Thủy phân dầu dừa bằng Enzyme Lipase Thu nhận chế phẩm Lauric

Do đó nghiên cứu về “Thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase - thu nhận che phẩm lauric” được thực hiện với các nội dung: Khảo sát nguyên liệu Khảo sát các thông số cho quá ttình thủy phân

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa-ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Trần Bích Lam

TS Phan Ngọc Hòa (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Nguyễn Hoài Hương

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 TS Hoàng Kim Anh

2 TS Nguyễn Hoài Hương

3 TS Huỳnh Tiến Phong

4 TS Tôn Nữ Minh Nguyệt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Nguyễn Thị Vinh

Ngày, tháng, năm sinh: 12/11/1991

Chuyên ngành: Công nghệ Thực Phẩm

I TÊN ĐỀ TÀI: THỦY PHÂN DẦU DỪA BẰNG ENZYME LIPASE - THU NHẬN CHẾ PHẨM LAURIC

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

1 Khảo sát nguyên liệu dầu dừa và enzyme lipase từ tụy lợn (PPL)

2 Khảo sát điều kiện phản ứng thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase từ tụy lợn (LPP): tỉ

lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất; pH, nhiệt độ, thòi gian phản ứng

3 Thu nhận chế phẩm lauric, xác định thành phần acid béo và hoạt tính kháng khuẩn của che phẩm

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 11/01/2016

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2016

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Trần Bích Lam và TS Phan Ngọc Hòa

Mã số: 60 54 01 01

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

(Họ tên và chữ ký)

và đã tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi ừong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài luận vãn tại trường

Cuối cùng, tôi cũng xin cảm ơn sâu sắc đến các anh, chị và bạn bè làm việc tại phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã đồng hành, quan tâm và giúp đỡ tôi ừong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận vãn

Xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc nhất

TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 7 năm 2016

Học viên thực hiện

Nguyễn Thị Vinh

ii

ABSTRACT

Lauric acid is the main component of coconut oil fatty acid (43-56%) It is known for high antibacterial activity Thus this study was done with the following contents:

- Characterizing crude coconut oil and porcine pancreatic lipase

- Surveying parameters for hydrolysis of coconut oil using porcine pancreatic lipase (PPL) as: oil to buffer ratio, enzyme to substrate ratio, temperature, pH, reaction time

- Obtaining the preparation which is rich in lauric acid from the hydrolysate products, determining their fatty acid composition and thefr antibacterial activity

against Staphylococcus aureus

Results:

- Raw coconut oil contains lauric acid (49.47%), caprylic acid (7.23%)

- Conditions for the hydrolysis reaction of coconut oil by PPL to the highest degree

of hydrolysis are: oil to buffer ratio of 0.2 (v/v); enzyme to substrate of 1.2% (w/w), pH 8.5, temperature of 37°c, reaction time of 4h

- Preparation included mixture of glycerides and mixture of fatty acids Mixture of glycerides (52.6% lauric acid) have small antibacterial activity against

Staphylococcus aureus Mixture of fatty acid (62.2% caprylic acid, 14.2% lauric

acid) have high antibacterial activity against Staphylococcus aureus The results

showed that the high specificity of the PPL for caprylic acid (C8: 0) and this acid

is present mainly in the link a esters of coconut oil

iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Axit lauric là thành phần axit béo chính của dầu dừa (43 - 56%) và được biết đến với hoạt tính kháng khuẩn cao Do đó nghiên cứu về “Thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase - thu nhận che phẩm lauric” được thực hiện với các nội dung:

Khảo sát nguyên liệu

Khảo sát các thông số cho quá ttình thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase từ tụy lợn (porcin pancreas lipase - PPL) như hàm lượng dầu, hàm lượng enzyme, nhiệt

độ, pH, thời gian phản ứng

Thu nhận chế phẩm giàu lauric từ dịch thủy phân, xác định thành phần axit béo và

hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus aureus

Kết quả thu được như sau:

Nguyên liệu dầu dừa chứa axit lauric (49.47%), axit caprylic (7.23%)

Điều kiện cho phản ứng thủy phân dầu dừa bởi PPL cho mức độ thủy phân cao nhất là: tỉ lệ dầu/đệm 1:5, tỉ lệ enzyme/cơ chất 1.2%, pH 8.5, nhiệt độ 37 °C, thời gian phản ứng là 4 giờ

Sản phẩm thu nhận được bao gồm hỗn họp glyceride (axit lauric 52.6%) có hoạt

tính kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus rất thấp còn hỗn họp axit béo (axit

caprylic chiếm tỉ lệ cao nhất 62.2%, axit lauric chiếm tỉ lệ cao thứ hai 14.2%) có

hoạt tính kháng khuẩn dối với Staphylococcus aureus cao Kết quả cho thấy enzyme

PPL đặc hiệu cao đối với axit caprylic (C8:0) và acid này nằm chủ yếu trong liên kết a este của triglyceride dầu dừa

iv

LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chính bản thân tôi Các nội dung nghiên cứu và các kết quả ừong luận vãn là trung thực và chưa từng được ai công bố trước đây, không sao chép từ bất cứ tài liệu hay bất cứ nguồn nào dưới mọi hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu (nếu có) đều được trích dẫn và ghi rõ nguồn tài liệu tham khảo theo đúng quy định

Tác giả luận văn Nguyễn Thị Vinh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

ABSTRACT ii

TÓM TẮT LUẬN VÃN iii

LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT X MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Dầu dừa 3

