Nghiên cứu khả năng chống oxi hóa, kháng viêm của cao chiết thực vật lấy từ một số bài thuốc trị gout của người việt trên dòng tế bào RAW

Do đó, chúng tôi thực hiện nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng chống oxi hóa, kháng viêm của cao chiết Thực vật lấy từ một số bài thuốc trị Gout của người Việt trên dòng tế bào RAW” nhằm: -

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CỦA NGƯỜI VIỆT TRÊN DÒNG TẾ BÀO RAW

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS ĐỖ MINH HÀ

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Minh Hà - người thầy đã luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và

thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Trịnh Hồng Thái, các thầy

cô và các bạn học viên, sinh viên đang làm việc và học tập, đặc biệt là các nhóm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Proteomic và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzyme và Protein, tại Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, ThS Bùi Thị Vân Khánh và Bộ môn Sinh học Tế bào và Trung tâm Khoa học sự sống, Khoa sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn

Tôi xin cảm ơn toàn thể các anh chị và các bạn học viên lớp K25 cao học Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Tôi cũng xin cảm ơn GS Kihara Takanori, trường Đại học Kitakuyshu (Nhật Bản) đã hỗ trợ việc nuôi cấy tế bào

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Hà Nội trong đề tài mã

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 5

Chương 1- TỔNG QUAN 6

1.1 Bệnh gout 6

1.2 Polyphenol, Phenolic acid trong điều trị gout 11

1.3 Điều trị Gout trong y học cổ truyền 13

1.4 Mô hình bệnh gout trên dòng tế bào RAW 264.7 23

Chương 2- VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 Vật liệu 27

2.2 Phương pháp 29

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Tối ưu hóa quy trình chiết 40

3.2 Xác định các thành phần có trong dịch chiết bằng TLC 43

3.3 Kết quả HPLC và thu các phân đoạn 44

3.4 Đánh giá khả năng chống oxi hóa của các dịch chiết 46

3.4 Thử nghiệm khả năng kháng viêm của các dịch chiết trên dòng tế bào RAW 264.7 49

3.5 Sự thay đổi trạng thái sinh lý chuột khi gây bệnh 56

3.6 Tình trạng stress oxi hóa của các nhóm chuột 58

KẾT LUẬN 61

KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Cơ chế gây viêm thông qua tinh thể MSU [14] 8

Hình 2: Cơ chế tác động của các thuốc điều trị gout [13] 10

Hình 3: Phân loại các chất thuộc lớp phenols 12

Hình 4: Gnetum parvifolium [2] 16

Hình 5: Perilla ocymoides L [2] 18

Hình 6: Piper lolot C.DC [2] 20

Hình 7: Homalomena aromatica [2] 21

Hình 8: Smilax glabra [2] 22

Hình 9: Morus alba L [2] 23

Hình 10: Tế bào RAW 264.7 ở mật độ thấp [6] 24

Hình 11: Bản sắc ký TLC 31

Hình 12: Phổ hấp thụ dịch chiết tía tô sau các lần chiết 1 (a), 2 (b), 3 (c) và 4 (d) 41

Hình 13: Phổ hấp thụ của dịch chiết thổ phục linh sau 4 giờ (a), 8 giờ (b), 16 giờ (c), 24 giờ (d) 42

Hình 14: Sắc ký bản mỏng một số dịch chiết thu được 43

Hình 15: Đồ thị HPLC của dịch chiết dây gắm với Ethanol 45

Hình 16: Kết quả sắc ký TLC với các cao dịch chiết và dịch chiết ban đầu 49

Hình 17: Ảnh hưởng của cao dịch chiết lên tế bào RAW 264.7 52

Hình 18: Giá trị LC50 của tế bào khi thử các cao dịch chiết 52

Hình 19: Biểu hiện IL-1β của tế bào khi thử các dịch chiết 55

Hình 20: Hình thái chân chuột trước (a) và sau khi tiêm (b) 58

Hình 21: Biến động lượng MDA ở mô gan (a) và màng hồng cầu (b) ở các nhóm chuột 60

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Tóm tắt thành phần các bài thuốc điều trị Gout 15

Bảng 2: Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 27

Bảng 3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 29

Bảng 4: Gradient nồng độ dung môi chạy HPLC 32

Bảng 5: Các nhóm chuột thử nghiệm thuốc 36

Bảng 6: Một số các phân đoạn dịch chiết sau HPLC 45

Bảng 7: Khả năng chống oxi hóa của các dịch chiết 48

Bảng 8: Biểu hiện IL-1β ở các nhóm tế bào 53

Bảng 9: Thay đổi cân nặng chuột trước và sau tiêm 57

Bảng 10: Sự thay đổi kích thước chân giữa các nhóm chuột 57

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Gout là một bệnh chuyển hóa thường gặp ở nam giới, gây ra các cơn đau dữ dội

ở vùng khớp, kèm theo đó các triệu chứng như sưng đỏ ở các khớp ngón Ở giai đoạn muộn, bệnh có thể dẫn đến nhiều biến chứng nguy hiểm đến sức khỏe như tiểu đường, các bệnh về giác mạc, mất hoạt động chức năng khớp

Bệnh do sự bất thường trong bài tiết uric acid dẫn đến sự tăng uric acid huyết và hình thành các tinh thể monosodium urate (MSU) tại các khớp Các tinh thể này dẫn đến sự đáp ứng miễn dịch của các tế bào bạch cầu trung tính mà chủ yếu là

sự tăng cường biểu hiện của các cytokin như Interleukin-1beta (IL-1β), IL-18 Các thuốc điều trị Gout hiện nay đa phần đều là những thuốc kháng viêm phổ rộng, không có tính đặc hiệu cao và thường có những tác dụng phụ như suy giảm chức năng thận, gan và hệ miễn dịch Do đó, chúng tôi thực hiện nghiên cứu:

“Nghiên cứu khả năng chống oxi hóa, kháng viêm của cao chiết Thực vật lấy từ một số bài thuốc trị Gout của người Việt trên dòng tế bào RAW” nhằm:

- Tạo cao, tách chiết và phân tích một số thành phần có trong dịch chiết của một

số vị thuốc Nam được sử dụng trong điều trị gout;

- Thử nghiệm đánh giá khả năng chống oxi hóa, ức chế cytokine IL-1β của cao chiết một số vị thuốc Nam trên dòng tế bào RAW và trên dòng chuột đực Swiss trắng

Nghiên cứu này được thực hiện tại các phòng Thí nghiệm thuộc Trung tâm Khoa học Sự sống, BM Tế bào học, BM Sinh lý học và Sinh học người – Khoa Sinh học và tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc, thuộc Hệ thống Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein (KLEPT), đại học Khoa học

Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Bệnh gout

1.1.1 Định nghĩa và dấu hiệu lâm sàng

Gout là tính trạng rối loạn chuyển hóa gây ra các cơn đau bất chợt và gây đỏ ở các khớp, đặc biệt là các khớp ngón Nguyên nhân chính gây ra bệnh là do nồng

độ uric acid trong máu tăng cao, có thể hình thành các tinh thể monosodium urate (MSU), chính các tinh thể này tích tụ trong các khớp ngón, dẫn tới tính trạng viêm và đau nhức, trạng thái này được gọi là tăng uric acid huyết (hyperuricemia) [36] Ở các động vật khác không thuộc bộ linh trưởng, lượng uric acid (UA) trong máu được điều hòa thông qua enzyme uricase, giúp phân giải UA thành allantoin và có thể được bài tiết qua đường nước tiểu Tuy nhiên,

