước khi bước sang sinh nhật lần thứ năm [169] Phế cầu khuẩn còn gây ra bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng não, và là căn nguyên hàng đầu gây viêm tai giữa Ngoài ra, phế cầu cũng là nguyên nhân chủ yếu gây mắc và tử vong ở người già [37] Vắc xin là một chiến lược quan trọng để bảo vệ trẻ em khỏi bệnh phế cầu, đặc biệt là ở châu Phi và châu Á, nơi 95% trường hợp tử vong phế cầu xảy ra [113] Tuy nhiên mức độ bảo vệ của vắc xin chủ yếu chỉ giới hạn ở trong những typ huyết thanh được bao phủ trong thành phần vắc xin

Kích thước hình tròn biểu thị số lượng trẻ chết do phế cầu: India (142 000), Nigeria (86 000), Ethiopia (57 000), Cộng hoà Congo (51 000), Afghanistan (31 000), China (30 000), Pakistan (27 000), Bangladesh (21 000), Angola (20 000), and Uganda (19 000) Hình 1.2 Mười nước có số lượng trẻ dưới 5 tuổi chết do phế cầu khuẩn lớn nhất [113] Mười quốc gia có số lượng và tỷ lệ mắc bệnh phổi cao nhất thuộc châu Á và châu Phi; chiếm 66% (44-88%) ca bệnh do phế cầu khuẩn trên toàn thế giới (Ấn Độ 27%, Trung Quốc 12%, Nigeria 5%, Pakistan 5%, Bangladesh 4%, Indonesia 3%, Ethiopia 3%, Congo 3%, Kenya 2%, và Philippines 2%) Trong số 14,5 triệu trường hợp bệnh do phế cầu khuẩn, 95,6% là viêm phổi, 3,7% viêm ngoài phổi, hội chứng viêm phổi xâm lấn không viêm màng não, và 0,7% viêm màng não [113]

Nhiễm trùng do S pneumoniae có thể dự phòng bằng vắc xin và điều trị bằng

kháng sinh thích hợp Từ năm 2007, WHO và Liên hiệp quốc phát động chương trình hành động qui mô toàn cầu “Mục tiêu Phát triển Thiên niên kỷ 4” (MDG4 - Millenium Development Goal 4) nhằm mục đích giảm đáng kể tỉ lệ tử vong ở trẻ đến năm 2015, trong đó viêm phổi là một mục tiêu quan trọng, nguyên nhân của 1/5 số ca tử vong của trẻ trên toàn thế giới [170]

1.1.4.2 Tình hình mắc bệnh do phế cầu khuẩn tại Việt Nam

Ở Việt Nam, tỉ lệ nhiễm trùng do S pneumoniae ước tính hàng năm ít nhất 48,7 trường hợp trên 100.000 trẻ [9] S pneumoniae đồng thời là căn nguyên hàng đầu gây nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não mủ S pneumoniae được phát hiện trong hơn 90%

Số trẻ chết do phế cầu khuẩn/100.000 dân

các trường hợp nhiễm khuẩn huyết và 55% trường hợp viêm màng não mủ ở 213 trẻ nghiên cứu [156]

Viêm phổi do phế cầu khuẩn là một trong những nguyên nhân chính gây ra tử vong

ở trẻ em và người già, đặc biệt ở những nơi có điều kiện sống thấp Trước đây khi chưa có kháng sinh, tỷ lệ tử vong/mắc tại các bệnh viện là 20- 40%, tỷ lệ này giảm còn 5-10% sau khi kháng sinh được sử dụng rộng rãi Nhưng đối với những trẻ suy dinh dưỡng, trẻ sinh thiếu tháng hoặc mắc các bệnh bẩm sinh khác như tim mạch, tiêu chảy cấp thì tỷ lệ vẫn ở khoảng 30%, thậm chí trên 50% Những bệnh nhân nghiện rượu và mắc các bệnh mạn tính khác thì cũng có tỷ lệ tương tự

Về sự phân bố typ huyết thanh, các nghiên cứu đã tiến hành ở Việt Nam cho thấy

typ huyết thanh S pneumoniae gây bệnh thường gặp nhất là 6, 14, 19F và 23F Nghiên

cứu của Christopher M.Parry trên khoảng 900 trẻ khỏe mạnh ở lứa tuổi từ 1 đến 16 tại 6 điểm nghiên cứu ở miền Nam Việt nam cho thấy tỷ lệ phân lập được phế cầu là 49,4% ở trẻ dưới 5 tuổi và 40,6% ở trẻ trên 5 tuổi Typ huyết thanh phế cầu nổi trội nhất là 14, 19

và 23 chiếm 67% ở trẻ dưới 5 tuổi và typ huyết thanh 6, 14, 18, 19 và 23 chiếm đến 70%

