Nghiên cứu thành phần hóa học cao Etyl Acetat của cây phèn đen (Phyllathus reticulatus Poir)

HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ KIM LIÊN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETYL ACETAT CỦA CÂY PHÈN ĐEN Phylỉathus reticulatus Poừ... TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN H

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ KIM LIÊN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETYL ACETAT CỦA CÂY

PHÈN ĐEN (Phylỉathus reticulatus Poừ.)

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

Mã Số: 60.520.301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 1 năm 2016.

Công trình được hoàn thành tại: Đại học Bách Khoa TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Ánh Tuyết

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS: Hoàng Thị Kim Dung

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS: Mai Huỳnh Cang

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 21 tháng 1 năm 2016

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch: PGS.TS Lê Thị Hồng Nhan

2 Phản biện 1: TS Hoàng Thị Kim Dung

3 Phản biện 2: TS Mai Huỳnh Cang

4 ủy viên: TS Huỳnh Khánh Duy

5 Thư kí: TS Lê Xuân Tiến

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHÚ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ KIM LIÊN MSHV: 13050189 Ngày, tháng, năm sinh: 24/11/1990 Nơi sinh: Quảng Ngãi Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số : 60520301

I TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY PHÈN ĐEN

(Phyllanthus reticulatus Poir.)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

-Xử lý sơ bộ mẫu

-Điều chế cao ethanol và các cao phân đoạn cao n-hexane, ethyl acetate, butanol -Phân lập, xác định cấu trúc hóa học một số hợp chất từ cao ethyl acetate

-Phân lập 6 chất và định danh bằng các phương pháp phân tích phổ hiện đại

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 6/7/2015

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 4/12/2015

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS Nguyễn Thị Ánh Tuyết

Tp HCM, ngày .21 tháng 1 nãm 2016

TS Nguyễn Thị Ánh Tuyết

TRƯỞNG KHOA

LỜI CẢM ƠN - -

Luận văn này được thực hiện tại phòng thí nghiệm hợp chất thiên nhiên thuộc khoa Hóa trường đại học Sư Phạm Tp HCM, tại địa chỉ 280 An Dương Vương p.4 Q.5 Tp.HCM Với tấm lòng kính trọng và biết ơn chân thành, tôi kính gửi lời cảm ơn đến:

Các bạn học viên cao học tại Trường Đại Học Bách Khoa, cũng như các bạn sinh viên đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng, con rất cảm ơn người thân trong gia đình đã động viên, tạo mọi điều kiện

từ vật chất đến tinh thần cho con học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chi Minh, thángl năm2016

NGUYỄN THỊ KIM LIÊN

TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chúng tôi đã cô lập được 6 hợp chất gồm : acid oleanolic (PEA-26), cerevisterol (PEA-22), 7-ơ-[ a-L-arabinopyranosyl -(1—>6)- yỡ-D-glucopyranosyl Jdiphyllin (PEA-13), acid 3-ơ-metyl -4’-ơ-a-Lrahmnopyranosylellagic (PEA-12), acid 3,3’,4’-ơ-trimethyl-4’-ơ-0-D-glucopyranosylellagic (PEA-17); 3,4',7,8-

tetrahydroxyflavone (PEA-3), từ cao etyl acetat của Phèn Đen (Phyllanthus reticulatus

Poữ) Trong số đó hợp chất 13 lần đầu tiên được cô lập từ trong chi Hợp chất

PEA-22, PEA-26, PEA-17, PEA-12, PEA-3 lần đầu tiên được cô lập trong loài

Cấu trúc của những chất này được xác định bằng các phương pháp phổ HR-

ESI-MS, ’H-NMR, 13C-NMR, COSY, DEPT, HSQC, HMBC và so sánh với các tài liệu tham khảo

ABSTRACT

We isolated 6 compounds including : oleanolic acid (PEA-26) , cerevisterol (PEA- 22), ơ-[ a-L-arabinopyranosyl -(1—>6)- yỡ-D-glucopyranosyl Jdiphyllin (PEA-13), 3- ơ-methyl -4’-ơ-a-Lrahmnopyranosylellagic acid (PEA-12), 3,3’,4’-ơ-trimethyl-4’-ơ- 0-D-glucpopyranosylellagic acid (PEA-17); 3,4',7,8- tetrahydroxyflavone (PEA-3), from the

7-ethyl acetate extract of the whole Phyllanthus reticulatus Poữ Theh structures were

elucidated by spectral methods as HR-ESI-MS, ’H-NMR, 13C-NMR, COSY, DEPT, HSQC, HMBC and comparision with reported data

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này được hoàn thành dựa hên các kết quả nghiên cứu của riêng tôi, chưa từng được dùng trong bất kì luận văn cùng cấp nào Các kết quả thu được ửong luận văn đảm bảo tính chính xác và khách quan

Tp HCM, ngày 1 tháng 1 năm 2016

Tác giả Nguyễn Thị Kim Liên

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC Sơ ĐỒ

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN 1

1.1 Đặt điểm thực vật cây phèn Đen 1

1.2 Các nghiên cứu về dược tính 2

1.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học 4

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 10

2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất tinh khiết 10

2.2 Hóa chất và thiết bị 11

2.3 Thực nghiệm 12

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 17

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ 34

4.1 Kết luận 34

4.2 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

^-NMR

13C-NMR

Proton Nuclear Magnetic Resonance Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance brs broad (NMR)

EtOAc Ethyl acetate

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HR-ESI-MS : High Resolution Electrospray Ionisation Mass Spectrometry HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