ở các động vật linh trưởng, trong đó có con người thì gen mã hóa cho enzyme uricase bị bất hoạt, làm cho UA trong máu không thể chuyển hóa và dễ hình thành các tinh thể ở khớp [10] Bên cạnh đó, tình trạng này còn do quá trình hoạt động chức năng quá mức của gan và sự mất khả năng bài tiết của thận Tuy nhiên, cũng có các yếu tố khác tham gia vào quá trình hình thành bệnh Rất nhiều bệnh nhân bị tăng uric acid huyết nhưng không phát triển thành bệnh gout Thống kê cho thấy chỉ có 5% số bệnh nhân có lượng uric acid huyết thanh SUA lớn hơn 9 mg/dL tiến triển thành bệnh [15]

1.1.2 Cơ chế phân tử của bệnh

Như đã nói ở trên, bệnh gout là trạng thái bệnh lý do các tinh thể MSU tích tụ tại hoạt dịch khớp, gây sưng đỏ ở khớp và đau cho bệnh nhân Quá trình sưng đau này là đáp ứng lại sự hình thành của tinh thể MSU của các tế bào bạch cầu trong hoạt dịch khớp, gây nên trạng thái viêm, sưng, đỏ, đau cho bệnh nhân

- Tế bào gây viêm

Loại tế bào gây viêm được nghiên cứu chủ yếu trên đối tượng bệnh nhân Gout là các dòng tế bào bạch cầu, cụ thể là bạch cầu trung tính, đại thực bào Các tinh thế MSU có thể kích thích bạch cầu trung tính sản sinh ra các enzyme từ

lysosome và bào tương để gây chết tế bào Các nghiên cứu in vitro cho thấy, tinh

thể MSU có thể kích thích giải phóng enzyme ở lysosome bằng cách phá vỡ màng lysosome [18] Bạch cầu trung tính không chỉ tấn công vị trí viêm bằng các yếu tố như cytokine, chemokine mà còn thông qua các yếu tố điều hòa quá trình viêm như IL-1β, IL-8, CXCL-1 và yếu tố kích thích ngưng kết bạch cầu hạt [37]

- Chức năng của yếu tố gây viêm NLRP3 đối với bệnh Gout

Martinon và cs đã chứng minh rằng yếu tố gây viêm NLRP3 có thể tham gia vào

sự nhận biết tinh thế MSU và hoạt hóa các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh Các thí nghiêm trên chuột đã cho thấy yếu tố gây viêm NLRP3 có thể có liên quan đến các cơn đau ở gout cấp tính Đối với các các tinh thể CPPD, yếu tố gây bệnh gout giả,cũng cho kết quả tương tự Mặc dù rất nhiều con đường sinh học liên quan đến Gout đã được làm sáng tỏ, nhưng cơ chế khiến tinh thể MSU có thể hoạt hóa yếu tố viêm NLRP3 vẫn chưa được làm rõ và rất có thể, con đường này còn được trung gian bởi nhiều loại protein [30]

Quá trình gây viêm bằng MSU cần thông qua NLRP3 imflammasome là một chuỗi các phản ứng Đầu tiên, tinh thể MSU được các thụ thể đặc hiệu với nó phát hiện, ví dụ như họ thụ thể Toll-like (TLRs) Khi đi vào trong tế bào, các tinh thể này sẽ kích thích yếu tố gây viêm NLRP3, đây là một phức hợp protein bao gồm domain cảm biến LRR ở đầu C, domain bám nucleotide ở giữa (NACHT), và PYD ở đầu N Kết quả của phản ứng này là sự oligomer hóa NLRP3 và biến procaspase-1 thành caspase-1 Caspase-1, đến lượt mình biến đổi các proIL-1 thành IL-1β được hoạt hóa Sau khi được giải phóng vào dịch khớp, IL-1β kích hoạt thụ thể IL-1 trên tế bào nội mô và thực bào, kích hoạt các con đường tín hiệu, điều hòa biểu hiện gen và dẫn tới sự tiết ra các cytokine tiền viêm và chemokine Các chất này thu hút và kích hoạt bạch cầu tới khu vực khớp và dẫn tới sự viêm (Hình 1)

- ROS và quá trình hoạt hóa NLRP3 inflammasome

Trong nghiên cứu của Franz Bauernfeind và cs (2015) đã cho thấy, ROS cũng có thể ức chế bước đầu của quá trình hoạt hóa NLRP3 inflammasome Hiện tượng

này có thể là do bản thân NLRP3 là một phân tử rất nhạy với ROS, do đó, chỉ ở trong những giai đoạn nhất định, ROS mới cần thiết tham gia vào hoạt hóa còn ở những giai đoạn đầu, việc kích hoạt NLRP3 cần sự tương tác chặt chẽ với các proinflammasome đặc hiệu mà cụ thể là LPS [8] Tuy nhiên, sự giải phòng các ADN ti thể cũng được ghi nhận là yếu tố cản trở hoạt hóa NLRP3 [34] Khả năng giải phóng ADN ty thể vào tế bào chất phụ thuộc vào sự hoạt động của NLRP3 inflammasome cũng như sự tương tác của ROS ty thể, khi ra ngoài tế bào chất, ADN ty thể có thể gây ra sự tăng tiết IL-1β và IL-18 trong đáp ứng với LPS và ATP [32] Hơn nữa, cardiolipin, một phân tử phospholipid nằm trên màng trong ti thể, có thể chuyển vị ra màng ngoài ti thể và liên kết với phân tử LRR của NLRP3 Phân tử này đóng vai trò như một vị trí cửa ngõ để tạo tín hiệu hoạt hóa [20]

Hình 1: Cơ chế gây viêm thông qua tinh thể MSU [14]

1.1.3 Các hướng điều trị dựa trên cơ chế phân tử của bệnh

Như đã đề cập ở trên, gout là tình trạng bệnh lý liên quan đến sự gia tăng lượng uric acid trong huyết thanh Các cơn đau gout cấp thường khởi đầu từ quá trình viêm do các tính thể uric acid Do đó, thông thường có 3 phương pháp chính để

điều trị gout, một là giảm hiện tượng viêm trong cơn đau gout, hai là tăng khả năng bài tiết uric acid của thận, và cuối cùng là ức chế enzyme xanthine oxidase (XO) (Hình 2)

- Các thuốc kháng viêm

Do bản chất của những cơn đau do gout là sự tấn công của hệ thống miễn dịch, gây ra trạng thái viêm nên rất nhiều dòng thuốc kháng viêm được sử dụng trong điều trị gout Các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) ví dụ như indomethacin là một trong những dòng thuốc hiệu quả trong điều trị gout cấp tính Các thuốc này có tác dụng làm giảm sự hình thành prostaglandin Trong khi

đó, colchicine cũng là loại thuốc thường được sử dụng nhằm làm giảm sản xuất leukotriene B4 và giảm hình thành gốc tự do

NSAIDs và glucocorticoid đều có tác dụng làm giảm quá trình viêm ở hoạt dịch khớp do chúng phản ứng với tubulin và ức chế hình thành các sợi vi ống, trong khi đó, mặc dù cũng có tác dụng tương tự nhưng colchicine cũng đồng thời là một chất gây độc cho quá trình nguyên phân

Về tác dụng phụ, NSAIDs có thể gây ra các thương tổn cho thận, đặc biệt là indomethacin có thể phá hủy cấu trúc xương Đối với các glucocorticoid, trong liệu trình ngắn có thể gây mất cân bằng glucose trong máu Riêng đối với colchicine, đây là một loại thuốc có nhiều tác dụng phụ nhất, đặc biệt là cho gan, thận, do đó, khi sử dụng cần rất chú ý về liều lượng sử dụng [6, 55]