ở trẻ trên 5 tuổi [117] Trong một nghiên cứu khác cũng của Christopher M Parry xác định typ huyết thanh của 60 chủng phế cầu phân lập từ máu và dịch não tủy của bệnh nhân mắc bệnh do phế cầu xâm lấn nhập viện tại bệnh viện Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh, 68% số chủng có typ huyết thanh trùng với typ huyết thanh được bao phủ trong thành phần của vắc xin phế cầu, bao gồm 23F (38%), 14 (13,3%), 19F; 18C (5%), 1; 3; 6A; 6B (1.6%) Tương tự, nghiên cứu của Đặng Đức Anh ở bệnh nhi dưới 5 tuổi bị viêm phổi nhập viện tại Bệnh viện Nhi Hải Phòng, tỷ lệ phân lập được phế cầu là 26,3% với typ huyết thanh nổi trội là 19F và 23F, 82% số chủng có typ huyết thanh trùng với typ huyết thanh có trong thành phần của vắc xin phế cầu, bao gồm 19F (29,8%), 23F (21,4%),

14 (13,1%), 6B (13,1%), 15B (2,4%), 11A (2,4%) Các typ huyết thanh gây bệnh ít gặp là 19A, 23A và 9V với tỉ lệ là 2%-3% Có 9(11%) số chủng không định được typ huyết thanh Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu này là kỹ thuật phồng vỏ Quellung [65, 111, 160]

Về tình trạng kháng kháng sinh, cũng trong nghiên cứu tại Bệnh viện Nhi Hải Phòng năm 2006-2007, thực hiện kỹ thuật MIC để xác định tình trạng kháng kháng sinh của 80

chủng S pneumoniae phân lập từ dịch tỵ hầu cho thấy 74% kháng penicillin ở mức trung

gian và 3% kháng hoàn toàn Có 75% số chủng đa kháng kháng sinh, 100% kháng với cotrimoxazole, 71% kháng với erythromycin và 58% kháng cefuroxime Các chủng đều nhạy cảm với amoxicillin, cefotaxime, cefepime, ofloxacin [65] Nghiên cứu của Christopher M Parry và cộng sự về tình trạng kháng kháng sinh tại miền Nam, Việt Nam cho thấy 34% số chủng kháng trung gian với penicillin, 19% kháng hoàn toàn 13% kháng trung gian với ceftriaxone, 1% kháng hoàn toàn Hơn 40% số chủng phân lập từ bệnh nhi sống ở thành thị kháng với erythromycin, trimethoprim-sulfamethoxazole, chloramphenicol và tetracycline [117] Một số nghiên cứu về kháng kháng sinh tại bệnh

viện Bạch Mai và BVĐK Khánh Hoà cho thấy, các chủng S pneumoniae nhạy cảm với

penicillin thì tỷ lệ kháng với kháng sinh khác thấp như kháng tetraxycline là 20%, erythromycin là 2% và co-trimoxazole là 10%; những chủng kháng penicillin thường kết hợp với đa kháng nhiều loại kháng sinh khác, tỷ lệ kháng lên tới từ 50 đến 100% [7, 8]

Tỷ lệ kháng kháng sinh tại Khoa Hô hấp Bệnh viện Nhi Trung ương năm 2002-2003 ở trẻ dưới 5 tuổi, nhiễm trùng hô hấp cấp cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh macrolide rất cao, có

tới 90% số chủng S pneumoniae kháng erythromycin [4]