1.1.1 Phân loại dầu dừa 3

1.1.2 Thành phần hóa học của dầu dừa 4

1.1.3 Tính chất hóa lý của dầu dừa 5

1.1.4 phản ứng thủy phân dầu dừa 6

1.1.4.1 Thủy phân bằng hóa chất 6

1.1.4.2 Thủy phân bằng enzyme 6

1.2 Acid Lauric 7

1.2.1 ứng dụng của axit lauric 7

1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn của acid lauric 8

1.2.3 Sản xuất axit lauric 9

1.3 Lipase 9

1.3.1 Phân loại lipase 10

1.3.2 Cơ che xúc tác phản ứng thủy phân chất béo của lipase 17

1.3.3 Các phản ứng xúc tác bởi lipase 19

1.4 Porcine pancreas lipase (PPL) 20

1.4.1 Cấu trúc của enzyme PPL 20

1.4.2 Các yếu tố ảnh huởng đến hoạt tính xúc tác của PPL 21

vi

1.4.3 ứng dụng của PPL 23

1.4 Một số nghiên cứu liên quan 24

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 28

2.1.1 Nguyên liệu 28

2.1.2 Hóa chất sử dụng 29

2.1.3 Dụng cụ - thiết bị 30

2.2 Sơ đồ nghiên cứu 32

2.3 Bố trí thí nghiệm 33

2.3.1 Phân tích nguyên liệu 33

2.3.1.1 nguyên liệu dầu dừa 33

2.3.1.2 Khảo sát tính chất của enzyme PPL 33

2.3.2 Khảo sát điều kiện phản ứng thủy phân 33

2.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dầu/đệm 35

2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/cơ chất 37

2.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH 38

2.3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 39

2.3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân 40

2.3.3 Thu nhận chế phẩm ở qui mô phòng thí nghiệm 41

2.3.3.1

Thu hỗn họp axit béo và hỗn họp glyceride 41

2.3.3.2

Xác định thành phần axit béo 44

2.3.3.3

Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm 44

2.5 Phương pháp phân tích 45

2.5.1 Phương pháp xác định chỉ số axit 45

2.5.2 Phương pháp xác định chỉ số peroxide 45

2.5.3 Phương pháp xác định độ ẩm 46

vii

2.5.4 Xác định hàm lượng protein của enzyme theo phương pháp Bradford 46

2.5.5 Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp chuẩn độ axit - bazơ 46

2.5.6 Định lượng axit béo bằng phương pháp đo quang 47

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 48

3.1 Phân tích nguyên liệu 48

3.1.1 Nguyên liệu dầu dừa 48

3.1.1 Enzyme PPL 49

3.2 Khảo sát điều kiện phản ứng thủy phân 50

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dầu/đệm 50

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/cơ chất 51

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH 53

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 54

3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân 56

3.3 Thành phần axit béo của các chế phẩm Lauric 57

3.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm lauric 59

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

4.1 Kết luận 63

4.2 Kiến nghị 63

BẢNG DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 74

8

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần acid béo trong dầu dừa 4

Bảng 1.2 Tính chất hóa lý của dầu dừa 5

Bảng 1.3 Các thông số sinh hóa của lipase vi sinh vật 11

Bảng 2.1 Hóa chất chính được sử dụng 29

Bảng 2.2 Thiết bị chính sử dụng ừong thí nghiệm 30

Bảng 2.3 Dụng cụ sử dụng 31

Bảng 2.4 Điều kiện khảo sát tỉ lệ dầu/đệm 36

Bảng 2.5 Lượng dầu và đệm cần để tạo nhũ theo các tỉ lệ dầu/đệm 36

Bảng 2.6 Điều kiện khảo sát tỉ lệ enzyme/cơ chất 37

Bảng 2.7 Điều kiện phản ứng khảo sát pH 38

Bảng 2.8 Điều kiện khảo sát nhiệt độ 39

Bảng 2.9 Điều kiện khảo sát thời gian thủy phân 40

Bảng 3.1 Thành phần axit béo của nguyên liệu dầu dừa được cung cấp bởi trung tâm sắc ký Hải Đăng 48

Bảng 3.2 Các chỉ tiêu hóa lý của nguyên liệu dầu dừa 49

Bảng 3.3 Bảng qui đổi từ tỉ lệ % enzyme /cơ chất ra u/g cơ chất 52

Bảng 3.4 Thành phần axit béo của hỗn họp axit béo và hỗn họp glyceride 58

Bảng 3.5 Đường kính kháng khuẩn của chế phẩm lauric 60

9

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các loại dầu dừa 3

Hình 1.2 Phản ứng thủy phân triacylglycerol trong môi trường axit 6

Hình 1.3 Phản ứng thủy phân triacylglycerol có xúc tác của lipase 7

Hình 1.4 Phân loại lipase theo nguồn thu nhận 10

Hình 1.5 Phản ứng thủy phân của lipase không đặc hiệu 14

Hình 1.6 Phản ứng thủy phân triglyceride của lipase đặc hiệu vị trí sn-1, sn-3 15

Hình 1.7 Mô hình hoạt động của lipase tại bề mặt liên pha dầu/nước 17

Hình 1.8 Cơ chế của phản ứng thủy phân cơ chất bằng xúc tác lipase 19

Hình 2.1 Dầu dừa nguyên chất (VCO) 28

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 32

Hình 2.3 Qui trình tạo nhũ dầu 34

Hình 2.4 Qui trình thủy phân dầu vco bằng PPL 34

Hình 2.5 Qui trình thu hỗn họp glyceride và hỗn họp acid béo 42

Hình 3.1 Đồ thị đường chuẩn mật độ quang theo nồng độ protein 49

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ dầu/đệm đến mức độ thủy phân của enzyme PPL 50

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/cơ chất đến mức độ thủy phân của enzyme PPL 52

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến mức độ thủy phân của enzyme PPL53 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân của enzyme PPL 55

Hình 3.6 Đồ thị biểu Diễn ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới mức độ thủy phân của enzyme PPL 56

Hình 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm lauric 60

DANH MUC CÁC TỪ VIẾT TẤT

•

ARA: Arachidonic acid

CRL: Candida rugosa lipase

DAG: Diacylglyceride

DH: Degree hydrolysis - Mức độ thủy phân

DHA: Docosahexaenoic acid

DPA: Docosapentaenoic acid

EDPA: Eicosapentaenoic acid

FFA: Free fatty acid

1

MỞ ĐẦU

Axit béo ngoài việc đóng vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp hữu cơ, lợi ích đổi với sức khỏe [1], [2], [3], nó còn được biết đển bởi hoạt tỉnh kháng khuẩn rẩt tốt [4], [5], [6] Nhiều nghiên cứu cho thẩy axit béo và monoglyceride của nó cho hoạt tỉnh kháng khuẩn tốt trên nhiều loài vi khuẩn và không cho thấy tình trạng kháng kháng sinh như đổi với các loại kháng sinh thường dùng [7], [8] Do đó hướng nghiên cứu về việc thu nhận axit béo được quan tâm rất nhiều

Đã có rẩt nhiều công trình nghiên cứu về axit béo chưa bão hòa và việc thu nhận chúng từ nhiều loại dầu béo khác nhau Tomoko Okada và cộng sự (2007) đã nghiên cứu

sử dụng lipase xúc tác thủy phân dầu chiết xuất từ cá mỏi để sản xuất axit béo Cữ - 3 [9] Kriti Bhandari và cộng sự (2013) nghiên cứu sản xuất axit docosahexaenoic (DHA) bằng cách thủy phân dầu cá ngừ sử dụng lipase Candida rugosa [10] Axit béo no cụ thể là axit béo no chuỗi trung bình đặc biệt là acid lauric cũng được quan tâm nghiên cứu nhiều

do hoạt tính kháng khuẩn của nó Axit lauric có nhiều trong các loại dầu cọ, dầu dừa 56%) và được biết đển với hoạt tính kháng khuẩn cao [11], [12], Tuy nhiên, hiện trong nước chưa có một công trình nghiên cứu nào về việc thu nhận axit lauric

(43-Để thu nhận chể phẩm lauric phải tiến hành thủy phân các liên kểt ester của các triglyceride trong dầu Có hai phương pháp thủy phân chính là sử dụng xúc tác hóa học

và xúc tác enzyme tuy nhiên hiện nay vĩ những lợi ích vượt trội của xúc tác enzyme cụ thể

là enzyme lipase mà chúng được ưu tiên sử dụng Do đó, ở nghiên cứu này em hướng tới mục tiêu thủy phân dầu dừa bằng lipase và thu nhận chế phẩm lauric Nội dung nghiên cứu gồm hai bước:

2

Bước 1: Khảo sát các nguyên liệu (dầu dừa, enzyme) và các thông số tối ưu cho quá trình thủy phẫn dầu dừa như tỉ lệ enzyme/cơ chẩt, tỉ lệ dầu/đệm, nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng

Bước 2: Thu chế phẩm lauric từ dịch sau thủy phân, xác định thành phần axit béo

và hoạt tính kháng khuẩn.

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Dầu dừa

1.1.1 Phân loại dầu dừa

Dựa vào qui trình sản xuất, dầu dừa được phân thành hai loại là dầu dừa tinh luyện (refined, bleached and deodorized coconut oil - RBDCO) và dầu dừa nguyên chất (vữgin coconut oil -VCO) [13]

RBDCO là loại dầu được sản xuất từ com dừa khô vói chất lượng khác nhau, chiết xuất bằng phương pháp khô, sau đó sẽ được đem tinh chế, khử màu, khử mùi Trong đó, quá trình khử mùi được thực hiện ở nhiệt độ cao (204°C - 245°C)

vco là loại dầu được sản xuất từ com dừa tươi, chiết xuất bằng phương pháp ướt, không qua quá trình tinh chế, khử màu, khử mùi như dầu RBDCO Công nghệ sản xuất không dùng hóa chất và nhiệt độ cao nên giữ lại được các đặc điểm tự nhiên của dầu

Hình 1.1 Các loại dầu dừa

■

1.1.2 Thành phần hóa học của dầu dừa

Dầu dừa chứa khoảng 92% axit béo bão hòa bao gồm axit caproic, axit capric, axit lauric, axit myristic, axit palmitic, axit stearic (nằm ở dạng triglycerides) Hầu hết các axit béo này (khoảng 70%) là axit béo bão hòa trung bình không phổ biến ở các loại dầu thực vật, với axit lauric (C12) chiếm 45-56% [16],

Trong dầu dừa, axit lauric được tìm thấy có mặt trong 92% triacylglyceride (TAG )

và các TAG chính là trilaurin (3C12; 23,6%), capryl dilauryl glyceride (CIO + 2C12; 19,8%), dicapryl lauryl glyceride (2C10 + C12; 15,4%) và dilauryl myristyl (2C12 + C14; 15,2%) [17],

Pham và cộng sự đã phân tích từ dầu dừa Philippines sử dụng lipase tụy đặc hiệu vị trí sn-1 và sn-3 Họ đã xác định rằng có 54,3 % TAG dầu dừa có axit lauric ở vị trí sn-1

và sn-3 và 44,1% trong vị trí sn-2 [18]

Bảng 1.1 Thành phần acid béo trong dầu dừa [19]

1.1.3 Tính chất hóa lỷ của dầu dừa

Dầu dừa không tan trong nước Tại nhiệt độ nóng chảy của dầu dừa, nó có thể hòa tan hoàn toàn với hầu hết các dung môi không phân cực như petroleum, benzene, carbon tetrachloride, Dau dừa tan nhiều hơn hong alcohol so với các loại dầu và chất béo thông thường [16],

Các thông số hóa lý của dầu dừa theo tiêu chuẩn Codex như nhiệt độ nóng chảy, độ

ẩm, chỉ số peroxide, chỉ số iode, chỉ số xà phòng, thành phần không xà phần hóa,

phospholipid và hàm lượng axit béo được thể hiện trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Tỉnh chẩt hóa lỷ của dầu dừa [16]

a

6

1,1.4 phản ứng thủy phân dầu dừa

Nhìn chung là có 2 phương pháp để thủy phân dầu dừa: thủy phân bằng hóa chất và thủy phân bằng enzyme

I.I.4.I Thủy phân bằng hóa chất

Hĩnh 1.2 Phản ứng thủy phân triacylglycerol trong môi trường axit

> Tác nhân xúc tác thủy phân có thể là acid, kiềm (NaOH hoặc KOH)

> Thủy phân bằng nước : cần nhiệt độ 250-330°C và áp suất là 50-60 bar

> Ưu điểm: Hiệu suất thủy phân cao, thời gian thủy phân ngắn

> Nhược điểm: Tốn nhiều chi phí năng lượng và chi phí xử lý chất thải, điều kiện phản ứng khắc nghiệt

I.I.4.2 Thủy phân bằng enzyme.

7

Phản ứng thủy phân dầu bỏi enzyme lipase xảy ra ữên bề mặt tiếp xúc hai pha dầu

và nước, enzyme lipase có thể có sẵn trong nguyên liệu hoặc do vi sinh vật mang vào Lipase đã được thương mại hóa dưói dạng các chế phẩm để đáp ứng cho các mục đích công nghiệp và nghiên cứu

óiux + ỊỉOX-b z 'F~~| 1H

I ■ Ipase I I CESÉ I HƯA- 'P™ I uny

Hình 1.3 Phản ứng thủy phân trỉacylglỵcerol có xúc tác của lipase

> Ưu điểm: Có tính đặc hiệu cao, hiệu suất thủy phân khá cao, không tốn nhiều chi phí năng lượng và chi phí xử lý chất thải, điều kiện phản ứng ôn hòa

> Nhược điểm: Điều kiện phản ứng hẹp (nhiệt độ, pH trong khoảng hoạt động của enzyme), thời gian thủy phân dài

Việc sử dụng enzyme lipase để thủy phân dầu thực vật đã được nghiên cứu rất nhiều bởi các tác giả như Tomoko Okada và cộng sự (2007) [9], Yuji Shimada và cộng sự (1998) [20], Kriti bhandari và cộng sự (2013) [10], N.A Serri và cộng sự (2008) [21], L.L.You

và cộng sự (2006) [22], Xiao Yan Wu và cộng sự (1996) [23], Lee Suan Chua và các cộng

sự (2012) [24]

1.2 Acid Lauric

1.2.1 ửng dụng của axit lauric Ngoài việc đóng vai trò quan trọng trong ngành công

nghiệp hóa hữu cơ thì axit lauric còn có một tính chất quan trọng khác mà những năm gần đây nó khá được quan tâm, đặc biệt trong lĩnh vực y học và mỹ phẩm là khả năng kháng khuẩn Khi axit lauric được hấp thụ vào cơ thể nó sẽ chuyển hóa thành monolaurin - là một họp chất có khả năng kháng virut, vi khuẩn và nấm bằng cách phá hủy lớp màng lipit của chúng [25],

Một nghiên cứu của Teruaki Nakatsuji và cộng sự (2009) về khả năng kháng khuẩn

8

của axit lauric đối với Propionibacterium acnes trong điều ừị viêm mụn Vulgaris đã cho

thấy khả năng kháng khuẩn của axit lauric cao hon 15 lần so với benzoyl peroxide (BPO)

- chất có hiệu quả đối với điều ừị mụn trứng cá Ngoài ra nghiên cứu còn cho thấy axit lauric không gây độc ttong quá trình sử dụng, đặc hiệu đối với khuẩn mụn

Propionibacterium acnes mà không ảnh hưởng tới u nang tuyến bã nhờn ừên da [26],

TT Padgett và cộng sự (2000) nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung axit lauric đối với hoạt tính kháng khuẩn và khả năng thấm nước của bột đạm ngô - chứa nisin - một chất bảo quản ừong thực phẩm, Các nisin một mình và kết họp với axit lauric cho thấy sự giảm số tế bào vi khuẩn và tăng khả năng chống thấm nước [12],

Jon J Kabara và cộng sự (1972) đã nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc của 30 axit béo mạch thẳng, các dẫn xuất và tính chất kháng khuẩn của chúng trên 8 loài vi khuẩn gram âm và 12 loài vi khuẩn gram dương cho thấy C12 (axit lauric) là axit béo bão hòa

ức chế tốt nhất đối với vi khuẩn gram dương [27],

1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn của acid lauric

Acid lauric có cơ chế kháng khuẩn giống như các acid béo tự do khác

Cơ chế kháng khuẩn của acid béo tự do chưa được biết chính xác Tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn của acid béo liên quan đến việc tác động đến màng tế bào vi khuẩn và các quá trình khác nhau bên trong và bên ngoài tế bào vi khuẩn Một số tác dụng bất lợi đến màng tế bào vi khuẩn có thể là do tính hoạt động bề mặt của acid béo do cấu trúc amphipathic của chúng Chúng tương tác với màng tế bào tạo ra các lỗ trống với kích thước khác nhau Ở nồng độ cao axit béo có thể hòa tan màng tế bào vi khuẩn với mức

độ khác nhau tùy thuộc vào protein màng hoặc là giải phóng lớp lipid kép Quá trình này gây ảnh hưởng đen chuỗi truyền electron và sự gián đoạn phosphoryl hóa (Sheu và Freese 1972; Galbraith và Miller 1973 b; Miller et al năm 1977; Boyaval et al năm 1995; Wojtczak và Wiẹckowski 1999) Ngoài ra, các quá trình khác gây ức chế sự tăng trưởng hoặc tiêu diệt vi khuẩn đó là sự phân giải tế bào vi khuẩn, ức chế hoạt động của enzyme,

9

làm suy giảm sự hấp thụ dinh dưỡng và sự sinh ra các peroxide và các sản phẩm do sự tự oxi hóa gây độc đối với tế bào vi khuẩn khi có mặt của axit béo tự do (Kodicek và Worden 1945; Sheu và Freese 1972) [28],

1.2.3 Sản xuất axit lauric

Trong công nghiệp, việc sản xuất axit béo nói chung và acid lauric nói riêng chủ yếu sử dụng phương pháp thủy phân triglyceride của các loại dầu mỡ (nguồn chủ yếu là dầu dừa, dầu cọ) bởi nhiệt độ cao (250 - 255°C) và áp xuất cao (50 - 55 bar) Hỗn hợp các axit béo thô sau thủy phân sẽ được hydro hóa, chưng cất và phân đoạn [29], [29] Sản phẩm thu được có độ tinh khiết khác nhau tùy thuộc vào mục đích sử dụng Phương pháp này cho hiệu suất cao tuy nhiên điều kiện phản ứng khắc nghiệt, tốn nhiều chi phí năng lượng, chi phí xử lý chất thải, sản phẩm axit béo có màu sậm [29],

Một phương pháp khác được sử dụng để sản xuất acid béo đó là thủy phân dầu sử dụng xúc tác enzyme lipase Ở Nhật Bản đã có một số nhà máy sản xuất axit béo bằng cách thủy phân dầu béo sử dụng xúc tác enzyme lipase Xúc tác enzyme có tính chọn lọc cao, điều kiện phản ứng ôn hòa, sản phẩm axit béo có màu nhẹ, ít tốn chi phí về năng lượng và chi phí xử lý chất thải Tuy nhiên, phương pháp này có khoảng điều kiện phản ứng hẹp (pH, nhiệt độ trong khoảng hoạt động của enzyme) [29],

1.3 Lipase

Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC3.1.1.3) là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol (dầu thực vật và mỡ động vật) giải phóng các axit béo tự do, diacylglycerol, monoacylglycerol và glycerol [30],

10

1.3.1 Phân loại lipase

J Phân loại theo nguồn thu nhận

Lipase phân bố rộng rãi trong các vi sinh vật (vi khuẩn và vi nấm), thực vật, động vật Dữ liệu thống kê cho thấy rằng lipase từ vi khuẩn chiếm 45%, lipase từ vi nấm chiếm 21%, lipase động vật chiếm 18%, lipase thực vật là 11% và lipase tảo là 3% [31]

vi khuẩn

■ vi nấm động vật

■ thực vât tảo

Hình 1.4 Phân loại lipase theo nguồn thu nhận

(Nguồn: Patil và cộng sự, 2011 [31]

• Lipase vi sinh vật:

Lipase có nguồn gốc từ vi sinh vật có ý nghĩa thương mại vì chi phí sản xuất thấp,

ổn định hơn và ứng dụng rộng hơn lipase thực vật và động vật Hầu hết lipase vi sinh vật trong công nghiệp có nguồn gốc từ nấm và vi khuẩn [32], Các đặc tính sinh hóa của Lipase

vi sinh vật được cho ở bảng 1.3 Chúng có khoảng pH từ 4.0 - 10.0, nhiệt độ từ 27-80°C, khối lượng phân tử khác nhau từ 11-176 kDa [33],

Bảng 1.3 Các thông số sinh hóa của lipase vi sinh vật [33]

11

Trong số các lipase từ vi khuẩn đang được khai thác, vi khuẩn Bacillus có tiềm năng

cho các ứng dụng công nghệ sinh học Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus

licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus và Bacillus alcalophilus là

các lipase vi khuẩn phổ biến nhất Ngoài ra, Pseudomonassp., Pseudomonas aeruginosa,

Burkholderỉa multivorans, Burkholderỉa cepacia và Staphylococcus caseolyticus cũng

được dùng trong sản xuất lipase từ vi khuẩn [34],

Các loài nấm men để sản xuất lipase đã được tìm thấy là: Candida rugosa, Candida

tropỉcalỉs, Candida antarctica, Candida cylỉndracea, Candida parapsilopsis,

Candidadeformans Trong số đó, lipase từ c.rugosa và C.antarctica được sử dụng phổ

biến nhất [35],

• Lipase động vật

Động vật cũng là một nguồn lipase phong phú nhưng do tính sẵn có của lipase vi

khuẩn chúng được nghiên cứu ít hơn nhưng vẫn được phân lập từ nhiều loại côn trùng, cá,

động vật có vú Lipase động vật đóng vai trò quan trọng trong sự tiêu hóa chất béo trong

hệ thống sinh học (Walton & Coweyl984) [31],

Nguồn sản xuất lipase động vật quan ừọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và lợn

Lipase từ tụy tạng lợn là một ừong những lipase được biết đến sớm nhất và khá thông dụng

[31], Các thông số hóa sinh của lipase động vật được đưa trong bảng 1.4

Bảng 1.4 Các thông sô sinh hóa của lỉpase động vật [31]

12

và năng lượng để hỗ ttợ cho sự phát triển của cây con Các nguồn lipase ở thực vật được cho ở bảng 1.5 [36],

Lipase thực vật có khoảng pH hoạt động là 4.0-8.0, khoảng nhiệt độ từ 25- 60°C, ừọng lượng phân tử của chúng khác nhau 40-143 kDa [36],

Bảng 1.5 Các thông so sinh hóa của Lipase thực vật [33]

■J Phân loại theo tính đặc hiệu

• Đặc hiệu vị trí xúc tác thủy phân

Nhóm 1: Là những lipase không đặc hiệu - những lipase có thể thủy phân ngẫu

nhiên giải phóng acid béo tại bất kỳ vị trí nào ừên triglyceride Ví dụ như lipase của

Candida rugosa và Candida cylinda

phân đặc hiệu có thể kể đến như Aspergillus niger, Muco mỉeheỉ,

14

Rhizopus arrhizu, Candida deformans Hầu hết lipase thông dụng có tính đặc hiệu vị trí

nhóm hydroxyl 1,3 (tương ứng các alcohol bậc 1) ừong mạch glycerol

Hình 1.6 Phản ứng thủy phân triglyceride của lipase đặc hiệu vị trí sn-1, sn-3

Bảng 1.6 Các kiểu xúc tác đặc hiệu của những lipase có nguồn gốc khác nhau [38]

Thermomyces lanuginosa Yarrowia lipolytica

Đặc hiệu vị trí 1,3 Đặc hiệu vị trí 1,3

Vi khuẩn

Bacillus thermocatenulatas Pseudomonas glumae Pseudomonas cepacia Bacillus subtilis Chromobacterium viscosum

Pseudomonas fluorescens

Đặc hiệu vị trí 1,3 Không đặc hiệu Không đặc hiệu

Không đặc hiệu Không đặc hiệu

Thực vật Brassica napus Đặc hiệu vị trí 1,3

Động vật Lipase từ tụy heo Đặc hiệu vị trí 1,3

• Đặc hiệu axit béo

l CHiOCOR

CH1OCOR

1 CHOCQR

1 CHiOH CHjOH

1 CHỮCOR

CHiOH

15

về tính đặc hiệu đối với axit béo, lipase có thể chuyển hóa ester mạch ngắn đến trung bình, có thể đến cả mạch dài (C4 đến C18, có thể lên đến C22) nhưng với hiệu quả khác nhau Ngay cả những enzyme từ cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau ở tính

chất này Với Candida rugosa, lipase dạng 1 chủ yếu hoạt động với cơ chất có mạch carbon

có độ dài trung bình (C8 - CIO), dạng 3 với cơ chất mạch ngắn, trong khi dạng 2 và 4 tác động ở mạch dài (C16 - C18) Một số lipase lại có thể chọn lọc axit béo không no Điều

này nhận thấy ở lipase từ Geotrichum candidum với tính đặc hiệu cơ chất chứa acid béo

không no (A-9) dạng cis Lipase tụy và một so lipase từ vi sinh vật thể hiện hoạt tính trên các axit béo không no nhiều nối đôi (polyunsaturated fatty acid, PUFA) lipase từ chủng

Pseudomonas sp hoạt động hướng đến các chuỗi axit béo từ trung bình đến dài (CIO đến

C18) [39]

• Đặc hiệu triglyceride

Một đặc trưng khác của lipase là hoạt động của nó trên các axit béo mono-, diglycerid

Theo kết quả nghiên cứu của Sakiyama et al (2001) thì enzyme lipase từ Pseudomonas sp

LP7315 xúc tác phản ứng thủy phân tất cả các monoglycerid, tuy nhiên hoạt tính của nó

tùy thuộc vào loại monoglycerid, hoạt tính của nó thể hiện ở monomyristin là cao nhất Enzyme này không thể thủy phân di và triglycerid, bao gồm cả dầu olive Hiện tượng này

chỉ ra rằng Pseudomonas sp LP7315 có tính chọn lọc nghiêm ngặt cho các monoglycerid

[34],

1.3.2 Cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân chất béo của lipase [40]

Lipase chỉ thủy phân chất béo đã nhũ hóa và hoạt động tại bề mặt phân pha dầu/ nước Lipase khác esterase ở chỗ lipase chỉ thủy phân các liên kết ester tan trong nước như triacylglycerol [39]

Đầu tiên, enzyme (E) sẽ được hấp thụ tại bề mặt liên pha dầu/nước Từ đây, enzyme được cung cấp năng lượng để chuyển sang trạng thái hoạt động (E*) Sau đó, lipase sẽ kết

16

hợp với cơ chất tạo thành phức enzyme-cơ chất (E*S) dẫn đến sự hình thành sản phẩm (P*) Những sản phẩm mạch ngắn sẽ tan trong nước (P) Đa phần các sản phẩm của quá trình này thường là mạch dài không tan trong nước [41],

Hình 1.7 Mô hình hoạt động của lipase tại bề mặt liên pha dầu/nước

Bước 1 Các enzyme liên kết với các cơ chất để tạo thành phức (1)

Bước 2: Tác nhân ái nhân tấn công acyl cacboxyl của cơ chất bởi nhóm Ser-OH tạo thành một tứ diện trung gian liên kết cộng hóa trị Bước này có sự tham gia của xúc tác His trong bộ ba (2)

Bước 3: Dạng trung gian bị phá hủy tạo thành acyl enzyme (3)

Bước 4: Xảy ra sự deacylation của acylenzyme với tương tác của nước tại trung tâm His, dẫn đến sự hình thành một tứ diện trung gian (4)

Phản ứng xúc tác lipase được phân thành 2 loại chính [43]:

RCOOR' + R"NII2< > R"CONHR' + ROH

1.4 Porcine pancreas lipase (PPL)

Porcin pancreas lipase (PPL) là một ttong những enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong các phản ứng chuyển hóa sinh học PPL rẻ hơn các loại lipase thương mại khác từ

vi khuẩn và động vật khác [44], PPL được coi là rất thích hợp để ứng dụng ttong công nghiệp do khả năng dễ tiếp cận (nó đã được thương mại hóa bởi các nhà cung cấp ttên thị trường quốc tế), tính ổn định cao và tính đặc hiệu rộng đối với các cơ chất phản ứng [45],

1.4.1 Cẩu trúc của enzyme PPL

PPL là một protein hình cầu nhỏ bao gồm một chuỗi duy nhất của 449 axit amin với phân tử lượng ừong khoảng 50 - 52 kDa Kích thước phân tử enzyme vào khoảng 4.6 nm X 2.6 nm X 1.1 nm cấu trúc không gian 3 chiều của PPL cho thấy có 2 đầu riêng biệt trong cấu trúc: đầu N và đầu c

Đầu N gồm các vòng xoắn a và gấp nếp p từ acid amin số 1 tới acid amin số 336

20

Bộ ba xúc tác Serine, Aspatate và Histidin nằm lần lượt tại axit amin số 153, 177 và 264 Cấu trúc tinh thể của PPL cho thấy có nhiều vòng xoắn che kín bộ ba xúc tác, các vòng này ngăn cản việc cơ chất tiếp xúc với trung tâm hoạt động của enzyme, đây là dạng đóng của enzyme, cấu trúc mở của enzyme được ổn định bằng liên kết hydro giữa nắp và colipase, cho phép cơ chất tiếp xúc với trung tâm hoạt động của lipase

Đầu c bao gồm các gấp nep p, bắt đầu từ axit amin số 337 tới axit amin số 449 Đây

là phần liên kết trực tiếp với colipase Colipase là một protein cofactor nhỏ với phân tử lượng khoảng 10 kDa Tuyến tụy tiết ra preform, procolipase, sau đó các chất này bị phân tách nhóm amino terminal pentapeptide ở tá tràng và trở thành colipase hoàn thiện Hoạt tính thủy phân của enzyme PPL là kết quả của sự phối họp hoạt động giữa lipase, colipase

và muối mật Ngoài ra, lipase cũng là một glycoprotein chứa manose và N - acetyl glucosamine, bao gồm 6 liên kết disunfur và 3 nhóm thiol, trong đó 2 nhóm thiol ở dạng

tự do nhưng không tham gia vào hoạt động của enzyme [46]

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của PPL

pH

PPL thể hiện hoạt tính cao nhất ở môi trường kiềm, trong khoảng từ 7.3 - 9.0 Tuy nhiên, pH tối ưu của PPL thay đổi theo loại cơ chất Với cơ chất là dầu olive, pH tối ưu là 7.5 - 9.0 Phản ứng thủy phân ethyl acetate đạt tối ưu tại pH 7.5 [47], Mặc dù LPP hoạt động xúc tác tối ưu trong khoảng pH kiềm, tuy nhiên nó lại bền vững hơn trong môi trường pH trung tính đến axit Khi phản ứng ở 50 0 c, sau 40 phút, ở pH 7.0 và 6.0, nó giữ lại 35 % và 40% hoạt độ ban đầu, ở pH 8.0, LPP hoàn toàn bị bất hoạt [48],

Nhiệt độ

PPL có khoảng nhiệt độ hoạt động tối ưu trong khoảng từ 35 - 45°c Sau khi lưu trữ trong 1 giờ ở 30°C, hoạt tính của PPL giảm còn 80%, và chỉ còn 50% khi lưu trữ ở 50°C Khi nhiệt độ vượt quá 60°C, PPL mất gần 90% hoạt tính [49],

21

lon kim loại và các chất ức chế

Các ion kim loại và muối đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác của các enzyme Những ion này liên kết chặt chẽ trên bề mặt các phân tử và đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc Một số ion kim loại như Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt tính của PPL lên

5 - 10% Tuy nhiên, một số ion kim loại như K+, Ag +, Fe2+, Pb2+ và Al3+ được cho là có khả năng ức chế hoạt động của enzyme [50], Một số chất có hoạt tính sinh học chiết xuất

từ thực vật có khả năng ức chế lipase tụy Các chiết xuất Quercus infectoria, Eucalyptus

galbie, Rosa damascena và Levisticum officinale cho thấy tác dụng ức chế hoạt động PPL

tương ứng là 85, 64, 57 và 55% [51],[52], Tetrahydrolipstatin, một dẫn xuất từ lipstatin

(lipid sản xuất bởi Streptomyces toxytriciní), đã được tìm thấy cũng là một chất ức chế

quan trọng của lipase tụy, bao gồm cả PPL [53],

Loại cơ chất

Tính đặc hiệu là một trong những thuộc tính quan trọng nhất của các enzyme, chủ yếu bao gồm cơ chất và vị trí đặc hiệu Đối với PPL, cơ chất tự nhiên là este của glycerol như tri-(TAG), di-(DAG) và monoacylglycerols (MAG) và phospholipid, cholesterol este

và galactolipids [54], Quá trình thủy phân TAG bởi PPL xảy ra ở cả các vị trí sn - 1 và sn

- 3 của glycerol tạo thành hai phân tử axit béo, trong khi ở vị trí sn - 2 vẫn chưa bị thủy phân (2 - MAG) [55] Tính đặc hiệu của lipase ở các cơ chất khác nhau chịu tác động bởi hai yếu tố quan trọng là hiệu ứng cảm ứng và trở ngại về không gian Nhóm thế halogen (F, Cl, và Br), cyano (CN) và nitro (NO2) tăng hiệu quả quá trình thủy phân (nhóm cho electron), trong khi nhóm hydroxyl (nhóm hút electron) làm giảm hoạt động của PPL [56], cấu trúc của axit béo cũng ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của LPP, kết quả cho thấy PPL có

độ đặc hiệu thấp đối với este cacboxylic của axit béo có liên kết đôi ở các vị trí 2-5 làm giảm đáng kể hoạt động của PPL Tuy nhiên, lipase này lại cho thấy tính đặc hiệu cao đối với este của chuỗi axit béo có liên kết không bão hòa ở vị trí > 6 Trong số các axit nhánh methyl, PPL cũng cho thấy tính đặc hiệu thấp khi thủy phân este với các nhóm methyl ở

vị trí 2, 3 và 4 Ngược lại, độ đặc hiệu cao đối với cơ chất được tìm thấy là có nhóm methyl

dầu từ M elengi và p aculeata được thực hiện bằng cách sử dụng PPL để nghiên cứu sự

phân bố vị trí của các axit béo trong trục glycerol [58], Những loại dầu có chứa hàm lượng cao các axit béo không bão hòa với axit linoleic là thành phần chính được thủy phân trong đệm Tris-HCl pH 8,0 chứa dung dịch muối mật và CaCl2 ở 40°C trong 3 phút Ket quả cho thấy axit linoleic chiếm ưu thế ở vị trí 2 ừong glycerol, tiếp theo là axit oleic Padilha

và Augusto-Ruiz đề xuất một phương thức sản xuất các axit béo không bão hòa nhiều nối đôi (PUFA) bằng cách thủy phân dầu cá sử dụng xúc tác PPL ở 38°c trong đệm amoni pH 8.0 trong 60 phút Hỗn hợp ỪĨ-, di-, monoacylglycerols và các axit béo tự do được tách bằng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng [59]

Tiền xử lý nước thải giàu lipid:

Nước thải lò giết mổ, có chứa từ 2.5 đến 3.0 g / L lipid đã được xử lý bằng PPL trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng [60] Quá trình tiền xử lý này làm giảm 60% kích thước hạt trung bình của các hạt chất béo trong nước thải lò mổ và tăng nồng độ axit béo tự do chuỗi dài, một số có thể tan được Trong nghiên cứu khác, Masse et al [61] cũng xử lý sơ bộ nước thải lò mổ có chứa các hạt mỡ lợn với lựa chọn PPL-250 tại 25°c ừong 5.5 giờ Việc tiền xử lý enzyme làm giảm khoảng 5% thời gian phân hủy và giảm 80% chất béo trung tính trong nước thải

Biodiesel:

Sản xuất este alkyl bằng phản ứng ừansester dầu babassu với ethanol, propanol và

23

butanol bằng PPL cố định ừên silica-poly (vinyl alcohol) đã được tiến hành [62], Kết quả cho thấy PPL cố định có thể chuyển đổi có hiệu quả dầu babassu để thu este alkyl axit béo 75-95% Trong một nghiên cứu khác, este hóa của dầu hạt bông với methanol được xúc tác bởi PPL tự do đã được thực hiện [63], Hiệu suất chuyển đổi tối đa đạt được 80% sau

4 giờ ở 37°c, pH 7.0, tỷ lệ mol dầu : methanol là 1:15, nồng độ enzyme 0.5 % (w/w) và nước 5% (w/w)

Ngoài ra, PPL còn được ứng dụng rất nhiều ttong sản xuất chất nhũ hóa và mỹ phẩm, dược phẩm, [64],

1.4 Một sổ nghiên cứu liên quan

Lee Suan Chua và cộng sự (2012) nghiên cứu thủy phân dầu dừa nguyên chất (VCO)

sử dụng lipase cố định từ Mucor miehei (Lipozyme) và đã đưa ra điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân là: nồng độ dầu vco 40% (v/v), hàm lượng enzyme 1% (w/v), hàm lượng nước 7% (v/v) và nhiệt độ 45 °C [24],

Mayank T.Patel và cộng sự (1995) đã nghiên cứu ảnh hưởng tương tác của các thông

số phản ứng và tối ưu hóa các thông số này ừong phản ứng thủy phân triacylglycerol của

dầu olive và dầu dừa xúc tác bởi enzyme lipase từ Candida cylỉndracea và Rhizopus

javanicus trong hệ micelle đảo Ket quả cho thấy điều kiện tối ưu của phản ứng thủy phân

triacylglycerol của dầu dừa bởi enzyme Candida cỵlindracea và Rhizopus javanicus lần

lượt là pH 6.0-6.8 và 6.8-7.6, nhiệt độ 22-28°C và 16-22°c, nồng độ chất hoạt động bề mặt AOT 140 -170 mM và 110-170 mM, tỉ lệ nước/chất hoạt động bề mặt 8-11 và 14-17 [65],

Nghiên cứu của Kamol Tangkam và cộng sự (2008) về khả năng xúc tác của các

enzyme lipase Candida rugosa ừên dầu dừa tinh khiết ở 40°C, tỉ lệ dầu/nước là 1:1, tỉ lệ

enzyme/dầu là 3.3% (w/w) cho kết quả thủy phân đạt 60-70% sau 2 giờ [66],

Bagi K và cộng sự (1997) đã sử dụng enzyme PPL cố định lên các hạt

24

polyacrylamide để thủy phân dầu oliu Ket quả cho thấy đối với cả hai dạng enzyme PPL

tự do và cố định, pH tối ưu là 8.9, nhiệt độ tối ưu là 37 °C 4- 40 °C [48],

Li Yanjing và cộng sự (2009) nghiên cứu cố định enzyme PPL lên vật liệu xốp SB

A - 15 dạng sợi để thủy phân tri acetin Khi khảo sát các thông số phản ứng thủy phân triacetin và so sánh PPL dạng tự do và cố định thì cả hai đều có pH tối ưu là 7 và nhiệt độ tối ưu cho cả 2 dạng tự do và cố định đều là 35°c [67],

Trong một nghiên cứu khác của K Saerens và cộng sự (2008), đã so sánh khả năng thủy phân của sáu loại lipase đối với việc tăng hàm lượng axit béo mạch ngắn đặc biệt là axit butanoic (đóng vai trò quan họng ừong tạo hương vị cho bơ sữa) cho kết quả là lipase

từ porcin pancreas và một so lipase khác như từ Candida cylindracea, Penciỉỉium

roqueforti cho thấy tính đặc hiệu đối với các axit béo mạch ngắn và mạch trung bình [68],

Trong nghiên cứu của W.J.Ting và cộng sự (2006), khi thủy phân dầu đậu nành bằng

enzyme lipase từ Candida rugosa (CRL) thì tỉ lệ dầu/đệm tối ưu là 10:7, pH tối ưu trong

khoảng 64-7 [69],

Trong một nghiên cứu khác của N.A Serri và cộng sự (2008) về việc sản xuất acid béo từ dầu cọ thủy phân bởi enzyme CRL, khi khảo sát hàm lượng enzyme CRL từ 3.73 kLU/ml đến 14.92 kLU/ml với hàm lượng dầu là o.lg/ml và nhiệt độ là 45°c, tốc độ khuấy

200 rpm thì mức độ thủy phân dầu cọ cũng tăng dần và đạt giá trị lớn nhất với hàm lượng enzyme 7.46 kLU/ml Khi tăng hàm lượng enzyme CRL từ 7.46 kLU/ml đến 14.92 kLU/ml thì mức độ thủy phân cũng giảm nhẹ [21],

Yuji Shimada và cộng sự (1998) đã nghiên cứu về sản xuất axit y-linolenic (GLA)

bằng cách thủy phân dầu cây lưu ly bởi enzyme lipase Candida rugosa ừên 2 yếu tố ảnh

hưởng là thời gian và nồng độ enzyme/cơ chất cho kết quả: nồng độ enzyme cho mức độ thủy phân là cao nhất là 100 u/g mẫu và khi tăng nồng độ enzyme cao hơn nữa thì mức

độ thủy phân cũng không tăng thêm Tỉ lệ dầu/nước tối ưu là 2:1 (v/v) Mức độ thủy phân đạt cao nhất là 80% sau 1511 phản ứng Tuy nhiên, so với mức độ thủy phân sau 8h, khi kéo dài thời gian phản ứng đến 1511 thì mức độ thủy phân tăng không đáng kể [20],