- Các thuốc uricosuric – Thuốc lợi tiểu

Thông thường, 90% uric acid trong cơ thể sẽ được lọc ở thận và tái hấp thụ ở ống lượn gần Các thuốc thuộc dòng uricosuric (probenecid, sulfinpyrazone) là các axit yếu và cạnh tranh tái hấp thụ với uric acid ở ống lượn gần, nhờ đó, hỗ trợ bài tiết uric acid So với các thuốc NSAIDs và colchicine, các thuốc lợi tiểu ít

để lại tác dụng phụ cho cơ thể người bệnh hơn, nhưng do chúng đều là các sulfonamide nên có thể gây ra trạng thái dị ứng thuốc [6, 55]

- Các chất ức chế Xanthine oxidase

Lƣợng uric acid trong có thể bị hạn chế thông qua việc ức chế enzyme xanthine oxidase, nhƣ đã đề cập ở trên, enzyme này sẽ chuyển hypoxanthine thành xanthine và cuối cùng thành uric acid Bằng cơ chế này, các thuốc ức chế enzyme xanthine oxidase cũng đƣợc sử dụng trong điều trị gout Allopuriol sẽ bị chuyển hóa thành oxypurinol (alloxanthine) nhờ xanthine oxidase, sản phẩm của phản ứng này là một chất ức chế enzyme và khiến cho enzyme không thể phục hồi đƣợc Bên cạnh đó, febuxostat cũng là một chất ức chế phi purine của xanthine oxidase và có tính chọn lọc cao hơn allopurinol và alloxanthine [5]

Hình 2: Cơ chế tác động của các thuốc điều trị gout [13]

1.2 Polyphenol, Phenolic acid trong điều trị gout

và mỗi chất có tỷ lệ rất ít, do đó, dự liệu về các hợp chất lớp phenols vẫn chưa đầy đủ [24]

Theo phân loại của Maria (2012), lớp phenol được chia thành các nhóm chính gồm: Phenolic acids, Polyphenols, Chalcones và Coumarins (Hình 3) Phenolic acid là một nhóm chất nằm trong lớp phenols có chứa một nhóm chức carboxylic acid và được xếp vào một nhóm axit hữu cơ thực vật riêng biệt Các phenolic acid của thực vật có thể được chia thành nhiều nhóm nhỏ, dựa trên số lượng và phân bố các gốc hydroxyl trên vòng benzene có thể chia thành các nhóm monohydric phenol, dihydric phenol và trihydric phenol Về mặt cấu trúc, các phenolic acids có hai dạng cấu trúc cơ bản là dạng cinnamic và benzoic Trong khi đó, các hợp chất thuộc nhóm polyphenols thường là một phân tử có kích thước lớn và được tìm thấy chủ yếu trong không bào của tế bào thực vật Chức năng chính của các polyphenol là bảo vệ cơ thể khỏi các thương tổn do gốc tự do gây nên cũng như tăng cường khả năng chống lại các yếu tố gây bệnh Polyphenol được chia thành hai nhóm nhỏ hơn dựa vào số lượng các nhóm phenolic trong phân tử cũng như các yếu tố cấu trúc khác [27] [38]

Hình 3: Phân loại các chất thuộc lớp phenols

1.2.2 Phenolic acids trong điều trị gout

Đã có một số nghiên cứu thực hiện nhằm đánh giả hiệu quả điều trị gout cũng như điều trị tăng uric acid huyết của các phenolic acid Ví dụ như nghiên cứu của Ferraz-Filha và cs (2017), nhóm đã tiến hành kiểm tra khả năng điều trị gout

của dịch chiết cây Kèn hồng (Tabebuia roseoalba) cũng như một số phenolic

acid được tách ra từ dịch chiết này Kết quả nghiên cứu cho thấy, về khả năng kháng viêm do MSU ở hoạt dịch khớp, dịch chiết của cây Kén hồng có khả năng kháng viêm tương đương với indomethacin, một chất kháng viêm hiện được sử dụng trong điều tri gout, trong khi đó các phenolic acid như caffeic acid và chlorogenic acid đều có khả năng kháng viêm tương đương với indomethacin sau 72 giờ điều trị Ngoài ra, các phenolic acid này cũng đồng thời làm giảm hoạt độ của enzyme XO cũng như chỉ số SUA trong cơ thể chuột bị tăng uric acid huyết [16] Năm 2015, Mufeed và cs đã nghiên cứu khả năng điều trị gout

của dịch chiết quả na xiêm, Annona muricata Kết quả thí nghiệm xác định khả

năng ức chế XO cho thấy, phân đoạn coumarin thu được từ HPLC có khả năng

ức chế 70,155% hoạt độ XO, cao hơn hẳn allopuriol (67,11%) [31]

1.2.3 Polyphenols trong điều trị gout

Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng làm giảm SUA và giảm khả năng tiến triển của bệnh gout của các chất thuộc nhóm polyphenol Nghiên cứu của Meng và cs (2014) đã cho thấy khả năng kháng gout của chlorogenic acid, một loại polyphenol làm giảm SUA thông qua khả năng ức chế XO Đồng thời, chlorogenic acid cũng cho thấy khả năng làm giảm sưng ở khớp cũng như các triệu chứng khác của bệnh, ức chế quá trình hình thành các cytokine tiền viêm do IL-1β, IL-6 và TNF-α kích thích [28] Năm 2015, Hong Ki Min và cs đã tiến hành kiểm tra khả năng kháng viêm và ngăn ngừa viêm khớp của anthocyanin trong dịch chiết hạt đỗ tương đen, kết quả của nghiên cứu này cho thấy, anthocyanin trong dịch chiết có khả năng làm giảm các triệu chứng viêm khớp, giảm viêm và quá trình stress oxi hóa Đồng thời, chất này cũng làm giảm lượng cytokine tiền viêm có trong khớp chuột, ức chế tín hiệu gây viêm NF-κB [30]

1.3 Điều trị Gout trong y học cổ truyền

1.3.1 Các bài thuốc dân gian dùng trong điều trị Gout

- Bài thuốc của người Tày ở Lục Yên

Từ xưa đến nay, người Tày vùng Lục Yên đã sử dụng cao dây gắm làm thuốc điều trị các triệu chứng của bệnh gout Thân cây được chặt về, rửa sạch, thái nhỏ, sao khô Thân cây được ninh nhừ bằng nước trong 72 giờ liên tục, tinh lọc,

cô đặc liên tục để tạo ra cao gắm Người Tày sử dụng cao gắm để pha nước uống hàng ngày hoặc ngâm với rượu uống [2]

- Bài thuốc chữa đau khớp của Hải Thượng Lãn Ông

Trong bộ Hải Thượng Y Tôn Tâm Lĩnh, tác giả đã giới thiệu bài rượu thuốc chữa các chứng phong xâm nhập vào xương tủy, ứ huyết, khắp mình tê đau, eo lưng đầu gối đau nhức, tay chân tê dại, liệt nửa người, bài thuốc gồm: Rễ gắm 160g, chân chim 100g, rễ rung túc 80g, rễ bươm bướm 60g, rễ chiêng chiềng 60g, đương quy 40g, ô dược 40g, mấn đỏ 40g, cỏ xước 40g, rễ bưởi bung 40g, rễ

cỏ chỉ 80g, cỏ roi ngựa 20g, rễ chỉ thiên 20g, tầm gửi 40g Tất cả sao qua, tán

thô, cho vào một túi vải và cho hũ rượu, đun nóng trong 20 phút rồi chôn xuống đất 72 giờ [3]