1.1.5 Dự phòng và điều trị

1.1.5.1 Vắc xin phòng bệnh do phế cầu khuẩn

Nhiễm phế cầu khuẩn là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, đặc biệt ở trẻ em ở các nước đang phát triển và kém phát triển Các bệnh do phế cầu có thể phòng tránh được và theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), tiêm chủng được xem là biện pháp chủ động, tiết kiệm và có tầm ảnh hưởng quan trọng giúp giảm số ca bệnh mắc mới do nhiễm phế cầu khuẩn Tiêm chủng cho trẻ từ sớm sẽ giúp giảm thiểu tác hại của các căn bệnh do phế cầu gây ra Sản xuất vắc xin phòng bệnh phế cầu dựa trên

kháng nguyên polysaccharide nằm ở vỏ tế bào vi khuẩn S pneumoniae Có ít nhất 93 typ huyết thanh khác nhau của S pneumoniae được xác định dựa trên phản ứng ngưng kết

giữa kháng thể kháng với kháng nguyên vỏ polysaccharide Mặc dù chỉ có một số giới

hạn các typ huyết thanh thường xuyên phân lập được từ bệnh nhân nhiễm phế cầu khuẩn, nhưng việc phát triển loại vắc xin vỏ polysaccharide có khả năng phòng tất cả các typ huyết thanh phế cầu vẫn bị hạn chế do sự đặc hiệu của kháng thể, sự biến đổi của các typ huyết thanh lưu hành ở các khu vực địa lý hoặc quần thể dân cư khác nhau

Vắc xin liên hợp 7-valent (PCV7) phòng bệnh phế cầu cho trẻ dưới 2 tuổi được áp dụng từ năm 2000 Sau đó, để mở rộng khả năng bảo vệ, vắc xin 10 giá (PCV10) và 13 giá (PCV13) lần lượt được cấp phép từ năm 2009 và 2010 Tất cả các vắc xin này tạo ra

phản ứng miễn dịch chống lại sự nhiễm trùng S pneumoniae với các typ huyết thanh có

trong công thức của mỗi loại vắc xin [112, 151]

Vắc xin PPSV23 (23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine), chứa 23 typ huyết thanh vỏ phổ biến, chiếm tới 88% số trường hợp mắc bệnh viêm phổi xâm lấn (Invasive Pneumococcal Disease - IPD), được phát triển năm 1983 [23] PPSV23 tạo ra đáp ứng miễn dịch độc lập tế bào T và có hiệu lực phòng ngừa từ 56% - 81% trong các thử nghiệm lâm sàng [24] Vắc xin này có hiệu quả nhất ở người lớn, nhưng không hiệu quả ở trẻ em dưới hai tuổi

Thành công của việc triển khai vắc xin Haemophilus influenzae typ b đã dẫn tới

nhu cầu phát triển một loại vắc xin cộng hợp phế cầu (PCV7) để bảo vệ chống lại 7 loại

typ huyết thanh của S pneumoniae (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, và 23F) cho gần 80%

trường hợp viêm phổi xâm lấn (IPD) ở trẻ nhỏ tại Hoa Kỳ [172] Vắc xin này được cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ cấp phép năm 2000 và khuyến cáo sử dụng ở trẻ em dưới hai tuổi [172] Không giống như PPSV23, PCV7 tạo ra đáp ứng miễn

dịch phụ thuộc tế bào T và rất hiệu quả trong việc kiểm soát nhiễm khuẩn do S

pneumoniae Kết quả sử dụng PCV7 làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc viêm phổi xâm lấn IPD

và viêm tai giữa ở trẻ được tiêm chủng [16, 40, 123, 162]

Qua miễn dịch tự nhiên, tiêm chủng PCV7 cũng làm giảm tỷ lệ nhiễm phế cầu trong cộng đồng và viêm phổi xâm lấn trong quần thể không tiêm chủng [25, 75] Tuy nhiên, hiệu lực của vắc xin PCV7 đã tạo ra một thách thức mới đó là sự gia tăng các chủng phế cầu có typ huyết thanh không chứa trong vắc xin ở bệnh nhi [25, 47, 59, 119]

Để mở rộng độ bao phủ, vắc xin bao gồm nhiều serotypes hơn lần lượt được cấp phép sử dụng: năm 2009 là vắc xin PCV 10-valent (PCV10) chứa 3 typ huyết thanh bổ sung (1, 5 và 7F) và năm 2010 là PCV 13-valent (PCV13) chứa 6 serotypes bổ sung (1, 3,

4, 6B, 9V,

14, 18C, 19F, 23F

1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F

1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F

Vắc xin PCV7, PCV10, và PCV13 đã lần lượt đưa vào triển khai áp dụng ở các nước/lãnh thổ khu vực châu Á Hiệu quả bảo vệ tại các khu vực này chưa công bố nhưng được ước tính dựa trên độ bao phủ các typ huyết thanh Sự phân bố typ huyết thanh của

