Nghiên cứu đặc điểm di truyền và đặc tính kháng nguyên của một số tác nhân vi rút gây viêm đường hô hấp cấp trên bệnh nhân tại bệnh viện ở miền bắc việt nam, 2013 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- TRẦN THỊ THANH LOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA MỘT SỐ TÁC NHÂN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƯỜNG HÔ H

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TRẦN THỊ THANH LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN

VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA MỘT SỐ TÁC NHÂN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP TRÊN BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN Ở MIỀN BẮC

VIỆT NAM, 2013-2016

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TRẦN THỊ THANH LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN

VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA MỘT SỐ

TÁC NHÂN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP TRÊN

BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN Ở MIỀN BẮC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tập thể mà tôi là thành viên chính thức tham gia nghiên cứu Tôi đã được trưởng nhóm nghiên cứu cho phép sử dụng kết quả nghiên cứu công bố trong luận án

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa từng được công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

NGHIÊN CỨU SINH

Trần Thị Thanh Loan

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn:

Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

 Ban Giám đốc Bệnh viện Y học cổ truyền Trung ương đã cho phép, tạo

điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện và hoàn thành luận án

Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:

PGS.TS Lê Thị Quỳnh Mai, Phó viện trưởng Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, là người hướng dẫn khoa học luôn chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, là giáo viên đồng hướng dẫn, đã truyền thụ cho tôi những kiến thức chuyên ngành Vi sinh vật học và lòng nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành luận án này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới:

PGS.TS Nguyễn Lê Khánh Hằng, Phó trưởng Khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, là người thầy và cũng là người bạn luôn hướng dẫn

và chỉ bảo tận tình để tôi hoàn thành luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới :

giáo trong bộ môn đã truyền thụ cho tôi nhũng kiến thức quý báu trong thời gian qua

TS Hoàng Vũ Mai Phương, Trưởng Khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cùng toàn thể các bạn đồng nghiệp công tác tại Phòng Thí

nghiệm Cúm, Khoa Vi rút đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

động lực cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án Cuối cùng, tôi xin dành tất cả lòng biết ơn và tình cảm yêu quý tới Bố, Mẹ tôi, Chồng và các con trai tôi cùng những người thân trong gia đình, các bạn thân, các đồng nghiệp đã luôn động viên, hỗ trợ tôi, chia sẻ cùng tôi những khó khăn vất vả và luôn hết lòng vì tôi trong cuộc sống và sự nghiệp!

Hà Nội, ngày….tháng… năm 2018

Tác giả

Trần Thị Thanh Loan

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH 4

DANH MỤC CÁC BẢNG 6

CÁC CHỮ VIẾT TẮT 8

MỞ ĐẦU 9

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13

1.1 BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP VÀ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC CỦA CÁC TÁC NHÂN VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP THƯỜNG GẶP 13

1.1.1 Vi rút họ Orthomyxoviridae 14

1.1.2 Vi rút Paramyxoviridae 27

1.1.3 Vi rút họ Picornaviridae 37

1.1.4 Vi rút họ Adenoviridae 41

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC CỦA CÁC CĂN NGUYÊN VI RÚT GÂY BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP 47

1.2.1 Trên thế giới 47

1.2.2 Tại Việt Nam 49

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÒNG THÍ NGHIỆM DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN TÁC NHÂN VI RÖT GÂY VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP 51

1.3.1 Xét nghiệm chẩn đoán nhanh (Quicktest) 52

1.3.2 Phân lập vi rút 52

1.3.3 Phản ứng Realtime PCR/ RT-PCR 53

1.3.4 Kỹ thuật Luminex/xTAG RVP 55

1.3.5 Phương pháp xác định trình tự gen Sanger sequencing 56

1.3.6 Phương pháp phát hiện kháng thể 57

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 58

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 58

2.1.1 Định nghĩa bệnh viêm đường hô hấp cấp 58

2.1.2 Cỡ mẫu, thời gian và địa điểm 58

2.2 VẬT LIỆU 58

2.2.1 Mẫu bệnh phẩm 58

2.2.2 Các dòng tế bào được sử dụng trong nghiên cứu 59

2.2.3 Sinh phẩm 60

2.2.4 Các chủng vi rút mẫu chứng 63

2.2.5 Trang thiết bị và dụng cụ 64

2.3 SƠ ĐỒ TÓM TẮT NGHIÊN CỨU 65

2.3.1 Sơ đồ tóm tắt mục tiêu 1 65

2.3.2 Sơ đồ tóm tắt mục tiêu 2 66

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 67

2.4.1 Phương pháp Realtime RT-PCR 67

2.4.2 Phân lập vi rút 70

2.4.3 Định typ vi rút bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) 71

2.4.4 Kỹ thuật giải trình tự gen 73

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 77

2.5 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 77

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 78

3.1 ĐẶC ĐIỂM NHÓM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 78

3.1.1 Kết quả thu thập mẫu theo thời gian trong giai đoạn nghiên cứu 78 3.1.2 Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu theo tuổi và giới 80

3.2 KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TYP CÁC TÁC NHÂN VI RÖT GÂY VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP 81

3.2.1 Xác định các tác nhân vi rút gây viêm đường hô hấp cấp 81

3.2.2 Sự phân bố các vi rút gây viêm đường hô hấp cấp theo thời gian 83

3.2.3 Sự phân bố các họ vi rút gây viêm đường hô hấp cấp tại miền Bắc Việt Nam, 2013-2016 84

3.3 ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA VI RÚT CÚM 88

3.3.1 Kết quả phân lập và định typ vi rút cúm, 2013-2016 89

3.3.2 Đặc điểm di truyền phân đoạn gen HA và NA của vi rút cúm

A/H1N1pdm09 phân lập từ bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp, 2013-2016

90

3.3.3 Đặc điểm di truyền của phân đoạn gen HA, NA của vi rút cúm A/H3N2 phân lập từ bệnh nhân VĐHHC, 2013-2016 96

3.3.4 Đặc điểm di truyền của vi rút cúm B phân lập từ bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp, 2013-2016 103

3.3.5 Đặc tính kháng nguyên vi rút cúm phân lập từ bệnh phẩm viêm đường hô hấp cấp tại miền Bắc, 2013-2016 110

3.4 ĐẶC ĐIỂM CÁC VI RÖT KHÁC GÂY VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN KHU VỰC MIỀN BẮC, 2013-2016 114

3.4.1 Phân bố các tác nhân vi rút đường hô hấp khác theo thời gian nghiên cứu 116

3.4.2 Phân bố các tác nhân vi rút đường hô hấp khác theo lứa tuổi 117

3.4.3 Kết quả phân lập vi rút đường hô hấp khác 120

KẾT LUẬN 126

KIẾN NGHỊ 128

TÀI LIỆU THAM KHẢO 130

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Mô hình cấu trúc virion của vi rút cúm 15

Hình 1 2 Hệ gen của vi rút thuộc họ Orthomyxoviridae 16

Hình 1 3 Sự thay đổi nhỏ và lớn kháng nguyên của vi rút cúm 17

Hình 1 4 Chu trình nhân lên của vi rút cúm vào tế bào vật chủ 18

Hình 1 5 Giải phẫu bệnh tổ chức phổi nhiễm vi rút cúm A/H1N1pdm09 21

Hình 1 6 Nhóm thuốc ức chế neuraminidase (NAIs) 25

Hình 1 7 Mô hình cấu trúc virion của vi rút họ Paramyxoviridae 28

Hình 1 8 Hệ gen của vi rút thuộc họ Paramyxoviridae 28

Hình 1 9 Chu trình nhân lên của vi rút họ Paramyxoviridae 30

Hình 1 10 Cấu trúc virion của Piconarviridae 37

Hình 1 11 Hệ gen của vi rút thuộc họ Piconarviridae 37

Hình 1 12 Chu kỳ sống của vi rút Picona 38

Hình 1 13 Hình thái của Adenoviridae 41

Hình 1 14 Cấu trúc hệ gen Adeno 42

Hình 1 15 Quá trình nhân lên ở vi rút Adeno 43

Hình 1 16: Phân tích Real time RT-PCR 54

Hình 2 1 Định typ vi rút bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu 71

Hình 2 2 Sơ đồ thực hiện phản ứng HI 72

Hình 3 1 Kết quả thu thập mẫu theo tháng trong giai đoạn nghiên cứu 2013-2016 79

Hình 3 2 Sự tương quan giữa tác nhân vi rút gây viêm đường hô hấp cấp và số mẫu thu thập theo thời gian 83