- Bài thuốc Sâm tô ẩm

Theo y học cổ truyền, bài thuốc Sâm tô ẩm, với thành phần chính là tía tô và nhân sâm có tác dụng chữa đau các khớp xương, trừ phong thấp, tốt cho người bị bệnh gout Cụ thể, bài thuốc gồm các thành phần sau: Lá tía tô, nhân sâm, trần

bì, chỉ xác, cát cánh, cam thảo, mộc hương, bán hạ, can khương, tiền hồ [2]

- Các bài thuốc chữa xương khớp trong dân gian

Trong nhân dân, lá của cây lá lốt được dùng làm gia vị và làm thuốc sắc uống chưa đau xương, thấp khớp, tê thấp, đổ mồ hôi tay, chân, bệnh đi lỏng Để chữa chân tay đau nhức, nhân dân thường dùng bài thuốc gồm lá lốt, rễ bưởi bung, rễ

cỏ vòi voi, rễ cỏ xước, mỗi vị 15g khô, sắc với 600 ml nước, cô còn 200 ml, chia

3 lần uống trong ngày Bên cạnh thuốc uống, người dân còn sử dụng lá lốt tươi

để làm thuốc ngâm chân tay, làm giảm đau nhức do gout, cụ thể, rửa sạch 30g lá lốt tươi rồi cho vào ấm đun sôi với 1 lít nước, sau đó cho muối, để nguội bớt và ngâm chân tay trước khi đi ngủ

Ngoài lá lốt, thiên niên kiện cũng là một vị thuốc thường được người dân sử dụng nhằm trừ phong thấp, chỉ thống, dùng trong các trường hợp phong hàn thấp

tỳ đau nhức xương khớp, cơ nhục, đặc biệt là các khớp vai, cổ, có thể phối hợp với một số vị thuốc khác như khương hoạt, phòng phong, tế tân, Bên cạnh đó, thiên niên kiện cũng có tác dụng thông kinh hoạt lạc, dùng trong các trường hợp khí huyết ứ trệ, dẫn đến tê dại, co quắp, đau dây thần kinh, dây chằng, có thể phối hợp điều trị cùng kê huyết đằng, uy linh tiên, để tăng cường tác dụng Ngoài chức năng làm dược liệu, thiên niên kiện cũng được sử dụng để điều chế tinh dầu trong kỹ nghệ nước hoa và làm nguyên liệu chiết suất linalola [4]

Trong dân gian, còn có rất nhiều các bài thuốc sử dụng lá dâu là nguyên liệu chính Ví dụ như bài thuốc chưa nôn ra máu gồm lá dâu cuối màu, sao vàng sắc uống Bài thuốc chữa mụn nhọt lâu ngày không liền bao gồm lá dâu sao vàng tán nhỏ, rắc vào mụn đã rửa sạch [2]

Bảng 1: Tóm tắt thành phần các bài thuốc điều trị Gout

Chân Chim,

Rễ rung túc,…

4

1.3.2 Một số loại dược liệu chính trong điều trị Gout

Từ các bài thuốc và phương cách chữa bệnh ở trên, nhóm đã tiến hành phân tích các thành phần có trong từng bài thuốc và xác định các vị Quân và Thần, từ đó chọn ra các đối tượng nghiên cứu phù hợp Cụ thể, các vị thuốc được lựa chọn

gồm: Dây gắm lá nhỏ (Gnetum parvifolium), Tía tô (Perilla ocymoides L.), Lá lốt (Piper lolot C.DC.), Thiên niên kiện (Homalomena aromatica (Roxb)), Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.), Dâu tằm (Morus alba L.)

1.3.2.1 Dây Gắm lá nhỏ- Gnetum parvifolium

Còn được gọi là dây sót, dây mấu, dây gấm lốt, vương tôn

Tên khoa học là Gnetum parvifolium, thuộc họ Dây gắm Gnetaceae

Bộ phận sử dụng làm dược liệu: thân

Đây là cây thường xanh, mọc leo trên các trên các cây to và có thể dài tới 12m, thân có nhiều mấu, phình lên ở các đốt, vỏ nâu đen Lá nguyên, mọc đối, hình trứng thuôn, mặt trên sẫm bóng, mặt dưới nhạt, đầu lá nhọn dài tới 25 cm, rộng 10 cm Hoa đực và hoa cái mọc khác gốc, nón đực mọc thành chùm dài 8

10-cm ở các mấu cành, phân nhánh hai lần, trong khi đó, nón cái gồm nhiều hoa, mọc vòng từ 20 hoa một chùm, phân nhánh 2-3 lần Quả hình bầu dục, có cuống ngắn, dài 12-26 mm, rộng 11-13 mm, bóng, trên phủ một lớp như sáp, khi chín

có màu vàng đỏ (Hình 4)

Về phân bố, dây gắm mọc hoang tại các vùng rừng núi phía bắc nước ta như Sapa, Hà Giang, Tuyên Quang Quả có thể ăn được, dây để làm chạc hay thừng buộc thuyền bè và làm thuốc [2]

Theo Đông y, dây gắm có vị đắng, tính bình, có tác dụng khu phong, trừ thấp, thư cân hoạt huyết, giải độc, tiêu viêm, sát trùng Rễ và thân dây gắm thường được dùng làm thuốc giảm đau, chữa phong tê thấp, sản hậu gầy mòn, giải độc sơn, rắn cắn

Hình 4: Gnetum parvifolium [2]

Bên cạnh các tài liệu về y học cổ truyền, một số nghiên cứu gần đây cũng cho thấy một số hợp chất có trong thân, hạt, rễ dây gắm co khả năng làm giảm SUA Ví dụ trong nghiên cứu của Hiroyuki Konno và cs (2013) khi thí nghiệm kiểm tra tách

động của dịch chiết hạt gắm đến cơ thể đã cho thấy thành phần trans-resveratrol trong dịch chiết có tác dụng làm giảm lượng uric acid trong máu chỉ trong 4 tuần Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng chỉ ra khả năng thúc đẩy quá trình chuyển hóa lipid trong cơ thể , nhờ vậy làm tăng chỉ số HDL cholesterol trong máu [23]

1.3.2.2 Tía tô- Perilla ocymoides L

Còn gọi là tử tô, tử tô tử, tô ngạnh, tô diệp

Tên khoa học Perilla ocymoides L., thuộc họ Hoa môi Lamiaceae

Bộ phận sử dụng làm dược liệu: Lá

Tía tô là cây thân cỏ, cao chừng 0,5-1,5 m Thân thẳng, có lông, lá mọc đối hình trứng, đầu nhọn, mép lá có răng cưa to, phiến lá dài 4-12 cm, rộng 2-10 cm, màu tím hoặc xanh tím, mặt trên có lông màu tím, cuống lá dài từ 2-3 cm Hoa nhỏ, màu trắng hoặc tím nhạt, mọc thành từng chùm ở kẽ lá hay đầu cảnh, chùm dài 6-20 cm Quả là hạch nhỏ, hình cầu, đường kính 1 mm, màu nâu nhạt (Hình 5) [2]

Trong Đông y, tía tô là vị thuốc có vị cay, tính ấm, quy vào hai kinh tỳ và phế, chủ trị trong giải cảm hàn, kiện vị chỉ nôn, khử đờn chỉ ho, hành khí an thai, cố thận, giải độc sát khuẩn [4]