Bảng 2.1: sắc kí cột silica gel ttên cao etyl acetate

Bảng 2.2: Sac kí cột sillica gel trên phân đoạn A2

Bảng 2.3: sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn A5

Bảng 2.4: sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn A6

Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR của PEA-22 và so sánh với tài liệu Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR của PEA-26 và so sánh với tài liệu Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR của PEA-

12 và so sánh với tài liệu Bảng 3.4: Dữ liệu phổ NMR của PEA-13 và so sánh với tài liệu Bảng 3.5: Dữ liệu phổ NMR của PEA-3 và so sánh với tài liệu Bảng 3.6: Dữ liệu phổ NMR của PEA-17 và so sánh với tài liệu

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế cao ete dầu hỏa và etyl acetat

Sơ đồ 2.2: Quy trình phân lập các hợp chất từ cao etyl acetat

Phụ lục 1.5: Phổ COSY của PEA-22

PHỤ LỤC 2: Dữ liệu phổ của chất PEA-26 Phụ lục 2.1: Phổ ’H-NMR của PEA-26

Phụ lục 3.5: Phổ COSY của PEA-12

Phụ lục 3.6: Phổ HR-ESI-MS của PEA-12

PHỤ LỤC 4: Dữ liệu phổ của chất PEA-13 Phụ lục 4.1: Phổ '1I NMR của PEA-13

Phụ lục 4.2: Phổ 13C-NMR của PEA-13

Phụ lục 4.3: Phổ DEPT của PEA-13

Phụ lục 4.4: Phổ HSQC của PEA-13

Phụ lục 4.5: Phổ HMBC của PEA-13

Phụ lục 4.6: Phổ COSY của PEA-13

Phụ lục 4.7: Phổ NOESY của PEA-13

Phụ lục 4.8: Phổ HR-ESI-MS của PEA-13

PHỤ LỤC 5: Dữ liệu phổ của chất PEA-3 Phụ lục 5.1: Phổ ’H-NMR của PEA-3

Phụ lục 5.2: Phổ 13C-NMR của PEA-3

Phụ lục 5.3: Phổ HSQC của PEA-3

Phụ lục 5.4: Phổ HMBC của PEA-3

Phụ lục 5.5: Phổ COSY của PEA-3

PHỤ LỤC 6: Dữ liệu phổ của chất PEA-17 Phụ lục 6.1: Phổ ’H-NMR của PEA-17

Phụ lục 6.2: Phổ 13C-NMR của PEA-17

Phụ lục 6.3: Phổ HSQC của PEA-17

Phụ lục 6.4: Phổ HMBC của PEA-17

MỞĐẰU

Xu hướng hiện nay của thế giới cũng như nước ta là quay về các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên đã và đang đóng góp những thành tựu quý báu cho ngành hóa học cũng như ngành sinh học và y dược học

Sự kết hợp những chứng cứ khoa học từ lĩnh vực nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên

và hoạt tính sinh học đã góp phần cũng cố và phát triển nền y học cổ truyền

Từ lâu, Y học dân gian đã phát hiện khoảng 20 loại cây cỏ có khả năng chữa trị

viêm gan, trong đó đáng chú ý là các loài thuộc chi Phyllanthus (họ Thầu dầu, Euphorbiaceae) [2] Cây phèn đen (Phyllanthus retỉculatus Poir.) cũng như là thực vật thuộc chi Phyllanthus được dùng trong Y học cổ truyền của Việt Nam và nhiều nước

trên thế giới Các bộ phận của cây đều được sử dụng làm thuốc: rễ phèn đen thường được dùng trị lỵ, viêm ruột, ruột kết hạch, viêm gan, viêm thận Lá thường dùng chữa sốt, lỵ, phù thũng, ứ huyết do đòn ngã, huyết nhiệt sinh đinh nhọt.vỏ thân được dùng

để chữa lên đậu có mủ và tiểu tiện khó khăn

Chính vì các loài thuộc chi Phyllanthus có nhiều hoạt tính sinh học như vậy và cây Phyllanthus reticulatus Poữ chỉ mới được nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa

học Theo tài liệu (2000) của Đỗ Tất Lợi, Việt Nam chưa có công trình nào nghiên

cứu về cây Phèn Đen [4] nên chúng tôi quyết định chọn cây Phyllanthus reticulatus

Poir để khảo sát thành phần hóa học

Trang 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật cây Phèn đen

Tên thông thường: Phèn đen

Tên gọi khác: Nỗ, Sáp hàng thảo, Tảo phàn diệp, Diệp hạ châu mạng Thuộc họ Thầu dầu

(Euphorbiaceae)

Tên khoa học: Phyllanthus reticulatus Poừ

Hình 1 Trái phèn đen Hình 2 Lá phèn đen

1.1.1 Mô tả chung

Phèn đen là cây bụi mọc tự nhiên ở bờ bụi, ven đường, ven rừng, cây cao 2-4m, cành gầy mảnh đen nhạt, đôi khi họp từ 2 đến 3 cành trên cùng một đốt dài 10-20 cm

Lá có hình dạng thay đổi, hình trái xoan, hình bầu dục hay hình trứng ngược nhọn, hay tù

ở hai đầu, phiến lá rất mỏng, dài 1,5 - 3cm, rộng 6 - 12mm, mặt trên có màu sẫm hơn mặt dưới, lá kèm hình tam giác hẹp

Cụm hoa hình chùm, mọc dưới nách lá, riêng lẻ hay xếp 2-3 cái một Quả hình cầu, khi chín màu đen, dài 5 mm, rộng 3mm Hạt hình 3 cạnh, màu nâu, có những đốm rất nhỏ Cây ra hoa kết quả từ tháng 8-10 hàng năm