Hình 3 3 Tỷ lệ các vi rút gây viêm đường hô hấp cấp 86

Hình 3 4 Cây gia hệ phân đoạn gen HA 1778 nucleotide của vi rút cúm A/H1N1pdm09, 2013-2016 91

Hình 3 5 Cây gia hệ phân đoạn gen NA 1413 nucleotide của vi rút cúm A/H1N1pdm09, 2013-2016 92 Hình 3 6 Phân tích gia hệ nhóm 6 vi rút cúm A/H1N1pdm09 lưu hành tại miền Bắc, 2013-2016 94 Hình 3 7 Cây gia hệ phân đoạn gen HA 1184 nucleotide của vi rút cúm A/H3N2, 2013-2016 97 Hình 3 8 Cây gia hệ phân đoạn gen NA 1455 nucleotide của vi rút cúm A/H3N2, 2013-2016 98 Hình 3 9 Cây gia hệ vi rút cúm A/H3N2 theo từng năm, 2013-2016 99 Hình 3 10 Cây gia hệ phân đoạn gen HA 1115 nucleotide của vi rút cúm B/Victoria, 2013-2016 104 Hình 3 11 Cây gia hệ phân đoạn gen HA 1115 của vi rút cúm B/ Yamagata, 2013-2016 105 Hình 3 12 Cây gia hệ vi rút cúm B dòng Vitoria lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2013 và 2016 107 Hình 3 13 Cây gia hệ cúm B dòng Yamagata lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2013-2016 109 Hình 3 14 Phân bố tác nhân vi rút đường hô hấp khác theo thời gian nghiên cứu 116 Hình 3 15 Phân bố các tác nhân vi rút viêm đường hô hấp cấp theo lứa tuổi 117 Hình 3 16 Hình ảnh CPE của vi rút RSV trên dòng tế bào cảm nhiễm Hep2

(độ phóng đại x200) 122

Hình 3 17 Hình ảnh CPE của vi rút Adeno trên dòng tế bào cảm nhiễm A549

(độ phóng đại x200) 123

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2 1 Các dòng tế bào thường trực dùng trong phân lập vi rút cúm và các

vi rút hô hấp khác 59 Bảng 2 2 Hệ thống mồi và probe sử dụng phát hiện vi rút cúm bằng phương pháp Realtime RT-PCR 60 Bảng 2 3 Hệ thống mồi và probe sử dụng phát hiện vi rút hô hấp khác bằng phương pháp Realtime RT-PCR 61 Bảng 2 4 Hệ thống mồi cho giải trình tự phân đoạn gen HA, NA 62 Bảng 2 5 Hệ thống mẫu chứng sử dụng trong nghiên cứu 63 Bảng 2 6 Chủng chuẩn vi rút cúm trong nghiên cứu di truyền và đặc tính kháng nguyên 64 Bảng 3 1 Kết quả thu thập mẫu trong giai đoạn nghiên cứu 2013-2016 78 Bảng 3 2 Phân bố bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp theo tuổi và giới 80 Bảng 3 3 Tỷ lệ phát hiện tác nhân vi rút gây viêm đường hô hấp cấp, 2013-

2016 82 Bảng 3 4 Sự phân bố các họ vi rút gây viêm đường hô hấp cấp tại miền Bắc, 2013-2016 84 Bảng 3 5 Các vi rút gây viêm đường hô hấp cấp tại miền Bắc, 2013-2016 86 Bảng 3 6 Kết quả phân lập vi rút cúm năm 2013-2016 89 Bảng 3 7 Sự thay đổi các axit amin trong nhóm 6 của các vi rút

A/H1N1pdm09 lưu hành tại miền Bắc, 2013-2016 95 Bảng 3 8 Nhóm/ phân nhóm trên cây gia hệ của vi rút cúm A/H3N2 lưu hành tại miền Bắc, 2013-2016 100 Bảng 3 9 Sự thay đổi axit amin của các vi rút H3N2 theo thời gian và

nhóm/phân nhóm 102 Bảng 3 10 Sự thay đổi trên protein HA của vi rút cúm B dòng Yamagata lưu hành tại Việt Nam, 2013-2016 110

Bảng 3 11 Kết quả xác định đặc tính kháng nguyên vi rút cúm phân lập từ bệnh phẩm viêm đường hô hấp cấp, 2013-2016 111 Bảng 3 12 Phân bố các vi rút khác gây viêm đường hô hấp cấp 114 Bảng 3 13 Phân bố các tác nhân vi rút theo nhóm tuổi 118 Bảng 3 14 Kết quả phân lập các vi rút khác gây viêm đường hô hấp cấp 121

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Control and Prevention

Trung tâm Phòng ngừa và Kiểm soát bệnh – Mỹ

Assay

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu

transcriptase-Loop-mediated isothermal amplification

Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên

mã ngược Realtime

RT-PCR

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

Phương pháp sao chép ngược chuỗi polymerase theo thời gian thực

Infection

Viêm đường hô hấp cấp tính

Tế bào ung thư biểu mô phổi

Epithelial Cells

Tế bào biểu mô thận khỉ

Organization

Tổ chức Y tế thế giới

Surveilance and Response System

Hệ thống phản ứng và giám sát cúm toàn cầu

MỞ ĐẦU

Viêm đường hô hấp cấp (VĐHHC) do căn nguyên vi rút là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu tại các nước đang phát triển Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có khoảng 4,5 triệu trẻ em dưới 5 tuổi tử vong hàng năm do VĐHHC và do căn nguyên vi rút chiếm 40% trong tổng số đó [69] Các tác nhân vi rút thường gặp như vi rút cúm mùa

(Influenzavirus), vi rút hợp bào đường hô hấp (RSV), vi rút á cúm (Parainfluenzavirus) đã được ghi nhận Bên cạnh đó sự xuất hiện của các tác nhân vi rút mới như vi rút cúm A/H5N1 (1997), metapneumovirus (hMPV) (2001), SARS-CoV (2003), cúm A/H1N1 đại dịch (2009), vi rút MERS-CoV

(tháng 9/2012) và gần đây nhất là vi rút cúm A/H7N9 lây từ gia cầm sang người tại Trung Quốc (4/2013)…[31, 142] đã làm tăng mối quan ngại cho sức khỏe cộng đồng, đặc biệt đối với trẻ em và người già (>65 tuổi) Trong khi

đó, thuốc kháng vi rút dùng trong điều trị đặc hiệu là hạn chế, vắc xin dự phòng của nhiều tác nhân vẫn còn trong giai đoạn nghiên cứu và phát triển

Vi rút gây VĐHHC thường mang tính chất mùa tại các nước có khí hậu

ôn đới, trong khi Việt Nam là nước nhiệt đới, có sự khác biệt rõ rệt của khí hậu tại 2 khu vực miền Bắc và miền Nam Do phần lớn các tác nhân vi rút gây bệnh VĐHHC có sự đa dạng di truyền và đặc tính kháng nguyên nên việc nghiên cứu để lựa chọn vi rút phát triển vắc xin phòng bệnh có tính ổn định cao và đại diện cho quần thể vi rút lưu hành là cần thiết Các nghiên cứu trước đây về vi rút VĐHHC đã có tại Việt Nam sử dụng phương pháp phân lập vi rút trên tế bào cảm thụ hoặc phương pháp PCR thông thường nên chưa mang tính đồng bộ, chưa phản ánh được đầy đủ tỷ lệ lưu hành và đặc điểm của các loại vi rút gây VĐHHC

Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật trong lĩnh vực Y-Sinh học tại Việt Nam những năm gần đây, kỹ thuật Realtime RT-PCR đã được triển

khai nhằm phát hiện toàn bộ các tác nhân vi rút gây VĐHHC với độ chính xác cao trong thời gian ngắn giúp cho các bác sĩ lâm sàng có định hướng điều trị hiệu quả Tuy nhiên, thông tin về vai trò, đặc điểm vi rút học của các tác nhân

vi rút gây VĐHHC tại Việt Nam còn hạn chế Xuất phát từ lý do trên, chúng

tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền và đặc tính kháng

nguyên của một số tác nhân vi rút gây viêm đường hô hấp cấp trên bệnh nhân tại bệnh viện ở miền Bắc Việt Nam, 2013-2016‖ với mục tiêu:

1 Xác định các tác nhân vi rút gây viêm đường hô hấp cấp bằng phương pháp Realtime RT-PCR

2 Phân tích đặc điểm di truyền, tính kháng nguyên một số tác nhân vi rút chủ yếu gây viêm đường hô hấp cấp trong giai đoạn nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu

- Xác định 12 tác nhân vi rút bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR tại Trung tâm Cúm Quốc gia – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

Nội dung 2: Phân tích đặc điểm di truyền, tính kháng nguyên một số tác nhân

vi rút chủ yếu gây viêm đường hô hấp cấp trong giai đoạn nghiên cứu

- Phân lập các mẫu bệnh phẩm được xác định dương tính với các tác nhân vi rút cúm, RSV, hMPV trên tế bào cảm thụ (MDCK, Vero, LLC/MK, Hep 2…)

- Xác định hình thái tế bào bị huỷ hoại bởi các tác nhân vi rút hô hấp

RSV, hMPV, Adeno…

- Khuếch đại chủng vi rút, giải trình tự nucleotide một số mẫu đại diện theo thời gian của vi rút cúm

- So sánh phân đoạn gen HA và NA với các vi rút cúm lưu hành tại một

số nước khác trong khu vực và trên thế giới; xây dựng cây gia hệ

- Nghiên cứu giám sát hiệu quả cho việc phát hiện các chủng vi rút nguy hiểm mới từ các hiện tượng đột biến hoặc trao đổi tích hợp gen và có thể

là về nguy cơ xuất hiện dịch cũng như mức độ lan rộng của dịch

Tính mới, ý nghĩa khoa học và sự cần thiết của vấn đề cần nghiên cứu

- Là công trình nghiên cứu giám sát một cách toàn diện 12 tác nhân vi rút

hô hấp phổ biến gây VĐHHC tại miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2013-2016 bằng phương pháp Realtime RT-PCR, đã cung cấp các thông tin cập nhật về

sự lưu hành các vi rút gây VĐHHC tại miền Bắc Việt Nam, bổ sung vào các thông tin chung tại khu vực và trên hệ thống giám sát toàn cầu

- Là công trình công bố các kết quả nghiên cứu về đặc tính vi rút học của chủng vi rút A/H1N1pdm09, A/H3N2 và B trong giai đoạn nghiên cứu (2013-2016) một cách đầy đủ

- Đây là thông báo đầu tiên về nhiễm hMPV trong mẫu bệnh phẩm thu thập tại đối tượng người lớn (19-59 tuổi) tại Việt Nam Kết quả nghiên cứu này sẽ cung cấp thêm thông tin vào các nghiên cứu trên thế giới về gánh nặng bệnh tật của nhiễm hMPV, góp phần thúc đẩy phát triển vắc xin phòng chống hMPV trong tương lai

Nghiên cứu là một trong những hoạt động không những cung cấp các kết quả khoa học, mà còn góp phần trong công tác đảm bảo sức khoẻ cộng đồng cho nhân dân Việt Nam Điều lệ Y tế quốc tế (IHR-2005) đã được 194 quốc gia và vùng lãnh thổ cam kết thực hiện, Việt Nam cũng là một thành viên thành viên đã và đang triển khai thực hiện chương trình An ninh Y tế

toàn cầu (GHS) với sự hỗ trợ của TCYTTG (WHO) và Trung tâm Kiểm soát bệnh tật Mỹ (CDC)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP VÀ ĐẶC ĐIỂM VI RÖT HỌC CỦA CÁC TÁC NHÂN VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP THƯỜNG GẶP

Viêm đường hô hấp cấp (VĐHHC) do căn nguyên vi rút là nguyên nhân chính của tỷ lệ mắc, nhập viện, tử vong trong các bệnh lý đường hô hấp trên phạm vi toàn cầu, đặc biệt tại các nước đang phát triển VĐHHC thường gây bệnh nặng cho trẻ em (<5 tuổi) và người già (>65 tuổi), tuỳ thuộc vị trí địa lý, điều kiện khí hậu, căn nguyên vi rút gây viêm đường hô hấp khác nhau trong từng quốc gia Tuy nhiên, các vi rút thường gặp tại các bệnh nhân nằm

viện được ghi nhận từ 5 họ: Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae,

Picornaviridae, Coronaviridae và Adenoviridae Mỗi loại vi rút có thể chịu

trách nhiệm cho các hội chứng/ triệu chứng lâm sàng khác nhau phụ thuộc vào lứa tuổi, hệ miễn dịch của từng cá thể Ngược lại, mỗi triệu chứng/ hội chứng viêm đường hô hấp cấp có thể gây nên bởi nhiều tác nhân vi rút khác nhau [64] Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu các vi rút thuộc 4 họ:

Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Picornaviridae và Adenoviridae

VĐHHC thường biểu hiện tại đường hô hấp trên hoặc đường hô hấp dưới, mặc dù VĐHHC được phân loại theo tác nhân gây bệnh, nhưng thông thường được gọi theo hội chứng: cảm lạnh, viêm phế quản, viêm thanh quản,

viêm phổi…và tương ứng với các hội chứng đó là các tác nhân liên quan (VD:

viêm tiểu phế quản thường gặp do vi rút hợp bào đường hô hấp - RSV)

VĐHHC do căn nguyên vi rút được lây truyền từ người bệnh sang người lành trong quá trình tiếp xúc: nói chuyện, ho, hắt hơi, các giọt khí mang tác nhân gây bệnh sẽ lưu hành trong không khí, và có thể nhiễm vào đường thở người bên cạnh Ngoài ra, vi rút cũng có thể lây truyền khi tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với người bệnh: bắt tay, khăn giấy, chất thải (vi rút đường ruột)

Một số vi rút gây bệnh mang tính theo mùa và được biểu hiện rõ tại các nước có khí hậu ôn đới như vi rút cúm và RSV thường gây dịch vào mùa đông Những hiểu biết về xu hướng và mùa của VĐHHC trong cộng đồng có thể cung cấp các thông tin cần thiết để cảnh báo về sự bùng phát dịch cũng như xây dựng các chiến lược phòng bệnh, giảm thiểu sự lây truyền trong cộng đồng [3, 64]

1.1.1 Vi rút họ Orthomyxoviridae

Vi rút thuộc họ Orthomyxoviridae bao gồm 7 loài: vi rút cúm A, vi rút

cúm B, vi rút cúm C, vi rút cúm D, Isavirus, Thogotovirus và Quaranjavirus, trong đó 3 loài vi rút cúm A, B và C (vi rút cúm mùa) được ghi nhận là tác nhân chính gây VĐHHC [135] Trong đó vi rút cúm A lưu hành phổ biến trên gia cầm, người và các động vật khác như lợn, ngựa… là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu Vi rút cúm B thường gây bệnh nhẹ nhưng cũng

có thể bộc phát thành dịch vào mùa đông, đặc biệt là ở trẻ em Vi rút cúm C chưa thấy biểu hiện gây bệnh nguy hiểm cho người Vi rút cúm A có tổng số

256 phân typ khác nhau dựa vào kháng nguyên (KN) bề mặt HA và NA Trong số đó, chỉ có các phân typ A/H1N1; A/H3N2; A/H2N2 và gần đây là A/H1N1pdm09 được ghi nhận gây bệnh cho người Nguồn gốc các vụ đại dịch cúm thế kỷ XX, XXI với căn nguyên là vi rút cúm A như sau:

- H1N1 (1918): Có nguồn gốc từ vi rút cúm gia cầm, do đột biến tại các điểm quan trọng liên quan đến khả năng thích nghi trên vật chủ là người (gen HA) [115]

- H2N2 (1957): Do trao đổi tích hợp giữa vi rút cúm người và vi rút cúm gia cầm: vi rút cúm mới có gen HA, NA và PB1 của gia cầm [96]

- H3N2 (1968): Do trao đổi tích hợp giữa vi rút cúm người và vi rút cúm gia cầm: vi rút cúm mới có gen HA và gen PB1 của gia cầm [122]

- H1N1 (1977): Vi rút cúm mới tái tạo lại từ vi rút cúm A/H1N1 đã lưu hành vào đầu năm có thể là do sơ xuất trong phòng thí nghiệm [122]

- H1N1pdm (2009): Do trao đổi tích hợp giữa vi rút cúm lợn (H1N1, H3N2),

vi rút cúm gia cầm (H5N1) và vi rút cúm người (H3N2) [107]