Trong lá tía tô có chứa 0,5% tinh dầu, trong đó chứa chủ yếu là perilla aldehyde (55%), Limomen (20-30%), α-pinen và dihydrocumin Perilla aldehyde có mùi thơn rất đặc trưng và có vị ngọt gấp 2000 lần đường, khó tan trong nước, dung nóng sẽ phân giải, có độc nên không dùng làm chất điều vị được Bên cạnh đó, trong lá tía tô còn chứa các chất phenylpropanoid và β-caryophyllene, có tác dụng ức chế các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Ngoài ra, cây còn có tác dụng khử mùi tanh của hải sản, giải độc cua cá [2]

Hình 5: Perilla ocymoides L [2]

Ngoài y học cổ truyền, các nghiên cứu hiện đại cũng đã chứng minh được tác dụng điều trị gout Nghiên cứu của Li-Na Huo và cs (2015) đã tiến hành thử nghiệm khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase từ dịch chiết tổng số từ lá tía

tô Kết quả cho thấy, khi cho chuột uống dịch chiết thô của lá tía tô, lượng SUA giảm rõ rệt và gần như tương đương với ngưỡng bình thường Nhóm đã tiến hành tách và phân tích một số thành phần có trong dịch chiết, cụ thể gồm axit caffeic, vinul caffeate, axit rosmarinic, methyl rosmarinate và apigenin, và thấý rằng, dựa trên giá trị IC50, các chất vinyl caffeate, methyl rosmarinate và apigein

có khả năng ức chế enzyme XO, trong khi các chất axit caffeic và axit rosmarinic có khả năng ức chế enzyme thấp hơn khi so sánh với allopuriol [19]

Ở Việt Nam, cũng đã có một số nghiên cứu về khả năng điều trị gout bằng dịch chiết lá tía tô Năm 2017, Đặng Kim Thu và cs đã nghiên cứu “Tác dụng ức chế

enzyme xanthine oxidase và hạ uric acid máu của dịch chiết lá tía tô (Perilla frutescens L.)” Kết quá phân tích IC50 cho thấy cao chiết ethanol 50% của lá tía

tô có tác dụng ức chế enzyme XO với giá trị IC50 là 25,32 µg/ml), đồng thời, khi

sử dụng cao tía tô với liều 200 mg/kg, lượng SUA giảm một cách đáng kể và có

ý nghĩa thống kê Kết quả này gợi ý rằng là tía tô là một loại dược liệu có khả năng phòng và điều trị gout [1] Bên cạnh đó, nghiên cứu của Thanh Mai và cs

(2004) khi chiết lá tía tô với Methanol ở các nồng độ khác nhau cũng cho thấy khả năng ức chế tới 79,9% khi chiết ở nồng độ 100µg/ml với Methanol 100%, trong khi ở nồng độ 10µg/ml và khi chiết với nước, dịch chiết thu được không có khả năng ức chế XO [33]

Theo y học cổ truyền, lá lốt là vị thuốc có tính ấm, hơi cay, vị nồng, có tác dụng trừ lạnh, giảm đau, giảm khí huyết hư nên được nhiều thầy thuốc đưa vào bài thuốc chữa các bệnh về xương khớp ví dụ như đau lưng, đau chân tay, đau đầu gối, bệnh gout, chữa đầy bụng, ăn uống không tiêu, nôn mửa, [2]

Trong nghiên cứu của Thanh Mai và cs (2004) về khả năng ức chế xanthine oxidase của một số loại dược liệu cổ truyền Việt Nam đã cho thấy, khi được chiết với Methanol 50%, dịch chiết lá lốt có khả năng ức chế xanthine oxidase, khả năng ức chế này tăng dần khi nồng độ tăng lên Từ 0,4% ở nồng độ 10µg/ml lên 2,6% ở 100µg/ml [33]

Hình 6: Piper lolot C.DC [2]

1.3.2.4 Thiên niên kiện - Homalomena aromatica

Tên khoa học là Homalomena aromatica (Roxb), thuộc họ Ráy Araceae

Bộ phận được dùng làm dược liệu: Rễ

Về hình thái, thiên niên kiện là một cây sống lâu năm, có thân rễ mập, màu xanh, đường kính 1-2 cm Lá cây mọc so le, có cuống dài 18-25 cm, màu xanh, mềm, nhẵn, phía dưới cuống mở rộng thành bẹ có màu vàng nhạt, phiến lá hình mũi tên, dài 11-15 cm, rộng 7-11 cm, đầu nhọn, phía dưới hình cánh tên, mép liền, mặt trên có màu đậm hơn, gân ở hai mép đều hướng về phía đỉnh lá Cụm hoa nở vào tháng 3-4, quả mọng Đây là cây mọc hoang ở nhiều vùng núi ở nước ta và cũng được dùng làm cây cảnh Thiên niên kiện ưa nơi ẩm ướt, thường mọc dọc theo các con suối (Hình 7)

Trong rễ khô thiên niên kiện có từ 0,8-1% tinh dầu Tinh dầu có màu vàng nhạt hoặc nâu vàng, mùi thơm dễ chịu, có tỷ trọng ở 300C là 0,8868 hoặc 0,8920, tan trong cồn 700 ở 300C Tinh dầu thiên niên kiện chứa 40% linalola, tecpineola và 2% este, ngoài ra còn có sabinen, limonen, α-tecpinen, axetaldehyde, propionic aldehyde [2]

Trong khảo sát của Thanh Mai và cs (2004) về khả năng ức chế XO của một số loại dược liệu cổ truyền Việt Nam đã ghi nhận, dịch chiết thiên niên kiện đều có

khả năng ức chế XO ở tất cả các dịch chiết và tất cả các mức nồng độ, trong đó, dịch chiết với Methanol 100% ở nồng độ 100µg/ml, khả năng ức chế này cao nhất, lên tới 21,3% [33]

Hình 7: Homalomena aromatica [2]

1.3.2.5 Thổ phục linh- Smilax glabra

Cây còn có tên gọi khác là củ kim cang, tên khoa học là Smilax glabra Roxb., thuộc họ Hành Liliaceae

Bộ phận sử dụng làm dược liệu: Thân, rễ

Thổ phục linh là cây sống lâu năm, dài 4-5 m, có nhiều cành nhỏ, không gai, thường có tua cuốn dài Lá hình trái xoan thuôn, phía dưới tròn, dài 5-13 cm, rộng 3-7 cm, chắc cứng, hơi mỏng, có 3 gân nhỏ từ gốc và nhiều gân con Hoa thổ phục linh mọc thành chùm 20-30 bông Quả mọng, tròn, đường kính 6-7

mm, chứa 3 hạt Thổ phục linh mọc hoang ở nhiều nơi, thu hoạch tốt nhất vào mùa đông, chủ yếu lấy rễ để làm dược liệu (Hình 8)

Trong Đông y, thổ phục linh có vị ngọt, tính bình, quy vào các kinh can, thận, vị,

có tác dụng trừ phong thấp, lợi gân cốt, thanh nhiệt giải độc, chữa đau xương,

phù phũng Trong dân gian, thổ phục linh còn được dùng dể tẩy độc cơ thể, bổ

dạ dày, khỏe gân cốt [2, 3]

Hình 8: Smilax glabra [2]

