Trong nghiên cứu này, chitosan đã được cắt mạch trong dung dịch chitosan/H2O2 bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60. Khối lượng phân tử (Mw) và độ đề axetyl (ĐĐA) của chitosan lần lượt được xác định bằng phương pháp sắc ký gel thấm qua (GPC) và phương pháp phổ hồng ngoại (IR).
Trang 1Nghiên cứu chế tạo Oligochitosan bằng phương pháp
khảo sát hiệu ứng gia tăng số lượng hoa trên cây dâu tây
(Fragaria Vesca L.)
A study on preparation of Oligochitosan by Gamma irradiation onto Chitosan/H2O2 solution and examining effects of increase in the number of flowers on strawberry
(Fragaria Vesca L.)
TS Đặng Xuân Dự, Trường Đại học Sài Gòn
Dang Xuan Du, Ph.D., Saigon University
Tóm tắt
Trong nghiên cứu này, chitosan đã được cắt mạch trong dung dịch chitosan/H 2 O 2 bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 Khối lượng phân tử (Mw) và độ đề axetyl (ĐĐA) của chitosan lần lượt được xác định bằng phương pháp sắc ký gel thấm qua (GPC) và phương pháp phổ hồng ngoại (IR) Kết quả cho thấy oligochitosan khối lượng phân tử Mw < 10 kDa đã được chế tạo một cách hiệu quả bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 dung dịch chitosan/H 2 O 2 ở liều xạ thấp, khoảng 8 kGy Oligochitosan chế tạo được có hiệu ứng gia tăng số lượng hoa của cây dâu tây Nồng độ phù hợp của oligochitosan để phun lên cây dâu tây là khoảng 50 ppm
Từ khóa: Oligochitosan, bức xạ Gamma, dâu tây
Abstract
In this study, the degradation of chitosan in the presence of H 2 O 2 solution by gamma irradiation was investigated The molecular weight and the degree of deacetylation of chitosan were determined by gel permeation chromatography (GPC) and infrared spectra (IR), respectively Results showed that oligochitosan with molecular weight Mw < 10 kDa were preparared efficiently by gamma irradiation in small doses, ~8 kGy The obtained oligochitosan imposes effects of increase in the size of leaves of fracaria vesca L The appropriate concentration of oligochitosan used to spray onto fracaria vesca L trees was 50 ppm
Keywords: Oligochitosan, Gamma irradiation, fracaria vesca L.
1 Mở đầu
Chitosan là polyme có nguốn gốc tự
nhiên, là sản phẩm biến tính từ chitin bằng
cách loại các nhóm axetyl Oligochitosan là
dẫn xuất của chitosan được chế tạo bằng
phản ứng cắt mạch Oligochitosan tự phân hủy sinh học, là prebiotic có độc tính thấp,
có khả năng kháng khuẩn [8], [7] và kháng nấm [6] Ngoài ra, oligochitosan còn làm tăng sinh tế bào, tăng cường miễn dịch của
Trang 2cơ thể động vật bằng cách kích thích sản
sinh bạch cầu, giảm cholesterol trong máu
và có tác dụng làm lành các vết thương, vết
bỏng [11] Hoạt tính của oligochitosan
thường được quyết định bởi khối lượng
phân tử (KLPT, Mw) và độ đề axetyl
(ĐĐA) Do có nhiều hoạt tính sinh học độc
đáo, oligochitosan được ứng dụng khá đa
dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như
làm chất điều hòa sinh trưởng, phòng trị
nấm bệnh thực vật và gia tăng khả năng