1.1.2 Vùng phân bố, thu hái

Phèn đen là loài cây nhiệt đới nên có phân bố rất rộng, vùng Đông Nam Á, Nam Trung Quốc, Tây và Nam Phi

Trang 2

Ở nước ta, phèn đen mọc thành bụi tự nhiên, có thể tìm dễ dàng ở bờ bụi, ven đường, ven rừng

1.2 Các nghiên cứu về dược tính

1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền

Phèn đen vị đắng chát, tính mát, có tác dụng làm se, giảm đau, sát khuẩn, giải độc Chủ trị làm thuốc cầm máu, chữa đậu mùa, chữa viêm cầu thận, chữa lỵ, tiêu chảy Trong đó rễ phèn đen

có vị chát, tính lạnh, có tác dụng tiêu viêm, thu liễm, chỉ tả Lá phèn đen có tác dụng thanh nhiệt giải độc, sát trùng, lợi tiểu [3]

Chữa kiết lỵ, chữa bị đòn máu ứ ở trong nguy cấp, chữa nhọt độc mới phát, chữa nhiệt tả

và lỵ, chữa đại tiện ra máu, chữa chảy máu nướu răng, trị rắn cắn Ngoài ra phèn đen còn phối hợp với một vài loài thảo dược khác để chữa trị như: lá long não, lá xuyên tiêu phơi khô

1.2.2 Các nghiên cứu về dược tính trong y học

Hoạt tính chống tiểu đường: Dịch chiết ete dầu hỏa và etanol từ lá của cây Phyllanthus reticulatus Được thử nghiệm ở chuột Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng hạ đường huyết tốt

nhất ở liều 1000 mg/kg [23],

Tác dụng giảm cholesterol trong máu: Dịch chiết nước từ phần trên mặt đất của cây

Phyllanthus reticulatus đã cho thấy hoạt tính giảm cholesterol Điều này được chứng minh khi thử

nghiệm so sánh giữa hai nhóm thử nghiệm Một nhóm có chế độ ăn làm tăng cholesterol nhóm còn lại bình thường Thực hiện trong vòng 45 ngày Ket quả cho thấy dịch chiết thử nghiệm ở động vật ở liều lượng 250 và 500 mg/kg cho hiệu quả làm giảm chỉ số xơ vữa động mạch [23]

Tác dụng kháng khuẩn: Dịch chiết metanol từ vỏ cây Phyllanthus reticulatus đem chiết

lỏng-lỏng với ete dầu hỏa, CCI4, CHCI3 sau đó đem dịch chiết thu được thử nghiệm ttên chuột, kết quả cho thấy đường kính kháng khuẩn đối với dịch chiết ete dầu hỏa, CCI4 , CHCI3 lần lượt như sau: 14-19mm., 14-20mm, 10-18mm [23] với liều lượng thực hiện là 400 microgram/disc

Ở Quảng Tây Trung Quốc, cây Phyllanthus reticulatus Poừ.(Euphorbiaceae) là một loại

thuốc được sử dụng để chống viêm khớp và điều trị bệnh thấp khớp [26],

Năm 2008, Biplab k Das [8] đã tiến hành thử hoạt tính bảo vệ gan của dịch chiết ethanol

của loài Phyllanthus reticulatus trên chuột bạch Kết quả cho thấy, dịch chiết này có khả năng

Trang 3 kháng lại CCI4 chất gây tổn thương gan

Năm 2012, Wu Huai-en và cộng sự đã [28] đã nghiên cứu hoạt tính chống vi khuẩn Kết

quả cho thấy dịch chiết nước và dịch chiết etanol của lá cây Phyllanthus reticulatus chống lại các

vi khuẩn sau: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli Nhóm

nghiên cứu cũng đã chứng minh phần chiết từ etanol có hoạt tính kháng vi khuẩn mạnh hơn phần chiết từ nước

Năm 2013, Huang và cộng sự [11] đã nghiên cứu công dụng giảm đau và kháng viêm của

triterpen trong Phyllanthus reticulatus Kết quả cho thấy các triterpene này có công dụng khá tốt

trong việc giảm đau và kháng viêm Tiếp theo nhóm nghiên cứu này đã thử hoạt tính kháng oxi

hóa của các flavonoid được cô lập từ cây Phyllanthus reticulatus với DPPH Kết quả cho thấy các

flavonoid có khả năng kháng oxi hóa với DPPH Bên cạnh đó Lan, Mingsheng (2013) cùng cộng

sự [18] đã chứng minh dẫn xuất isoguanine (28),

19-hydroxyspruceanol-19-ơ-yỡ-D-glucopyranoside (29), aryl naphthalene (30) từ cây Phyllanthus reticulatus có khả năng kháng tốt

virut viêm gan c Kết luận đưa ra dẫn xuất isoguanine được xem như là một loại thuốc dùng để điều trị viêm gan c

Trang 4

1.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Những hợp chất được phân lập của cây Phèn đen được thống kê lần lượt theo các năm được trình bày ửong bảng 1.1

Bảng 1.1: Những hợp đã được phân lập từ cây Phèn đen

-21-a-hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one (1), 0-sitosterol (2)

friedelin-ip,220-diol (3) và glochidonol (4), friedelin (5) betulin (6),

3-0-0-D Lupeol acetat (24), Lupeol (25) A.K Jamal (2008) [6] -Acid 3,3’,4-tri-ỡ-methylellagic (26), Acid p-coumaric (27)

scopoletin (28), 3-(3-methylbut-2-en-l-yl)isoguanine (29), 19-

hydroxyspuruceanol 19-ỡ-P-D-glucopyranoside (30)