Nghiên cứu của Thanh Mai và cs (2004), dịch chiết Methanol 100% của Thổ phục linh 100 µg/ml có khả năng ức chế XO tới 52,7%, trong khi đó, đa số các dịch chiết với nước không có khả năng này Đặc biệt, ở nồng độ 10µg/ml, cả dịch chiết với Methanol 50% và nước đều không có khả năng ức chế XO [33]

1.3.2.6 Dâu tằm- Morus alba

Còn gọi là mạy môn, dâu cang, tầm cang Tên khoa học là Morus alba L., thuộc

họ Dâu tằm Moraceae Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng lá dâu (tang

diệp- Folium Mori) là đối tượng nghiên cứu chính

Cây dâu có chiều cao từ 2-3 m, lá mọc so le, hình bầu dục, nguyên hoặc chia thành 3 thùy, có lá kèm, đầu lá nhọn hay hơi tù, phía cuối hơi tròn hoặc hơi bằng, mép có răng cưa to Từ cuống lá tỏa ra 3 gân rõ rệt Hoa đơn tính khác gốc, hoa đực mọc thành bông, có 4 lá đài, 4 nhị, hoa cái cũng mọc thành khối hình cầu, có 4 lá đài Quả mọng nước và mọc thành quả phức màu đỏ hoặc màu đen sẫm, quả có thể ăn được và làm thuốc Cây dâu được trồng ở nhiều nơi trên

nước ta, tập trung nhiều ở các khu vực nuôi tằm hoặc những vườn dược liệu (Hình 9)

Trong lá dâu có chất caroten, tanin, rất ít tinh dầu, vitamin C, cholin, adenin, trigonenlin Ngoài ra còn có pentozan, đường, canxi malat và canxi carbonate [2]

Nghiên cứu của Thanh Mai và cs (2004) cho thấy, dịch chiết methanol 100%, 50% và nước của lá dâu đều có khả năng ức chế hoạt động của enzyme XO, khả năng này gần như không thay đổi nhiều ở tất cả các mức nồng độ sử dụng, 100µg/ml, 50µg/ml, 25µg/ml, 10µg/ml [33]

Hình 9: Morus alba L [2]

1.4 Mô hình bệnh gout trên dòng tế bào RAW 264.7

1.4.1 Dòng tế bào RAW 264.7

Dòng tế bào RAW 264.7 là dòng tế bào giống đại thực bào được tách từ chuột

Mus musculus BALB/c bị ung thư bạch cầu do nhiễm vi khuẩn Abelson Đây là

dòng tế bào có hình thức giống đại thực bào và có khả năng thực bào (Hình 10) Dòng tế bào này có hiệu suất biến nạp DNA cao, nhạy với các iRNA và hỗ trợ

tốt cho quá trình phân chia của norovirus Đồng thời, tế bào RAW 264.7 cũng biểu hiện âm tính với các immoglobulin bề mặt (slg-), la (la-) và Thy -1.2 (Thy-1.2) Dưới sự kích thích của LPS, các tế bào RAW 264.7 sẽ tăng cường sản xuất Nitric oxide (NO) và thực bào Hơn nữa, tế bào này có khả năng tiêu diệt các tế bào đích thông qua hệ thống gây độc tế bào dựa vào kháng thể [6] Tuy nhiên, tính ổn định về hình thái và chức năng của dòng tế bào này còn rất nhiều tranh cãi, do dòng tế bào này vẫn được sử dụng một cách rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trong hơn 40 năm qua Khi tế bào RAW 264.7 được kích thích bởi các chất kích thích NF-κB, tế bào này biệt hóa thành osteoclast và không còn thể hiện đầy đủ đặc tính của dòng tế bào cũ nữa Do đó, để duy trì tốt đặc tính của tế bào RAW 264.7, nghiên cứu của Bartłomiej Taciak và cs (2018) đã đưa ra khuyến cáo, hạn chế sử dụng tế bào RAW 264.7 sau khi đã cấy chuyển 20 lần [7]

Hình 10: Tế bào RAW 264.7 ở mật độ thấp [6]

1.4.2 Gây viêm trên dòng tế bào RAW 264.7

Những năm gần đây, dòng tế bào RAW 264.7 là đối tượng thường được dùng để xây dựng mô hình bệnh gout cũng như thử nghiệm thuốc và kiểm chứng các con

đường tín hiệu liên quan đến viêm nhiễm trên rất nhiều các nghiên cứu trên thế giới

Trong nghiên cứu của Su Jung Hwang và cs (2014), nhóm đã tiến hành kiểm tra kháng viêm của chlorogenic acid, một hợp chất thuộc lớp phenolic trên dòng tế bào RAW 254.7 với quy trình như sau: Tế bào sau khi được nuôi cấy ổn định và tăng sinh sẽ được cấy trên đĩa 96 giếng với lượng 5x104

tế bào/giếng và ủ ở 370C trong 24 giờ Sau đó, tiếp tục ủ đĩa với LPS (1µg/ml) trong 24 giờ Môi trường nuôi cấy được nhóm sử dụng là DMEM high glucose với 10% FBS, penicillin (100U/ml), streptomycin (100 µg/ml) Kết quả cho thấy, nhóm tế bào được xử lý với LPS có lượng nitrite cao gấp 2 lần so với nhóm đối chứng sinh học Cùng với đó, lượng IL-1β và IL-6 của nhóm tế bào này cũng tăng lên nhiều lần so với nhóm đối chứng, trong khi β-actin không thay đổi về hoạt tính khi được kích thích viêm với LPS [35]

Bên cạnh đó, nghiên cứu của Yonglin Gao và cs (2011) cũng đã sử dụng dòng tế bào RAW 264.7 để đánh giá khả năng kháng viêm của sophocarpine thông qua 2 con đường tín hiệu NF-κB và MAPKS Khác với nhóm của Su Jung Hwang, nghiên cứu này nuôi cấy tế bào RAW 264.7 bằng môi trường RPMI high glucose với penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 µg/ml), 10% FPS Tế bào được nuôi ổn định và tăng sinh sau đó gây viêm bằng LPS (1 µg/ml) và ủ trong

24 giờ Lượng Nitrite ở các nhóm tế bào xử lý với LPS cao hơn rất nhiều lớn so với nhóm đối chứng sinh học Kèm theo đó, biểu hiện IL-6 cũng có sự tăng mạnh, từ 11,32 pg/ml lên 338,45 pg/ml [41]

Từ các nghiên cứu trên có thể thấy, hai môi trường chính thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào RAW 264.7 là DMEM và RPMI high glucose, trong đó, môi trường RPMI là môi trường không chứa các ion Ca2+

, Mg2+, được thiết kế

để nuôi cấy các dòng tế bào lymphoblastoid cũng như các dòng tế bào bám dính

và không bám dính khác Khác với RPMI, DMEM là môi trường cơ bản và được

sử dụng một cách rộng rãi, có bổ sung đầy đủ các yếu tô vi lượng, ion kim loại, các vitamin, nucleoside, pyruvate, lipoic acid, thích hợp cho việc nuôi cấy tế bào

bước đầu [21] Để đánh giá tính viêm của tế bào RAW 264.7, các nghiên cứu

thông thường đều sử dụng hai dấu chuẩn chính là lượng NO sinh ra và biểu hiện

của các interleukin như IL-1β và IL-6

Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã sử dụng môi trường nuôi cấy là

DMEM high glucose có bổ sung 10% FBS, penicillin (100U/ml), streptomycin

(100 µg/ml) theo khuyến cáo của ATCC và sử dụng dấu chuẩn đế đánh giá tình

trạng viêm của tế bào là biểu hiện interleukin mà cụ thể là IL-1β

Chương 2- VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

- Mẫu dược liệu

Mẫu dược liệu được sử dụng trong nghiên cứu này gồm Dây gắm lá nhỏ Gnetum parvifolium (thân cây), cây Tía tô Perilla ocymoides L (lá), cây Lá lốt Piper lolot C.DC (lá), cây Thiên niên kiện Homalomena aromatica (rễ), cây Thổ phục linh Smilax glabra (rễ), cây Dâu tằm Morus alba L (lá) được định danh và so

sánh với dữ liệu và mẫu lưu trong Hebarium của Bảo tàng Sinh học HNU bởi ThS Nguyễn Anh Đức BM Khoa học thực vật – trường ĐHKHTN – ĐHQGHN Trong đó, các mẫu lá tía tô, lá lốt được thu tại Nông trại hữu cơ ECO Hoàng Mai, Hà Nội; các mẫu thiên niên kiện, thổ phục linh được Công ty cổ phần Trà thảo dược Trường Xuân, Hà Nội Tất cả các mẫu dược liệu sau khi thu đều được sấy khô ở 600C trong 24 giờ Sau khi đã khô, mẫu được tán nhỏ và bảo quản ở nhiệt độ phòng

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng

Bảng 2: Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu

4 Methanol Fisher Chemical (EU)

9 Dipotassium phosphate (K2HPO4) Merck (EU)

10 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Merck (EU)

12 Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Merck (EU)

20 Othor-Phosphoric acid (H3PO4) Merck (EU)

22 1, 1-Diphenyl –2-picrylhydrazyl (DPPH) Sigma (USA)

28 Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Merck (EU)

31 FBS Sigma

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị cơ bản được sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng

Bảng 3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

1 Máy đo quang phổ hấp thụ Biomate 3 Thermo Electron (Mỹ)

9 Máy nghiền đồng thể IKA T10 Turrax IKA (Đức)

10 Máy đo quang phổ SpectraMax 384 Plus Molecular Devices (USA)

11 Máy HPLC Waters Alliance e2685 Waters (Pháp)

16 Tủ ấm nuôi tế bào có cảm biến CO2 Trung Quốc

2.2 Phương pháp

2.2.1 Tối ưu hóa quy trình chiết

Phương pháp ngâm (Solid-Liquid Extract- SLE) là cách thức đơn giản và được

sử dụng phổ biến nhất trong tách chiết các hợp chất thuộc lớp phenolic từ thực

vật Thông thường, phương pháp này sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau như nước, methanol, ethanol, aetone để hòa tan các thành phần có trong mẫu thực vật tươi hoặc đã sấy khô Để nâng cao hiệu quả tách chiết, có thể sử dụng bổ sung siêu âm trong quá trình ngâm và sử dụng các dung môi để loại bỏ một số thành phần không mong muốn

Các dược liệu sau khi thu được phân loại và xử lý Đối với các dược liệu từ lá và

rễ, mẫu được sấy khô ở 600C và tán nhỏ trước khi chiết Đối với các dược liệu từ thân là Dây gắm, thân được sấy khô ở 600C, tán nhỏ và rửa với các dung môi có

độ phân cực thấp gồm n-hexane và ethyl acetate ở 600

C trong 2 giờ Sau khi rửa, mẫu được chiết tương tự như các dược liệu từ lá và rễ

2.2.1.1 Tối ưu hóa lượng dung môi

Trong nghiên cứu này, các dược liệu được chiết với các dung môi gồm nước, ethanol 1000, methanol 100% với tỷ lệ, 1g dược liệu không ngâm trong 10 ml dung môi và ủ ở 600C Cứ sau mỗi 4 giờ, dịch chiết cũ được rút ra và bổ sung thêm dịch chiết mới vào với lượng tương đương Dịch chiết thu được sau đó được đem đi đo phổ hấp thụ trong dải bước sóng từ 200-800 nm Quy trình này được lặp lại nhiều lần cho đến khi trên phổ hấp thụ không còn đỉnh hấp thụ tại vùng từ 250-350 nm Từ số lần lặp lại, xác định được tổng lượng dung môi sử dụng trong quá trình chiết

2.2.1.2 Tối ưu hóa thời gian chiết

Các dược liệu được sau khi xử lý được chiết với lượng dung môi tối ưu ở quy trình trên trong các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ, 16 giờ và 24 giờ Dịch chiết thu được sau đó được đem đi đo phổ hấp thụ trong dải bước sóng từ 200-800

2.2.3 Chạy sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Thí nghiệm dựa trên quy trình của Wen và cs (2005) đã cải tiến và được thực hiện trên hệ thống HPLC Waters Alliance e2685 (Pháp) với cột C18 (150 x 4,6 x

5 mm) nhằm phát hiện và phân tách các thành phần thuộc nhóm phenolic acids

có trong dịch chiết thực vật Trước khi tiến hành sắc ký, các mẫu dịch chiết đều được bổ sung TFA với nồng độ 1% và lọc qua giấy lọc có kích thước lỗ 0,22

µm Đầu dò được sử dụng ở đây là đầu dò Diode Array Detector (DAD) và đọc kết quả ở các bước sóng 254 nm, 275 nm, 305 nm và đầu dò huỳnh quang toàn dải từ 350-800nm Thể tích mẫu cần cho một lần chạy là 10µl với đệm A là dung dịch TFA 2% pha trong nước, đệm B là dung dịch TFA 2% pha trong Methanol

Bảng 4: Gradient nồng độ dung môi chạy HPLC

2.2.4 Định lượng khả năng chống oxi hóa tổng số bằng phương pháp quét gốc tự do DPPH

Trong phương pháp thử khả năng chống oxi hóa bằng DPPH, các chất có hoạt tính kháng oxi hóa trung hòa gốc DPPH bằng cách cho một nguyên tử hydro, từ

đó làm giảm cường độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm của dung dịch, màu của dung dịch chuyển từ tím (màu đặc trưng của DPPH) sang vàng [22]

Đầu tiên, 4,3 mg DPPH được pha trong 3,3 ml Ethanol 1000

Hỗn hợp phản ứng gồm 3,5 ml Ethanol 1000, 250 µl DPPH và 250 µl mẫu Hỗn hợp được cho chung vào ống epp, lắc mạnh và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Sau khi ủ, hỗn hợp được đem đo giá trị hấp thụ ở bước sóng 517 nm Mẫu chuẩn được sử dụng ở đây là vitamin C được pha thành nhiều nồng độ từ 0.01 mM đến 10 mM

Từ giá trị hấp thụ kết hợp với đường chuẩn vitamin C có thể đánh giá khả năng chống oxi hóa của mẫu tương đương với bao nhiêu mM vitamin C Ngoài ra, có thể dựa vào công thức sau để xác định khả năng chống oxi hóa:

Trong đó:

AA%: là phần trăm chống oxi hóa

Acontrol: Giá trị hấp thụ của DPPH

Amẫu: Giá trị hấp thụ của mẫu

Mẫu dịch chiết được pha loãng ở nhiều nồng độ khác nhau xác định giá trị AA% của các mốc nồng độ này, từ đó xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa sự thay đổi nồng độ và giá trị AA% bằng phần mềm Minitab Ver.18 Từ đường chuẩn thu được, giá trị IC50 được xác định, từ đó đánh giá khả năng chống oxi hóa của dịch chiết