S.pneumoniae và độ bao phủ typ huyết thanh trong vắc xin PCV7 và PCV13 ở một số

quốc gia khu vực châu Á đã được công bố Tuy nhiên, hầu hết các bài báo đều từ các nghiên cứu riêng lẻ hoặc do sự hợp tác của các bệnh viện [151] Các số liệu giám sát quốc gia chỉ nhận được ở một số nước nhất định Do vậy rất khó để có những thông tin tổng hợp bởi sự giữa các bài báo lại khác nhau ở cỡ mẫu, thời gian nghiên cứu, khu vực địa lý, tình trạng y tế và quần thể nghiên cứu

Tại Việt Nam hiện nay có 2 loại vắc xin đang được sử dụng: đó là PCV10 và PPSV23 PCV10 ngoài công dụng chính còn có công dụng phụ là ngừa viêm phổi, viêm tai giữa Tiêm cho trẻ em từ 2 tháng đến 5 tuổi (2-4 mũi tuỳ tuổi) PPSV23 - Pneumo23: không có công dụng phụ như trên, nhưng ngừa thêm được 13 chủng nữa, được sử dụng cho người già (PPSV23 chỉ tiêm 1 mũi) Vắc xin phế cầu hiện nay chỉ được sử dụng trong tiêm chủng dịch vụ, chưa được sử dụng trong chương trình tiêm chủng cho trẻ Vắc xin

PCV10 đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng và dự kiến sẽ được áp dụng tiêm rộng rãi cho trẻ trong chương trình tiêm chủng mở rộng tại Việt Nam

1.1.5.2 Điều trị

Điều trị viêm phổi và các bệnh viêm đường hô hấp khác do vi khuẩn ở trẻ em bắt buộc phải dùng kháng sinh sau đó là các điều trị hỗ trợ khác Việc lựa chọn kháng sinh trong điều trị lý tưởng nhất là dựa vào kết quả nuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ để lựa chọn kháng sinh thích hợp Bên cạnh đó việc lựa chọn kháng sinh trong điều trị viêm phổi ở trẻ em còn chủ yếu dựa vào đặc điểm lâm sàng, lứa tuổi, tình trạng miễn dịch, mức

độ nặng nhẹ của bệnh cũng như tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh đối với từng khu vực, thời gian cụ thể [5] Các kháng sinh được Bộ Y tế khuyến cáo sử dụng trong điều trị viêm phổi ở trẻ em hiện nay là nhóm beta-lactam như benzyl penicillin, ampicillin, amoxycilin, một số kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ thứ 2 và 3 như ceftriaxon, cephalothin, cefuroxime, hoặc khác sinh nhóm khác như macrolid (azithromycin…), nhóm quinolon [2, 5] Các bác sĩ cũng có thể cho sử dụng kháng sinh phối hợp trong những trường hợp bệnh nặng mà không chờ được kết quả xét nghiệm vi sinh, người suy giảm sức đề kháng, nhiễm khuẩn do nhiều loại vi khuẩn khác nhau Tuy nhiên tác dụng không mong muốn do phối hợp kháng sinh lại thường gặp hơn, vì vậy cần thận trọng và giám sát tốt người bệnh khi kê đơn kháng sinh [2] Ngày nay, việc sử dụng rộng rãi, kéo dài và lạm dụng, chưa hợp lý, không an toàn nên tình trạng kháng kháng sinh của các vi sinh vật ngày một gia tăng Mức độ kháng thuốc ngày càng trầm trọng làm ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị, tiên lượng xấu, nguy cơ tử vong cao Để điều trị có hiệu quả và ngăn ngừa khả năng phát sinh các chủng vi khuẩn kháng thuốc cần tôn trọng chẩn đoán vi sinh, điều trị theo kết quả kháng sinh đồ và tuân thủ nguyên tắc điều trị kháng sinh

1.2 YẾU TỐ ĐỘC LỰC VÀ TYP HUYẾT THANH CỦA VI KHUẨN Streptococcus

pneumoniae

1.2.1 Độc tố vi khuẩn và cấu trúc kháng nguyên

Các yếu tố độc lực của S pneumoniae gồm 2 loại chính: Polysaccharides và Protein

(protein bề mặt, các protein bài tiết và protein tế bào chất)

Hình 1.3 Yếu tố độc lực của S pneumoniae [142]