Lang, Ming-Sheng (2010) [16][20]

-3,4-di-ỡ-methylellagic acid (31), 4,4 -di-ỡ-methylellagic acid

Trang 5

-Isoguanine (37), aryl naphthalene (38), acid galic

(39) Epi- friedelanol (40), kaempferol (41), taraxerol

taraxeron (43), Sorghumol (44), sorghumol kokoonol

Riêng ở Việt Nam, Phan Văn Dân (2009), “Nghiên Cứu Thành Phần Hoá Học Có

Trong Cây Phèn Đen (PhyllanthusReticulatus Poir Euphorbiaceae)”, Luận vãn cao học, Trường

Đại học Sư phạm Thái Nguyên, đã cô lập được 3 hợp chất Nhóm nghiên cứu Nguyễn Thị Ánh Tuyết (2015) cũng đã công bố 1 bài báo trên tạp chí hóa học Việt Nam Công thức cấu tạo các hợp chất đã được phân lập

acetat (42) Shalini Sharma

acetat (45) (2013), [21,22]

(49), 6’- Nguyễn Thị Ánh Tuyết

Rajesh Kumar Soni,

(2014), [5]

Trang 6

OH

Trang 7

(16)

Trang 8

UGH J

2.1.2 Phương pháp cô quay áp suất thấp

Dung môi được loại bỏ ra khỏi dung dịch bằng phương pháp cô quay áp suất thấp bằng máy cô quay chân không

Dung dịch được chứa trong bình thủy tinh ở điều kiện áp suất thấp Đun nóng dun dịch cho quá trình bay hơi diễn ra nhanh hơn Hơi đi qua hệ thống làm lạnh, ngưng tụ Kết quả loại được dung môi ra khỏi dung dịch Nhờ tiến hành quá trình bay hơi ở áp suất thấp nên không làm hư hại các mẫu kém bền nhiệt

2.1.3 Phương pháp sắc ký

Sắc ký là một phương pháp vật lý dùng để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào ái lực khác nhau của những loại chất đó với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh) Phương pháp sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng thường được sử dụng để phân lập các hợp chất từ cao chiết thu được

2.1.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

2.1.4.1 Phương pháp khối phổ (Mass spectrometer -MS)

Cho phép xác định khối lượng phân tử của một chất sau khi chuyển chất đó thành trạng thái hơi rồi thành ion bằng phương pháp thích hợp Theo đó, mẫu phân tích sẽ bị phá hủy trong quá trình phân tích

2.1.4.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance- NMR)

Phương pháp dựa trên tương tác của các hạt nhân nguyên tử với điện từ trường

Trang11 ngoài Khi bị kích thích bởi bức xạ điện từ tần số thích hợp, các hạt nhân được đặt trong từ trường sẽ hấp thụ năng lượng làm thay đổi trạng thái năng lượng của các spin hạt nhân Sự nhảy spin như thế là cơ sở của phương pháp NMR

Các loại phổ 13C-NMR, 'H-NMR, DEPT, hai chiều (2D-NMR), HSQC, HBMC tuỳ theo chất cụ thể

2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.1 Hóa chất

■ Silica gel: silica gel 60, 0,04-0,06 mm, Merck dùng cho cột sắc ký

■ Silica gel pha đảo, RP-18, Merck dùng cho sắc ký cột

■ Sắc ký bảng mỏng loại 25DC - Aflufolein 20x20, Kiesel gel 60F254, Merck

■ Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm hiệu

Cân điện tử Sartorius Mass 620g

Trang 12

2.3 Thực nghiệm

2.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Mẩu cây dùng trong nghiên cứu luận văn là lá, thân và rễ cây Phèn Đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) được thu hái tại huyện Tân Uyên, Bình Dương, vào tháng 7/2014

Mẩu cây đã được GS.TS Võ Văn Chi nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus reticulatus Poir.”, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

2.3.2 Xử lý nguyên liệu

Mẩu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn có khối lượng không đổi (m = 26.0 kg)

2.3.3 Điều chế các loại cao

Nguyên liệu bột mịn được tận trích với etanol 96° bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao etanol thô (534.0 g)

Cao etanol thô được chiết lỏng - lỏng lần lượt với ete dầu hoả, etyl acetat, butanol thu được cao ete dầu hoả (52.0 g), cao etyl acetat (118.0 g), và cao butanol (100.5g) Quá trình thực hiện được tóm theo sơ đồ 2.1

Trang 13

Sơ đ |L| 2.1: Quy trình đi'- u chỀ các loại cao

Hiệu suất điều chế cao:

- Cao butanol: 18.50 %

- Cao ete dầu hỏa: 9.57 %

- Cao etyl acetat: 21.73 %

2.3.4 Cô lập các hợp chất hữu cơ trong cao etyl acetat

2.3.4.1 Sắc kí cột silica gel trên cao etyl acetat

Thực hiện sắc kí cột (SKC) silica gel ttên cao etyl acetat (118.0 g) với hệ dung môi rửa giải ED 100%, EtOAc 100%, EtOAc:MeOH có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% metanol Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ.Theo dõi quá ttình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gộp

Trang 14 chung thành một phân đoạn Ket quả thu được 9 phân đoạn (EA1-EA9), được trình bày ửong bảng 2.1

Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên cao etyl acetate STT

Phân đoạn Dung môi giải ly

Trọng lượng (g) Sắc kí lớp mỏng

Ghi chú

2 A2 ED:EA (90:10) 3.09 Nhiều vết Khảo sát

5 A5 EA:M 95:5 25.40 Nhiều vết Khảo sát

6 A6 EA:M 85:15 27.30 Nhiều vết khảo sát

Chú thích: ED: ete dầu hỏa, EA: etyl acetat, M: methanol

2.3.4.2 Sắc kí cột sillỉca gel trên phân đoạn A2 của bảng 2.1

Phân đoạn A2 (3.09 g) được tiếp tục tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với

hệ dung môi tăng dần từ ED đến EtOAc thu được 4 phân đoạn đánh số tương ứng từ A2.4 Quá trình sắc ký cột pha thường phân đoạn A2 thu được 4 phân đoạn được tóm tắt trong bảng 2.2

A2.1-Bảng 2.2 : Kết quả sắc kí cột phân đoạn A2 Phân đoạn Hệ dung môi Khối lưọng Ghi chú

A2.1 ED -EA (95:5) 1.15(g) Khảo sát thu được PEA-22

A2.3 ED: EA (70:30) 1.06 (g) Khảo sát thu được PEA-26

Phân đoạn A2.1 (1.15 g) có vết xanh dương khi đem phun với thuốc thử axit H2SO4

(25%) , tiếp tục sắc kí cột pha thường nhiều lần rửa giải với hệ dung môi ED:C: EtOAc ( 30:20:50) Sau đó sắc kí cột pha đảo 4 lần hệ dung môi M:H2O (3:2) thu đươc hợp chất

được kí hiệu PEA-22 (15 mg)

Phân đoạn A2.3 (1.06 g) có vết màu hồng khi đem phun với thuốc thử axit

Trang 15 H2SO4 (25%), được tiếp tục sắc kí cột pha thường nhiều lần rửa giải với hệ dung môi

ED:C: EtOAc (35:10:65), thu được hợp chất được kí hiệu PEA-26 (25 mg)

2.3.4.3 Sắc kí cột sillỉca gel trên phân đoạn A5 của bảng 2.1

Phân đoạn A5 (25.40 g) được tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi tăng

dần EtOAc -MeOH-H2O thu được 4 phân đoạn đánh số tương ứng từ A5.1-A5.4, Quá trình sắc ký cột phân đoạn A5 thu được 4 phân đoạn được tóm tắt ửong bảng 2.3

Bảng 2.3 : Kết quả sắc kí cột phân đoạn A5 Phân đoạn Hệ dung môi Khối lượng Ghi chú

A5.2 EA:M (90:10) 5.12 (g) Khảo sát thu được PEA-12

A5.3 EA:M (80:20) 4.57(g) Khảo sát thu được PEA-13

Sắc kí lớp mỏng hên phân đoạn A5.2 (5.12 g) cho vết màu cam nhạt khi đem phun

với thuốc thử axit H2SO4 (25%) , phân đoạn A5.2 được sắc kí cột pha thường nhiều lần rửa giải với hệ dung môi EtOAc:C:MeOH:H2O (65:20:12:3), thu được hợp chất được kí hiệu PEA-12 (30 mg) dạng tinh thể hình kim màu hắng

Sắc kí lớp mỏng hên phân đoạn A5.3 (4.57g) cho vết màu tím khi đem phun với thuốc thử axit H2SO4 (25%), tiếp tục sắc kí cột pha thường nhiều lần rửa giải với hệ dung môi EA:C:MeOH:H2O (60:20:15:5), sau đó sắc kí cột pha đảo 8 lần với hệ dung môi aceton: H2O (50:50) thu được hợp chất được kí hiệu PEA-13 15 mg) dạng bột màu ttắng

2.3.4.4 Sắc kí cột sillỉca gel trên phân đoạn A6 của bảng 2.1

Phân đoạn A6 (27.30g) được tiếp tục tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung

môi tăng dần EA-MeOH-H2O thu được 5 phân đoạn đánh số tương ứng từ A6.1- A6.5, được trình bày ttong bảng 2.4

Bảng 2.4 : Kết quả sắc kí cột phân đoạn A6 Phân đoạn Hệ dung môi Khối lưọng Ghi chú

A6.2 EA:M (90:10) 8.26 (g) Khảo sát thu được PEA-3 và PEA-17

Trang 16

A6.4 EA:M:H 2 0 (70:25:5) 12.51 (g) Chưa khảo sát

Phân đoạn A6.2 (8.26 g) cho vết màu vàng khi đem phun với thuốc thử axi H2SO4

(25%) , tiếp tục sắc kí cột pha thường nhiều lần rửa giải với hệ dung môi EtOAc:C:MeOH

(80:17:3), thu được hợp chất được kí hiệu PEA-3 (15 mg) dạng bột màu vàng

Phân đoạn A6.2 (8.26 g) cho vết màu đen khi đem phun với thuốc thử axi H2SO4

(25%) , tiếp tục sắc kí cột pha thường nhiều lần rửa giải với hệ dung môi EtOAc:C:MeOH:H2O (60:20:15:5), thu được hợp chất được kí hiệu PEA-17 (8 mg) dạng

PEA12 30mg

T

PEA13 15mg

PEA3 PEA17 1.15(g) 0.2(g) 1.06(g) 0.42(g) 2.0(g) 5.12(g) 457(g) 15.0(g) 5.0(e) 8 2.5(g) 13.5(g)

Trang 17

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Nhận danh cấu trúc các chất đã phân lập

3.1.1 Biện luận cấu trúc PEA-22

Hợp chất PEA-22 (15 mg) thu được từ phân đoạn A2 của sơ đồ 2 có những đặc điểm

sau: dạng bột màu trắng, SKLM với hệ giải ly C:Aceton (1:1) cho một vết duy nhất, hiện

hình với thuốc thử H2SO4 25% cho vết màu xanh dương

❖ BIỆN LUẬN CẤU TRÚC:

Phổ *H-NMR cho thấy tín hiệu công hưởng của proton olefin ở ÔH 5.26 (d, 7=5.0);

hai proton olefin khác cộng hưởng ở ÔH 5.25 (dd, 7=14.5 , 6.5 Hz) và 5.19 (dd, 7=15.5,

7.5 Hz) hằng số ghép J của 2 proton olefin này là 14.5 và 15.5 Hz nên nối đôi có cấu hình

trans

Phổ *H-NMR còn thể hiện tín hiệu cộng hưởng của proton gắn trên carbon mang

oxygen ở ÔH 3.55 (d, 5.0 Hz) và 5H3.98 (m) ; các tín hiệu cộng hưởng ở vùng từ trường

cao (ÔH( 1.46-2.12) ứng với các mũi cộng hưởng của proton bão hòa >CH-,

-CH2-

Ngoài ra, phổ 11I NMR còn thể hiện các tín hiệu cộng hưởng của các proton của

nhóm metyl, bao gồm 5H0.64 (3H, s), 5H0.86 (3H, d, 6.5Hz), 5H0.84 (3H, d, 7Hz), 5H0.94

(3H, d, 6.5 Hz), ÔH 1.06 (3H, s), ÔH 1.05 (3H, d, 6.5 Hz)

Phổ 13C-NMR và HSQC cho thấy PEA-22 có 28 nguyên tử carbon Trong đó,có 6

carbon loại -CH3,7 carbon loại -CH2-, 3 carbon loại =CH-, 1 carbon loại =c<, 6 carbon

loại >CH-, 2 carbon loại >c<, 2 carbon loại >CH-OH, 1 carbon loại >C(OH)-

Trang 18 Các carbon olefin cộng hưởng ở ỗc 143.78 (>CH=),137.02 (-CH=), 133.26 (=CH-) và 119.08 (=CH-)

Tương quan HMBC từ proton olefin ở ÔH 5.26 tương quan tới cacbon ôc 76.9 và 55.9 Proton ở ÔH 2.09 và 1.69 (H-4) tương quan HMBC với cacbon ôc 68.4(C-3) và 76.9 (C-5), proton ÔH 3.55 (H-6) tương quan với cacbon ôc 143.7, 119.0, 76.9,

38.1

Từ các dữ liệu phổ trên dự đoán PEA-22 có khung ergostan với nối đôi nằm ở vị trí

7 và 22,3 nhóm OH gắn ở vị trí 3, 5, 6

Kết hợp so sánh với số liệu phổ NMR của hợp chất ergosta-7,22-dien-30,5a,60- triol

[22] cho thấy có sự tương đồng nên chúng tôi đề nghị cấu trúc của hợp chất PEA- 22 là

chất Ergosta-7,22-dien-3p,5a,60-triol hay cerevisterol

Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PEA-22

3.1.2 Biện luận cấu trúc PEA-26

Hợp chất PEA-26 (25 mg) thu được từ phân đoạn A2 của sơ đồ 2 có những đặc

điểm sau: dạng bột màu ttắng, SKLM với hệ giải ly C:M (95:5) cho một vết duy nhất, hiện hình với thuốc thử H2SO4 25% cho vết màu hồng

Phổ '1I NMR (DMSO, phụ lục 2.1): ÔH 5.15 (1H, z>rs); ÔH 2.99 (1H, m); ở ÔH 2.73

(1H, dd, J = 4.0/14.0), các độ chuyển dịch khác được trình bày ttong bảng 3.2

Phổ 13c NMR (DMSO, phụ lục 2.2): >c=o ( ôc 178.5), >c= (5C 143.8), -CH=( 5c 121.4), -CH-O- ( 5c 76.7), -CH3 5C (32.8-15.0), >c< 5C (45.6-30.3), >CH- 5C (54.7-40.7), các độ chuyển dịch khác được trình bày ttong bảng 3.2

Trang 20 Phổ Phổ HSQC, HMBC (DMSO, phụ lục2.3 và 2.4)

❖ BIỆN LUẬN CẤU TRÚC:

Phổ *H NMR cho các tín hiệu: 1 proton olefin ở ÔH 5.15 (1H, brs); 1 proton

oxymethine ở ÔH 2.99 (1H, nì); 1 proton methine ở ÔH 2.73 (1H, dd, J = 4.0 /14.0); và các

proton methylene vùng ÔH 1.60 - 1.23; proton của nhóm -CH3 ôH0.67 - 1.09

Phổ 13C-NMR và HSQC cho thấy PEA-26 cho thấy carbon carbonyl >c=o ở ỗc 178.5 hai carbon olefin ôc 143.8 và ôc 121.4, carbon methine kề oxy -CH-O- ở ôc 76.7, carbon

>c<, >CH-,-CH2- ở trong vùng tín hiệu ôc (54.7-18.0), và 7 carbon - CH3 Ở trong vùng ôc (32.8-15.0)

Phổ HMBC cho thấy proton olefin ở ÔH 5.15 cho tương quan với carbon methine ở

ôc 40.7 (C18), 47.0 (C9) và carbon bậc bốn ở ôc 41.3 (C14), cho phép dự đoán có nối đôi

ở vị trí số 12 và 13

Proton methine ở ÔH 2.73 tương quan với carbon carbonyl ỗc 178.5 cho phép dự đoán nhóm carbonyl gắn vào vị trí C28 proton oxymethine ở ÔH 2.99 tương quan với 2 carbon methyl ở ôc (28.2 và 16.0) cho phép dự đoán nhóm hydroxy gắn vào vị trí C3