miễn dịch trên động vật
Các phương pháp cắt mạch chitosan để
chế tạo oligochitosan đã được phổ biến bao
gồm: phương pháp hóa học, phương pháp
enzym và phương pháp chiếu xạ Ưu điểm
của phương pháp hóa học là dễ dàng tiến
hành với quy mô lớn do điều kiện phản
ứng đơn giản Tuy nhiên, hạn chế của
phương pháp này là cho hiệu suất thấp và
có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường
Phương pháp enzym cho hiệu suất cao
nhưng chi phí đắt Trong khi đó, phương
pháp chiếu xạ có lợi thế là có thể tiến hành
dễ dàng với quy mô lớn nhưng để chế tạo
được oligochitosan đòi hỏi phải sử dụng
liều xạ cao [2] Điều này dẫn đến khả năng
sản phẩm tạo thành dễ bị cắt mạch nhóm
amin và phá vỡ vòng glucopyranose [5],
làm giảm hoạt tính của oligochitosan
Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình
bày kết quả chế tạo oligochitosan dựa trên
sự kết hợp đồng thời giữa bức xạ gamma
Co-60 và H2O2 Ưu điểm của phương pháp
là có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng, giảm
thời gian và liều xạ, có thể chế tạo được
sản phẩm với quy mô lớn ở dạng lỏng hay
dạng rắn đáp ứng yêu cầu sử dụng Ngoài
ra, tác nhân cắt mạch là H2O2 và bức xạ
gamma Co-60 là những tác nhân được cho
là khá thân thiện với môi trường Sản phẩm
cắt mạch được nghiên cứu ứng dụng làm
chất gia tăng số lượng hoa của cây dâu tây
(Fragaria vesca L), loại cây cho hiệu quả
kinh tế cao, được trồng phổ biến ở cao nguyên Lâm Đồng Kết quả nghiên cứu hướng đến cung cấp các chất kích thích tăng trưởng trong nông nghiệp có nguồn gốc tự nhiên góp phần phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững
2 Thực nghiệm
2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất
α - chitosan được chế tạo từ vỏ tôm có ĐĐA khoảng 90%, Mw khoảng 50 kDa
Dâu tây Labiang (Fragaria vesca L.) được
mua ở tại vườn giống Dâu tây xã An Phú, thành phố Pleiku, Gia Lai Hydro peroxit (H2O2) là sản phẩm tinh khiết của Merck, Đức Các hóa chất axit lactic, etanol, amoniac… được dùng ở dạng tinh khiết phân tích Nước cất một lần được sử dụng cho toàn bộ thí nghiệm
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp chế tạo oligochitosan
Trong nghiên cứu này, oligochitosan được chế tạo bằng cách hòa tan 5 g chitosan trong dung dịch axit lactic 3%, thêm một lượng H2O2 30% và định mức đến 100 mL để thu được dung dịch chiếu
xạ chứa 5% chitosan và 1% H2O2 Tiến hành chiếu xạ trên nguồn SVST Co-60/B tại trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ VINAGAMMA, Viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam với suất liều 1,33 kGy/h, khoảng liều đến 15 kGy [5] Dung dịch sau khi chiếu xạ được trung hòa bằng NH4OH 5%, thêm một lượng cồn bằng 6 lần thể tích dung dịch mẫu, khuấy đều, sau đó lọc kết tủa và rửa sạch bằng cồn [1] Mẫu sau khi rửa sạch, để khô tự nhiên rồi sấy ở nhiệt độ 60°C trong 2 giờ
2.2.2 Xác định khối lượng phân tử và
độ đề axetyl của chitosan