1.2.1.1 Độc tố protein

*PspA: Protein A trên bề mặt tế bào vi khuẩn (Pneumococcal surface protein A) PspA đa hình thái, có kích thước thay đổi từ 67-99 kDa Sự thay đổi này là do gen mã hoá PspA có kiểu gen khảm xuất hiện do sự tái tổ hợp cho phép chuyển gen ngang PspA được gắn trên bề mặt tế bào nhờ các polysaccharide thành tế bào (CWPS) thông quan liên kết chặt chẽ giữa choline và protein Vai trò chính của PspA là để ngăn chặn sự gắn kết của bổ thể C3b, do đó ức chế cả hai quá trình opsonin hoá và thực bào của vi khuẩn PspA giúp phế cầu bám dính vào tế bào biểu mô phế quản, tạo điều kiện cho sự xâm lấn sâu hơn xuống đường hô hấp dưới PspA còn liên kết với lactoferrin [68]

*PspC: Protein C trên bề mặt tế bào vi khuẩn (Pneumococcal surface protein C) còn được gọi là CbpA, SpsA và PbcA PspC là một choline khác gắn protein, có kích thước

75 kDa PspC nhận diện axit sialic trên tế bào biểu mô và do đó gián tiếp bám dính vào tế bào chủ Ngoài ra, PspC còn liên kết với kháng thể IgA và yếu tố H [33]

Vỏ polysaccharide

Kháng nguyên F

Yếu tố H

Thành tế bào

*Autolysin (LytA) có kích thước 36 kDa, nằm trong lớp màng ngoài LytA là enzyme N-acetylmuramoyl-Lalanine amidase, có vai trò phân giải các lớp peptidoglycan của thành tế bào dẫn đến ly giải tế bào phế cầu Tế bào sau khi bị ly giải sẽ giải phóng ra độc tố bào tương, pneumolysin LytA được hoạt hoá bởi mật dẫn đến tính chất tan trong muối mật của phế cầu khuẩn được ứng dụng để thực hiện các thử nghiệm xác định [142]

* Pneumolysin là protein có kích thước 53kDa, là độc tố nội bào được giải phóng nhờ sự ly giải của autolysin LytA LytA gắn cholesterol vào tất cả các tế bào chủ và tạo nên các lỗ chuyển màng dẫn đến ly giải tế bào chủ [49] Pneumolysin phá huỷ tế bào nội

mô phổi, phá vỡ hàng rào nội mô ngăn cách phế nang và máu, do đó phế cầu có thể tràn

từ các phế nang vào máu, là nguyên nhân dẫn tới các triệu chứng nặng như khởi phát đột ngột rầm rộ, phù quink não, đông máu nội mạch rải rác

* Neuraminidase: Ở S pneumoniae có 2 enzyme neuraminidases là NanA (108 kDa)

và NanB (75 kDa) Neuraminidase là enzyme sialidase tách đầu axit sialic khỏi glycolipids, glycoprotein và oligosaccharides trong chất nhầy và trên bề mặt tế bào [15]

* PsaA: Protein bám dính bề mặt phế cầu khuẩn PsaA là một lipoprotein ngoại bào liên kết màng tế bào Có vai trò vận chuyển ion Mg đi vào trong tế bào

* IgA1: Enzym phân huỷ IgA là một enzyme protease gắn kẽm liên kết đặc hiệu vào

tế bào miễn dịch người A1 (immunoglobulin A1-IgA1) giúp phế cầu tránh được tác động của kháng thể IgA để tồn tại được ở hầu họng IgA1 chiếm hơn hơn 90% IgA trong đường thở của người [83]

1.2.1.2 Độc tố polysaccharide

* CPS: Các polysaccharide vỏ

Vỏ của phế cầu là yếu tố độc lực quan trọng và có tính quyết định trong bệnh sinh, giúp vi khuẩn tồn tại và phát triển để gây bệnh: Vỏ polysacharide là yếu tố bảo vệ vi khuẩn tránh được sự thực bào bởi các tế bào bạch cầu của cơ thể vật chủ, tạo điều kiện cho vi khuẩn tồn tại, nhân lên trong tổ chức vật chủ và sinh bệnh Phức hợp polysacharide

vỏ phế cầu có thành phần là: glucose, 2-acetamido-2,4,6-trideoxy galactose, galactosamine, ribitolphosphate và cholinphosphate [5]