Từ các dữ liệu phổ trên dự đoán PEA-26 có khung olean với nối đôi nằm ở vị trí 12

và 13, nhóm -OH gắn ở vị trí 3, nhóm -COOH ở vị trí 28

Kết hợp so sánh với số liệu phổ NMR của hợp chất acid oleanolic [10] cho thấy có sự

tương đồng nên chúng tôi đề nghị cấu trúc của hợp chất PEA-26 là chất Acid oleanolic

Hình 3.2: Tương quan HMBC của hợp chất PEA-26

PEA-26

Trang 21

Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PEA-26

3.1.3 Biện luận cấu trúc PEA-12

Hợp chất PEA-12 (30 mg) thu được từ phân đoạn A5 của sơ đồ 2 có những đặc điểm

sau: dạng tinh thể hình kim màu trắng, SKLM với hệ giải ly C:M:H2O 7:3:0.2 cho một vết

duy nhất, hiện hình với thuốc thử H2SO4 25% cho vết màu cam nhạt

Phổ ’H-NMR (DMSO, phụ lục 3.1): ÔH 7.56 (1H, j), 7,51 (1H, j), ÔH 5.48 (đ, 1.0

Hz), -OCH3 (ỖH 4.01), -CH3 (ÔH 1.11 (d, 6.5 Hz), >CH-0 (3.3-4.0), các độ chuyển dịch

khác được trình bày trong bảng 3.3

Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT (DMSO, phụ lục 3.2): >c=o (8C 159.5 và 159.1),

(8c 99.6-C-l”), -CH3 (ôc 18.0), các độ chuyển dịch khác được trình bày trong bảng 3.3

Phổ Phổ COSY, HSQC, HMBC, HR-ESI-MS (DMSO, phụ lục 3.5, 3.3, 3.4, 3.6)

❖ BIỆN LUẬN CẤU TRÚC:

Phổ ’iINMR của hợp chất PEA-12 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của hai proton gắn

trên vòng thơm ở ÔH 7.56 (1H, s) và 7.51 (1H, s), tín hiệu cộng hưởng của proton anomer

ở ÔH 5.48 (d, 1,0 Hz), nhóm metoxy ở ÔH 4,01, nhóm -CH3 ở ÔH 1.11 (d, 6.5 Hz) cùng với

các tín hiệu của proton >CH-O ở trong vùng ÔH 3.3-4.0

Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT cho thấy hợp chất PEA-12 có hai carbon >c=o

cộng hưởng ở 5c 159.5; 159.1, các carbon của vòng thơm (5c 110.9-152.4), carbon anomer

cộng hưởng ở 5c 99.6, carbon mang oxygen của đường (5c 69.7-72.1) và nhóm -CH3 (5c

18.0) Hai carbon >c=o cộng hưởng ở vùng từ trường cao tại 5c 159.5 và 159.1 có thể dự

đoán cho thấy hợp chất B có chứa hai vòng lacton với >c=o liên hợp

Tương quan HSQC từ proton proton ở ÔH 4.01 tới carbon tại 5c 60.9

Trang 23

Sự tương quan HMBC từ proton ở ÔH 7.51 (1H, s, H-5) đến carbon tại ôc 159.1 (>c=o,

C-7) và hai carbon mang oxygen khác của vòng thơm ở tại ôc 152,4 (C-4) và 139,9 (C-3) cho thấy hai vị trí C-3, C-4 gắn nhóm thế Proton cộng hưởng ở ÔH 7.56 (1H, s, H-5’) cho tương

quan HMBC đến carbon tại ôc 159.1 (>c=o, C-7’), 147.8 (C- 4’)

Từ tất cả những dữ liệu trên cho phép dự đoán hợp chất PEA-12 là dẫn xuất của acid ellagic có gắn thêm phân tử đường

Proton anomer (ÔH 5.48, d, 1.0 Hz) cho tương quan HMBC tới carbon cộng hưởng ở ôc

147.8 (C-4’) nên phân tử đường gắn vào aglycon qua C-4’ Proton của nhóm methoxy cộng hưởng ở ÔH 4.01 cho tương quan HMBC tới carbon cộng hưởng ở ôc 139.9 (C-3) nên tại

vị trí C-3 đã được metyl hóa

Phổ HR-ESI-MS cho thấy mũi ion phân tử giả ở m/z = 461.0710 [M-H]', phù hợp

với công thức phân tử (C21H18O12 -H) với [M - H]' = 461.0720

Phần đường được xác định dựa vào các sự kết hợp phổ 1H, 13c, COSY, HSQC, HMBC Theo đó, phần đường gồm các 6 carbon (99.6; 70.1; 70.4; 72.1; 69.7 và 18.0) Tín hiệu cộng hưởng của proton anomer ở ÔH 5.48 dưới dạng mũi đôi, J = 1,0 Hz và nhóm metyl C-6” (ÔH 1.10, d, 6.5 Hz, ôc 18.0) cho phép dự đoán đây là đường a-L- rhamnoz

Kết hợp so sánh với số liệu phổ NMR của hợp chất acid 3-ơ-metyl-4’-ơ-a-L- rhamnopyranosylellagic [7] cho thấy có sự tương đồng nên chúng tôi đề nghị cấu trúc của hợp chất PEA-12 là acid 3-ỡ-metyl-4’-ỡ-a-L-rhamnopyranosylellagic

