Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của lá trà hoa vàng Cúc Phương (Camellia cucphuongensis NinhRosmann)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC TÙNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA LÁ TRÀ HOA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN ĐỨC TÙNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG

CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA LÁ TRÀ HOA VÀNG CÚC PHƯƠNG (Camellia cucphuongensis

Ninh & Rosmann)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Ninh & Rosmann)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 8720206

Người hướng dẫn:

1 PGS TS Nguyễn Hoàng Tuấn

2 PGS TS Đỗ Thị Hà

LỜI CẢM ƠN

Em xin được bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn và lời cảm ơn sâu sắc nhất tới

PGS TS Nguyễn Hoàng Tuấn - Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội

và PGS TS Đỗ Thị Hà – Khoa Hóa Thực vật, Viện Dược Liệu, các thầy cô đã tận

tình hướng dẫn, định hướng, truyền cảm hứng và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu và các thầy cô Trường

Đại Học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, hướng dẫn nhiệt

tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể học hỏi và hoàn thành việc học Thạc

sỹ của mình

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị trong Bộ môn Dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội và Khoa Hóa Thực vật Viện Dược Liệu đã tận tình giúp

đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt quá trình làm thực nghiệm

Lời sau cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, các anh chị và bạn bè đã luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên em trong suốt quá học tập, nghiên cứu

và hoàn thành đề tài này

Hà Nội, tháng 4 năm 2019

Học viên

Nguyễn Đức Tùng

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CCBu Cao chiết phân đoạn n-buthanol

CTCT Công thức cấu tạo

EGCG Epigallocatechin gallat

EtOAc Ethyl acetat

DPPH 2,2-Diphenyl-1 picrylhydrazyl

HMBC Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple

Bond Connectivity)

HPLC Sắc ký lỏng cao áp (High performance liquid chromatography)

HPLC-MS Sắc ký lỏng khối phổ (High-performance liquid chromatography-mass

MPLC Sắc ký lỏng trung áp (Medium performance liquid chromatography)

TLTK Tài liệu tham khảo

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

UV-VIS Ultraviolet–visible spectroscopy

DANH MỤC CÁC BẢNG

cúc phương

33

phương pháp đo quang

39

phương

39

Bảng 3.15 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của mẫu cao

dicholoromethan

51

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

bước sóng 750,5 nm

37

Hình 3.14 Đồ thị sự phụ thuộc tỉ lệ gốc tự do bị trung hòa theo nồng độ của mẫu cao

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Vị trí phân loại chi Camellia L 3

1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Camellia L 3

1.2.1 Đặc điểm hình thái thực vật chi Camellia L 3

1.2.2 Đặc điểm phân bố chi Camellia L 9

1.3 Thành phần hóa học chi Camellia L 11

1.4 Về tác dụng, công dụng của chi Camellia L 13

1.4.1 Công dụng 13

1.4.2 Tác dụng chống oxy hóa 13

1.5 Một số nét về cây Trà hoa vàng cúc phương (Camellia cucphuongensis) 14

1.5.1 Tên khoa học 14

1.5.2 Đặc điểm hình thái và phân bố 14

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 16

2.1.3 Hóa chất, dung môi 16

2.1.4 Máy móc, thiết bị và dụng cụ 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Giám định tên khoa học và đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu 18

2.2.2 Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp bằng phản ứng hóa học 18

2.2.3 Định lượng polyphenol toàn phần trong lá 22

2.2.4 Chiết xuất, phân lập 2-3 hợp chất từ phân đoạn tiềm năng 25

2.2.5 Nghiên cứu tác dụng sinh học 26

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 Nghiên cứu thực vật học Trà hoa vàng cúc phương 28

3.1.1 Đặc điểm hình thái 28

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu thân 31

3.1.3 Bột lá 32

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 32

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học 32

3.2.2 Định lượng polyphenol toàn phần trong lá 35

3.2.3 Chiết xuất, phân lập 2-3 hợp chất từ phân đoạn tiềm năng 40

3.2.4 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 43

3.3 Kết quả thử tác dụng thu dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao tổng và cao phân đoạn lá Trà hoa vàng cúc phương ở các phân đoạn 49