1.1.1.1 Đặc điểm vi rút họ Orthomyxoviridae

a Hình thái và cấu trúc phân tử

Hình 1 1 Mô hình cấu trúc virion của vi rút cúm [145]

Orthomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài, thường có hình

cầu với cấu trúc xoắn, đường kính 80-120nm, đôi khi cũng thấy dạng sợi dài đến vài µm Bề mặt vi rút có đính các gai bản chất là glycoprotein, đó là kháng nguyên hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Protein HA gây ngưng kết hồng cầu và có vai trò gắn vi rút vào tế bào vật chủ, protein NA có vai trò phá vỡ liên kết giữa vi rút và tế bào để giải phóng vi rút (Hình 1.1)

Vật liệu di truyền của vi rút cúm A, B có hệ gene ARN được cấu trúc

từ 8 phân đoạn riêng biệt và không có gene mã hóa enzym sửa chữa ARN, tạo điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các đột biến điểm trong các phân đoạn genqua quá trình sao chép nhân lên của vi rút, hoặc trao đổi các phân đoạn gen giữa các chủng vi rút cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng vi rút cúm A, B mới Cấu trúc vi rút có 8 phân đoạn, có chiều dài khoảng 10 đến 15 kb Mỗi phân đoạn mã hoá cho 1 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc: 7 protein cấu

trúc: PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc: NS1, NS2 và M2 đối với vi rút cúm A và NP đối với vi rút cúm B (Hình 1.2)

Hình 1 2 Hệ gen của vi rút thuộc họ Orthomyxoviridae [145]

Trong đó PB1, PB2: là enzym phiên mã, tìm thấy trong quá trình tổng hợp mARN, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp vi rút thế hệ mới vào trong

tế bào chủ [81], thích ứng với nhiệt độ trên người và trên cúm gia cầm [111],

có hiện tượng tế bào chết theo chương trình (appoptosis) [120] PA là một tiểu đơn vị của polymerase, kéo dài phiên mã trong quá trình tổng hợp ARN của vi rút [72] HA (hemaglutinin): có cấu trúc trimer, thuỷ phân thành HA1

và HA2, là cơ sở cho khả năng nhiễm trùng Cầu nối HA1 và HA2 gồm một

số aminoacid được mã hoá bởi một chuỗi oligonucleotid, là điểm cắt của enzym protease là vùng quyết định độc lực của vi rút [20] NP (nucleoprotein): là protein được glucosyl hoá, chứa một trong các kháng nguyên đặc hiệu typ, phân biệt 3 typ cúm A, B, C [81]; NA (neuraminidase): phân cắt phân tử axit sialic của phân tử HA từ các virion mới tổng hợp, làm lộ

HA ra ngoài, tăng khả năng nhiễm trùng Trên các nghiên cứu phân tử cho thấy phần đầu 5’ của gen này có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng

vi rút cúm A liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau [19] M1 tham gia vào quá trình lắp ráp vi rút và nảy chồi, là kháng nguyên đặc hiệu typ, ổn định cấu trúc vi rút [72];

M2 là kênh ion, cần thiết cho khả năng lây nhiễm của vi rút NS1-NS2: là protein phi cấu trúc, kết thúc quá trình tổng hợp protein của tế bào chủ, chỉ có trong tế bào nhiễm vi rút

b Tính đa dạng về vật liệu di truyền và sự tiến hóa của vi rút cúm A

Vi rút cúm A (không xảy ra đối với vi rút cúm B hoặc C) có đối tượng gây nhiễm phong phú: gia cầm (gà, vịt, ngan ), thủy cầm, chim di cư, động vật có vú và người nên vật liệu di truyền ARN của vi rút luôn chịu tác động của vật chủ trong quá trình xâm nhiễm, phiên mã, nhân lên, tích hợp, nảy chồi

và giải phóng thế hệ mới ra khỏi tế bào chủ Kết quả của quá trình này là các biến đổi trong vật liệu di truyền hoặc có sự pha trộn các phân đoạn gen của vi rút cúm A khác nhau khi cùng đồng nhiễm trên một tế bào (trao đổi và tích hợp) Hệ quả của nó là sự thay đổi kháng nguyên: thay đổi nhỏ kháng nguyên (antigenic drift) hoặc thay đổi lớn kháng nguyên (antigenic shift) (Hình 1.3)

Đó chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch lẻ tẻ hoặc đại dịch cúm Những thay đổi trong vật liệu di truyền của vi rút cúm A là động lực cho sự tiến hóa của nó [12]

Hình 1 3 Sự thay đổi nhỏ và lớn kháng nguyên của vi rút cúm

Vật liệu di truyền của vi rút cúm A với các phân đoạn rời kết hợp với đặc tính không ổn định, kém bền vững đã làm cho vi rút cúm trở thành tác nhân sinh học nguy hiểm với sức khỏe cộng đồng Đại dịch cúm xảy ra khi xuất hiện một vi rút cúm A phân typ hoàn toàn mới, thoát khỏi sự bảo vệ của

hệ thống miễn dịch đã có trong quần thể người Vi rút cúm A phân typ mới xuất hiện khi [116]:

+ Có sự trao đổi, tích hợp vật liệu di truyền của các vi rút cúm A đã biết + Có sự lây truyền chéo vi rút giữa các loài

Những giả thuyết trên đã được chứng minh khi nghiên cứu về các vi rút cúm A gây đại dịch trong thế kỷ XX, XXI

c Cơ chế nhân lên của vi rút cúm vào tế bào vật chủ

Hình 1 4 Chu trình nhân lên của vi rút cúm vào tế bào vật chủ [72]

Bước đầu, vi rút gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng sinh chất của tế bào chủ nhờ gai glycoprotein HA theo nguyên tắc khóa - chìa Các thụ thể đặc hiệu có bản chất là các axit sialic (N- acetyl neuraminic acid – NANA) Sau

đó vi rút xâm nhập vào bên trong tế bào theo cơ chế nhập bào Các virion vi rút ấn sâu vào màng tế bào tạo hốc rồi khép lại tạo túi nội bào hay bọng (endosome) nằm bên trong tế bào chất Bơm proton trong endosome vận

chuyển H+ vào làm cho pH trong endosome giảm xuống 5, pH thấp tạo điều kiện cho protein F (fusion) chồi lên cắm vào màng endosome như chiếc neo, kéo vỏ ngoài vi rút sát với endosome và tiến hành dung hợp với màng endosome để giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất Sự hợp nhất này chỉ

protease phổ biến là furin Phân tử HA2 có đầu – N đóng vai trò hoà tan trung gian giữa vỏ vi rút và màng nội bào Protein M2 ở vi rút cúm A hay còn gọi là kênh ion (ion- channels) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình thay đổi

pH và dung hợp này [109]

Trong nhân, sợi ARN (-) ban đầu được làm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN (+) theo cơ chế bổ sung [cARN (+)] nhờ enzym ARN - polymerase phụ thuộc ARN của vi rút Chính các cARN (+) này lại được dùng làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN (-) mới là nguyên vật liệu di truyền của vi rút Các sợi ARN (-) được tạo thành này là một sợi hoàn chỉnh về độ dài (có độ dài đủ - full length ARN), không được mũ hoá ở đầu 5’ và không được adenyl hoá ở đầu 3’ Các ARN (-) mới này một phần được phiên mã tạo ra các mRNA (+) ngắn hơn Sau đó, quá trình dịch mã thành các protein với các chức năng khác nhau xảy ra ở tế bào chất Các protein này bao gồm 7 protein cấu trúc PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc NS1, NS2 và M2 đối với vi rút cúm A và NB đối với vi rút cúm B Các protein NS1, M1 và NP được vận chuyển vào nhân kết hợp với sợi ARN (-) mới tổng hợp để hình thành nên nucleocapsid, sau đó được vận chuyển ra tế bào chất Tại đây, các protein HA, NA, M2 được chuyển qua lưới nội chất tới bộ máy Golgi, tương tác với nhau, bao bọc nucleocapsid, khởi đầu cho việc nảy chồi của vi rút Hạt virion mới được tạo thành bằng cách nảy chồi từ màng sinh chất (Hình 1.4) Phân tử NA phân cắt axit sialic giải phóng vi rút ra khỏi tế bào chủ để bắt đầu một chu trình lây nhiễm mới và tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [84, 85]

Quá trình nhân lên của RNA vi rút cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các vi rút khác Sau khi hợp nhất màng, nucleocapsid được vận chuyển vào trong nhân tế bào [132]

Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt vi rút mới của vi rút cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6 giờ) Sự tạo thành các hạt vi rút mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo chương trình làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [114, 124]

d, Dịch tễ học

Tại các nước ôn đới, dịch cúm thường xảy ra vào mùa đông trong khi tại các nước nhiệt đới, vi rút cúm có thể lưu hành quanh năm Biểu hiện lâm sàng từ nhẹ đến nặng, nguy hiểm và có thể tử vong Bệnh nhân nhập viện hoặc tử vong do cúm thường gặp ở các nhóm nguy cơ cao (trẻ em, người già trên 65 tuổi, có bệnh lý nền) [117], số ca nhiễm cúm có biểu hiện nặng từ 3-5 triệu/ năm trên toàn cầu và trong số đó 250.000 đến 500.000 tử vong Hiện tại, dịch cúm tại các nước đang phát triển chưa có những thống kê rõ ràng, tuy nhiên ước tính 99% trường hợp tử vong ở trẻ nhỏ (< 5 tuổi) viêm phổi có liên quan đến nhiễm vi rút cúm đã đươc ghi nhận tại một số nghiên cứu [82]

1.1.1.2.Bệnh cúm

Khi vi rút cúm thâm nhiễm vào đường hô hấp thông qua các sol khí (aerosol) hoặc tiếp xúc trực tiếp với nước bọt, dịch tiết của bệnh nhân, vi rút bám vào tế bảo biểu mô đường hô hấp và bắt đầu nhân lên tại cả đường hô hấp trên và hô hấp dưới trong nhiễm tự nhiên cũng như trong thực nghiệm

a Những thay đổi bệnh lý tại hệ hô hấp

Hình 1 5 Giải phẫu bệnh tổ chức phổi nhiễm vi rút cúm A/H1N1pdm09 [88]

A: Dịch phù nề chứa tơ huyết ( fibrin) trong phế nang ( mũi tên)

B: Dấu hiệu tổn thương phế nang lan toả:giả mạc bám vào thành phế nang, các tế bào viêm thâm nhập trong lòng phế nang

C: Tổ chức xơ hoá tổ chức kẽ và thành phế nang

D: Hoại tử tiểu phế quản và các lông mao tế bào biểu mô đường hô hấp

Nhiễm vi rút cúm không biến chứng thường chỉ gây viêm phế quản với các hoá tế bào biểu sự mất các nhung mao trên tế bào biểu mô đường hô hấp, gây ra thoái hoá tế bào, hình thành các giả mạc, phù nề, xung huyết, xuất tiết

Trong những trường hợp biến chứng viêm phổi có thể gây tử vong, các tổn thương nặng nề bao gồm: xuất huyết, phổi đông đặc, thành vách phế nang dày, phù, các mao mạch xung huyết, lòng phế nang chứa nhiều sợi tơ huyết, hồng cầu, ít dịch phù, bạch cầu và tế bào biểu mô long của phế nang Sau đó,

tổn thương lan toả trong phế nang, các tế bào biểu mô đường hô hấp bị hoại

tử và một số trường hợp tổ chức liên kết thành phế nang tăng sinh, phát triển vào trong lòng phế nang tạo thành tổ chức hạt và xơ hoá [88] (Hình 1.5)

Kháng nguyên vi rút cúm xuất hiện trên hầu hết các tế bào đường hô hấp và nhân lên trong tổ chức phổi sau 3 tuần nhiễm bệnh, gây ra hiện tượng chết có trình tự ở tế bào nhiễm vi rút Cho dù viêm phổi nặng thường liên quan đến đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào và có thể được tăng cường sự chuyển dịch của tế bào lympho T được chứng minh trong thử nghiệm trên mô hình động vật, tuy nhiên vai trò của đáp ứng miễn dịch tế bào chưa được xác định rõ ràng trên người Bệnh nhân tử vong do nhiễm vi rút cúm thường biểu hiện bệnh tại các tổ chức khác như: sung huyết lan toả và phù nề não, viêm cơ tim, xuất huyết tiêu hoá, hoại tử cơ được ghi nhận trong hơn 1/3 những

b Bệnh sinh

Liên quan trực tiếp đến nhiễm vi rút cúm là đường hô hấp trên và dưới,

vì vậy biểu hiện thường gặp nhất là ho và kích ứng phế quản trong giai đoạn đầu Viêm phế quản và những bất thường về chức năng phổi có thể diễn biến trong vài tuần hoặc vài tháng sau đó Chức năng phổi sẽ bị ảnh hưởng được ghi nhận đó là hạn chế trao đổi khí với sự tăng ngưỡng áp oxy phế nang, giảm khả khuếch tán CO2 [121]

Nguyên nhân của các chỉ số chức năng phổi thay đổi trong nhiễm vi rút cúm liên quan một phần đến sự xuất hiện các yếu tố trung gian miễn dịch (cytokine) tiền viêm Rất nhiều các cytokines và chemokines được xác nhận như interferon alpha (IFN-α), (IFN-y), interleukin -1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 và IL-12 được phát hiện trong đường hô hấp trong các thử nghiệm trên động vật Nồng độ của IFN-œ và chemokine MIP-2 trong phế quản tương đồng với sự lan toả của viêm phổi Cơ chế tạo ra cytokines chưa được xác

định, tuy nhiên protein HA của vi rút cúm kích hoạt các yếu tố tạo cytokine được đề cập, ngoài ra protein NA cũng hoạt hoá TNF và IL tạo ra bởi tế bào đơn nhân [29, 121]

c Triệu chứng lâm sàng

Những biểu hiện lâm sàng đầu tiên của bệnh nhân nhiễm cúm chỉ xuất hiện sau giai đoạn ủ bệnh Những dấu hiệu này thường khó phân biệt với các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp khác như á cúm, hợp bào đường hô hấp Chính vì vậy, để phân biệt chẩn đoán sớm những trường hợp nhiễm virút cúm, đặc biệt là virút cúm A/H5N1, cần kết hợp các biểu hiện lâm sàng và các yếu tố dịch tễ có liên quan

-Thời gian ủ bệnh: mặc dù cơ thể đã nhiễm virút nhưng chưa được xác định là nguồn lây nhiễm Thời gian ủ bệnh thường từ 1-5 ngày, tùy thuộc vào nồng

độ virút cũng như tình trạng miễn dịch của mỗi người Không có biểu hiện triệu chứng trong giai đoạn ủ bệnh

- Thời gian khởi phát

hiện ngay ngày đầu tiên, sau đó sẽ giảm dần vào ngày thứ 2 hoặc thứ 3 và khỏi vào ngày thứ 6 của bệnh

+Đau đầu, đau mỏi người, ho khan, có thể kèm theo viêm long đường

hô hấp

Đặc điểm lâm sàng bệnh cúm mùa giữa trẻ em và người lớn hầu như không có sự khác nhau Người già có thể sốt cao, mệt mỏi không kèm theo triệu chứng đường hô hấp, trong khi trẻ em có thể sốt cao kèm theo co giật

d Đáp ứng miễn dịch

Mỗi cá thể đều có thể nhiễm và mắc bệnh cúm nhiều lần trong đời, hồi phục sau khi nhiễm và có khả năng bảo vệ không tái nhiễm liên quan đến hệ thống miễn dịch đặc hiệu của vật chủ Quan sát tại đại dịch cúm A/H1N1 năm

1977 cho thấy những người đã nhiễm vi rút tương tự trước đấy (có thể từ 20 năm trước) đều rất ít bị ảnh hưởng, chứng tỏ đáp ứng miễn dịch có thể lâu bền

và có khả năng bảo vệ chống tái nhiễm hoặc mắc bệnh Số liệu huyết thanh đã chứng minh việc tái nhiễm bởi vi rút cùng phân típ hoặc có đặc điểm kháng nguyên tương đồng thường có biểu hiện lâm sàng nhẹ hoặc không có triệu chứng ở người trưởng thành [29, 121]