Hình 3.3: Tương quan HMBC của hợp chất PEA-12

Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PEA-12

b Tín hiệu bị che khuất

3.1.4 Biện luận cấu trúc PEA-13

Hợp chất PEA-13 (15 mg) thu được từ phân đoạn A5 của sơ đồ 2 có những đặc

điểm sau: dạng bột màu ttắng, SKLM với hệ giải ly C:M 7:3 cho một vết duy nhất, hiện hình với thuốc thử H2SO4 25% cho vết màu tím đậm

Phổ ’H-NMR (CD3OD, phụ lục 4.1): proton vòng thơm (ÔH 8.13 - 6.78), ÔH

8.13/8.12 (1H, s, H-6), 7.06/7.04 (1H, s, H-3), ỖH 6.95/6.94 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5’), 6.83 (1H, d,J= 1.5 Hz, H-2’), 6.78/6.76 (1H, dd, J = 6.0/1.5 Hz, H-6’), -OCỊỊa (ÔH 4.02 và 3.72),

Trang 25 proton anomer ở ÔH 4.81(H-1”) và 4.23 (H-l’”), >CH-O- (ỖH 4.11 - 3.54), các độ chuyển dịch khác được trình bày trong bảng 3.4

Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT (CDOD3, phụ lục 4.2): >c=o (8c 172.4, C 9’), O-CH2-O- (8C 102.6); 8C 106.7 (C-l’”), 8C 105.0 (C-l’”), các độ chuyển dịch khác được trình bày trong bảng 3.4

-Phổ COSY, HSQC, HMBC, NOESY, HR-ESI-MS (CDOD3, phụ lục 4.5, 4.3, 4.4, 4.6, 4.7)

❖ BIỆN LUẬN CẤU TRÚC:

Phổ 'H-NMR của hợp chất PEA-13 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của 5 proton vòng

thơm trong vùng SH 8.13 - 6.78 Trong đó, hai proton cộng hưởng dưới dạng mũi đơn tại

SH 8.13/8.12 (1H, s, H-6); 7.06/7.04 (1H, s, H-3) Tín hiệu cộng hưởng của vòng benzen

>CH-O- của phân tử đường cộng hưởng trong vùng 8H 4.11 - 3.54

Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT cho thất hợp chất PEA-13 có 1 cacbon >c=o (8c

172.45); cacbon vòng benzen mang oxy [8c 153.3; 151.6; 149.0; 148.97; 146.2]; cacbon của vòng thơm trong vùng (8c 102.7-137.6), cacbon của nhóm đioxymetylen -O-CH2-O- (8C 102.6); cacbon metylen mang oxygen (8c 69.4); 2 nhóm metoxy (8c 56.8 và 55.0) và các cacbon của phân tử đường trong vùng (8c 77.9-66.7)

Phổ '1I NMR, 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy hợp chất PEA-13 có nhóm O-CH2-O (8H 6.05 và 6.04, 8c 102.6)

Bên cạnh đó, có sự tương quan HMBC từ proton cộng hưởng ở 8H 8.13 và 7.06 đến 8c 56.82 và 55.05 Hai proton của nhóm đioxymetylen (8H 6.05 và 6.04) tương quan đến cacbon cộng hưởng tại ôc 149.0 và 148.9 (=c<) Bên cạnh đó phổ 13C-NMR xuất hiện các tín hiệu cặp đôi [tltk]

Từ các dữ liệu phổ trên cho phép dự đoán PEA-13 là một lignan dạng arynaphthalen Kết hợp các dữ liệu phổ COSY, HSQC, HMBC có thể xác định các cacbon cộng

Trang 26 hưởng tại ôc 106.7; 77.9; 77.1; 75.4; 69.8; 71.3 thuộc phân tử đường thứ nhất có 6 cacbon

và các cacbon cộng hưởng tại ôc 105.0; 74.2; 72.0; 69.4; 66.7 thuộc phân tử đường thứ hai

có 5 cacbon

Tương quan HMBC từ proton anomer của phân tử đường thứ nhất (ÔH 4.81) đến cacbon C-7 (ôc 146.2) cho phép xác định phân tử đường thứ nhất gắn vào aglycon tại C-7 Phân tử đường thứ hai gắn vào phân tử đường thứ nhất tại C-6" (ôc 69.5) được xác định qua

sự tương quan HMBC từ proton anomer của phân tử đường thứ hai (ÔH 4.23) đến cacbon C-6" và ngược lại

Hằng số ghép của hai proton anomer lần lượt là 8.0 và 7.5 Hz cho thấy rằng hai proton này ở vị trí trục, proton H-2” ÔH 3.65 trong phân tử đường 6 cacbon không thể hiện sự tương quan noesy với proton H-4”( ÔH 3.44) nên H-4” ở vị trí xích đạo Phổ noesy thể hiện

sự tương quan từ proton anomer H-l’” (ÔH 4.23) tới proton H-4’” (ÔH 3.77), H-2’” (ÔH

3.56) không có tương quan với proton H-4’”, nên H-4’” cũng ở vị trí xích đạo, do đó 2 phân

tử đường được dự đoán là 0-D-galactopyranose và a-L- arabinopyranose

Phổ HR-ESI-MS cho thấy mũi ion phân tử giả ở m/z = 697.1865 [M+Na]+, phù hợp với công thức phân tử (C32H34O16 + Na) với [M + Na]+ = 697.1745

Từ các dữ liệu phổ trên kết hợp so sánh số liệu NMR của 7-ỡ-[/?-D-galactopyranosyl- (1

—>6)-a-L-arabinopyranosyl]diphyllin [15] khá tương đồng nên đề nghị cấu trúc của hợp chất PEA-13 là: