Nghiên cứu 7 cây thuốc việt nam có tác dụng hỗ trợ miễn dịch ở động vật thực nghiệm

Nghiên cứu tác động của Viên tăng sức đề kháng lên gà bị gây suy giảm miễn dịch bằng virus Gumboro thông qua những chỉ số hóa sinh, huyết học.. Tại Việt Nam các công trình nghiên cứu về

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN VIỆT PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU 7 CÂY THUỐC VIỆT NAM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN VIỆT PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU 7 CÂY THUỐC VIỆT NAM

1 GS VS TSKH Đái Duy Ban

2 PGS TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2019

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực, khách quan, một phần đã công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý, cho phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả

NCS Nguyễn Việt Phương

ii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận án tốt nghiệp tôi đã nhận được sự dạy dỗ tận tình của các thầy cô, sự giúp đỡ động viên của đồng nghiệp, gia đình và bạn bè Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:

- GS VS TSKH Đái Duy Ban và PGS TS Nguyễn Quang Huy là những người Thầy hướng dẫn khoa học, đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm để tôi có thể hoàn thành luận án

- PGS TS Hồ Bá Do - P Chủ tịch Hội Y Dược học Cổ truyền Việt Nam và PGS

TS Nguyễn Văn Mùi - Giám đốc Trung tâm Công nghệ Hóa sinh Ứng dụng đã luôn động viên, hỗ trợ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành được luận án

- Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà

Nội nơi có những thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp đã tận tâm hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

- Ban giám hiệu, phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Hóa sinh và Sinh học Phân tử - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

- Ban giám đốc, cán bộ, nhân viên Khoa kiểm soát dịch bệnh, HIV/AIDS - Trung tâm Y tế quận Tây Hồ - Hà Nội Xin chân thành cảm ơn BS Đặng Thị Bích Lan, BS Nguyễn Thị Phương, BS Cao Thị Hoa Bằng, BS Lê Thị Hồng Loan, bệnh nhân, gia đình bệnh nhân đã tích cực hợp tác, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án này

- Xin chân thành cảm ơn các chuyên gia của Tổ chức thầy thuốc thế giới Pháp (MDM), Tổ chức PACT Việt Nam, Tổ chức phát triển quốc tế - Mỹ (USAID) đã có những góp ý thiết thực giúp tôi hoàn thành luận án

- Xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp ở Viện Dược liệu TW, Viện Thú y

TW, Trung tâm Tiên tiến về Hóa sinh Hữu cơ - Viện Hóa sinh Biển - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, Phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

Cuối cùng con xin nhớ ơn cha mẹ, vợ, hai con yêu quý, xin được cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH MIỄN DỊCH 4

1.1.1 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh 4

1.1.2 Suy giảm miễn dịch mắc phải 5

1.2 HỆ MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT 6

1.2.1 Các cơ quan lympho tham gia đáp ứng miễn dịch 6

1.2.2 Đáp ứng miễn dịch ở gia cầm 8

1.2.3 Giới thiệu bệnh do virus Gumboro 9

1.2.4 Giới thiệu Hội chứng rồi loạn sinh sản và hô hấp do virus ở lợn 11

1.3 TÌNH HÌNH NHIỄM HIV TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 12

1.4 MỘT SỐ HỢP CHẤT THỰC VẬT THỨ SINH HỖ TRỢ MIỄN DỊCH ĐƯỢC BIẾT ĐẾN 12

1.4.1 Các Alkaloids 12

1.4.2 Các Flavonoids 13

1.4.3 Các hợp chất Phenol và Tanin 13

1.4.4 Glycoside 14

1.4.5 Saponins 15

1.4.6 Adenosine và cordycepin 16

1.5 Các cây thuốc được nghiên cứu 16

1.5.1 Gấc 17

1.5.2 Tam thất 18

1.5.3 Đẳng sâm 19

1.5.4 Trinh nữ hoàng cung 19

1.5.5 Linh chi 20

iv

1.5.6 Diệp hạ châu 21

1.5.7 Đông trùng hạ thảo 23

1.6 TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC MỚI TỪ NHIỀU CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26

2.1.1 Động vật thực nghiệm 26

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn thỏ làm thí nghiệm 26

2.1.3 Tiêu chuẩn chọn chuột làm thí nghiệm 27

2.1.4 Virus cường độc Gumboro 27

2.2 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Các cây thuốc được sử dụng trong nghiên cứu 28

2.2.2 Phân loại mẫu 29

2.3 THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 30

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.4.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu cây thuốc 31

2.4.2 Phương pháp xác định một số hoạt chất trong 7 cây thuốc 31

2.4.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng carbohydrate 31

2.4.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng phenolic tổng 33

2.4.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng polisaccharide 34

2.4.2.4 Phương pháp định lượng saponin toàn phần 34

2.4.2.5 Phương pháp xác định adenosin tổng số 35

2.4.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng cordycepin 36

2.4.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid 36

2.4.2.8 Phương pháp xác định hàm lượng Rg1 và Rg2 toàn phần 37

2.4.2.9 Phương pháp định tính nhóm hợp chất phytosterol 38

2.4.2.10 Phương pháp thử hoạt tính DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 38

2.4.2.11 Phương pháp xác định kim loại nặng (Pb) ……… 39

2.4.3 Thiết kế nghiên cứu 40

2.4.4 Phương pháp xử lý và phân tích số liệu 47

v

2.4.5 Phương pháp kiểm soát kết quả các xét nghiệm 47

2.4.6 Đạo đức trong nghiên cứu 49

2.4.7 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 50

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 LỰA CHỌN 7 CÂY THUỐC THÔNG QUA ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC 51

3.1.1 Đánh giá về hàm lượng adenosin và cordycepin của đông trùng hạ thảo Isaria cerambycidae Lưu et Đái 2009 51

3.1.2 Hàm lượng phenolic tổng của trinh nữ hoàng cung 52

3.1.3 Đánh giá về hàm lượng cacbohydrate tổng số có trong linh chi 53

3.1.4 Đánh giá hàm lượng Phenolic tổng số có trong diệp hạ châu 55

3.1.5 Hàm lượng -spinasterol 3-O--D-glycopylannosid và polisaccharid tổng có trong đẳng sâm 56

3.1.6 Đánh giá về hàm lượng ginsenosid Rg1, Rg2 toàn phần của tam thất 58 3.1.7 Đánh giá về hàm lượng lycopen và β-Caoroten của Gấc 59

3.2 BÀO CHẾ VIÊN TĂNG SỨC ĐỀ KHÁNG CÓ TỶ LỆ PHÙ HỢP TỪ 7 CÂY THUỐC VIỆT NAM 62

3.2.1 Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ đẳng sâm (ĐS) có trong Viên tăng sức đề kháng 63

3.2.2 Đánh giá, chọn lọc tỷ lệ diệp hạ châu có trong Viên tăng sức đề kháng 66

3.2.3 Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ linh chi có trong Viên tăng sức đề kháng 68

3.2.4 Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ gấc có trong Viên tăng sức đề kháng 69

3.2.5 Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ trinh nữ hoàng cung có trong Viên tăng sức đề kháng 71

3.2.6 Đánh giá, chọn lọc tỷ lệ của tam thất có trong Viên tăng sức đề kháng 72

3.2.7 Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ đông trùng hạ thảo có trong Viên tăng sức đề kháng 75

3.3 QUY TRÌNH BÀO CHẾ VIÊN TĂNG SỨC ĐỀ KHÁNG TỪ 7 CÂY THUỐC ĐƯỢC CHỌN 76

vi

3.3.1 Phương pháp bào chế 1 77 3.3.2 Phương pháp bào chế 2 79 3.3.3 Kết quả phân tích và kiểm nghiệm Viên tăng đề kháng được chế tạo 82 3.4 NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA VIÊN TĂNG SỨC ĐỀ KHÁNG 84 3.4.1 Nghiên cứu độc tính cấp 84 3.4.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn 86 3.5 Nghiên cứu mô hình gây suy giảm miễn dịch mắc phải ở gà Lương Phượng bằng virus Gumboro và thử tác dụng của Viên tăng sức đề kháng 91 3.5.1 Các triệu chứng lâm sàng ở gà khi ăn Viên tăng sức đề kháng 92 3.5.2 Nghiên cứu tổn thương đại thể ở gà 92 3.5.3 Xét nghiệm giải phẫu bệnh lý vi thể tuyến Fabricius các lô gà 94 3.5.4 Đo hiệu giá kháng thể Gumboro qua phản ứng trung hoà huyết thanh

và theo dõi biểu hiện ở các lô gà 94 3.6 Nghiên cứu tác động của Viên tăng sức đề kháng lên gà bị gây suy giảm miễn dịch bằng virus Gumboro thông qua những chỉ số hóa sinh, huyết học 97 3.7 Đánh giá biểu hiện của virus PRRS (gây bệnh tai xanh ở lợn) ở cấp độ tế bào khi thử nghiệm với Viên tăng sức đề kháng 103 3.8 Đánh giá tác động của Viên tăng sức đề kháng đối với chức năng, hình thái gan và thận trên thỏ thực nghiệm 106

KẾT LUẬN 114 KIẾN NGHỊ 115

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO 117

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách và số lượng các mẫu cây thuốc thu nhận cho thí nghiệm

29

Bảng 2.2 Kết quả phân loại các nhóm cây thuốc được thử nghiệm 30

Bảng 2.3 Dãy nồng độ xây dựng đường chuẩn Glucose 32

Bảng 2.4 Dãy nồng độ xây dựng đường chuẩn axit Galic 33

Bảng 2.5 Giá trị bình thường của hoạt độ amylase trong máu và nước tiểu 41 Bảng 2.6 Trị số bình thường AST, ALT huyết thanh của một số hãng phân tích 41

Bảng 3.1 Hàm lượng adenosin và cordycepin của đông trùng hạ thảo tại các vùng 51

Bảng 3.2 Hàm lượng phenolic tổng số có trong các mẫu trinh nữ hoàng cung 52

Bảng 3.3 Hàm lượng cacbohydrat toàn phần có trong linh chi 54

Bảng 3.4 Hàm lượng phenolic tổng số của diệp hạ châu trong các mẫu 55

Bảng 3.3.5 Hàm lượng -spinasterols-O--D-glycopylannoside và polysaccharide tổng trong các mẫu đẳng sâm 57