Hệ thống miễn dịch bẩm sinh bao gồm hàng rào sinh lý (dịch nhày), các đại thực bào, các nhóm cytokine, interferons (IFNs) và các gen khởi động IFN sẽ tạo ra chiến tuyến đầu tiên chống lại nhiễm vi rút cúm A Đáp ứng miễn dịch thích nghi ( đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào) được dàn xếp bởi các tế bào lympho B và T, với các tế bào nhớ mang dấu ấn các KN đặc hiệu có khả năng tóm bắt và trung hoà tác nhân Đáp ứng miễn dịch dịch thể tạo ra các KT đặc hiệu kháng HA có khả năng trung hoà vi rút cúm A Thêm vào đó, KT có thể gắn vào bề mặt tế bào nhiễm và tạo ra cytotoxicity trung gian tế bào phụ thuộc KT (antibody-dependent cell-mediated) hoặc bổ thể hoạt hoá Cho dù có rất nhiều loại KT trung hoà kháng vi rút cúm, miễn dịch

tế bào đóng vai trò chủ yếu trong chống lại vi rút cúm A Trong một chiều hướng khác, vi rút cúm A cũng phát triển rất nhiều phương cách để trốn thoát

sự giám sát miễn dịch của vật chủ để tái tạo thành công [29]

Trong thời gian nhiễm vi rút cúm, miễn dịch bẩm sinh cung cấp các biện pháp bảo vệ đầu tiên và kích thích phản ứng viêm Miễn dịch thích ứng cũng đóng vai trò quan trọng trong việc làm sạch tác nhân vi rút ở giai đoạn sau Ngoài ra, dịch nhày miễn dịch tạo ra từ các tổ chức hoặc một số cơ chế trung hoà vi rút hoặc hạn chế thâm nhập, sao chép vi rút trong giai đoạn nhiễm vi rút cúm, tuy nhiên vi rút cúm vẫn tiến hoá và gây bệnh thường niên

Vì vậy, việc nghiên cứu về hệ thống miễn dịch của vật chủ và cách lẩn tránh miễn dịch của vi rút cúm vẫn được tiếp tục phát triển rộng rãi

1.1.1.3 Điều trị và dự phòng

a Điều trị

Hiện nay, có 2 nhóm thuốc đƣợc sử dụng để dự phòng và điều trị cúm

Đó là:

-Nhóm thuốc ức chế hoạt động kênh ion M2: 2 loại thuốc là Amantadine

và Rimantadine (Flumadine): ngăn cản sự xâm nhập của vi rút bằng cách ức chế hoạt động của kênh ion M2, do đó ngăn cản sự ―cởi áo‖ của vi rút

- Nhóm thuốc ức chế neuraminidase (NAIs): 4 loại thuốc (Hình 1.6)

Laninamivir

(Inavir®, Daiichi-sankyo

Hình 1 6 Nhóm thuốc ức chế neuraminidase (NAIs)

Oseltamivir (Tamiflu ®) và Zanamivir (Relenza ®): ngăn cản sự giải phóng vi rút khỏi tế bào nhiễm nhờ ức chế hoạt động của enzym neuraminidase (NA), là cơ chế hiệu quả nhất tác động vào vi rút Quá trình giải phóng của vi rút cúm phải có sự tham gia trực tiếp của enzym neuraminidase có tác dụng tách axit sialic từ màng glycoprotein của vi rút do đó vi rút đƣợc giải phóng ra khỏi tế bào nhiễm Nếu không có enzym này vi rút sẽ bị giữ lại bên trong tế bào và không có cơ hội tấn công sang các tế bào khác

Peramivir (Rapiacta ®) và Laninamivir (Inavir ®): 2 loại thuốc này đã được cấp phép tại Nhật Bản năm 2010 Tháng 1/2010, Nhật Bản thông qua một thuốc ức chế neuraminidase mới, peramivir, được tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp, cho phép sử dụng ở những bệnh nhân nặng không có khả năng sử dụng oseltamivir hoặc zanamivir - Amantadine và Rimantadine: ngăn cản sự xâm nhập của vi rút bằng cách ức chế hoạt động của kênh ion M2, do đó ngăn cản sự ―cởi áo‖ của vi rút

b Vắc xin dự phòng

Vắc xin phòng cúm được nghiên cứu và phát triển vào năm 1944 bởi

Dr Salk và Dr Francis Hàng năm, tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) dự đoán loại vi rút cúm lưu hành phổ biến có khả năng gây dịch và tiến hành lựa chọn,

đề xuất các vi rút dự tuyển cho thành phần vắc xin cúm mùa cho khu vực Bắc hoặc Nam bán cầu do mỗi mùa các vi rút cúm lưu hành phổ biến có thể khác nhau, có đột biến về di truyền so với các vi rút lưu hành những năm trước Có nhiều loại vắc xin cúm khác nhau đang lưu hành trên cơ sở số lượng các phân typ vi rút sử dụng trong thành phần vắc xin hoặc công nghệ sản xuất vắc xin: vắc xin sống giảm độc lực (Live Attenuated Influenza Vắc xin – LAIV) hay vắc xin bất hoạt (Inactivate Influenza Vắc xin - IIV) Vắc xin cúm cho tương lai được đề cập là một loại vắc xin lý tưởng có thể bảo vệ chống lại một phạm

vi rộng các phân typ vi rút cúm khác nhau, đây sẽ là sự thay đổi cơ bản so với các loại vắc xin cúm đang sử dụng

Hiện nay, các vắc xin đang lưu hành trên thị trường thế giới bao gồm vắc xin cúm theo mùa (vắc xin đa giá) bao gồm vi rút cúm A/H3N2, A/H1N1/09 đại dịch; vi rút cúm B được lựa chọn từ những chủng vi rút đại diện tương tự các vi rút lưu hành trong mùa dịch sắp tới hoặc là một vắc xin bao gồm 4 phân typ khác nhau của vi rút cúm: A/H1N1/09 đại dịch, A/H3N2,

B (Victoria), B (Yamagata) [94, 125] Các vắc xin đơn giá như vắc xin cúm

A/H5N1, A/H9N2… Vắc xin cúm A/H5N1được phát triển sau khi ghi nhận ảnh hưởng của vi rút cúm gia cầm A/H5N1 đến sức khỏe cộng đồng và nguy

cơ tiềm tàng của đại dịch cúm trên người Vi rút cúm A/H5N1 sử dụng trong phát triển vắc xin là vi rút ―trao đổi và tích hợp‖ (reassortant) được tổng hợp bằng kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetic) Vắc xin cúm A/H5N1 hiện tại cũng vẫn sử dụng công nghệ bất hoạt thông dụng toàn bộ hạt vi rút (Sinovac – Trung Quốc, Baxter – Mỹ); bất hoạt, kháng nguyên bề mặt (Novartis - Thụy Sĩ); bất hoạt, tách rời toàn bộ hạt vi rút (GlaxoSmithKline – GSK) và là vắc xin đơn giá Các loại vắc xin này được TCYTTG khuyến cáo chỉ nên phát triển dự trữ một số lượng nhất định [28]

1.1.2 Vi rút Paramyxoviridae

Các vi rút thường gặp gây VĐHHC thuộc họ Paramyxoviridae là vi rút

hợp bào đường hô hấp (RSV), hMPV, sởi và vi rút á cúm (vi rút parainfluenza)

1.1.2.1 Đặc điểm vi rút họ Paramyxoviridae

a Hình thái và cấu trúc phân tử

Họ Paramyxoviridae gồm các vi rút quan trọng gây bệnh cho người và

động vật như sởi, quai bị, á cúm (parainfluenza), hợp bào hô hấp (Respiratory Syncytial Virus - RSV), bệnh tả gà Newcastle, sốt chó (canine distemper), sốt trâu bò (rindepest) và một số bệnh đường hô hấp khác [64] Nhưng các vi rút thường gặp gây VĐHHC là vi rút hợp bào đường hô hấp (RSV), hMPV và

parainfluenza (á cúm phân typ 1, 2, 3) Paramyxoviridae được phân loại dựa

trên cấu trúc virion và hoạt tính neuraminidase (N):

+ Phân lớp Paramyxovirinae: chi Paramyxovirus (PIV 1, 3) có gai HN (haemagglutinin - neuraminidase), chi Rubalavirus (PIV2)

+ Phân lớp Pneumovirinae: chi Pneumovirus (RSV, hMPV): không có

gai HN (haemagglutinin - neuraminidase)

 Hình thái

Hình 1 7 Mô hình cấu trúc virion của vi rút họ Paramyxoviridae [145]

Virion thuộc loại đa hình thái, thường có hình cầu với đường kính 200nm, chứa 5-7 polypeptid và một phân tử ARN đơn (-), dài, khối lượng 5-

protein M không được glycosyl hoá Phía ngoài màng M là vỏ ngoài với các gai glycoprotein bề mặt dài khoảng 8nm (Hình 1.7) Virion bị bất hoạt bởi các dung môi hoà tan lipid, chất tẩy rửa, formaldehyde, các chất oxy hoá…

