Gene Igf2 (Insulin-like growth factor 2) là gene in dấu, chỉ biểu hiện trên allele có nguồn gốc từ cá thể đực (bố). Nó giữ nhiều chức năng quan trọng, cơ chế kiểm soát biểu hiện của gene Igf2 khá phức tạp và được điều khiển trực tiếp bởi các promoter.
Trang 1Nhân dòng và phân tích trình tự promoter
của gene Igf2 từ nhau thai chuột
Cloning and analysing the sequence of Igf2 gene’s promoter from the mouse’s placenta
Đỗ Mỹ Hiếu, Trường Đại học Sư phạm Huế
Do My Hieu, Hue University of Education
TS Phạm Quang Chinh, Trường Đại học Sư phạm Huế Nguyen Thi Thu Hang, Ph.D., Hue University of Education
TS Trần Văn Giang, Trường Đại học Sư phạm Huế Tran Van Giang, Ph.D., Hue University of Education
Tóm tắt
Gene Igf2 (Insulin-like growth factor 2) là gene in dấu, chỉ biểu hiện trên allele có nguồn gốc từ cá thể
đực (bố) Nó giữ nhiều chức năng quan trọng, cơ chế kiểm soát biểu hiện của gene Igf2 khá phức tạp và được điều khiển trực tiếp bởi các promoter Hai promoter P2 và P3 của gene Igf2 đã được tách chiết,
khuếch đại, tinh sạch và nhân dòng từ mô nhau thai chuột 17 ngày Trình tự promoter P2 và P3 của gene
Igf2 có chiều dài lần lượt là 420 và 212 nucleotid Trình tự của các promoter này có độ tương đồng rất
cao với trình tự (U71085.1) và (AH001929.2) trên GenBank
Từ khóa: gene in dấu, Igf2, nhau thai, nhân dòng, promoter
Abstract
Gene Igf2 (Insulin-like growth factor 2) is an imprinted gene which is expressed from only one of the
parental chromosomes This gene plays a lot of important functions; the mechanism for controlling its expression is quite complex and is carried out by the promoters The P2 and P3 promoters of Igf2 have been successfully split, amplified, purified and cloned from placental tissues of 17-day-old male mice The P2 and P3 promoters of the Igf2 gene are 420 and 212 nucleotides in length, which are very much similar with GenBank sequences (U71085.1 and AH001929.2 respectively)
Keywords: imprinted gene, Igf2, placenta, cloning, promoter
1 Đặt vấn đề
Động vật có vú là những loài có bộ
nhiễm sắc thể lưỡng bội, đời con thừa
hưởng bộ nhiễm sắc thể của cả bố và
mẹ Như vậy, chúng có hai bản sao của mỗi
gene Theo quy luật Mendel, thông thường
cả hai bản sao từ bố hoặc mẹ của mỗi gene
đều có sự biểu hiện như nhau Thế nhưng, một số gene chỉ biểu hiện bản sao có nguồn gốc từ bố hoặc mẹ Hiện tượng đó được gọi
là in dấu hệ gene (Genomic imprinting) Có
hơn 100 gene in dấu, trong đó điển hình là
gene Igf2 (Insulin - like growth factor 2)
nằm trên nhiễm sắc thể số 7 của chuột và số
Trang 2sinh trưởng và biệt hóa của tế bào và đặc
biệt là liên quan đến sự điều hòa phát triển
phôi và sự phát triển của nhau thai Với
chức năng đó, gene Igf2 biểu hiện sớm
trong quá trình phát triển phôi ở tất cả các
loại mô nội bì, ngoại bì và trung bì, ở cơ thể
trưởng thành, gene này biểu hiện thấp [1]
Gene Igf2 trên chuột được điều khiển
bởi 4 promoter khác nhau và các promoter
này có trình tự bảo thủ cao giữa gene Igf2
trên chuột và người và chúng chỉ biểu hiện
trên allele có nguồn gốc từ cá thể đực (bố)
truyền cho đời con [2] Mức độ biểu hiện
của gene này chủ yếu do các promoter
quyết định, 4 promoter đã được biết liên
quan đến sự biểu hiện của gene là P0, P1 và
P2 và P3 [7] Các promoter này điều khiển
biểu hiện của 3 exon là exon 4, exon 5 và
thận, tim) Còn các promoter khác như P0
và P1 thì biểu hiện khá thấp [3] Vì vậy, xác định được trình tự của các promoter này trong nhau thai để từ đó nghiên cứu chính
xác mức độ biểu hiện của gene Igf2 trong
nhau thai chuột thực sự là cần thiết
2 Nguyên liệu và phương pháp
2.1 Nguyên liệu và hóa chất
2.1.1 Nguyên liệu
Các mẫu nhau thai chuột đực 17 ngày tuổi được thu nhận tại phòng thí nghiệm Giải phẫu - Sinh lý thuộc khoa Sinh, trường Đại học Sư phạm Huế, xử lý mẫu với nitơ lỏng và bảo quản ở nhiệt độ -20oC
để tiến hành tách chiết ADN (Hình 1 A) Cặp mồi đặc hiệu được sử d ng để thực hiện quá trình khuếch đại và nh n dòng (Bảng 1)
Bảng 1 Trình tự cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn E coli DH5α do Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế cung cấp
- Vertor tạo dòng pGEM-T Easy (Promega) (Hình 1 B)
Trang 3
Hình 1 Vị trí lấy mẫu tách chiết ADN (A) Cấu tạo vector pGEM-T Easy (Promega) (B)
2.1.2 Hóa chất và thiết bị
Các hóa chất được sử d ng trong
nghiên cứu: Các môi trường LB lỏng, LB
đặc Các dung dịch: phá tế bào (10mM
Tris, 100mM EDTA, 2% SDS, pH 8,0),
dung dịch tủa protein (Ammonium acetate
7,5 M), PCI (Phenol - Chloroform -
Isoamylchloroform: 25:24:1), đệm TE
(10Mm Tris-HCl; 1mM EDTA; pH 8,0),
cồn rửa (70% EtOH) Tris, EDTA, SDS,
ammonium acetate, protein K, agarose,
chloroform, ethanol, loading dye (5X),
ampicillin,…
Các thiết bị được sử d ng trong nghiên
cứu như: Máy PCR (Mỹ), máy ly tâm lạnh
(Đức), máy vortex (Đức), hệ thống đọc UV
trực tiếp (Mỹ), hệ thống điện di (Mỹ) Máy
pH tự động (Th y Sỹ), nồi khử trùng (Nhật
Bản), tủ lạnh (Nhật Bản), tủ lắc (Đức), tủ
cấy (Nhật bản), tủ ấm (Nhật bản), cân phân
tích (Đức)
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Các phương pháp sinh học phân tử
được tham khảo theo Sambrook và Ruesel
(2001) [9] có cải tiến Các thí nghiệm được
thực hiện từ 10/2015 - 5/2017 tại phòng thí
nghiệm trọng điểm Di truyền - Vi sinh thuộc
khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Huế
2.2.1 Tách chiết ADN tổng số
2 ml dịch mô tế bào được giải đông ở
nhiệt độ phòng Thêm 40 µl proteinase
(20µg/ml) đã được hòa tan trong đệm pK
2X Sau 4 giờ ủ ở nhiệt độ 50°C, dịch tế bào được chiết với 4 ml phenol/chloroform (1:1) Ly tâm dịch chiết trong 30 phút ở 20°C (6000v/1phút) Dịch nổi được tủa bằng 8 ml (EtOH) 70% và 300 µl NaCl 5
M ở nhiệt độ -20°C trong 12 giờ hoặc qua đêm Ly t m thu lấy tủa, rửa tủa bằng 500
µl (EtOH) 70% Ly tâm loại bỏ cồn, làm khô ADN ở nhiệt độ phòng
2.2.2 Phản ứng PCR
Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 1
µl ADN; 6 µl đệm 2X PCR master mix
(2,4 mM dNTP mỗi loại; 0,3 đơn vị Taq
ADN polymerase), 0,5 µl mồi xuôi, 0,5 µl mồi ngược và bổ sung nước vô trùng để đạt thể tích phản ứng là 12 µl Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình sau: biến tính ADN bộ gene 95oC/5 phút; tiếp đến là 30 chu kỳ: 95oC/1 phút, 48oC/30 giây, 72oC/1 phút; cuối cùng là 72oC/10 phút [8]
2.2.3 Điện di agarose gel
Chuẩn bị agaro gel 0,8%, sau khi gel
đã đông, tra mẫu vào các giếng, chạy với điện trường 100 V trong 30 phút Sau khi kết thúc điện di, nhuộm bản gel với ethidium bromide (EtBr) có nồng độ 0,5 g/ml trong 15 phút, rửa lại bằng nước cất
và cho vào hệ thống máy đọc gel Ch p ảnh và phân tích kết quả
2.2.4 Gắn sản phẩm PCR vào vector
Sản phẩm PCR được gắn trong vector
Trang 4phương pháp shock nhiệt Hỗn hợp biến
nạp bao gồm: 10 µl dung dịch gắn chứa
vector mang sản phẩm PCR, 200 µl dung
dịch tế bào khả biến DH5α Hỗn hợp được
trộn nhẹ nhàng, ủ 30 phút trong tủ đá, sốc
nhiệt ở 42oC trong 45 giây, ngay lập tức
chuyển sang khay đá, ủ 3 phút Sau đó hỗn
hợp được nuôi trong môi trường LB lỏng
(800 µl) (không có kháng sinh), ủ ở 37oC,
lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ Lấy 200 µl
dung dịch biến nạp trải trên môi trường LB
đặc có bổ sung 50 µg/ml ampicillin, 30 µl
X - Gal 40 µg/ml, 30 µl IPTG 100 mM
2.2.6 Tách chiết và tinh sạch plasmid
tái tổ hợp
Lấy 1 ml dịch nuôi cấy các plasmid tái
tổ hợp đưa vào ống Eppendorf 1,5 ml, ly
t m 6000 vòng/phút trong 2 phút để thu tế
bào Sau ly tâm bỏ dịch phía trên, giữ cặn
tế bào bên dưới Thêm 600 µl nước cất vào
để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ lên
xuống vài lần cho đều Thêm 100 µl dung
dịch phá tế bào vào hỗn dịch trên để phá
màng tế bào, đảo nhẹ nhàng, ủ ở nhiệt độ
phòng trong 5 phút Thêm 350 µl dung
dịch rửa (nhiệt độ 4 - 8oC), trộn nhẹ nhàng,
sau đó ly t m trong 10 phút, nhiệt độ 4o
C
Lấy dịch trong bên trên đưa lên màng của
cột lọc Ly tâm trong 1 phút, bỏ dịch dưới
Bổ sung 200 µl dung dịch rửa lên trên
màng lọc, sau đó ly t m, bỏ dịch bên dưới
Rửa với 400 µl dịch rửa, ly tâm tiếp trong
1 phút Làm khô cột bằng ly tâm trong 2
phương pháp Sanger dựa trên các dideoxyl ADN polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’-OH của mạch đơn ADN đang tổng hợp, khi gặp các deoxynucleotide không có nhóm 3’-OH phản ứng tổng hợp sẽ bị ngừng lại Kết quả
là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thước hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang trên máy đọc chương trình tự động ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer Các phản ứng tổng hợp bị dừng bằng cách bổ sung formamite ngăn không cho các sợi ADN bắt cặp với nhau, các phân tử ADN mới được tổng hợp được điện di trên gel polyacrylamite để tách nhau ra Dịch chiết plasmid tinh sạch được gửi đến công ty Biomedic để giải trình tự thông qua Viện công nghệ Sinh học – Đại học Huế
2.2.8 Phân tích trình tự các promoter Các trình peomoter của gene IGF2
trong nhau thai chuột 17 ngày được phân tích bằng chương trình BLAST Các trình
tự được chỉnh sửa và sắp xếp bằng phần
mềm BioEdit 7.0
3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1 Tách chiết và khuếch đại ADN tổng số
Mẫu nhau thai chuột được sử d ng để
tách chiết ADN tổng số ADN tổng số sau khi được tách chiết được điện di trên gel
agarose 0,8 % (Hình 2 A)
Trang 5Hình 2 Điện di đồ ADN tổng số (A) Khuếch đại promoter P3, M: ADN marker 1 kb, 1: sản phẩm PCR (B) Khuếch đại promoter P2,
M: ADN marker 1 kb, 2: sản phẩm PCR (C)
Kết quả điện di cho thấy ADN tổng số
được tách chiết từ nhau thai chuột tập trung
thành một băng khá đậm, tương đối sạch, ít
bị đứt gãy, đảm bảo chất lượng cho các
nghiên cứu tiếp theo
Từ ADN tổng số, các promoter P2 và
P3 của gene Igf2 được nhân lên bằng phản
ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm
PCR tập trung một băng rõ nét, với kích
thước khoảng hơn 200 bp đối với promoter
P3 (Hình 2 B) và khoảng hơn 400 bp đối
với promoter P2 (Hình 2 C) Kích thước
ph n đoạn được nh n lên tương đương với
kích thước của P2 và P3 được tính toán
trên l thuyết
3.2 Nhân dòng các promoter P2 và P3
3.2.1 Gắn sản phẩm PCR vào vector
và biến nạp vào tế bào khả biến
Sản phẩm PCR được gắn vào vector
pGEM - T Easy, sau đó biến nạp vào tế bào
tế bào khả biến Dung dịch biến nạp được
trải lên đĩa chứa môi trường chọn lọc (LB
+ agar + 50 µg/ml ampicillin + X-Gal 40
µg/ml + IPTG 100 mM) Nuôi qua đêm ở
nhiệt độ 37oC, các khuẩn lạc sẽ xuất hiện
trên đĩa thạch (Hình 3) Các khuẩn lạc
trắng được chọn vì khuẩn lạc trắng là khuẩn lạc có thể mang gene tái tổ hợp và tiếp t c nuôi trong môi trường LB lỏng có
bổ sung ampicillin Dịch nuôi qua đêm được sử d ng để tách chiết plasmid và kiểm tra sự có mặt của các plamid tái tổ hợp mang các promoter
Hình 3 Khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch
3.2.2 Tách chiết và kiểm tra plasmid tái tổ hợp
Các khuẩn lạc trắng được nuôi trong môi trường LB lỏng có chứa 50 µg/ml ampicillin để tiến hành tách plasmid Plasmid sau khi được tách chiết được điện di kiểm tra với khuẩn lạc chỉ có vertor không mang gene chèn làm đối chứng âm (Hình 4)
Trang 6Hình 4 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp, (ĐC) plasmid đối chứng, (1, 2, 3, 4, 5) plasmid được tách chiết (A) PCR kiểm tra plasmid 5 (B) PCR kiểm tra plasmid 1
(C), M: marker
Ba plasmid (1, 2, 3) tách chiết từ các
khuẩn lạc mang sản phẩm biến nạp là PCR
P2, trong đó chỉ có plasmid 1 có chênh so
với đối chứng, nghĩa là nó có khả năng
mang tái tổ hợp, nên kích thước lớn hơn và
di chuyển chậm hơn, các plasmid này tiếp
t c PCR với mồi đặc hiệu để kiểm tra độ
chính xác, sản phẩm trên điện di đồ cho
thấy, kích thước đúng với sản phẩm PCR
P2 từ ADN tổng số cũng như tính toán trên
lý thuyết (Hình 4 A C) Ba plasmid (4, 5,
6) tách chiết từ các khuẩn lạc mang sản
phẩm biến nạp từ PCR P3, trong đó chỉ có
plasmid 4 có chênh so với đối chứng, nghĩa
là nó có khả năng mang tái tổ hợp, nên kích
thước lớn hơn và di chuyển chậm hơn, các
plasmid này tiếp t c PCR với mồi đặc hiệu
để kiểm tra độ chính xác, sản phẩm trên
điện di đồ cho thấy, kích thước đúng với
sản phẩm PCR P3 từ ADN tổng số cũng
như tính toán trên l thuyết (Hình 4 A &B)
3.3 Giải trình tự và so sánh với
trình tự trên GenBank
Mẫu plasmid tái tổ hợp mang promoter
P2 và P3 của chuột Mus musculus sau khi
tinh sạch được gửi đi giải trình tự Kết quả giải trình tự promoter P2 có 420 nucleotide, 44 đảo CpG (Hình 5) và kết quả giải trình tự promoter P3 có 212 nucleotide, có 6 đảo CpG (Hình 5) Quá trình methyl hóa ADN chủ yếu xảy ra ở vị trí phân tử carbon C5 của cytosine nằm trong các đảo CpG, thành dạng 5-methylcytosine Sự thay thế này không làm thay đổi trình tự ADN nhưng liên quan rất lớn đến cơ chế biểu hiện của gene [6] Với sự có mặt nhiều đảo CpG trong trình tự P2 thì promoter này dễ bị methyl hóa và ảnh hưởng lớn đến quá trình biểu
hiện của gene Igf2 so với promoter P3
Quá trình methyl hóa ADN thường xảy ra
ở vị trí dinucleotide CpG, gọi là đảo CpG,
nó thường diễn ra ở một số vùng nhất định như vùng promoter hoặc vùng exon đầu tiên Ở nhiều bệnh, như ung thư, đảo CpG trong promoter của gene có sự methyl hóa quá mức bất thường, sẽ gây ra sự bất hoạt quá trình phiên mã và có thể được di truyền cho các tế bào con bởi sự phân bào [9]
Trang 7Hình 5 Trình tự promoter P2 và P3
Sau khi khuếch đại và giải trình tự 2
promoter P2 và P3, kích thước và vị trí
đoạn khuyếch đại được so sánh với các
promoter khác của gene Igf2 (Hình 6)
Trong tương quan các promoter thì P2 có
kích thước lớn với 1 vị trí TSS, tiếp đến P1 [10] và kích thước nhỏ nhất là P0 và P3
Cả 2 promoter này không có hộp TATA như các promoter điển hình của một số loài sinh vật nhân chuẩn khác
Hình 6 Vị trí và kích thước các bản sao P2, P3 trong tương quan với các promoter khác
Trang 8A
B
Hình 7 So sánh P2 và P3 với trình tự trên GenBank
Trang 94 Kết luận
ADN tổng số được tách chiết từ mô
nhau thai của chuột Mus musculus 17 ngày
có nồng độ cao, sạch, ít bị đứt gãy và tập
trung thành băng rõ nét Đã giải trình tự và
phân tích trình tự của promoter P2 có 44
đảo CpG và có 420 nucleotide, giải trình tự
promoter P3 có 6 đảo CpG và có 212
nucleotide Trong tương quan các promoter
thì P2 có kích thước lớn với 1 vị trí TSS,
P3 ngắn hơn và 1 TSS Cả 2 promoter này
không có hợp TATA như promoter của
một số loài sinh vật nhân chuẩn khác
Trình tự promoter P2 có độ tương đồng là
99% so với trình tự trên GenBank
(U71085.1), còn promoter P3 có độ tương
đồng là 100% so với trình tự trên GenBank
(AH001929.2)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Christiansen, J., Kofod, M., Nielsen, F., C
(1994) A Guanosine Quadruplex and Two
Stable Hairpins Flank a Major Cleavage Site
in Insulin-like Growth Factor II mRNA
Nucleic acids research, 22(25): 5709 – 5716
2 Constância, Hemberger, M., Hughes, J.,
Dean, W., Smith, F., Fundele, R,, Stewart, F.,
Kelsey, G., Fowden, A., Sibley, C., Reik, W
(2002) Placental - Specific IGF - II is a Major
Modulator of Placental and Fetal growth,
Nature, 417(6892): 945 - 948
3 Butler, J E., Kadonaga, J T (2002) Regulation
of gene expression the RNA polymerase II core
promotor: A Key component in the regulation
of gene expression, Gene and development, 16
2583 - 2592
4 Elly, H (2003) The many levels of control of Igf2 expression, Nature, 5, 91 - 102
5 Firth, M., Ganeshprasad, U., Baxter, R C (1998) Structural determinants of ligand and cell surface binding of insulin-like growth factor-binding protein-3, J Biol Chem, 273(5): 2631 - 2638
6 Kim, M., S., Lee, J., Sidransky, D (2010) ADN methylation markers in colorectal cancer, Cancer Metastasis Review, 29 181 - 206
7 Monk, D., Sanches, R., Arnaud, P., Apostolidou, S., Hills, F., Abu-Amero, S., Murrell, A., Friess, H., Reik, W., Stanier, P., Constância, M., Moore, G E (2006) Imprinting of IGF2 P0 Transcript and Novel Alternatively Spliced INS-IGF2 Isoforms Show Differences between Mouse and Human.” Human molecular genetics, 15(8):
1259 – 1269
8 Rand, K., Clark, S J., Molloy, P (2002) Conversion-specific detection of DNA methylation using real-time polymerase chain reaction (ConLight-MSP) to avoid false positives Methods: 27 (2): 114 - 120
9 Sambrook, J and Russel, D W (2001) Molecular cloning: A laboratory manual, cold spring harbor labortory press
10 Tran, V G., Court, F., Duputié, A., Antoine, E., Aptel, N., Milligan, L., Carbonell, F., Lelay-Taha, M., Piette, J., Weber, M., Montarras, D., Pinset, C., Dandolo, L., Forné, T., Cathala, G (2012) H19 Antisense RNA Can up-Regulate Igf2 Transcription by Activation of a Novel Promoter in Mouse Myoblasts PloS one, 7(5): e37923
Ngày nhận bài: 30/6/2017 Biên tập xong: 15/8/2017 Duyệt đăng: 20/8/2017