Khối lượng phân tử của các mẫu chitosan được xác định bằng phương pháp sắc kí gel (GPC), trên máy LC-20AB
Trang 3Shimadzu, Nhật, sử dụng detector RID -
10A và cột Ultrahydrogel 250 của hãng
Water, Mỹ, nhiệt độ vận hành cột là 40°C,
pha động là đệm axetat CH3COOH
0,25M/CH3COONa 0,25M, tốc độ dòng là
1mL/phút Chất chuẩn được sử dụng là
polysacarit Pullulan có khối lượng phân tử
khác nhau từ 738 đến 380 000 Da [1] Mẫu
chitosan được chuẩn bị bằng cách hòa tan
trong axit axetic 0,25M với nồng độ 0,3%
đến khi tan hoàn toàn, thêm muối
CH3COONa 0,25M sau đó lọc dung dịch
qua màng 0,45μm (Millipore filters) Mẫu
chitosan được tiêm vào cột sắc kí với thể
tích khoảng 50 μl Dựa vào thời gian lưu và
so sánh với đường chuẩn xác định được
KLPT chitosan
Độ đề axetyl của chitosan được xác
định bằng phương pháp hồng ngoại trên
máy FT – IR 8400S, Shimadzu, Nhật
ĐĐA được tính dựa theo phương trình [3]:
ĐĐA,% = 100 – ([31,92 ×
(A1320/A1420)] -12,00) Trong đó, A1320 và
A1420 lần lượt là mật độ quang tương ứng
tại các đỉnh 1320 và 1420 cm-1
2.2.3 Khảo sát hiệu ứng gia tăng số
lượng hoa của oligochitosan đối với dâu tây
Chuẩn bị 4 lô thí nghiệm được đánh số
từ 1 đến 4 mỗi lô gồm có 40 cây Tiến hành
phun oligochitosan có KLPT khoảng 7,5
kDa với các nồng độ 50 ppm, 100 ppm, 150
ppm từ lô 2 đến lô 4 Lô 1 không phun
oligochitosan để làm đối chứng Thời điểm bắt đầu phun oligochitosan là sau khi cây giống được trồng khoảng 1 tuần Sau đó, oligochitosan được phun bổ sung vào ngày thứ 30 và 60 kể từ lần phun đầu tiên Cây được chăm sóc theo quy trình thông thường được canh tác tại địa phương, xã An Phú, thành phố Pleiku, Gia Lai Số hoa dâu tây được đếm vào các ngày thứ 120, 130 và
140 kể từ khi trồng Kết quả được tính trung bình cho một cây trên mỗi lô Sau
140 ngày tuổi, mỗi lô thí nghiệm được chia làm 5 nhóm, mỗi nhóm 8 cây được đếm số hoa lặp lại để phân tích thống kê, đánh giá
sự khác biệt giữa các lô nghiên cứu
3 Kết quả và thảo luận
Sự thay đổi KLPT của chitosan theo liều xạ được thể hiện trên hình 1 Kết quả cho thấy KLPT giảm nhanh trong khoảng thời gian đầu chiếu xạ, khoảng liều từ 0 đến 5 kGy Sau khoảng liều trên, KLPT của chitosan suy giảm khá chậm theo liều
xạ Điều này là do nồng độ H2O2 trong khoảng thời gian đầu chiếu xạ còn ở mức cao Ngoài ra, quá trình chiếu xạ hình thành nên gốc tự do hydroxyl đã làm phân hủy nhanh H2O2 [4] Do đó, gần như quá trình cắt mạch chủ yếu xảy ra ở giai đoạn đầu của quá trình chiếu xạ Khi liều xạ lớn hơn 5 kGy, phần lớn H2O2 đã bị phân hủy, nồng độ giảm mạnh nên hiệu quả cắt mạch cũng giảm theo
Hình 1 Sự thay đổi KLPT của chitosan theo liều xạ
Trang 4Cơ chế cắt mạch khi có mặt đồng thời
H2O2 và tia γ đã được Ulanski và các cộng
sự đề nghị [12] Theo đó, gốc tự do
hydroxyl (•OH) được hình thành nhờ quá
trình phân ly bức xạ nước và H2O2 đã đóng
vai trò như là tác nhân oxy hóa mạnh cắt
mạch chitosan:
γ ray - • • +
γ ray •
2 2
H O e , H , OH, H O , H , H O (1)
H O 2 OH (2)
Hơn nữa, sản phẩm của quá trình phân ly