2.2.5 Nuôi cấy và thử độc tính trên dòng tế bào RAW 264.7

- Giã đông tế bào

Tế bào ban đầu được lưu trong nitơ lỏng Trước khi đưa đi nuôi cấy, tế bào được giã đông với tốc độ tăng nhiệt là 10

C/phút và cuối cùng ổn định nhiệt độ ở 370C trong bể ổn nhiệt 15-20 phút Môi trường nuôi cấy được chuẩn bị sẵn gồm môi trường DMEM high glucose có bổ sung 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin và làm ấm từ từ trong 15-20 phút ở 370C Đổ 15 ml môi trường nuôi cấy mới vào bình nuôi cấy 75 cm2, lưu ý, cần giữ ấm môi trường nuôi cấy trong toàn bộ quá trình Sau đó, nhúng ống tế bào vào cồn 700 trước khi cấy vào bình nuôi để tiệt trùng bên ngoài vỏ ống Giữ ống tế bào trong tay 2-3 phút rồi mở nắp, hút tế bào ra và chuyển vào trong bình nuôi cấy Duy trì tế bào

- Cấy chuyển tế bào

Trong quá trình cấy chuyển, môi trường nuôi cấy tế bào RAW 264.7 vẫn được giữ ấm như trong quy trình giã đông để tránh làm shock nhiệt cho tế bào Chuẩn

bị sẵn ống cấy chuyển đã có chứa môi trường DMEM high glucose có bổ sung 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin và được làm ấm Thay môi trường nuôi cấy cũ và rửa tế bào với 10ml PBS Sau khi hút rửa, nhẹ nhàng cào nhẹ lớp tế bào đang bám trên thành bình cho đến khi chúng bong ra, lúc này

bổ sung môi trường mới vào trong bình nuôi cấy, đồng thời hút nhả dịch nuôi cấy liên tục và tránh tạo bọt Hút 10 µl dịch nuôi cấy tế bào mới vào hemacytometer Từ số tế bào có trên một milimet vuông nuôi cấy, có thể tính được tổng số tế bào có trong bình nuôi Chuyển tế bào vào trong các ống chuyển hoặc bình nuôi mới Duy trì tình trạng phủ của tế bào trên bề mặt bình luôn nhỏ hơn 80%

- Thử độc tính dịch chiết với MTT

Tế bào RAW 264.7 được nuôi cấy trên đĩa 96 giếng với nồng độ 1x104 tế bào/ml (tương đương 100 µl/giếng) và được xử lý với các dịch chiết ở các mức nồng độ khác nhau trong 24 giờ ở 370C, 5% CO2

Độc tính của các dịch chiết với tế bào RAW 264.7 được thử bằng thí nghiệm MTT MTT gốc được pha với nồng độ 5 mg/ml bằng PBS và được khử trùng bằng màng lọc với kích thước lỗ 0,22 µm và được bảo quản ở 40C Bổ sung 100

µl MTT vào mỗi giếng và ủ ở 370C, 5% CO2 trong 4 giờ Sau khi ủ, loại bỏ dịch nổi và bổ sung 100 µl 0,04N HCl (pha trong 2-propanol) vào tất cả các giếng Lắc đều các giếng trong 20-45 giây để formazan ở đáy giếng có thể hòa tan vào dung môi, tạo thành dung dịch đồng thể Ủ đĩa 96 giếng ở nhiệt độ phòng trong

10 phút Sau khi ủ, đọc giá trị hấp thụ của đĩa ở bước sóng 570 nm [11]

- Định lượng IL-1β bằng phương pháp ELISA

Tế bào được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung LPS với nồng độ 1 µg/ml và trong 6 giờ và sau đó được kích thích với MSU nồng độ 500 ng/ml trong 6 giờ tiếp theo Sau khi nuôi cấy, lượng IL-1β có trong dịch nuôi cấy tế bào được định lượng bằng phương pháp ELISA với bộ kit Mouse IL-1 beta Uncoated ELISA (Invitrogen, Australia) Sau đó, kết quả ELISA được đo và ghi lại bằng máy đo quang phổ Spectra Max Plus 384

Kết quả thu được xem được đem đi phân tích để xác định giá trị LD50 của cao dịch chiết

2.2.6 Gây viêm trên mô hình chuột Swiss và thử nghiệm thuốc trên chuột

- Gây viêm trên mô hình chuột

Chuẩn bị dung dịch MSU chuẩn theo tỷ lệ 1:10 (w/v) trong dung dịch PBS Chuột đực Swiss trắng được nuôi ổn định điều kiện và thúc đẩy cân nặng từ 17 g lên đến 30±2 g Trước khi tiêm MSU, chuột được đo các chỉ tiêu sinh lý như trọng lượng, kích thước khớp 2 chi sau và cố định các chi Sử dụng kim tiêm 30

½ G để hút dung dịch MSU và tiêm vào vùng khớp chi sau trái của chuột với lượng 50µl/chi Sau khi tiêm 24h, tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý của chuột một lần nữa trước khi mổ giải phẫu các cơ quan

- Thử nghiệm thuốc trên chuột

Từ kết quả các thí nghiệm định tính và định lượng, các dịch chiết được chọn ra Trước khi cho chuột uống, tất cả các dịch chiết đều được đem đi cô đặc ở 600

C trong 12 giờ Sau khi tất cả dung môi đã bay hơi hết, bổ sung nước vào trong falcon với lượng phù hợp Sau đó, tất cả các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 40C Trước khi tiến hành tiêm MSU 24 giờ, chuột thí nghiệm được cho uống thuốc với các liều lượng 50 mg/kg thể trọng, 25 mg /kg thể trọng và 10 mg/kg thể trọng, liều lượng này tương đương với việc chuột hấp thụ 50 mg, 25 mg và 10

mg dược liệu khô trên một kg thể trọng

2.2.7 Đánh giá tình trạng stress oxi hóa trên chuột thí nghiệm

Từ kết quả trên, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm một số cao chiết lên chuột, đối chứng sinh học là nhóm chuột được tiêm PBS, không được uống bất

kỳ loại thuốc nào Nhóm đối chứng âm là nhóm được gây sưng bằng MSU (150 mg/ml) nhưng không được uống bất kỳ loại thuốc nào Nhóm chuột đối chứng dương được uống colchicine với liều lượng 0,2 µg/g thể trọng

Bảng 5: Các nhóm chuột thử nghiệm thuốc

Nhóm Tiêm MSU Loại dịch chiết Liều lượng

(mg/kg thể trọng)

Trạng thái stress oxi hóa của chuột được tiến hành trên mẫu mô gan chuột sau khi đã mổ giải phẫu và được xác định thông qua định lượng Malonedialhyde (MDA), một sản phẩm thứ cấp của quá trình peroxide hóa lipid Nghiên cứu này

sử dụng quy trình định lượng MDA bằng phương pháp TBARS, được phát triển bởi Mitsuru Uchiyama và Midori Mihara (1978) đã cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam, cụ thể các quy trình như sau [29]:

2.2.7.1 Đánh giá tính trạng stress oxi hóa ở mẫu gan

Mẫu gan được thu lấy sau khi mổ Mẫu được rửa sạch bằng dung dịch muối sinh

lý và bảo quản ở nhiệt độ -200C trước khi tiến hành thí nghiệm Trong trường hợp cần phải vận chuyển và bảo quản lâu dài, mẫu được ngâm trong dung dịch đệm bảo quản bao gồm 125mM NaCl, 3mM KCl, 1mM MgCl2, 40mM Tris và giữ ở nhiệt độ -80oC Khi tiến hành thí nghiệm, mẫu được chia nhỏ thành các