Bảng 3.6 Hàm lượng toàn phần ginsenosid-Rg1 và ginsenosid-Rg2 58

của tam thất trong các mẫu thu nhận 58

Bảng 3.7 Thành phần lycopen và β-Caoroten tổng số trong các mẫu gấc 60

Bảng 3.8 Bảng tổng kết 7 cây thuốc được lựa chọn nghiên cứu 61

Bảng 3.11 Các chỉ tiêu phân tích ở các lô gà ăn và không ăn bổ sung linh chi. 68

Bảng 3.12 Các chỉ số phân tích ở các lô gà ăn và không ăn bổ sung gấc 69

Bảng 3.13 Chỉ số phân tích ở các lô gà ăn và không ăn bổ sung trinh nữ hoàng cung 71

Bảng 3.14 Các chỉ số phân tích ở các lô gà ăn và không ăn bổ sung tam thất. 73

Bảng 3.15 Các chỉ số phân tích khi cho gà ăn thức ăn có và không có thành phần đông trùng hạ thảo 75

viii

Bảng 3.16 Khả năng kháng vi sinh vật của Viên tăng sức đề kháng được bào

chế theo phương pháp 1 79

Bảng 3.17 Khả năng thử hoạt tính chống ô xi hóa của Viên tăng sức đề

kháng được bào chế theo phương pháp 1 79

Bảng 3.18 Khả năng kháng vi sinh vật của Viên tăng sức đề kháng bào chế

theo phương pháp 2 81

Bảng 3.19 Khả năng thử hoạt tính chống ô xi hóa của Viên tăng đề kháng

được bào chế theo phương pháp 2 81

Bảng 3.20 Thành phần các hoạt chất sinh học có trong Viên tăng sức đề

kháng 83

Bảng 3.21 Liều độc LD50 của chuột uống bột Viên tăng sức đề kháng 84

Bảng 3.22 Chuột uống dung dịch hồ tinh bột (2%) × 3lần/ngày (đối chứng)

Bảng 3.25 Tác động của Viên Tăng sức đề kháng đến những chỉ số hóa sinh

thăm dò chức năng gan, thận chuột thí nghiệm 88

Bảng 3.26 Kết quả theo dõi các triệu chứng ở 6 lô gà trong thời gian 3 ngày.

92

Bảng 3.27 Kết quả mổ khám đại thể của 6 lô gà 93 Bảng 3.28 Kết quả xét nghiệm giải phẫu bệnh lý vi thể tuyến Fabricius ở

các gà 94

Bảng 3.29 Đo lường hiệu giá kháng thể Gumboro qua phản ứng trung hoà

huyết thanh và biểu hiện lâm sàng gà 94

Bảng 3.30 Kết quả thử nghiệm ở 6 lô gà (mỗ lô 30 gà) 95 Bảng 3.31 So sánh giá trị trung bình các chỉ số liên quan đến hồng cầu lô gà A và

B 97

Bảng 3.32 Giá trị trung bình các chỉ số liên quan đến hồng cầu ở lô gà C và

D 98

ix

Bảng 3.33 Giá trị trung bình các chỉ số liên quan đến bạch cầu ở lô gà A và B

100

Bảng 3.34 Giá trị trung bình các chỉ số liên quan đến bạch cầu ở lô gà C và D 100

Bảng 3.35 Nồng độ protein trung bình trong huyết thanh ở lô gà A và B 101

Bảng 3.36 Tác động của Viên tăng sức đề kháng thông qua chỉ số cân nặng thỏ 107

Bảng 3.37 Tác động của Viên tăng sức đề kháng đến chỉ số AST trong máu thỏ 107

Bảng 3.38 Tác động của Viên tăng sức đề kháng qua chỉ số ALT máu thỏ 108 Bảng 3.39 Tác động của Viên tăng sức đề kháng qua chỉ số Bilirubin toàn phần 108

Bảng 3.40 Tác động của Viên tăng sức đề kháng qua chỉ số Protein toàn phần 108

Bảng 3.41 Tác động của Viên tăng sức đề kháng qua chỉ số Ure trong máu 109

Bảng 3.42 Tác động của Viên tăng sức đề kháng qua chỉ số Creatinin trong máu 109

Bảng 3.43 Tác động của Viên tăng sức đề kháng tới chỉ số hồng cầu 109

trong máu thỏ 109

Bảng 3.44 Tác động của Viên tăng sức đề kháng qua chỉ số bạch cầu 110

trong máu thỏ 110

Bảng 3.45 Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học gan thỏ 111

Bảng 3.46 Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học thận thỏ 111

Bảng 3.47 Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học lách thỏ 111

x

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ biệt hóa và vị trí tổn thương các tế bào miễn dịch 4

Hình 1.2 Phát triển Lympho B và T ở gà 8

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc virus Gumboro 10

Hình 1.4 Cấu trúc một số flavonoids có hoạt tính từ thực vật 13

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của tanin 14

Hình 1.6 Công thức cấu tạo chung của glycoside 15

Hình 1.7 Cấu trúc của các terpenoids có hoạt tính 15

Hình 1.8 Đông trùng hạ thảo 25

Hình 2.1 Hỉnh ảnh mẫu đẳng sâm Việt Nam và diệp hạ châu 29

Hình 2.2 Hỉnh ảnh linh chi và trinh nữ hoàng cung 29

Hình 2.3 Hỉnh ảnh gấc và tam thất nam 29

Hình 2.4 Đường chuẩn tính theo giá trị của glucose 32

Hình 2.5 Đường chuẩn axit galic (GA) 33

Hình 2.6 Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH 39

Hình 2.7 Kết quả chạy QC theo khuyến cáo của nhà sản xuất 48

Hình 2.8 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu của luận án 50

Hình 3.1 Mẫu trinh nữ hoàng cung số 1 53

Hình 3.2 Mẫu Linh chi số 2 trong nghiên cứu 55

Hình 3.3 Mẫu diệp hạ châu số 3 được tuyển chọn 56

Hình 3.4 Mẫu đẳng sâm số 1 được tuyển chọn và công thức hóa học của 57

C35H5806 (-spinasterols3-O--D-glycopylannoside) 57

Hình 3.5 Mẫu Tam thất số 1 được tuyển chọn làm nguyên liệu 59

Hình 3.6 Mẫu gấc 1 được lựa chọn làm nguyên liệu 60

Hình 3.7 Tỷ lệ các thành phần của 7 cây thuốc trong Viên tăng sức đề kháng 77

Hình 3.8 Sơ đồ tạo Viên tăng sức đề kháng theo phương pháp 1 78

Hình 3.9 Sơ đồ bào chế Viên tăng sức đề kháng theo phương pháp 2 80

Hình 3.10 Thử nghiệm độc tính cấp và độc tính trường của 86

Hình 3.11 Giải phẫu mô bệnh học thận của các lô chuột thí nghiệm 89

xi

Hình 3.12 Tuyến Fibricius sưng tấy, phù nề sau khi bị gây SGMDMP 95

Hình 3.13 Tuyến Fibricius bình thường sau khi dùng chế phẩm 96

Hình 3.14 Mổ khám bệnh tích ở đùi, lườn của gà lô 2 và lô 5 (lô được ăn chế phẩm) 103

Hình 3.15 Mẫu đối chứng trước khi xử lý Viên tăng sức đề kháng 103

Hình 3.16 Đánh giá tác động Viên tăng đề kháng sau 6 giờ 104

Hình 3.17 Đánh giá tác động Viên tăng đề kháng sau 28 giờ 104

Hình 3.18 Đánh giá tác động của Viên tăng đề kháng sau 40 giờ 105

Hình 3.19 Đánh giá tác động của Viên tăng sức đề kháng sau 56 giờ 105

Hình 3.20 Thử tác động của Viên tăng sức đề kháng trên thỏ thí nghiệm 110 Hình 3.21 Đại thể và vi thể gan thỏ sau khi uống Viên tăng sức đề kháng 112

xii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải

(Acquired Immune Deficiency Syndrome)

HIV Virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải

Ig Globulin miễn dịch (Immunoglobulin)

1

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Việt Nam là nước nhiệt đới có đặc điểm thổ nhưỡng, khí hậu địa lý với nhiều đặc trưng khác nhau, có hệ thực vật nhiệt đới vô cùng phong phú và đa dạng trong

đó gồm rất nhiều loài cây thuốc chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao [10]

Từ ngàn xưa, cộng đồng các dân tộc trên đất nước ta cũng có truyền thống sử dụng cây cỏ để chữa bệnh, bảo vệ sức khỏe Trên thế giới, Việt Nam được đánh giá là nước có nền y học cổ truyền, lâu đời và người dân biết cách áp dụng nhiều loại cây thuốc để bồi bổ, nâng cao thể trạng cơ thể, hỗ trợ và điều trị bệnh ở vật nuôi cũng như

hỗ trợ sức khỏe ở người [3, 5] Tại Việt Nam các công trình nghiên cứu về nhiều cây thuốc để bào chế ra một chế phẩm mới có tác dụng tăng cường sức đề kháng, hỗ trợ miễn dịch, được kiểm chứng thông qua đánh giá một vài chỉ số hoá sinh, huyết học, miễn dịch, tế bào, giải phẫu bệnh và mô tả khả năng kích thích miễn dịch ở động vật thực nghiệm cũng như trên người còn rất ít, tản mạn bởi nhiều lý do khách quan cũng như chủ quan [11, 25, 33]

Có nhiều mô hình gây suy giảm miễn dịch mắc phải ở động vật thực nghiệm được sử dụng tại Việt Nam và các nước trên thế giới Tuy nhiên, thường sử dụng gà

bị gây nhiễm virus là mô hình phổ biến, trong đó virus Gumboro là virus gây bệnh mạnh nhất Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (bệnh lợn tai xanh) thường được nhắc tới trong những nghiên cứu về suy giảm miễn dịch mắc phải ở lợn [32] Gà nhiễm virus Gumboro (còn gọi bệnh Sida gà) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus gây ra ở gia cầm, chủ yếu ở gà Bệnh có đặc điểm là gây viêm túi Fabricius, xuất huyết cơ ngực, cơ đùi, làm hoại tử thận và đặc biệt làm suy giảm hệ thống miễn dịch hoặc mất khả năng đáp ứng miễn dịch đối với vắc xin phòng các bệnh, gà bệnh dễ bị nhiễm các bệnh truyền nhiễm khác Bệnh thường xảy

ra khi gà ở giai đoạn từ 3 - 6 tuần tuổi, tỷ lệ nhiễm bệnh có thể lên đến 100% và tỷ

lệ chết từ 20 - 50% Tại Việt Nam hiện nay chưa có một sản phẩm nào được bào chế từ cây thuốc được thử nghiệm, ứng dụng phòng, điều trị Gumboro hiệu quả [6, 31] Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn PRRS (Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome) còn gọi là bệnh Tai xanh là một bệnh truyền nhiễm cấp tính

do virus gây nên, bệnh có tính chất lây lan nhanh, tăng nguy cơ chết nhiều lợn, phát bệnh đồng thời với những bệnh khác Đặc điểm của bệnh là gây sảy thai, thai chết lưu ở lợn Lợn ốm có triệu chứng điển hình sốt cao trên 40°C, viêm phổi nặng, đặc

có người nhiễm HIV, thực tế con số này có thể cao hơn [12, 20] Tại Việt Nam, đến hết năm 2015 đã phát hiện 10.195 trường hợp nhiễm mới HIV, số bệnh nhân chuyển sang AIDS là 6130, tử vong do AIDS 2130 trường hợp Tính đến cuối năm

2015 cả nước hiện có 227.154 trường hợp nhiễm HIV còn sống và ước tính hiện có khoảng 254.000 người nhiễm HIV trong cộng đồng [9]

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn đã nêu trên, chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu 7 cây thuốc Việt Nam có tác dụng hỗ trợ miễn dịch ở động vật thực nghiệm”

2 MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN

- Bào chế được Viên tăng sức đề kháng cơ thể từ 7 cây thuốc Việt Nam

- Mô tả tác động của Viên tăng sức đề kháng trên động vật thực nghiệm

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN

- Khảo sát, chọn lọc thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học từ 7 cây thuốc gồm: Linh chi, đông trùng hạ thảo, đẳng sâm, gấc, trinh nữ hoàng cung, tam thất và diệp hạ châu ở Việt Nam tại những vùng chuyên canh cây thuốc

- Lựa chọn tỷ lệ phối trộn phù hợp từ 7 cây thuốc Việt Nam để bào chế Viên tăng sức đề kháng có hoạt chất sinh học, an toàn trong sử dụng

- Đánh giá mức độ an toàn của Viên tăng sức đề kháng là thực phẩm chức năng được Bộ Y tế cấp phép

- Nghiên cứu, đánh giá tác động của Viên tăng sức đề kháng trên các đối tượng động vật thực nghiệm bị gây suy giảm miễn dịch mắc phải

4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam bào chế được chế phẩm mới là Viên tăng sức đề kháng từ 7 cây thuốc gồm: Linh chi, đông trùng hạ thảo, đẳng sâm, gấc, trinh nữ hoàng cung, tam thất và diệp hạ châu đạt tiêu chuẩn chất

lượng thực phẩm chức năng, được cấp phép của Bộ Y tế

3

- Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên đánh giá tác động hỗ trợ miễn dịch

của Viên tăng sức đề kháng trên một số nhóm động vật thực nghiệm bị gây suy giảm miễn dịch mắc phải

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN

Về khoa học

Lần đầu tiên tại Việt Nam tạo được Viên tăng sức đề kháng có nguồn gốc từ 7 cây thuốc gồm: Linh chi, đông trùng hạ thảo, đẳng sâm, gấc, trinh nữ hoàng cung, tam thất và diệp hạ châu từ những vùng cây thuốc của Việt Nam

Đánh giá được tác động hỗ trợ miễn dịch sau khi sử dụng chế phẩm trên gà bị gây suy giảm miễn dịch mắc phải bằng virus Gumboro, tác động ở cấp độ tế bào lên virus gây bệnh tai xanh ở lợn Thử nghiệm an toàn trên chuột, thỏ được Bộ Y Tế cấp phép là thực phẩm chức năng

6 LUẬN ÁN ĐƯỢC THỰC HIỆN TẠI

Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; Trung tâm Công nghệ Hóa sinh Ứng dụng; Trung tâm Chăm sóc Ban ngày (nay là Khoa kiểm soát dịch bệnh, HIV/AIDS) - Trung tâm Y tế quận Tây Hồ - TP Hà Nội; Viện Thú y Trung ương; Viện Dược liệu Trung ương; Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam; Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương; Trung tâm Xét nghiệm - 35 Nguyễn Ngọc Vũ, phường Trung Hòa, quận Cầu Giấy, TP Hà Nội

4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH MIỄN DỊCH

Miễn dịch (hay miễn nhiễm) là tập hợp các cơ chế sinh học giúp cho một cơ thể đa bào giữ được sự liên kết giữa các tế bào và các mô, đảm bảo sự toàn vẹn của

cơ thể bằng cách loại bỏ những thành phần bị hư hỏng cũng như các chất và sinh vật xâm hại Đáp ứng miễn dịch là một hiện tượng phức tạp nhưng là một trong những cách giúp cơ thể người và động vật tránh các tác nhân gây bệnh trong và ngoài cơ thể Bệnh do suy giảm miễn dịch mắc phải gồm 2 loại: suy giảm miễn dịch bẩm sinh và suy giảm miễn dịch mắc phải [29, 51]

1.1.1 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh

Suy giảm miễn dịch bẩm sinh là do những bất thường của vật chất di truyền Dựa vào nguồn gốc và vị trí tổn thương của các tế bào miễn dịch người ta phân loại suy giảm miễn dịch (hình 1.1)

Hình 1.1 Sơ đồ biệt hóa và vị trí tổn thương các tế bào miễn dịch [123]

(1) Suy giảm miễn dịch ngay từ các tế bào gốc chung cho cả 2 dòng tế bào B và T nên được gọi là suy giảm miễn dịch nặng phối hợp

(2) Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng T gồm 2 loại: Tổn thương tế bào T và rối

loạn hoạt hóa của các tế bào T đã trưởng thành

(3) Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng B gồm 2 loại: Tổn thương tế bào B và rối loạn quá trình biệt hóa của tế bào B để sản xuất kháng thể dịch thể

5

- Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng tế bào thực bào (liên quan đến cả sự trình diện kháng nguyên) và sản xuất bổ thể [29, 123]

1.1.2 Suy giảm miễn dịch mắc phải

Dựa vào nguyên nhân gây ra tình trạng suy giảm miễn dịch người ta chia ra một số nhóm chính sau: Suy giảm miễn dịch do suy dinh dưỡng, do nhiễm vi sinh vật: Nhiễm vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng, vi rút; Do bệnh lý: Gồm các bệnh mạn tính kéo dài, đặc biệt là bệnh ung thư Suy giảm miễn dịch do phóng xạ; Do thuốc hoặc hóa chất, cũng có thể do tuổi già, chấn thương [37]

- Đặc biệt suy giảm miễn dịch do nhiễm virus HIV ở người [44], nhiễm virus Gumboro ở gà hay hội chứng dịch bệnh tai xanh (ở lợn) [58] Đây cũng là mô hình suy giảm miễn dịch ở động vật và người thường được nghiên cứu với các loại thuốc điều trị khác nhau

Để đáp ứng lại việc suy giảm miễn dịch mắc phải ở người và động vật có các

cơ chế đáp ứng lại với sự tham gia của các tế bào khác nhau gồm:

Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào là đáp ứng chống các kháng nguyên gắn trên bề mặt tế bào hoặc là thành phần của tế bào, đó là những tế bào nhiễm virus hoặc tế bào ung thư có 2 loại: Miễn dịch đặc hiệu và miễn dịch không đặc hiệu Cả hai loại đáp ứng này đều cần có sự tham gia của nhiều loại tế bào khác nhau và các tế bào cũng hỗ trợ lẫn nhau trong việc đáp ứng lại các tác

nhân gây bệnh [92, 95]

Tế bào giết tự nhiên (natural killer cell)

Nghiên cứu in vitro người ta thấy trong cơ thể người và động vật có các tế bào

có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư Nghiên cứu nuôi cấy các tế bào này cho thấy chúng tiết ra chất perforin chọc thủng màng tế bào đích và tiêu diệt vi khuẩn [53, 133] Hoạt tính của các tế bào giết tự nhiên mạnh đối với tế bào có liên quan đến phức hệ phù hợp tổ chức như tế bào u hoặc các tế bào bị nhiễm virus Khả năng tiêu diệt các tế bào u và các tế bào ung thư của tế bào giết tự nhiên được tăng cường bởi một số cytokine do tế bào lympho và đại thực bào tiết ra như IL-2, TNF, nghiên cứu trên giống chuột nude cho thấy mặc dù các chuột này có suy giảm miễn dịch bẩm sinh nhưng có thể do chúng lại có số lượng tế bào giết tự nhiên bình thường hay tăng nên tỷ

lệ ung thư tự phát không cao hơn chuột bình thường khác [43, 138]

6

Tế bào LAK (lymphokine activating killer cell)

Các tế bào LAK tăng khi tế bào lympho được cytokin kích thích, trong đó có IL-2, cũng là loại có khả năng ly giải một số tế bào ung thư gấp nhiều lần so với tế bào giết tự nhiên [45]

Đại thực bào: Khi được hoạt hoá bởi những chất kích thích như cytokine hay các chất từ vi khuẩn (LPS, MDP) thì có thể ly giải các tế bào ung thư trên in vitro

Cơ chế của phản ứng này chưa được làm sáng tỏ, tuy nhiên có nhiều giả thiết khác nhau: Có thể là tế bào ung thư đã có kháng thể đặc hiệu gắn vào tạo nên phức hợp miễn dịch, là đối tượng để đại thực bào thực bào (giải phóng các enzyme lysosome, sản xuất các superoxyde mà tế bào ung thư thường lại ít có enzym superoxyde dismutase chống lại) [132]

Quan trọng nhất là các cytokin của đại thực bào tiết ra TNFα Cơ chế tác dụng

có lẽ đã gây ra một hiện tượng Shwartman tại chỗ làm cho khối u không có máu tới nuôi dưỡng (hiện tượng shwatzman) Khi tiêm LPS cho chuột tại chỗ gây tắc mạch, hoại tử) Hoặc nếu kháng thể gắn lên kháng nguyên ở tế bào ung thư thuộc lớp IgG thì quá trình hoạt hoá gây ra và làm ly giải các tế bào mang kháng nguyên (tế bào

ung thư) [23, 93]

Bạch cầu toan tính: Khi được hoạt hoá bởi cytokine mà mạnh nhất là IL-5 cũng có thể giết nhiều loại ký sinh trùng và cả tế bào ung thư

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải được gọi tắt là AIDS do HIV gây

ra HIV phá hủy các tế bào của hệ miễn dịch khiến cơ thể không có khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh do đó bệnh nhân dễ mắc một số loại bệnh thông thường như nhiễm trùng cơ hội hay ung thư [51, 97]

Virus HIV có hai type khác nhau về cách thức truyền bệnh Type 1 là virus hướng đến tế bào lympho T ở người còn type 2 là virus gốc của HIV type 1 Trong khi HIV type 1 phổ biến ở người thì Type 2 bắt gặp chủ yếu ở các bệnh nhân ở châu Phi [119, 160]

1.2 HỆ MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT

Hệ miễn dịch gia cầm có liên quan đến nhiều cơ quan và nhiều loại tế bào nằm rải rác trong cơ thể, chúng hợp tác để nhận diện kháng nguyên và phản ứng với kháng nguyên tạo đáp ứng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh

1.2.1 Các cơ quan lympho tham gia đáp ứng miễn dịch

Các cơ quan lympho trung ương:

7

Hệ thống cơ quan lympho trung ương tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch gồm có tủy xương, tuyến ức, túi Fabricius

- Tủy xương: Là nơi sản sinh ra các tế bào mầm, nguồn gốc của tế bào máu,

các tế bào bạch cầu và các tế bào của hệ miễn dịch Tủy xương cung cấp các tiền lympho T và B cho tuyến ức và túi Fabricius làm nhiệm vụ biệt hoá thành tế bào chuyên biệt

- Tuyến ức: Là hai chuỗi hạch nằm ở dưới hai bên cổ, kích thước từ 8 - 15

mm Tuyến ức là cơ quan lympho - biểu mô, gồm các tế bào lympho và tế bào biểu

mô Trong thời kỳ bào thai, tuyến ức là cơ quan lympho xuất hiện sớm, lớn và quan trọng nhất, sự phát triển về kích thước tăng dần và đạt đến tối đa lúc trưởng thành, sau đó sẽ thoái hoá, teo dần [61]

- Túi Fabricius: Túi có dạng hình cầu hoặc trái lê nằm phía trên, mặt ngoài

túi láng, mặt trong có nhiều nếp gấp thay đổi tuỳ theo tuổi và sinh lý gia cầm, túi có kích thước lớn nhất khi gà 1 - 2 tuần tuổi và qua quá trình cuộn xoắn từ từ, khoảng tháng thứ tư túi bắt đầu teo đến tháng thứ 11 - 12 thì mất hẳn Túi Fabricius là nơi phát triển và biệt hóa tế bào lympho B, ngoài ra nó còn tiết ra một số hormone, quan trọng nhất là Bursin, đó là tripeptide có vai trò hoạt hóa tế bào lympho B nhưng không hoạt hóa tế bào lympho T, túi Fabricius chỉ có ở gia cầm không có ở động vật có vú và ở người [61, 70]

Các cơ quan lympho ngoại vi:

Bao gồm lách, hạch hạnh nhân, manh tràng, tuyến Harder, mô bạch huyết

- Lách: Giống như một cơ quan lympho lọc kháng nguyên từ tổ chức bạch

huyết và là nơi lưu trữ hồng cầu, tiểu cầu, đồng thời là nơi sản sinh ra tế bào hồng cầu Tủy trắng là nơi xảy ra đáp ứng miễn dịch tế bào [29, 137]

- Hạch hạnh nhân manh tràng: Là cơ quan lympho địa phương ở manh

tràng Các hạch tập trung thành từng đám có cấu trúc giống như hạch lympho, trong hạch có các nang chứa lympho B và T, các nang này đều có tâm điểm mầm, nơi xảy

ra các đáp ứng miễn dịch mạnh [79, 137]

- Tuyến Harder: Là hạnh lympho có hình tròn hoặc bầu dục, tập trung thành

từng đám, trong hạch chứa đầy đủ các tế bào lympho B và T trưởng thành được phân bố thành hai vùng Vùng vỏ cạn có các nang lympho chứa chủ yếu các tế bào lympho B Vùng vỏ sâu chứa chủ yếu các tế bào lympho T Tuyến Harder là địa điểm chính cho tế bào kháng thể IgA [137]

8

Hình 1.2 Phát triển Lympho B và T ở gà [137]

- Mô bạch huyết: Tổ chức bạch huyết là những hạt lympho nằm dọc theo hệ

thống bạch huyết phân tán khắp các cơ quan trong cơ thể như: Tim, tuyến nội tiết, gan, thận, tụy và cơ Các tổ chức bạch huyết hình hạt đậu có hệ thống mạng lưới

chứa các tế bào lympho, đại thực bào, tế bào tua [137]

1.2.2 Đáp ứng miễn dịch ở gia cầm

Hệ miễn dịch gia cầm cũng giống như các động vật có vú, chia làm hai loại, miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu

Miễn dịch không đặc hiệu:

Gia cầm có hệ miễn dịch không đặc hiệu khá phát triển, bao gồm các tính chất bẩm sinh và di truyền, nhờ đó mà gia cầm chống lại các tác nhân có hại một cách chọn lọc, giúp duy trì sức khỏe gia cầm Miễn dịch không đặc hiệu bao gồm các yếu tố sau:

- Yếu tố di truyền: Một số nhóm gia cầm không có vị trí tiếp nhận (receptor)

cho phép nhiều tác nhân gây bệnh bám và tấn công vào cơ thể gây bệnh Ví dụ: Một

9

số giống gà có gen kháng virus máu trắng và bệnh Marek’s Gà tây không mẫn cảm với virus viêm phế quản Do quan điểm chọn lọc để cải thiện tính năng, một số khả năng kháng bệnh ở gà dần dần bị mất đi [70, 73]

- Cấu tạo giải phẫu học: Dịch niêm mạc có tác dụng ngăn chặn các tác nhân

gây hại xâm nhập vào cơ thể gây bệnh

- Hệ vi sinh vật bình thường: Trên bề mặt da và niêm mạc đường tiêu hóa,

đường hô hấp trên thường có một số quần thể vi sinh vật, có tác dụng bảo vệ cơ thể ngăn chặn sự xâm nhập của mầm bệnh bằng cách không cho khu trú và phát triển

- Lông rung đường hô hấp: Bề mặt đường hô hấp trên được bao phủ bởi lớp

lông rung, có tác dụng đẩy tác nhân gây bệnh ra khỏi cơ thể [80]

Miễn dịch đặc hiệu:

Gồm miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào:

- Miễn dịch thể dịch: Kháng nguyên hay vật lạ xâm nhập vào cơ thể gây

bệnh, sẽ được tế bào T và B hợp tác để hình thành kháng thể, về cấu trúc kháng thể gia cầm giống kháng thể loài hữu nhữ nhưng khác về đặc tính, ở gà chỉ có 3 lớp kháng thể chính là IgG, IgM, IgA không có IgE, IgD Kháng thể IgM xuất hiện trước tiên và sớm nhất trong máu khoảng 4 ngày sau khi tiếp xúc mầm bệnh, nhanh chóng mất vào ngày 10 - 12

- Miễn dịch qua trung gian tế bào: Quá trình đáp ứng miễn dịch do quần thể

lympho T đảm nhận Khi kháng nguyên xâm nhập sẽ kích thích sự biệt hóa của dòng tế bào lympho tăng sinh nhanh chóng tạo ra một lượng lớn lympho T sẵn sàng tiêu diệt kháng nguyên Các tế bào lympho T phân bào và biệt hóa sớm, nên đáp ứng miễn dịch tế bào được hình thành sau 2 - 3 ngày tiêm chủng vắc xin Trên gia

cầm miễn dịch trung gian tế bào có vai trò rất quan trọng

1.2.3 Giới thiệu bệnh do virus Gumboro

Ở gà bệnh Gumboro (còn gọi là bệnh Sida gà) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus gây ra ở gia cầm, chủ yếu ở gà Virus Gumboro hay còn gọi là Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) là virus ARN sợi đôi, gây viêm túi Fabricius, xuất huyết cơ, hư hại thận thể cấp ở gà [70, 73, 113]

Virus có khả năng đề kháng cao ngoài môi trường nên các biện pháp sát trùng thông thường không thể tiêu diệt hết mầm bệnh ngoài môi trường Sử dụng thuốc sát trùng Cloramin cho hiệu quả cao nhất Khi virus tồn tại ngoài môi trường

nó tăng độc lực qua mỗi lần cảm nhiễm nên cần có biện pháp để sát trùng chuồng

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc virus Gumboro

Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng bên cạnh chủng virus IBDV có tính độc lực cao, chủng cũng xuất hiện nhiều chủng có hoạt tính mới ở châu Âu và tình hình bệnh do đó dường như đang phát triển phức tạp Những thay đổi trong tính kháng nguyên và độc lực đã làm cho việc kiểm soát IBDV bằng cách tiêm vắc xin trở nên khó khăn thách thức nhiều hơn

Trong miễn dịch gia cầm hệ thống túi Bursa của Fabricius là một biểu mô và

cơ quan bạch huyết nơi tế bào gốc lymphocyte thu nhận và bị tác động bởi những nguyên nhân gây bệnh của virus từ bên ngoài Mức độ các thương tổn này tùy thuộc vào sự phát triển của Bursa, gà dễ bị IBDV nhất trong những tuần đầu tiên sau khi

nở và khả năng miễn nhiễm với virus được gây ra sớm sau khi nở Tuy nhiên, trong giai đoạn mang thai các kháng thể đặc hiệu IBDV phát ra con cái qua trứng tới phôi

có thể can thiệp bằng cách tiêm chủng sớm Trong khi cơ chế miễn dịch tự nhiên là

cơ chế phản ứng miễn dịch thích ứng tối ưu phát triển sau những tuần đầu tiên sau khi gà nở và chuyển giao kháng thể mẹ Điều này giúp bảo vệ con cái cho đến khi phản ứng miễn dịch thích ứng trở nên toàn vẹn, đầy đủ và có hiệu lực [58]

Việc tìm những cây thuốc quý của Việt Nam dùng cho gia cầm được coi như

là một kháng thể chống bệnh do virus Gumbro, viêm phế quản truyền nhiễm, cúm gia cầm và các kháng thể không đặc hiệu khác là một yêu cầu cấp thiết hiện nay

11

1.2.4 Giới thiệu Hội chứng rồi loạn sinh sản và hô hấp do virus ở lợn

Bệnh dịch tai xanh ở lợn hay còn gọi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo, gọi tắt là bệnh PRRS (Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome) là một bệnh nguy hiểm xảy ra trên lợn do virus gây ra khi cơ thể lợn bị suy giảm miễn dịch PRRS xuất hiện đầu tiên ở Mỹ năm 1987 và phải đến năm 1992 thì mới được

Tổ chức Thú y Thế giới OIE công nhận Còn ở Việt Nam, PRRS được phát hiện năm 1997 từ các đàn lợn nhập ngoại [26, 28]

Virus PRRS sau khi xâm nhập vào cơ thể lợn thì đích tấn công của chúng chính là tế bào đại thực bào phế nang (PAMs) Chúng không tạo ra sự suy giảm miễn dịch toàn diện nhưng nó làm cho các cơ chế phòng vệ của phổi bị tổn thương Khi đó, các mầm bệnh hô hấp, phụ nhiễm dễ dàng xâm nhập vào phổi Virus PRRS sinh sản trong tế bào đại thực bào phế nang PAMs Virus lưu hành lâu trong máu (~

3 tuần), tồn nhiễm ~ 157 ngày) Khả năng, mức độ lây nhiễm của virus PRRS rất cao (một lượng nhỏ virus trong môi trường đã có thể gây bệnh) tuy vậy mức độ độ lan truyền của virus này thường khá chậm Ban đầu không biểu hiện dấu hiện lâm sàng Virus PRRS có cấu trúc là một ARN có vỏ bọc, thuộc họ Arteriviridae, chi Arterivirus, trong bộ Nidovirals [26, 121]

Virus PRRS là một loại virus đặc biệt và vô cùng nguy hiểm vì liên tục biến đổi Theo nghiên cứu của Paolo Martelli trình bày tại Hội nghị APVS 2013 về sự

đa dạng gen của PRRS cho thấy các virus PRRS gây bệnh tai xanh khá đa dạng về

gen do:

Đột biến ngẫu nhiên: Virus PRRS vẫn tiếp tục đột biến khi nhân lên trong

vật chủ và biến chủng khác biệt trên từng lợn Đây là hậu quả của sự tích lũy đột biến ngẫu nhiên [38]

Tái tổ hợp: Trong thực nghiệm, tái tổ hợp xảy ra khi tế bào MA-104 được

gây đồng nhiễm 2 chủng virus PRRS khác nhau, nhưng chưa thấy trong cơ thể lợn thí nghiệm, điều này phần nào giải thích tại sao tái tổ hợp có thể không phổ biến trong thực địa

Đa dạng gen PRRS rất nguy hiểm do nó liên quan đến kỹ thuật xét nghiệm bệnh tai xanh và sự đáp ứng miễn dịch của PRRS, sự khác biệt của độc lực virus PRRS có thể biểu hiện triệu trứng không tương ứng do vậy khó khăn trong chẩn đoán và điều trị đàn lợn bị bệnh tai xanh Do đó cần có những nghiên cứu về tác dụng tăng cường miễn dịch, ức chế virus PRRS ở cấp độ tế bào, kiểm chứng

12

được tác động dược chất có trong sản phẩm lên tế bào một cách chi tiết, chính xác nhất [26, 109]

1.3 TÌNH HÌNH NHIỄM HIV TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

Tại Việt Nam, tính đến cuối năm 2015 cả nước hiện có 227.154 trường hợp nhiễm HIV còn sống và ước tính hiện có 254.000 người nhiễm HIV trong cộng đồng, tuy nhiên con số thực có thể cao hơn rất nhiều Việt Nam là nước nhiệt đới có đặc điểm thổ nhưỡng, khí hậu địa lý đa dạng, nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú, đặc biệt Việt Nam có nền y học cổ truyền, lâu đời trên thế giới nhân dân từ khắp các vùng quê đã biết áp dụng nhiều loại cây thuốc để làm thuốc bổ, nâng cao thể trạng cơ thể, hỗ trợ và điều trị một số bệnh [9, 12, 63]

Việt Nam là một trong những nước còn nghèo trên thế giới kinh phí hỗ trợ điều trị bệnh nhân HIV/AIDS còn rất eo hẹp và nguồn thuốc ARV phải hoàn toàn dựa vào nguồn tài trợ từ nước ngoài Việc thực hiện đề tài này góp phần tạo chế phẩm hoàn chỉnh, an toàn, hiệu quả, kéo dài cuộc sống của bệnh nhân HIV/AIDS với chi phí thấp [108]

Trên thế giới cũng như tại Việt Nam các công trình nghiên cứu về cây thuốc

có tác dụng tăng cường sức đề kháng, hỗ trợ miễn dịch dẫn đến sự thay đổi những chỉ số hoá sinh, miễn dịch ở người nhiễm HIV/AIDS còn rất ít, tản mạn bởi nhiều lý

do khách quan cũng như chủ quan: như khó khăn trong việc hợp tác giữa bệnh nhân

và người làm nghiên cứu, kinh phí đầu tư lớn Nguy cơ phơi nhiễm HIV, viêm gan

B, viêm gan C trong quá trình lấy máu, làm thủ thuật [8, 49, 108]

1.4 MỘT SỐ HỢP CHẤT THỰC VẬT THỨ SINH HỖ TRỢ MIỄN DỊCH ĐƯỢC BIẾT ĐẾN

Hầu hết hoạt tính sinh học trong các cây thuốc tập trung ở nhóm các chất thực vật thứ sinh như polyphenol, alkaloid, flavonoids Các chất thực vật thứ sinh có tác động tích cực đến tăng cường hệ miễn dịch, sức đề kháng của cơ thể và chống lại các tác nhân gây bệnh [68, 101, 151] Hàm lượng các chất thực vật thứ sinh trong cây thuốc thường cao hơn nhiều lần so với các thực vật khác và có liên quan đến hoạt tính chống ô xi hóa, kháng vi sinh vật được ứng dụng để ngăn ngừa stress ô xi

hóa đặc biệt là nhiều chất có tác dụng tới chu trình phát triển của tế bào [99, 100] 1.4.1 Các Alkaloids

Alkaloids là các hợp chất mà thành phần có tính ba-zơ Các alkaloids thường gặp là morphine, strychnine, quinine, ephedrine và nicotine Alkaloids được tìm thấy chủ yếu trong thực vật và phổ biến trong các thực vật có hoa Cấu trúc hóa học

13

của alkaloids rất đa dạng [124] Thông thường, một alkaloid chứa ít nhất một nguyên tử nitơ trong cấu trúc amin và đóng vai trò là một phần của vòng tuần hoàn nguyên tử [29]

Alkaloids thường được phân loại dựa trên cấu trúc hóa học Alkaloids chứa vòng indole được gọi là indole alkaloids

Ngoài ra, alkaloids có thể được phân loại theo các hệ thống sinh học mà chúng có gây hoạt tính như các alkaloid thuốc phiện xảy ra trong cây thuốc phiện

(Papaver somniferum) Alkaloids thường được dùng để giảm đau và làm thuốc gây

mê [8, 9]

1.4.2 Các flavonoids

Flavonoids là một nhóm gồm khoảng 4.000 hợp chất polyphenol có mặt trong tự nhiên, được tìm thấy phổ biến trong thực vật Dựa theo sự khác biệt các nhóm chức và vị trí của chúng trong khung 15- carbon (aglycons, hình 1.5), flavonoids được chia thành một số nhóm gồm: Flavone, flavanone, flavonol, isoflavonoid, anthocyanidin và chalcones [100] Thông thường, các flavonoids có màu vàng, ngoài ra chúng còn có màu xanh, tím hoặc không màu Flavonoids có thể

có từ nhiều nguồn thực vật khác nhau và cũng có nhiều hoạt tính khác nhau được sử dụng trong điều trị các bệnh như viêm gan [126, 129]

Hình 1.4 Cấu trúc một số flavonoids có hoạt tính từ thực vật [100]

1.4.3 Các hợp chất Phenol và Tanin

Tannins (axit tannin) là polyphenol tan trong nước có trong thực vật, có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác nhau như amino axit và alkaloit Chúng tồn tại chủ yếu trong thực vật sử dụng làm thực phẩm [1, 126]

14

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của tanin [126]

Các hợp chất tanin phân bố rộng rãi trong tự nhiên Dựa vào cấu trúc ta có thể chia tannins thành 4 nhóm chính: Gallotannins, ellagitannins, tannins phức hợp

Các hợp chất phenolic là nhóm có số lượng lớn có mặt trong nhiều loại thực vật làm thực phẩm và có nhiều ứng dụng như quercetin [125, 130] Một số đại diện

có hoạt tính từ các thực vật

Trong y học, đặc biệt ở các nước Châu Á như Nhật Bản và Trung Quốc, các chất được chiết xuất từ thực vật có chứa tanins được sử dụng như chất làm chống tiêu chảy, thuốc lợi tiểu, chống lại các khối u dạ dày và tá tràng, chống sưng tấy [27, 130]

1.4.4 Glycoside

Glycoside (Hình 1.6) là một hợp chất hữu cơ được hình thành bởi sự ngưng

tụ của một phân tử đường với một phân tử hữu cơ, với điều kiện là phần hydroxy của acetal đường được tham gia vào sự ngưng tụ

15

Hình 1.6 Công thức cấu tạo chung của glycoside [110]

Nhiều glycoside có hoạt tính đã được tách chiết từ các loài thực vật khác nhau và nghiên cứu cơ chế tác dụng (hình 1.10) Một số nhóm chất từ glycoside từ nhân sâm cho thấy có hoạt tính chống lại stress ô xi hóa và bảo vệ gan đối với chuột thí nghiệm [107, 110]

Hình 1.7 Cấu trúc của các terpenoids có hoạt tính [107]

1.4.5 Saponins

Saponins là một nhóm các hợp chất tự nhiên có tính chất hoạt tính bề mặt Các hợp chất này cho thấy sự biến thiên về kiểu, cấu trúc và thành phần của chuỗi hydlycone và các chuỗi oligosaccharide Saponins có tác dụng điều hòa cholesterol huyết tương ở người và đóng vai trò quan trọng trong việc làm giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính Hơn nữa, saponins còn cho thấy tác dụng gây độc tế bào mạnh

mẽ để chống lại dòng tế bào ung thư [111, 122, 162] Nghiên cứu của Qiu Y., và

cộng sự [118] đã tách chiết một số saponin từ sâm Panax quinquefolium cho thấy

chúng có hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư vú MCF-7

16

1.4.6 Adenosine và cordycepin

Trong đông trùng hạ thảo và một số loài nấm có một số hoạt chất sinh học hỗ trợ miễn dịch, tuy vậy hai hoạt chất sinh học được biết đến và nghiên cứu nhiều nhất trong đông trùng hạ thảo là adenosine và cordycepin

Adenosine: giúp ổn định huyết áp, phòng và điều trị bệnh tim mạch, adenosine trực tiếp kiểm soát các chức năng mô tim, tác dụng giãn mạch vành, giãn mạch ngoại biên, giảm lực co cơ tim, giúp gia tăng lượng oxy trong máu Hoạt chất adenosine triphosphat còn được dùng làm thuốc điều trị rối loạn nhịp tim Hoạt chất này giúp ổn định tinh thần, giải tỏa căng thẳng, mệt mỏi, giảm bớt tình trạng đau đầu, chóng mặt, hỗ trợ hoạt động của hệ thần kinh Kháng viêm, giảm dị ứng đường hô hấp: adenosine có khả năng điều chỉnh chức năng các

tế bào bạch cầu lympho, và nó được chứng minh là một chất có khả năng kháng viêm tại thụ thể của adenosin A2A [3]

Cordycepin được tạo thành bởi nhân purin liên kết với đường ribofuranose bằng liên kết β - N9 - glucosid, với công thức phân tử là C10H13N5O3 và danh pháp khoa học là 9-(3-deoxy-β-D ribofuranosyl) adenin Khi sử dụng ở liều cao: Chặn đứng tế bào ngăn chặn quá trình dính chặt vào nhau của chúng, từ đó gây ức chế sinh trưởng của các tế bào (đặc biệt là tế bào ung thư) Còn khi sử dụng với liều thấp: cordycepin giúp ức chế và kiểm soát quá trình tăng trưởng và phân hóa của tế bào hoạt chất cordycepin có thể ức chế sự phân hạch của các tế bào ung thư, ngăn cản sự phân bào, hạn chế sự lây lan của chúng, là một hoạt chất chống ung thư không gây ra bất kì một tác dụng phụ nào cho con người Hoạt chất này hỗ trợ điều trị khối u ác tính, ức chế sự sinh trưởng và di căn của các khối u một cách rõ rệt Chống ung bướu: Nhiều nghiên cứu còn chỉ ra rằng cordycepin có khả năng ức chế một cách rõ ràng các tế bào ung thư vòm họng, ung thư cổ tử cung, ung thư máu, ung thư dạ dày, ung thư não,…khả năng kháng khuẩn của cordycepin: đây là chất chống virus cực mạnh với khả năng điều trị các rối loạn gây ra bởi viêm nhiễm cực

kỳ hiệu quả Đối với hệ miễn dịch: cordycepin có tác dụng thúc đẩy, điều tiết hai chiều đối với hệ thống miễn dịch, hoạt hóa tế bào miễn dịch, hạn chế tối đa các virus, vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể

1.5 Các cây thuốc được nghiên cứu

Thực vật được làm thuốc: Thực vật làm thuốc đã được con người tìm ra và ứng dụng từ 2000 năm trước, ngoài ra trong thực vật làm thuốc có chứa lượng lớn các chất có hoạt tính sinh học Thực vật ngày nay được ứng dụng trong điều trị và bảo vệ sức khỏe động vật nói chung và con người nói riêng Ưu điểm nổi bật của cây thuốc là ít gây tác dụng phụ nguy hại cho vật nuôi, trên người Vì vậy cây thuốc

Mã, Trung Quốc Loài người đã phát hiện ra một số loài cây có thể dùng làm thuốc

từ rất sớm như: Cam thảo (Glycyrrhiza glabra), Bách (Cupressus sempevirens), Tuyết tùng (Cedrus) cho tới nay có nhiều bài thuốc tác dụng cho từng bệnh cụ thể

[10, 28, 91] Hiện nay, cây thuốc còn là nguồn nguyên liệu cho phát triển các loại hợp chất mới sử dụng làm thuốc chống lại các căn bệnh nguy hiểm và mới xuất hiện

ở người và động vật như ung thư, các bệnh truyền nhiễm và kháng lại các vi sinh vật, virus gây bệnh [15, 30, 135]

Hầu hết các loại thuốc điều trị trong Đông y đều có nguồn gốc từ thực vật vì chúng dễ kiếm và thân thiện với môi trường Hiện nay các nhà khoa học, dược sĩ và các y bác sĩ có xu hướng áp dụng cây thuốc trong điều trị bệnh do tính an toàn và thân thiện với tự nhiên Tuy nhiên việc sử dụng thuốc cây thuốc cũng cần lưu ý về liều lượng sử dụng, các chất độc có trong cây thuốc [4, 5]

Cây thuốc được lựa chọn từ các thành phần khác nhau như: rễ, lá, hoa, củ,

vỏ, thân, hạt Các loài khác nhau sử dụng các thành phần khác nhau Các bài thuốc thường khai thác các hoạt tính tập trung chủ yếu ở lá, rễ, củ và hạt của cây thuốc Các thành phần khác của hoa, quả thường ít được sử dụng hơn [24, 127] Một điểm lưu ý là các thành phần sử dụng làm thuốc trong thực vật thường là những thành phần “bỏ đi” hoặc ít được quan tâm khi làm thực phẩm Một số bài thuốc có thể sử dụng toàn bộ thành phần của cây thuốc [5, 14]

Các cây thuốc trong tự nhiên được khai thác sử dụng từ những thành phần khác nhau của cây như vỏ, củ, rễ, lá tùy thuộc vào điều kiện môi trường khác nhau

có thể có thành phần các hoạt tính khác nhau Một số thực vật khác như nấm thường

sử dụng thể quả, dịch chiết [15, 16]

1.5.1 Gấc

Cây gấc tên thường gọi: là gấc

Tên gọi khác: Mộc Miết

Tên khoa học: Momordica cochinchinensis

Bộ phận dùng: Thịt, lá, màng hạt, nhân hạt, rễ

Theo Y học Cổ truyền:

+ Tính vị: Nhân hạt gấc vị đắng, hơi ngọt, tính ấm, có độc

18

+ Tác dụng: Hoạt huyết, hóa ứ tiêu sưng, sang thương

+ Chủ trị: Ngâm rượu xoa bót trị nhức mỏi gân, xương, chấn thương ứ huyết, giã đắp sưng vú, tắc tia sữa, trĩ, ngâm giấm trị quai bị

Theo Y học Hiện đại:

Gấc có nhiều dầu, trong dầu gấc có nhiều axit béo không no và đặc biệt có

-caroten Dầu gấc ngoài việc dùng trong trường hợp thiếu vitamin A, chống khô mắt, làm vết thương mau lành, tăng cường thể trạng của cơ thể thì ngày nay được dùng trong phòng và hạn chế ung thư vì β-caroten trong gấc tham gia vào điều hoà hoạt động gen, đưa tế bào vào con đường biệt hoá Thành phần: Tinh dầu và dầu gấc; β-caroten (tiền vitamin A); Lycopen; Carotenoids; Vitamin E (α- tocophenol) Tác dụng sinh dược học: Có tác dụng điều hoà sự biệt hoá tế bào, chống ô xi hóa, tăng cường miễn dịch, bảo vệ bộ gen Tác dụng chống tia xạ, chống độc hại, kích thích miễn dịch có thể chống ung thư, virus, phục hồi các thương tổn cấu trúc tế bào, làm lành vết thương, vết bỏng, vết loét Giúp hồi phục sức khoẻ nhanh chóng của bệnh nhân ung thư sau phẫu thuật, xạ trị và hoá trị liệu [4, 14]

Khả năng chống gốc tự do bởi tác động của vitamin E có thể lên tới 90% Một nghiên cứu của trường Đại học ở New York cho thấy vitamin E có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống gốc tự do, bảo vệ cơ thể người [22] Lycopen trong gấc làm dưỡng, bảo vệ da, giúp da hồng hào, tươi trẻ, mịn màng, chống lại lão hóa, mệt mỏi, giữ sắc đẹp được lâu dài Chống nhiễm trùng nhẹ, khắc phục tình trạng suy dinh dưỡng do thiếu chất, chữa khô mắt, mờ mắt và phòng chống mù loà [14, 104]

1.5.2 Tam thất

Tam thất tên thường gọi: Tam thất

Tên gọi khác: Sơn tất, Kim bất hoán, Huyết sâm, Sâm tam thất

Tên khoa học: Panax pseudoginseng

Bộ phận dùng: Củ, rễ, hoa

Theo Y học Cổ truyền:

+ Tính vị: Vị ngọt, đắng, tính ấm

+ Tác dụng: Cầm máu và ứ trệ, hoạt huyết và giảm đau

+ Chủ trị: Cơ thể suy nhược, xuất huyết nội tạng hoặc xuất huyết ngoài

Có thể dùng riêng bột tam thất hoặc phối hợp Xuất huyết và sưng do bị thương ngoài thì dùng dạng bột

Theo Y học Hiện đại:

19

Tam thất có chứa nhiều saponin, có tác dụng chỉ huyết, hoạt huyết, bổ huyết Tam thất là một vị thuốc quý rất có giá trị trong bồi dưỡng cơ thể, tăng sức đề kháng, trong các trường hợp mất máu

Tam thất dùng điều trị ung thư do tác dụng tăng cường miễn dịch, chống biến đổi tế bào trong điều kiện bất lợi, tăng sự thích nghi của cơ thể đối với ngoại cảnh Hiện nay người ta mới phát hiện ra chất ginenosid gồm: Rg1 và Rg2 của tam thất được dùng phòng ngừa ung thư và tăng cường miễn dịch bằng cách kích thích các bạch cầu lympho làm nhiệm vụ thực bảo, ngoài ra hai chất này có thể tăng cường giải độc gan, tăng khả năng hoạt động chức năng thận [19]

1.5.3 Đẳng sâm

Đẳng sâm tên thường gọi: Đẳng sâm hoặc đảng sâm

Tên gọi khác: Đông đảng sâm, Tây Đảng sâm, Lộ đảng sâm

Bộ phận dùng: Rễ

Theo Y học Cổ truyền:

+ Tính vị: Vị ngọt, tính bình, không độc

+ Tác dụng: Cầm máu và ứ trệ Hoạt huyết và giảm đau

+ Chủ trị: Trị phế hư, trị ích phế khí, trị tỳ vị hư yếu, khí huyết đều suy, không có sức, ăn ít, tiêu chảy lâu ngày, trị thiếu máu mạn, gầy ốm, tiểu ra máu

Theo Y học Hiện đại:

Trong đẳng sâm có nhiều hoạt chất sinh học quý như: Saponin, Alkaloid, Sucrose, Glucose, Inulin, Polysaccharid, Spinasterols có khả năng hỗ trợ miễn dịch trên động vật thực nghiệm cũng như trên người:

Polysaccharid, Spinasterols có khả năng thích miễn dịch bằng cách cảm ứng sự sản xuất của interleukin-6, interferons, immunoglobulin-G, đại thực bào và

tế bào lympho T Nó có tác dụng chống lại sự ức chế miễn dịch do hóa trị và xạ trị gây nên và đối kháng lại với sự ức chế miễn dịch do khối u gây ra [41, 47] Một vài thử nghiệm đã chứng minh rằng Spinasterols có tiềm năng rất lớn trong liệu pháp điều trị ung thư bằng tá dược Chất có tác dụng với những bệnh ung thư như: dạ dày, thực quản, vú và phổi Trong một số thực nghiệm những năm gần đây cũng cho thấy một số hoạt chất sinh học trong đẳng sâm như Polysacchrid, Spinasterols đóng vai trò như là chất điều biến miễn dịch Cơ chế phân tử cụ thể tạo ra hoạt tính sinh học những chất này vẫn chưa được giải thích một cách đầy đủ [14, 17]

1.5.4 Trinh nữ hoàng cung

Trinh nữ hoàng cung tên thường gọi: Trinh nữ hoàng cung

Tên gọi khác: Không có

+ Tác dụng: Thông huyết, tán ứ, tiêu sưng, giảm đau

+ Chủ trị: Phì đại tiền liệt tuyến, điều trị tiêu u, viêm đau, bong gân, xương cốt, dùng như là một chất gây nôn, mụn nhọt, rắn cắn, bệnh ngoài da

Theo Y học Hiện đại:

Thành phần của Trinh nữ hoàng cung có chứa alkaloid, phenolic, crinafolin, crinafolidin, ambelline, 1β, 2β-epoxyambelline có khả năng ức ung thư tiền liệt tuyến, đặc biệt người ta đã xếp trinh nữ vào hàng các dược liệu giàu selen Trinh nữ hoàng cung có tác dụng an thần, giảm đau, chống viêm, giải độc, kích thích miễn dịch Trinh nữ chứa selen rất cần cho bệnh nhân ung thư vì tác dụng an thần của nó Selenoprotein, crinafolin, crinafolidin có tác dụng phòng ung thư do có hoạt tính chống ô xi hóa mạnh Phenolic có khả năng kháng vi sinh vật, phenolic khi vào cơ thể động vật thực nghiệm tăng sinh các đại thực bào Một số nghiên cứu chỉ ra rằng trinh nữ hoàng cung có hoạt chất chống oxy hóa khi vào cơ thể Tiêu biểu là enzym superoxyd dismutase (SOD), glutathion (GSH), enzym glutathion peroxydase (GSH-Px), enzym catalase và các phân tử nhỏ: Tocopherol, ascorbat [14]

Trong cơ thể luôn tồn tại sự cân bằng các dạng oxy hoạt động và dạng chống oxy hóa Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội môi (homeostasis) Do ảnh hưởng của nhiều yếu tố tác động từ bên ngoài hay bên trong cơ thể, làm cho cân bằng này di chuyển theo hướng gia tăng các dạng oxy hoạt động Trạng thái sinh lý này được gọi là stress oxy hóa [4]

1.5.5 Linh chi

Linh chi tên thường gọi: Linh chi

Tên gọi khác: Tiên thảo, Nấm Trường Thọ, Vạn Niên Nhung

Tên khoa học: Ganoderma

Bộ phận dùng: Quả thể nấm

Theo Y học Cổ truyền:

+ Tính vị: Vị nhạt, tính ấm

+ Tác dụng: Công năng bổ khí, dưỡng huyết, dưỡng tâm, bình xuyễn

+ Chủ trị: Trị khí huyết bất túc, tâm thần bất an, ho hen, khí suyễn, tỳ vị hư nhược, cường kiện gân cốt, đẹp da

21

Theo Y học Hiện đại:

Trong thành phần của linh chi có chứa các hợp chất đa đường (45% hàm lượng) gồm: Arabinogalactane, β-D-glucane; ganoderane A, B và C

Triterpene: Acid ganoderic A, B, C, D, F, H, K, M, R, S và Y

Ganodermadiol phân sinh của loại acide lanostaoic

Esteroides: Ganodosterone

Acide béo chưa bão hòa (axit oleique là loại chứa nhiều chất alkaloid)

Chất đạm protide: Ling Zhi-8, glycoproteine (lactine)

Khoáng chất: Ca, K, Mg, Fe, Mn, Zn, Ca, Be, Al, Na…

Những chất khác: Manitole, adenine, trechalose, uracine, lysine, axit stearic và nhiều axit amin khác Những chất hợp chất đa đường có trọng lượng phân tử cao của Linh chi làm tăng khả năng đề kháng của cơ thể, chống các chứng ung thư (làm tăng chất cytocine bởi đại thực bào và tế bào lymphocyte và làm tăng lượng interleucine (IL) 1 beta, IL-6, và IL-2, đó là những yếu tố làm hủy hoại tế bào ung thư hoặc ức chế

sự hình thành, phát triển những khối u ác tính, lành tính

Chất interpheron α và γ là chất chống chống siêu vi trùng, chống độc nhiễm và giảm đường trong máu, chính vì thế chúng có tác dụng giảm phản ứng phụ của chất thuốc khác Về phần chất triterpene của linh chi có tác dụng chống viêm sưng, giảm lượng cholesterol thừa trong máu, hạ huyết áp và bảo vệ tốt cho gan Nghiên cứu cho thấy linh chi có dụng chống bệnh sơ gan, làm giảm chất collagene trong gan, điều hòa lại các enzyme hoạt động trong tế bào gan như: ALT (GPT), AST (GOT), lactodehydrogenase (LDH), phosphatase alcaline và lượng mật toàn phần bilirubine total Có tác dụng chống dị ứng, hơn nữa người ta mô tả hiệu quả chống sự hóa đông của tuyến máu (plaquettes) và làm thư giãn bắp cơ [37, 157]

Linh chi có những tác dụng với hệ miễn dịch: Linh chi được dùng trong điều trị

viêm gan do virus, tăng cường chức năng sản xuất interferon trong cơ thể, tăng hoạt tính của đại thực bào và lympho bào Hỗ trợ điều trị các bệnh ung thư nhờ polysaccharide: β-1-3D-glucan chất này có tác dụng chống dị ứng, chống viêm nhờ các axit ganoderic [71] Tác dụng chống ô xi hóa, khử các gốc tự do trong cơ thể, bảo vệ và chống ảnh hưởng của các tia chiếu xạ và nâng cao hệ miễn dịch trong hệ điều trị nhiễm HIV [4, 30]

1.5.6 Diệp hạ châu

Diệp hạ châu tên thường gọi: Diệp hạ châu

Tên gọi khác: Cây chó đẻ, Cỏ chó đẻ, Trân châu thảo, Nhật khai dạ bế

22

Theo y học cổ truyền:

+ Tính vị: Vị hơi đắng ngọt, tính mát

+ Tác dụng: Thanh can, minh mục, thấm thấp, lợi tiểu

+ Chủ trị: Trị trẻ con cam tích, phù thủng do viêm thận, nhiễm trùng đường niệu, sỏi bàng quang, viêm ruột, tiêu chảy, họng sưng đau…

Theo y học hiện đại:

Trong thành phần diệp hạ châu (P urinaria L.) có mặt các axit, triterpen,

một số alkaloid và các dẫn xuất phenol, axit ellagic, axit gallic, axit phenolic và một

số flavonoid, phyllanthin Nghiên cứu cho thấy thành phần phyllanthin trong diệp

hạ châu đắng (thân xanh) cao gấp 27 lần hàm lượng phyllanthin trong diệp hạ châu

(thân tím) [30] Các hợp chất có hoạt tính trong diệp hạ châu đắng là các lignan

(phyllanthin, hypophyllanthin, flavonoids (quercetin, quercetrin, rutin, gallocatechin, kaempferol), amariin, furosin, axit gallic, triterpenes (phyllanthenol,

phyllanthenone, phytllantheol), alkaloids (securinine, dihydrosecurinine, hydrosecurinine etc.), sterol (amarosterol-A, amarosterol-B ) Các lignin liên quan

4-đến hoạt tính kháng viêm như nirtetralin, phyltetralin hoặc niranthin ức chế PAF sản sinh từ quá trình sưng viêm Phyltetralin, nirtetralin và niranthin ức chế carrageenan tạo ra trong quá trình viêm và sự tăng sinh bạch cầu trung tính [116, 136]

Các phức chất phenol trong dịch chiết với nước của diệp hạ châu có hoạt tính chống ô xi hóa mạnh nhất là phyllanthin, amariin, repandusinic acid và phyllanthusiin D Hoạt tính chống ung thư cũng được thử nghiệm trên chuột với hỗn hợp phyllanthin và hypophyllanthin (1:1) Phyllanthin được chứng minh vai trò bảo vệ tế bào gan chuột gây độc với ethanol hoặc CCl4 [30]

Tác dụng dược lý của diệp hạ châu: Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác

dụng bảo vệ gan của chất chiết diệp hạ châu hoặc những hoạt chất từ diệp hạ châu Một số nghiên cứu chứng minh diệp hạ châu có tác dụng bảo vệ gan chuột khi gây độc bằng nimesulide, một thuốc kháng viêm không steroide (COX) liều 750mg/kg trong 3 ngày [60] Một số nghiên cứu chứng minh vai trò của phyllanthin trong việc bảo vệ tế bào gan do đối kháng với những ảnh hưởng gây độc gan của cồn ethanol Chất này cũng hồi phục lại khả năng chống ô xi hóa của tế bào gan chuột bao gồm glutathion tổng số và hoạt tính của glutathione reductase [154, 155]

Dịch chiết thân và rễ của P amarus trong methanol với liều 50, 200 và 1000

mg/kg thể trọng, dùng đường uống đã ức chế loét dạ dày của chuột gây bệnh thực nghiệm bằng ethanol tuyệt đối (8 mL/kg thể trọng) Một nghiên cứu khác cho rằng

23

dịch chiết Diệp hạ châu đắng (400 mg/kg) thử nghiệm có khả năng trì hoãn thời gian bắt đầu tiêu chảy, giảm tần số đi phân dẫn đến ức chế nhu động ruột 79,9% so với 86,9% do tác động của morphine (100 mg/kg) được dùng như đối chứng [81]

Một số nghiên cứu chứng minh một số hoạt chất sinh học quan trọng trong Diệp hạ châu có thể ứng dụng trong bào chế thuốc Một số nghiên cứu khác cho rằng dịch chiết Diệp hạ châu hoặc các hoạt chất sinh học trong nó có tác dụng khác như: Chống chứng lãng quên, chống ung thư, chống bệnh sốt rét, lợi tiểu, tránh thai,

hạ đường huyết và giảm cholesterol trong máu, điều hòa miễn dịch và bảo vệ thận Ngoài ra một số bài báo khoa học, công trình nghiên cứu trong nhiều năm qua chỉ ra Diệp hạ châu là cây thuốc có thể sử dụng riêng lẻ hoặc phối hợp với các cây thuốc khác ít gây tác dụng phụ hay ngộ độc trong sử dụng [30, 46, 48]

Điều trị viêm gan: Tại Việt Nam, khá nhiều công trình nghiên cứu về tác

dụng điều trị viêm gan của diệp hạ châu đã được tiến hành, một số nhóm nghiên cứu đã bước đầu thành công trong việc phân tích và bào chế sản phẩm như: CADEF, DAISVAN do Đái Duy Ban và cộng sự bào chế [3, 5]

Tác dụng trên hệ thống miễn dịch: Các nhà khoa học Hoa Kỳ, Nhật Bản

cũng đã khám phá tác dụng ức chế sự phát triển HIV-1 của cao lỏng Phyllanthus niruri thông qua sự kìm hãm quá trình nhân lên của virus HIV Năm 1996, Viện Nghiên cứu Dược học Bristol cũng đã chiết xuất từ diệp hạ châu được một hoạt chất

có tác dụng này và đặt tên là “Nuruside” [60, 131]

Tác dụng giải độc: Người Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc dùng Diệp hạ châu

để trị các chứng mụn nhọt, lở loét, đinh râu, rắn cắn, giun Nhân dân Java, Ấn Độ dùng để chữa bệnh lậu Theo kinh nghiệm dân gian của Malaysia, diệp hạ châu có thể dùng để trị các chứng viêm da, viêm đường tiết niệu, giang mai, viêm âm đạo Nghiên cứu tại Viện Dược liệu giai đoạn 1987 - 2000 kiểm chứng khi dùng liều 10 -

50g/kg, diệp hạ châu có tác dụng chống viêm cấp trên chuột thí nghiệm [5, 94] 1.5.7 Đông trùng hạ thảo

Đông trùng hạ thảo tên thường gọi: Đông trùng hạ thảo

Tên gọi khác: Trùng thảo, hạ thảo đông trùng

Tên khoa học: Codyceps sinensis (Becrk)

24

+ Chủ trị: Bệnh về đường hô hấp, bệnh phổi, bệnh thận, bệnh gan, bệnh tim mạch và yếu khả năng sinh lý, hỗ trợ tăng cường miễn dịch, kháng virus

Theo y học hiện đại:

Cordyceps là một loại nấm thuộc ngành Ascomycotina, lớp Asiomycetes

Trong số các loài khác nhau của chủng loại này, C.sinensis (Berk) Saac được đánh

giá cao trong các bài thuốc y học cổ truyền Trung Quốc do chứa đầy đủ các thành phần và hàm lượng tăng cường miễn dịch, tăng sức đề kháng [57, 59] Các thành phần đó gồm:

Axit cordycepic, axit glutamic, các axit amin (phenylalanine, proline, histdine, valine, arginine); Polyamines (1,3- diamino propane, cadaverine, spermidine, homospermidine và purtescine); Cyclic dipeptides (cyclo - (gly-pro), cyclo - (leu-pro), cyclo - (val-pro), cyclo - (ala-pro), cyclo - (ala-leu), cyclo - (ala-val) và cyclo - (thr-leu); Saccharides và dẫn xuất đường (d-mannitol, oligosacharides và polysaccharides); Sterols (ergosterol, delta -3ergosterol, ergosterol peroxide, 3-sistosterol, daucosterol và campasterol); Nucleotides và Nucleosides (adenine, uracil, uridine và cordycepin); 28 axit béo bão hòa và không bão hòa, chất dẫn xuất của chúng và các axit hữu cơ khác (oleic, linoleic, palmitic

và acid stearic); Vitamins (B1, B2, B12, E và K); các chất vô cơ (K, Na, Ca, Mg, Fe…) Các chất hoạt tính sinh học chính: Cordyceps [3’-deoxyadenosine] và axit cordycepic đây là những hợp chất ban đầu được tách chiết từ loài cordyceps militaris Một nghiên cứu khác đã báo cáo về sự có mặt của cordycepin [3’-deoxyadenosine] và 2’ deoxyadenosine và vai trò của chất này trong nghiên cứu về suy giảm miễn dịch bằng cách sử dụng cộng hưởng từ và quang phổ học (trong

chiết suất của cordyceps sisnensis) [121, 157] Đặc biệt có các hợp chất ức chế miễn

dịch đa dạng được tìm thấy trong cordyceps như: Cyclosporin là chất chống thải ghép chính được sử dụng cho việc cấy ghép các bộ phận trên cơ thể người Những hợp chất ức chế miễn dịch khác tương tự được tìm thấy trong một loài liên quan mật

thiết đến cordyceps có tên là Isaria Sinclarii [3, 143]

Adenosine, cordyceps, polysaccharides: Trong đông trùng hạ thảo là phổ biến nhất và được khẳng định như là các hợp chất có hoạt tính sinh học giúp kích thích miễn dịch mạnh nhất Ngoài ra trong đông trùng hạ thảo còn có một số hợp chất sterol: Một số hợp chất loại sterol đã được tìm thấy trong cordyceps Trong những chất này gồm: Ergosterol, delta - 3 ergosterol, ergosterol peroxide, 3-

sitosterol, daucosterol và campasterol Chúng có tác động, bình ổn chứng rối loạn tình dục (sex-steroid) [141]

25

Các thành phần cấu tạo khác: có 28 axit béo bão hòa hay chưa bão hòa và các

chất dẫn xuất của chúng được tách chiết từ C.sinensis, hợp chất phân cực của chiết xuất

cordyceps bao gồm rất nhiều hợp chất hydrocarbons, alcohols và aldehydes Đặc biệt

có chuỗi hydrocarbon aromatic polycylic (PAH) được sản xuất bởi cordyceps sinensis

như là chất chuyển hóa thứ cấp [153, 161]

Hình 1.8 Đông trùng hạ thảo [12]

Tại Việt Nam, đông trùng hạ thảo Việt Nam được Đái Duy Ban và cộng sự công

bố tìm thấy phát triển từ ấu trùng xén tóc Batocera davidis họ Cerambycidae

coleopteran được đặt tên khoa học là Isaria cerambycidae Lưu et Đái 2009 Đông

trùng hạ thảo Isaria cerambycidae Lưu et Đái 2009 so với loài đông trùng hạ thảo

Cordyceps sinensis (Beck) Sacc có một số hoạt chất sinh học tương đương, nhưng giá

thành đông trùng hạ thảo được tìm thấy tại Việt Nam rẻ hơn rất nhiều [3]

1.6 TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC MỚI TỪ NHIỀU CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

Tại Việt Nam hiện chưa có nhiều công trình nghiên cứu bào chế từ nhiều loại cây thuốc khác nhau để tạo ra một chế phẩm mới có hoạt tính sinh học, kiểm chứng được tác dụng hỗ trợ miễn dịch thông qua đánh giá các chỉ tiêu: Biểu hiện lâm sàng bệnh, các chỉ số xét nghiệm máu, giải phẫu bệnh, đánh giá ở cấp độ tế bào Điều này cần phải thực hiện đồng thời trên nhiều mô hình thử nghiệm như: Virus Gumboro gây suy giảm miễn dịch ở gà, Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (ở cấp độ tế bào), thử nghiệm an toàn trên chuột, thỏ và được cấp phép là thực phẩm chức năng để ứng dụng trong đời sống, phục vụ nhân dân Việc nghiên cứu phối trộn 7 cây thuốc trong cùng một bài thuốc, kiểm chứng được tác động hỗ trợ miễn dịch cơ thể trên nhiều mô hình thử nghiệm khác nhau là chưa có tại Việt Nam

Vì vậy việc bào chế thành công tạo ra một bài thuốc mới, dưới dạng thực phẩm chức năng từ 7 cây thuốc Việt Nam có hoạt chất sinh học, hỗ trợ miễn dịch cơ thể như: flavonoid, saponin, adenosine, polysaccharide, phytosterol, cordycepin, flavonoid, phenolic là nhiệm vụ cấp bách và cần thiết

26

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Động vật thực nghiệm

Đánh giá tác động của chế phẩm mới cho nhiều đối tượng động vật thử nghiệm khác nhau như: Gà, thỏ, chuột, virus gây bệnh tai xanh trên lợn trước khi thử nghiệm trên người

2.1.1 Giống gà Lương Phượng

Giống gà Lương Phượng được lựa chọn do đặc tính dễ nuôi, thích nghi cao, chịu đựng tốt với khí hậu nóng ẩm và đòi hỏi chế độ dinh dưỡng không cao, có thể nuôi nhốt, sức đề kháng tốt

Tiêu chuẩn lựa chọn gà: Gà giống Lương Phượng được chọn lọc tại trại gà

thôn Phú Hạ, xã Minh Phú, huyện Sóc Sơn, Hà Nội, gà không bị bệnh, không tiêm phòng bất cứ loại vắc xin nào

Gà nuôi lớn đến 25 ngày tuổi làm thí nghiệm chọn ra các gà khỏe mạnh, nhanh nhẹn, không bị bệnh và nuôi cách ly tại xã Đồng Mô, Ba Vì, Hà Nội

Lô gà đối chứng: Chỉ sử dụng thức ăn chăn nuôi gà, loại túi 50 kg do Công

ty Cổ phần Việt Pháp sản xuất, ký hiệu V5008, đóng gói 25 kg/ bao Thành phần như: Protein (18%), chất xơ (5%), Canxi (0,7 - 1,4%), Lysine (1,05%), độ ẩm: 13%

Với lô gà thí nghiệm (ăn bổ sung cây thuốc hoặc Viên tăng sức đề kháng)

- Thử nghiệm với cây thuốc: Trộn thức ăn chăn nuôi V5008 với bột của từng cây thuốc riêng lẻ, theo tỷ lệ tương ứng trong các thí nghiệm

- Thử nghiệm với Viên tăng sức đề kháng: Sử dụng hỗn hợp được trộn với

Viên tăng đề kháng theo tỷ lệ trộn 40 kg thức ăn chăn nuôi V5008 với 10 kg bột Viên tăng sức đề kháng có tỷ lệ: (4 : 1)

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn thỏ làm thí nghiệm

Thỏ có trọng lượng từ 2,2 - 2,4 kg do Trung tâm Chăn nuôi Thỏ Việt cung cấp Thỏ thí nghiệm cả hai giống, khỏe mạnh được nuôi cách ly thử nghiệm, được

ăn thức ăn tiêu chuẩn dành cho thỏ và uống nước tự do

Thỏ được chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con trong đó:

Lô A (lô chứng): Thỏ được uống dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% với liều 5 ml/kg/ngày

Lô B: Thỏ được uống Viên tăng sức đề kháng với liều 0,12g (tương đương liều dùng trong lâm sàng) pha trong 5 ml nước muối sinh lý/kg/ngày