Các CPS tạo thành lớp vỏ ngoài cùng dày khoảng 200-400 nm, bao bọc tế bào vi

khuẩn S pneumoniae Vỏ được gắn cộng hóa trị với bề mặt ngoài của thành tế bào

peptidoglycan Hơn 90 kiểu lớp vỏ CPS đã được xác định về cấu trúc và typ huyết thanh [116] Sự tạo thành vỏ là yếu tố độc lực không thể thiếu của phế cầu khuẩn chống lại hiện tượng thực bào mạnh mẽ đối với cơ thể chưa có đáp ứng miễn dịch Mặc dù những chủng phế cầu không có vỏ thường liên quan đến nhiễm khuẩn đường hô hấp trên, triệu chứng nhẹ Những chủng phân lập từ những vị trí vô trùng khác gây nhiễm khuẩn xâm lấn thường có vỏ Biến thể không có vỏ của những chủng này phần lớn là không có độc tính Tuy nhiên nó có thể gây nhiễm khuẩn xâm lấn đối với bệnh nhân suy giảm miễn dịch [98] Các typ huyết thanh vỏ CPS đều tích điện cao ở điều kiện pH sinh lý, điều này giúp

vi khuẩn có vỏ trực tiếp ngăn cản sự tương tác với đại thực bào Hầu hết các cấu trúc CPS đơn là một polymer mạch thẳng với các đoạn lặp lại gồm ít nhất hai monosaccharide Các cấu trúc CPS phức tạp hơn sẽ phân nhánh và các đoạn lặp lại chính bao gồm từ 1 đến 6 monosaccharide và các chuỗi bên bổ sung Các typ huyết thanh được phân biệt bởi sự khác nhau về cấu trúc hóa học của CPS và khả năng hệ thống miễn dịch nhanh chóng nhận diện các thành phần cấu trúc khác nhau và đáp ứng bằng các kháng thể đặc hiệu chống lại các kháng nguyên của mỗi typ [142]

Có hai kiểu danh pháp khác nhau để gọi tên các typ huyết thanh là hệ thống của Đan Mạch và của Mỹ Chẳng hạn như hệ thống Đan Mạch typ huyết thanh 10A lại tương đương với typ 34 của Mỹ Hệ thống của Đan Mạch dựa trên các phản ứng chéo các typ huyết thanh khác nhau vì thế các kiểu typ có phản ứng chéo được xếp vào một nhóm chung, các typ riêng biệt trong nhóm được ký hiệu bằng chữ cái Trong hệ thống của Mỹ, các typ huyết thanh được đánh số tuần tự theo thứ tự phát hiện, việc đặt tên như này sẽ không phân biệt được các nhóm có phản ứng chéo giữa các typ huyết thanh với nhau Chính vì thế hệ thống gọi tên của Đan Mạch được sử dụng rộng rãi hơn Các công thức kháng nguyên sử dụng trong kỹ thuật phồng vỏ Quellung cũng được gọi tên theo hệ thống này [61]

* CWPS: Polysaccharide thành tế bào (Cell wall polysaccharide, axit teichoic):

Các chủng S pneumoniae độc tính hay không độc đều có một cấu trúc CWPS

chung Cấu trúc CWPS bao gồm một phân tử tetrasaccharide nối với nhau thông qua ribotol-phosphate diester và một hoặc hai phosphocholine CWPS và CPS liên kết cộng hóa trị với peptidoglycan thành tế bào, đây cũng là một trở ngại trong quá trình tinh sạch

do khó tách được các CPS ra khỏi các CWPS [141] CWPS là một kháng nguyên có mặt

ở tất cả các typ huyết thanh của phế cầu khuẩn Do vậy kháng nguyên CWPS được sử dụng để làm yếu tố phủ bản trong quá trình sản xuất các kit sinh phẩm chẩn đoán phế cầu khuẩn bằng kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (ELISA)

* Kháng nguyên F: Tất cả các chủng phế cầu (cả chủng độc tính hay không độc tính) đều có một polysaccharide như nhau được gọi là kháng nguyên F Kháng nguyên F có bản chất là axit lipoteichoic với phần polysaccharide có trình tự lặp lại CWPS Đây là phần liên kết với một gốc diacylated glycerol thông qua glucose [141]