Đặc điểm đặc trưng là hạt vi rút được bao bọc bởi 2 lớp vỏ lipid với các gai glycoprotein mang tính kháng nguyên [64] Phần vỏ bao của vi rút

Paramyxo bao gồm hai cấu trúc glycoprotein: H-N và F Chúng tạo nên các

gai trên bề mặt của hạt vi rút Các glycoprotein lớn H, N có vai trò của hemagglutinin và neuraminidase là enzym ngưng kết hồng cầu động vật lông

vũ và giúp sự hấp phụ của vi rút trên tế bào cảm thụ Tuỳ từng loại vi rút

trong họ Paramyxoviridae có thể có gai HN hoặc không có: PIV 1, 3 có gai

HN, RSVkhông có gai HN thay vào đó là gai G

 Cấu trúc phân tử

Hình 1 8 Hệ gen của vi rút thuộc họ Paramyxoviridae [145]

Paramyxoviridae là họ vi rút có hệ gen ARN (-) không phân đoạn Bộ

gen của các Paramyxoviridae là phân tử ssRNA với 15k nu chứa bộ gen mã

hóa 6 loại protein đặc trưng của vi rút 6 gen đó có chức năng mã hóa protein Ngắn ARN của nucleocapsid, phosphoprotein P của nucleocapsid, các enzym polymerase chính của tiểu phần L, protein màng M không gắn đường, glycoprotein gắn màng G, H hay HN và glycoprotein hòa màng F (Hình 1.8)

Ngoài ra, các thành viên trong họ Paramyxoviridae còn có thêm từ một đến

năm loại gen điển hình mã hoá các protein phi cấu trúc để tăng cường quá trình phát triển của vi rút

Do vỏ lipoprotein của vi rút dễ vỡ nên thông thường hình ảnh của hạt vi rút trên kính hiển vi điện tử méo mó, vỡ và thành phần nucleoprotein thường chảy ra ngoài hạt vi rút Các polypeptid cấu trúc của vỏ bao gồm HN (hemagglutinin - neuraminidase) và F (fusion) protein từ các gai bề mặt và M (matrix) protein 3 protein khác cùng với ARN cấu thành nhân nucleoprotein của hạt vi rút và quá trình phiên mã có thể thực hiện với các vi rút có vật liệu

di truyền là ARN đơn âm Protein F cấu tạo bởi sự phân giải protein của tiền polypeptid, có vai trò rất quan trọng trong quá trình hòa màng của tế bào nhiễm và sau đó hình thành hợp bào (syncytial) Lớp vỏ bao ngoài (envelope)

là màng kép lipid, lớp màng này thu nhận được từ màng tế bào chủ Lớp màng bao ngoài bao gồm ba loại glycoprotein bề mặt: Protein gắn màng G, protein hòa màng F và protein kỵ nước SH Ngoài ra còn có protein M (matrix protein) là protein nằm ở trong của lớp vỏ envelope

Phân lớp pneumovirinae (hMPV và RSV) không có enzym neuraminidase Protein G không có hemagglutinin mà nó đảm nhiệm chức năng thay cho hemagglutinin để gắn vào thụ thể của tế bào [8]

b Cơ chế nhân lên của vi rút họ Paramyxoviridae

Quá trình nhân lên của vi rút bao gồm 4 giai đoạn: hấp phụ và xâm nhập, sao chép và phiên mã, dịch mã, lắp ráp và giải phóng Đầu tiên, vi rút gắn gai H vào thụ thể chứa axit sialic (hoặc protein điều hoà bổ thể/ membrane cofactor protein) trên bề mặt tế bào, sau đó gai F tiến hành dung hợp vỏ ngoài của vi rút với màng sinh chất của tế bào để đưa nucleocapsid

vào tế bào chất (Hình 1.9)

Hình 1 9 Chu trình nhân lên của vi rút họ Paramyxoviridae [144]

Hệ gen ARN (-) phiên mã nhờ ARN-polymerase phụ thuộc ARN để tạo mARN có kích thước dưới hệ gen (subgenomic RNA), từ đó tiến hành dịch

mã tạo protein sớm đặc hiệu vi rút, trong đó có ARN-polymerase phụ thuộc ARN mới Enzym này dùng để tổng hợp chuỗi ARN (+) có chiều dài đủ dùng làm khuôn để tổng hợp nhiều bản sao hệ gen ARN (-) Các chuỗi ARN (-) mới tạo thành cũng được dùng để phiên mã tạo mARN muộn dành cho tổng hợp protein cấu trúc Các protein HN, F được lắp vào màng sinh chất Các

thành phần của vi rút được lắp ráp tạo túi và đưa ra màng để nảy chồi Vi rút

ra khỏi tế bào nhờ hoạt tính neuraminidase của protein HN [89]

c Dịch tễ học

Vi rút họ Paramyxoviridae gây VĐHHC lưu hành rộng rãi trên phạm

vi toàn cầu, và là căn nguyên gây viêm phổi với tỷ lệ mắc cao ở trẻ em <5 tuổi tại các nước đang phát triển Vi rút lan truyền theo đường giọt khí, tiếp xúc trực tiếp với dịch tiết và thâm nhiễm theo đường mũi và mắt vào cơ thể Dịch VĐHHC thường gặp tại các địa điểm tập trung đông người như trường học, nhóm trẻ và hay gặp vào mùa thu đông

Theo thống kê của TCYYTG, hàng năm có khoảng 4 triệu trẻ em tử

vong vì viêm phổi trên toàn thế giới, trong đó vi rút họ Paramyxoviridae như

RSV, sởi được ghi nhận với tỷ lệ khoảng 30% Lứa tuổi cảm nhiễm vi rút họ

Paramyxoviridae gây VĐHHC tập trung chủ yếu vào nhóm trẻ em < 5 tuổi,

tiến triển gây viêm phổi nặng hoặc các biến chứng ở các cơ quan khác thường gặp tại trẻ nhỏ < 6 tháng tuổi Tái nhiễm thường xảy ra, tỷ lệ tái nhiễm khoảng 60-70% và thường gặp tại trẻ > 2 tuổi [31]

d Triệu chứng lâm sàng

Các vi rút gây VĐHHC thuộc họ Paramyxoviridae liên quan đến bệnh

đường hô hấp thường gặp ở trẻ nhỏ cũng như người già Triệu chứng lâm sàng thường gặp:

- Giai đoạn ủ bệnh : mệt mỏi, kém ăn, sốt nhẹ

- Giai đoạn toàn phát : ho, khó thở, thở nhanh hơn bình thường, thở khò khè (ở trẻ nhỏ) XQ : rốn phổi đậm (viêm phế quản), phổi mờ 1 bên hoặc cả 2 bên phổi (viêm phổi)

- Biến chứng : bội nhiễm vi khuẩn, nhiễm khuẩn huyết

e Đáp ứng miễn dịch

Cũng giống như các vi rút gây viêm đường hô hấp khác, đáp ứng miễn

dịch của cơ thể người với vi rút họ Paramyxoviridae bắt đầu từ hệ thống miễn

dịch bẩm sinh (đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu) Interferon đóng vai trò quan trọng trong ức chế vi rút nhân lên trong tế bào biểu mô đường hô hấp trước khi miễn dịch thu được xuất hiện Kháng thể tiết kháng vi rút họ

Paramyxoviridae được phát hiện trong dịch mũi họng bao gồm IgA, IgM, IgG

và IgE, các KT này có nồng độ cao và đáp ứng miễn dịch tốt ở trẻ lớn hơn 6 tháng tuổi Trong trường hợp nhiễm vi rút tiên phát, KT tiết IgG và IgM xuất hiện và đạt đỉnh trong thời gian từ 8-13 ngày sau khởi phát, KT IgA xuất hiện

và đạt đỉnh muộn hơn trong thời điểm 14-28 ngày sau khởi phát Các KT tiết này mất hoàn toàn sau 3 tháng và trẻ có thể tái nhiễm nếu không được tiêm vắc xin phòng bệnh

f Điều trị và dự phòng :