bức xạ là e-aq và H• có thể phản ứng với
H2O2 để gia tăng gốc hydroxyl •OH [9]:
Theo Ulanski và cộng sự [12], gốc
•
OH bắt hydro, làm đứt liên kết C – H hình
thành gốc cacbohydrat R•, dẫn đến quá
trình chuyển vị và cuối cùng liên kết
glycoside bị cắt, tạo thành phân tử CTS có
KLPT thấp hơn Hằng số tốc độ của phản
ứng (3) và (4) lần lượt là k3 = 1,1×1010
l.mol-1.s-1 và k4 = 9×107 l.mol-1.s-1 [4]
Điều này giải thích tại sao nồng độ H2O2
giảm nhanh và quá trình cắt mạch chitosan
xảy ra có hiệu quả trong khoảng thời gian
đầu chiếu xạ Hình 1 cũng cho thấy
oligochitosan, KLPT < 10 kDa, có thể chế
tạo được ở liều xạ khá thấp, khoảng 8
kGy, tương ứng với độ suy giảm KLPT
khoảng 80% Giá trị này được nội suy từ bảng 1 Nguyễn Quốc Hiến và cộng sự đã chế tạo oligochitosan bằng kỹ thuật chiếu
xạ Kết quả cho thấy để chế tạo được oligochitosan có KLPT < 10 kDa phải sử dụng liều xạ cao hơn 100 kGy [2] Điều này cho thấy sự có mặt H2O2 chỉ ở nồng
độ thấp khoảng 1% trong nghiên cứu của chúng tôi cũng làm giảm đáng kể liều xạ cần thiết để chế tạo oligochitosan Nguyên nhân của hiện tượng này được giải thích bằng hiệu ứng đồng vận (synergistic effect) của các tác nhân cắt mạch Hiệu ứng đồng vận được định nghĩa là sự tương tác đồng thời của hai tác nhân phản ứng lớn hơn tổng tương tác của các thành phần riêng lẻ [5] Duy và cộng sự đã nghiên cứu hiệu ứng đồng vận của tia γ và H2O2
để chế tạo oligochitsan trong dung dịch Kết quả cho thấy để chế tạo oligochitosan
có KLPT < 10 kDa thì liều xạ cần thiết cũng chỉ khoảng 10 kGy [5] Tuy nhiên, nghiên cứu của Duy và cộng sự được thực hiện trên β – chitosan, loại chitosan dễ cắt mạch hơn α – chitosan, nồng độ áp dụng
là 3%, thấp hơn so với nghiên cứu của chúng tôi Như vậy, việc áp dụng hiệu ứng đồng vận của bức xạ γ và H2O2 cho phép giảm đáng kể năng lượng chiếu xạ, tăng hiệu quả chế tạo oligochitosan
Bảng 1: Sự thay đổi KLPT và ĐĐA của chitosan theo liều xạ
(*)
Suất liều 1,33 kGy/h
(3) (4)
Trang 5Hình 2 Phổ FT - IR của chitosan ban đầu (a) và chitosan được chiếu xạ ở liều 6,7
kGy (b); 11 kGy (c); 15 kGy (d)
Phổ FT- IR của mẫu chitosan ban đầu
và các mẫu chitosan sau khi chiếu xạ ở các
liều khác nhau được thể hiện trên hình 2
Kết quả cho thấy cấu trúc chính của
oligochitosan thu được (hình 2b, c, d) hầu
như không thay đổi so với chitosan ban đầu
(hình 2a) Các đỉnh đặc trưng tiêu biểu cho
các nhóm liên kết trong chitosan đều xuất
hiện trong các mẫu oligochitosan Đỉnh
phổ nằm trong vùng 3200 – 3500 cm-1 đặc
trưng cho dao động kéo giãn của liên kết
N–H trong nhóm amine và liên kết O–H
Đỉnh ở 1655 và 1595 cm-1
đặc trưng cho dao động kéo giãn của liên kết C=O trong
nhóm –CONH– (amide I) và dao động uốn
của –NH trong nhóm –CONH– (amide II)
Các đỉnh ở 1072, 1028, 1153 và 893 cm-1
lần lượt đặc trưng cho dao động kéo giãn
của liên kết C–O, dao động kéo giãn của
C–O–C trong vòng glucopyranose và các
dao động của liên kết β – 1,4 glycoside
[10] Các đỉnh ở 1320 và 1420 cm-1