1.2.1.3 Cấu trúc kháng nguyên

Cấu trúc kháng nguyên liên quan tới phân loại và độc lực: S pneumoniae có hai loại

kháng nguyên chính là kháng nguyên thân, bản chất là protein và kháng nguyên vỏ, bản

chất là polysaccarit Vỏ polysaccarit của S pneumoniae là yếu tố giúp vi khuẩn chống lại

thực bào bởi các đại thực bào, tạo điều kiện để vi khuẩn tồn tại, phát triển và gây bệnh

1.2.2 Các typ huyết thanh của vi khuẩn S pneumoniae

Vỏ polysaccharid của Streptococcus pneumoniae là cơ sở duy nhất cho sự phân

loại typ huyết thanh và là yếu tố độc lực duy nhất được biết Sự phân bố các typ huyết thanh thay đổi theo tuổi, khu vực địa lý và thời gian Các nghiên cứu ở Mỹ và châu Úc cho thấy hơn 80% các typ huyết thanh lưu hành trong khu vực là 6A, 6B, 9V, 14, 18C, 19F và 23F, trong khi mức độ phổ biến của chúng là dưới 50% ở châu Âu và các nước châu Á [136] Trong khi typ huyết thanh 1 và 5 chủ yếu gây nhiễm trùng xâm nhập cho trẻ em thì typ 3 lại thường gây bệnh ở người lớn [43] Thêm vào đó, có mối liên quan

giữa typ huyết thanh và tình trạng kháng các kháng sinh của vi khuẩn S pneumoniae Các

typ huyết thanh 6A, 6B, 9V, 14, 19A, 19F và 23F thường kết hợp với đa kháng kháng

sinh ở hầu hết các quốc gia trên thế giới Các nước ở khu vực châu Á như Hàn Quốc, Hồng Kông, Đài Loan và Nhật Bản có mức độ kháng kháng sinh cao nhất trên thế giới [60]

1.2.2.1 Vai trò của lớp vỏ polysaccharide

Cấu trúc hóa học của polysaccarit vỏ đóng vai trò quan trọng cho tính mãnh độc của

vi khuẩn và có tính chất quyết định trong bệnh sinh Vỏ giúp phế cầu tránh được sự thực bào, do đó phế cầu có thể tồn tại và nhân lên trong tổ chức của vật chủ Nhưng vỏ có khả năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu loài, kháng thể này có tính bảo vệ cơ thể vật chủ thông qua việc thúc đẩy hiện tượng thực bào, tăng khả năng giết vi khuẩn ngay ở bên trong tế bào bạch cầu đa nhân Ở các loài có vỏ thường có sự biến đổi về kháng nguyên

và biểu hiện một trong nhiều polysaccharide vỏ có đặc điểm hóa miễn dịch đặc trưng và

được định nghĩa là các typ huyết thanh [13] Hiện nay đã xác định được trên 90 typ huyết

thanh tương ứng với các kháng nguyên polysaccarit vỏ nhưng chỉ có trên 20 typ phổ biến gây bệnh thường gặp Trong mỗi nhóm được đánh số thứ tự, có 9 phân nhóm typ huyết thanh, được ghi theo thứ tự bằng chữ cái in hoa từ A đến I

Vai trò quan trọng của lớp vỏ là giúp phế cầu có thể tồn tại trong máu và liên quan chặt chẽ đến khả năng phế cầu gây các bệnh xâm lấn Lớp vỏ được bộc lộ ở bề mặt ngoài của vi khuẩn, kháng thể kháng CPS tạo ra hàng rào bảo vệ chống lại bệnh do phế cầu Do vậy, vắc xin polysaccharide đa giá phòng phế cầu khuẩn đã được phát triển, trong đó CPS

từ các typ huyết thanh phổ biến liên quan đến bệnh thể xâm lấn ở trẻ em được kết hợp với một chất mang protein Vắc xin polysaccharide cộng hợp bảy giá (PVC7) đã được thiết kế sản xuất và cho thấy có hiệu quả cao [17] Một loại vắc xin polysaccharide 23 giá cho người lớn cũng đã có mặt trên thị trường [124]

1.2.2.2 Điều hòa sinh tổng hợp các CPS

Ngoại trừ các typ 3 và 37, được tổng hợp bằng con đường tổng hợp (synthase) [159], thì các CPS khác được tổng hợp bằng con đường phụ thuộc Wzx/Wzy Các gen ở

con đường thứ hai có cùng một locus cps trên nhiễm sắc thể, giữa dexB và aliA [46] CPS

được tổng hợp bằng cách chuyển một monosaccharide phosphate đầu tiên từ một phân tử