 Thuốc kháng vi rút

Hiện tại thuốc điều trị VĐHHC do vi rút thuộc họ Paramyxoviridae rất

hạn chế, các thuốc kháng sinh chỉ sử dụng trong trường hợp biến chứng bội nhiễm vi khuẩn hoặc viêm phổi Thuốc kháng vi rút RSV đang được sử dụng hiện nay là Ribavirin là một chế phẩm tổng hợp tương tự guanosin được cấp phép sử dụng năm 1972 tại Mỹ Cơ chế tác dụng của Ribavirin phức tạp và có thể tác động vào nhiều yếu tố: ức chế enzym polymerase trong quá trình sao chép ARNt, ức chế inosine-5’ monophosphate dehydrogenase làm suy yếu các quá trình tổng hợp các nucleotid trong tế bào Năm 2014, tiền chất GS-

5806 đang được nghiên cứu và thử nghiệm để phát triển loại thuốc mới trong điều trị RSV Cơ chế của tiền chất là ngăn cản quá trình hoà màng giữa vi rút

và tế bào chủ thông qua việc ức chế protin F trên vỏ vi rút, do đó vi rút không xâm nhập được vào tế bào chủ để tạo thành hợp bào (syncytial) [33, 60]

Gần đây, thuốc Palivizumab được sử dụng cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ để ngừa nhiễm trùng đường hô hấp và phổi gây ra bởi vi rút hợp bào hô hấp RSV Thuốc thuộc dạng kháng thể đơn dòng hoạt động bằng cách ngăn chặn

sự tăng trưởng của RSV Thuốc không được sử dụng để điều trị nhiễm RSV [65]

 Vắc xin dự phòng

Phát triển vắc xin phòng chống vi rút gây VĐHHC thuộc họ

Paramyxoviridae là mục tiêu chăm sóc sức khoẻ cộng đồng, tuy nhiên các vắc

xin hiện có không nhiều chủ yếu tập trung phát triển vắc xin phòng nhiễm vi rút RSV và á cúm

Vắc xin vi rút hợp bào đường hô hấp (RSV): trên thế giới hiện nay

đang phát triển khoảng 60 loại vắc xin RSV, trong đó có 16 vắc xin đang được thử nghiệm lâm sàng Vắc xin đang được phát triển đã sử dụng các công nghệ sản xuất: vắc xin sống giảm độc lực (Live Attenuated Influenza vaccine – LAIV), vắc xin bất hoạt (Inactivate Influenza vaccine – IIV), vắc xin tiểu đơn vị, vắc xin axit nucleic, vắc xin dựa trên công nghệ gen…[54]

Vắc xin vi rút á cúm (hPIV): được phát triển trên công nghệ di truyền

ngược (Reverse genetics systems) Vắc xin được sử dụng thông qua đường mũi cho người lớn và trẻ em Hiện nay, 2 loại vắc xin hPIV3 đã được đánh giá qua thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 và vắc xin hPIV2, hPIV3 bắt đầu được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 [13]

1.1.2.2 Các vi rút gây VĐHHC thuộc họ Paramyxoviridae

a Vi rút hợp bào đường hô hấp (Respiratory Syncytial Virus- RSV)

RSV được phân lập đầu tiên năm 1956, là một nguyên nhân chủ yếu gây bệnh viêm phổi và viêm tiểu phế quản ở trẻ nhỏ dưới 1 tuổi [26, 27] và cũng có thể gây bệnh ở mọi lứa tuổi, đặc biệt nghiêm trọng ở người già và ở những người bị ức chế miễn dịch như người nhận cấy ghép tế bào gốc [42,

50] RSV chỉ có một serotyp duy nhất với hai nhóm kháng nguyên A và B Nghiên cứu dịch tễ học phân tử RSV tại Philippine trong 4 năm (tháng 5/2008 – tháng 4/2012) cho thấy có 2 vụ dịch RSV xảy ra tháng 6/2008-2/2009 với căn nguyên chính là RSV-A (97,5%) thuộc genotyp NA1 và tháng 6/2011-3/2012 với RSV-A (34,2%) và RSV-B (65,8%) thuộc genotyp BA Nhiều nghiên cứu tại Ấn Độ, Đức, Bỉ, Nhật… cho thấy cả 2 typ RSV-A, RSV-B lưu hành đồng thời trong một mùa, và thường nhiễm RSV-A có biểu hiện lâm sàng nặng hơn so với nhiễm RSV-B Sự đồng nhiễm 2 typ vi rút RSV không ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện bệnh [42]

Nhiễm RSV có thời gian ủ bệnh trong vòng 4-6 ngày, với các biểu hiện lâm sàng khác nhau theo tuỳ lứa tuổi:

- Người lớn và trẻ >3 tuổi: biểu hiện như cảm lạnh thông thường , ho khan, chảy nước mũi, sôt nhẹ, mệt mỏi

- Trẻ nhỏ: sốt cao, ho sâu, hắt hơi, thở nhanh hơn bình thường, thở khò khè, tím tái

Nhiễm RSV ở trẻ nhỏ dễ gây biến chứng viêm phổi, viêm phế quản và liên quan nhiều đến hội chứng tử vong đột ngột ở trẻ sơ sinh (SIDS)

Bệnh đã có vắc xin phòng chống, điều trị chủ yếu dựa vào bổ sung oxy, kháng sinh sử dụng khi có bội nhiễm Thuốc kháng vi rút Ribavirin sử dụng trong 2-5 ngày, bệnh nhân thường hồi phục trong vòng 8-15 ngày và ít khi để lại di chứng

b Vi rút hMPV (Human Metapneumoniavirus)

Vi rút hMPV được phân lập đầu tiên vào năm 2001 từ trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, là tác nhân chưa được biết đến tại thời điểm đó Bằng chứng huyết thanh học ở những bệnh nhân VĐHHC trong 4 thập kỷ trước đó đã cho thấy hMPV mới được phát hiện năm 2001 chứ không phải là vi rút mới xuất hiện Vi rút hMPV cũng là một tác nhân quan trọng gây bệnh VĐHHC ở trẻ em và người

già, mặc dù ảnh hưởng của hMPV dường như thấp hơn so với RSV [91] hMPV cũng chỉ có một serotyp với hai nhóm kháng nguyên A và B.Lứa tuổi nhập viện với trẻ nhỏ nhiễm hMPV từ 6 tháng đến 12 tháng tuổi Các đặc điểm lâm sàng và mức độ nghiêm trọng của hMPV tương tự như RSV hMPV cũng là một nguyên nhân quan trọng của bệnh ở người lớn tuổi Theo các nghiên cứu trước đây, hMPV liên quan 6% đến 40% nhiễm trùng đường hô hấp ở trẻ em nhập viện và ngoại trú [16, 37] Vi rút hMPV thường có ở vùng

ôn đới, phân bố theo mùa thường theo sau RSV và vi rút cúm vào cuối mùa đông và mùa xuân [11] Các nghiên cứu huyết thanh học đã chỉ ra hầu hết trẻ

em ở độ tuổi ≤5 đều dễ bị nhiễm vi rút hMPV mặc dù nhiễm hMPV ở giai đoạn đầu đời nhưng tái nhiễm phổ biến ở trẻ có độ tuổi lớn hơn và người lớn [41] hMPV ở người có thể gây nhiễm trùng đường hô hấp nhẹ (cảm lạnh thông thường) [129] Tuy nhiên ở trẻ sinh non hoặc những người suy giảm miễn dịch, và người già trên 65 tuổi có nguy cơ bị bệnh nặng và nhập viện và đặc biệt nghiêm trọng hơn đối với những người bị bệnh hen suyễn [62] và viêm phổi tắc nghẹn mãn tính (COPD) [74] Nhiều đợt dịch bùng phát cho thấy cả trẻ em và người lớn đều có thể bị nhiễm hMPV, gây tử vong [83]

Giai đoạn ủ bệnh từ 3-6 ngày, triệu chứng lâm sàng thường gặp: ho, sốt, sổ mũi, thở nông, khó thở và có thể tiến triển viêm phế quản, viêm phổi Hiện tại chưa có thuốc đặc trị, cũng như chưa có vắc xin phòng bệnh, kháng sinh chỉ sử dụng trong trường hợp bội nhiễm, chăm sóc y tế và bổ sung đầy

đủ dinh dưỡng, tăng cường sức đề kháng vẫn là phương pháp điều trị chủ yếu hiện nay Dự phòng sự lan truyền vi rút hMPV bằng các biện pháp chủ động: rửa tay bằng xà phòng khi tiếp xúc trực tiếp vào dịch tiết mắt, mũi, họng bệnh nhân, hạn chế tiếp xúc với người nhiễm bệnh