tương ứng đặc trưng cho dao động kéo giãn của liên kết C–N trong nhóm CH3CONH– (amide III) và dao động biến dạng của liên kết C–H, đây là hai đỉnh đặc trưng được sử dụng để tính toán sự thay đổi ĐĐA của chitosan [3] Kết quả xác định cho thấy oligochitosan KLPT khoảng 5,5 kDa, thu được tại liều xạ 15 kGy, có ĐĐA giảm khoảng 8% so với chitosan ban đầu (bảng 1) Kết quả này khá phù hợp với nghiên cứu của Duy và cộng sự khi cắt mạch chitosan trong dung dịch chứa 3% chitosan bằng tia γ và H2O2 với độ giảm ĐĐA khoảng 10% [5] Như vậy, sử dụng H2O2 ở nồng độ thấp khoảng 1% kết hợp đồng thời với tia γ cho phép chế tạo hiệu quả oligochitosan ở liều xạ khá thấp khoảng 8 kGy Oligochitosan thu được có cấu trúc hầu như không thay đổi so với chitosan ban đầu
Trang 6Hình 3 Cây dâu tây 140 ngày tuổi ở lô đối chứng 1 (a) và lô 2, được phun
oligochitosan nồng độ 50 ppm (b)
Hình 3 cho thấy sự khác nhau về số
lượng cuống hoa và quả của dâu tây sau
140 ngày tuổi Ở lô đối chứng (hình 3a) số
lượng cuống hoa thu được tương đối ít hơn
so với lô có phun oligochitosan ở nồng độ
50 ppm (hình 3b) Trong quá trình theo
dõi, chúng tôi nhận thấy dâu tây bắt đầu ra
hoa ở 120 ngày tuổi trên các lô 1, 2, 3,
riêng lô 4 thì vẫn chưa quan sát thấy hoa
sau thời gian trên Nguyên nhân của vấn đề
này vẫn chưa rõ cần được nghiên cứu
thêm Tuy nhiên, theo nhận định của chúng tôi có thể do oligochitosan là kháng sinh thực vật [9] khi được sử dụng ở liều cao (150 ppm) có thể gây ngộ độc cho cây dẫn đến ức chế khả năng ra hoa Ảnh hưởng của oligochitosan đến khả năng cho hoa của cây dâu tây theo ngày tuổi được thể hiện trên hình 4 Kết quả cho thấy số lượng hoa thu được sau 120, 130 và 140 ngày trên các lô 2 và 3 có phun oligochitosan tương đối lớn hơn so với lô đối chứng 1
Hình 4 Ảnh hưởng của oligochitosan đến khả năng cho hoa của dâu tây
Trang 7Bảng 2 Số lượng hoa trung bình của cây dâu tây sau 140 ngày tuổi ở các lô khác nhau
Nhóm (8 cây/nhóm)
Lô đối chứng 1
(0 ppm)
Lô 2 (50 ppm)
Lô 3 (100 ppm)
Trung bình
42,8 ± 0,1 43,7
± 0,2
43,6
± 0,1
Kết quả phân tích ANOVA một chiều
và kiểm định LSD bằng chương trình SPSS
16.0 đối với 5 nhóm lặp lại trên các lô thí
nghiệm ở 140 ngày tuổi (Bảng 2) cho thấy
nồng độ 50 và 100 ppm của oligochitosan
phun lên dâu tây đều cho hiệu quả gia tăng
số lượng hoa cao hơn so với lô đối chứng
(p = 0,00) Ngoài ra, số lượng hoa trên các lô
2 và 3 tương ứng với nồng độ của
oligochitosan được phun là 50 và 100 ppm
cũng khác nhau có ý nghĩa thống kê
(p = 0,002) Điều này chứng tỏ oligochitosan
ở nồng độ thấp khoảng 50 ppm có khả năng
kích thích gia tăng số lượng hoa tốt hơn so
với ở nồng độ 100 ppm Đối với lô 4, nồng
độ oligochitosan 150 ppm, cây chỉ cho hoa
sau 133 ngày tuổi, những quan sát ban đầu
cho thấy số lượng hoa ít hơn và không đồng
đều so với các lô 1, 2 và 3 Cơ chế kích thích
và ức chế khả năng cho hoa của
oligochitosan lên dâu tây vẫn cần được
nghiên cứu thêm Tuy nhiên, việc sử dụng
oligochitosan phun cho dâu tây theo chúng
tôi nên tiến hành ở liều thấp, với nồng độ
nhỏ hơn 100 ppm
4 Kết luận
Oligochitosan có KLPT < 10 kDa đã
được chế tạo hiệu quả bằng phương pháp
chiếu xạ dung dịch chitosan 5%, H2O2 1%
ở liều xạ khá thấp, khoảng 8 kGy Cấu trúc chính của oligochitosan thu được hầu như không khác biệt so với chitosan ban đầu ĐĐA của oligochitosan KLPT 5,5 kDa giảm khoảng 8% Oligochitosan KLPT khoảng 7,5 kDa có hiệu ứng gia tăng số lượng hoa đối với dâu tây Nồng độ phù hợp của oligochitosan để phun lên cây dâu tây là khoảng 50 ppm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Đặng Xuân Dự, Đinh Quang Khiếu, Diệp Khanh, Nguyễn Quốc Hiến “Nghiên cứu hiệu ứng đồng vận dung Co – 60 và H 2 O 2 cắt mạch
chitosan chế tạo oligochitosan”, Tạp chí Hóa
Học, 51(2C), 627-631 (2003)
2 Nguyễn Quốc Hiến, Lê Hải, Lê Quang Luân, Trương Thị Hạnh, Phạm Thị Lệ Hà “Nghiên cứu chế tạo oligochitosan bằng kỹ thuật bức
xạ”, Tạp chí Hóa học, 38(2), 22-44 (2000)
3 J Brugnerotto, J Lizardi, F M Goycoolea,
W Arguelles – Monal, J Desbrieres, M Rinaudo “An infrared investigation in relation with chitin and chitosan
characterization”, Polymer, 42, 3569-3580
(2001)
4 G V Buxton, C L Greenstock, W P Helman, A B Ross “Critical review of rate constants for hydrated electron, hydrogen atoms and hydroxyl radical (OH/O-) in
aqueous”, Journal of Physical and Chemical
Reference Data, 17(2), 513-886 (1988)
Trang 85 N N Duy, D V Phu, N T Anh, N Q Hien
“Synergistic degradation to prepare
oligochitosan by - irradiation of chitosan
solution in the presence of hydrogen
peroxide”, Radiation Physical Chemistry, 80,
848-853 (2011)
6 S Hirano, N Nagao “Effects of chitosan,
pectic acid, lysozyme and chitinase on the
growth of several phytopathogens”
Agricultural and Biological Chemistry, 53,
3065-3066 (1989)
7 Y J Jeon, S K Kim “Effect of antimicrobial
activity by chitosan oligosaccharides
N-conjugated with asparagines”, Journal of
Microbiology and Biotechnology, 11, 281-286
(2001)
8 Y J Jeon, P J Park, S K Kim
“Antimicrobial effect of chitooligosaccharides
produced by bioreactor”, Carbohydrate
Polymers, 44, 71-76 (2001)
9 S K Kim, N Rajapakse “Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides (COS): A review”,
Carbohydrate Polymers, 62, 357-368 (2005)
10 10.J Kumirstra, M Czerwicka, Z Kaczynski, A Bychowska, K Brozowski, J Thoming, P Stepnowski “Application of spectroscopic methods for structural
analysis of chitin and chitosan”, Marine
Drugs, 8, 1567-1636 (2010)
11 J Shao, Y Yang, Q Zhong “Study on preparation of oligoglucosamine by oxidative degradation under microwave”,
Polymer Degradation and Stability, 82,
395-398 (2003)
12 P Ulanski, C von Sontag “OH – radical induced chain scission of chitosan in the
absence and present of dioxygen”, Journal
of the Chemical Society, Perkin Transactions,
2, 2022-2028 (2000)
Ngày nhận bài: 28/7/2017 Biên tập xong: 15/9/2017 Duyệt đăng: 20/9/2017