3.3.1 Đối với mẫu cao ethanol 96% 49

3.3.2 Đối với mẫu cao n-hexan 49

3.3.3 Đối với mẫu cao ethyl acetat 50

3.3.4 Đối với mẫu cao dichloromethan 51

3.3.5 Đối với mẫu cao n-buthanol 52

3.3.6 Đối với mẫu đối chứng dương quercetin 52

PHẦN 4: BÀN LUẬN 54

4.1 Về thực vật 54

4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 55

4.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học 56

KẾT LUẬN 58

5.1 Nghiên cứu về thực vật học của Trà hoa vàng cúc phương 58

5.2 Nghiên cứu thành phần hóa học của lá Trà hoa vàng cúc phương 58

5.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của lá Trà hoa vàng cúc phương bằng phép thử DPPH 58

KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

Tài liệu tiếng Việt 60Tài liệu tiếng Anh 61

Phụ lục 5: Tiêu bản khô cây Trà hoa vàng cúc phương

Phụ lục 6: Bài báo đăng trên Tạp chí Dược học số 03/2019 (Số 515 năm 59), tr 62-67

Phụ lục 7: Ảnh cây Trà hoa vàng cúc phương ở thực địa

Phụ lục 8: Phiếu giám định tên khoa học và chứng nhận lưu mẫu tiêu bản

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trà hoa vàng (Camellia spp.) hay còn gọi là Kim hoa trà – là loài trà có hoa màu vàng thuộc chi Camellia L được xem là một nguồn gen tự nhiên vô cùng quý hiếm [31] Trên thế giới, đặc biệt là Trung Quốc đã có nhiều nghiên cứu chuyên sâu về Trà hoa vàng, đã bào chế thành công nhiều sản phẩm dùng để phòng và chữa bệnh có nguồn gốc từ Trà hoa vàng, mang lại giá trị kinh tế cao Trong lá, hoa của Trà có nhiều thành phần như flavonoid, saponin, polyphenol, acid amin, các nguyên tố vi lượng…mang lại lợi ích to lớn về sức khỏe Các nghiên cứu chỉ ra rằng Trà có tác dụng hạ huyết áp, giảm đường huyết, hạ cholesterol, hạ mỡ máu, chống u bướu, tăng cường hệ miễn dịch và kéo dài tuổi thọ [26], [32], [38] Trong đó, hợp chất polyphenol, đặc biệt là EGCG đang được quan tâm nhiều nhất trong Trà hoa vàng, tập trung chủ yếu vào nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của polyphenol và tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư [38], [51]

Tại Việt Nam cho cho đến nay đã phát hiện 31 loài Camellia L có hoa màu vàng

[12], [24], [36], [44], [45], [46] Trong một chuyến đi thực địa tại vườn quốc gia Cúc Phương, một loài Trà hoa vàng đã được nhóm nghiên cứu phát hiện, loài này đã được

mô tả bởi Lê Hải Ninh và cộng sự [45], loài này mọc tại vườn quốc gia Cúc Phương và

cũng được nhân dân tại đây và các vùng lân cận trồng và thu hái sử dụng rất nhiều Người dân ở đây dùng loài Trà hoa vàng này hãm với nước thay nước uống hàng ngày, theo chia sẻ kinh nghiệm sử dụng của người dân nơi đây sử dụng nước sắc lá Trà hoa vàng còn có các tác dụng như: hạ mỡ máu, hạ huyết áp, phòng chống tai biến, phòng ngừa ung thư, hưng phấn thần kinh, lợi tiểu, giải độc gan và thận, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tăng cường sức đề kháng, chống viêm, chống dị ứng Bên cạnh những chia

sẻ thiết thực của người dân địa phương về tác dụng của Trà hoa vàng tại vườn quốc gia Cúc Phương thì cho đến nay, chưa có bất kì nghiên cứu nào về đặc điểm vi học, thành

phần hóa học và các tác dụng sinh học của Trà hoa vàng tại vườn quốc gia Cúc Phương được thực hiện Do đó, việc nghiên cứu nhằm bổ sung về thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Trà hoa vàng cúc phương là hết sức cần thiết, góp

phần tìm hiểu và khai thác các giá trị của loài Trà hoa vàng này một cách hiệu quả nhất

Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài “Nghiên

cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và đánh giá tác dụng chống oxy hóa in

vitro của lá Trà hoa vàng cúc phương (Camellia cucphuongensis Ninh &

Rosmann)” được thực hiện với các mục tiêu sau:

 Nghiên cứu về thực vật học của Trà hoa vàng cúc phương

 Nghiên cứu thành phần hóa học của lá Trà hoa vàng cúc phương

 Đánh giá tác dụng thu dọn gốc tự do DPPH in vitro của lá Trà hoa vàng cúc

phương

Để thực hiện được mục tiêu trên đề tài triển khai các nội dung như sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học và giám định tên khoa học của Trà hoa vàng cúc phương

2 Định tính một số nhóm chất chính trong lá Trà hoa vàng cúc phương bằng các phản ứng hóa học đặc trưng

3 Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 2-3 chất trong

lá Trà hoa vàng cúc phương

4 Định lượng polyphenol toàn phần trong lá Trà hoa vàng bằng phương pháp

đo quang sử dụng catechin hoặc acid gallic

5 Đánh giá hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH của cao chiết tổng và cao phân đoạn (n-hexan, dichloromethan, ethyl acetat, n-buthanol và ethanol 96%) của lá Trà hoa vàng cúc phương

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1 Vị trí phân loại chi Camellia L

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan [20], vị trí phân loại của chi

Camellia L có thể được tóm tắt như sau:

Giới: Thực vật (Plantae)

Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Sổ (Dilleniidae) Bộ: Chè (Theales) Họ: Chè (Theaceae)

1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Camellia L

1.2.1 Đặc điểm hình thái thực vật chi Camellia L

Cây bụi hoặc cây nhỏ, thường xanh, cành nhẵn hay có lông Lá thường có cuống, đơn, mọc so le, không có lá kèm; chóp lá nhọn, có đầu nhọn hoặc kéo dài thành đuôi; gốc lá hình nêm hẹp, nêm rộng, tròn hay hình tim; mép có răng cưa nhọn hoặc tù Hoa đều, lưỡng tính, kích thước lớn hoặc nhỏ, mọc đơn độc ở nách lá hoặc đầu cành Hoa màu đỏ, trắng hoặc vàng Cuống hoa ngắn hoặc gần như không có cuống Lá bắc 2-10, mọc xoắn trên cuống hoa Cánh hoa 4-19, hợp một phần ở gốc cùng với vòng nhị ngoài Nhị nhiều, dính với nhau ở phía gốc, vòng nhị phía trong rời nhau, chỉ nhị dài Bầu trên, 1-5 ô, vòi nhụy 1-5, dạng sợi, rời hoặc dính nhau; bầu và vòi nhụy nhẵn hay phủ lông mịn Quả nang, hình cầu dẹt hoặc hình trứng, khi khô chẻ ô từ trên xuống thành 3, 4 hay 5 mảnh; có trụ hay không; vỏ quả dày hay mỏng, hóa gỗ Hạt 1 đến nhiều hạt trong mỗi ô, hình cầu, nửa cầu hay hình nêm, vỏ hạt màu nâu, nâu hạt giẻ

nhạt hoặc nâu hồng, phủ lông hay nhẵn [2], [9], [10], [18]

* Đặc điểm thực vật của một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam

Theo mô tả về trong khóa phân loại trong thực vật chí Trung Quốc [43] các đặc điểm chính dùng xác định các loài Trà hoa vàng là hình dạng, kích thước lá, cách mọc của hoa, cuống hoa, số lượng lá bắc, bề mặt lá bắc, đài hoa, tràng hoa, số lượng cánh hoa, cách dính vòi nhụy, bề mặt bầu, bề mặt chỉ nhị… Dưới đây là đặc điểm thực vật

của một số các loài Trà hoa vàng đã được tìm thấy và công bố ở Việt Nam

Camellia tonkinensis (Pit.) Cohen-Stuart - Trà hoa vàng ở Ba Vì là cây gỗ nhỏ,

cao 3-5m, mọc rải rác trong rừng Thân tròn, thẳng, có màu trắng nhờ, cành non và ngọn non có màu nâu đỏ Cây sinh trưởng thường xuyên nhưng tốc độ chậm, có rễ cọc

to và dài, ăn sâu Lá hình trái xoan dài, đầu lá nhọn, lá dài 9,5-14,5 cm, rộng 3,5-5,0

cm, lá đơn mọc cách không có lá kèm, lá non màu nâu đỏ và mọc chúc xuống rất đặc trưng Hệ gân lá nổi cả 2 mặt, có 8- 9 đôi, gân phụ hợp mép; phiến lá dày, cứng và dài, mép lá có răng cưa Cây có hoa màu vàng tươi, hoa lưỡng tính, hoa to, đường kính hoa 6-8cm, hoa nở lâu tàn, có thể duy trì được 8-10 ngày Mùa hoa từ tháng 10 đến tháng

12 Sống trong rừng thứ sinh đang phục hồi, chỉ còn lại ở ven một số khe suối sườn Tây núi Ba Vì, nơi có độ cao 300-500m so với mặt biển [13]

Camellia euphlebia Merr ex Sealy - Trà hoa vàng phân bố tự nhiên tại Sơn

Động (Bắc Giang) là loài cây gỗ nhỏ, vỏ nhẵn màu xám mốc; lá có dạng hình trứng thuôn dài, mép lá có răng cưa dài, mặt trên lá nhẵn bóng, có màu xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, hơi ráp Gốc lá hình nêm hay tù, đầu lá hơi nhọn, lá dài bình quân 9-15 cm, rộng 4-7 cm Mỗi bên lá có 9-12 gân, gân lá hợp cách mép lá 0,2 - 0,6cm; hoa màu vàng tươi, đường kính hoa 5 – 6cm, hoa nở vào tháng 10 đến tháng giêng năm sau; số

lượng hoa trên cây nhiều, hoa mọc ở đầu cành hay nách lá Trà hoa vàng ở Sơn Động

cũng thường mọc ven khe suối, trong rừng thứ sinh nghèo, ở độ cao so với mặt biển là 300- 350m; dưới độ tàn che 0,6-0,7; chiều cao trung bình của rừng là 12,3m [4]

Camellia flava (Pitard) Sealy - Là loài cây gỗ nhỏ, cao 3-8 m Lá hình trứng

hay elip dài 6-15 cm, rộng 3-6 cm, có mũi nhọn dài 1,8cm; gốc lá hình tim; gân bên gồm 5-7 cặp; chất lá mỏng, bóng và dai Hoa màu vàng nhạt, có cuống dài 3-5 mm, có lông Loài Trà hoa vàng này mọc ở các thung lũng ẩm trong rừng thường xanh trên núi

đá vôi ở độ cao 200-400 m (khu vực trung tâm Bống của vườn quốc gia Cúc Phương)

[4]

Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda - Trà vàng lá dày Ninh et Hakoda: Cây

gỗ nhỏ; cao 3-5 m; cành non và già màu nâu, nhẵn Lá có cuống dài 1,7-2,5 cm, không lông, phiến lá hình bầu dục rộng hoặc bầu dục, dài 17,3-25,1 cm, rộng 9,1-13 cm, xanh đậm và láng ở mặt trên, xanh sáng ở mặt dưới, có nhiều điểm tuyến màu đen, lá dày, gốc lá tròn hoặc tim nông, chóp lá tù, mép lá có răng cưa lõm nông, gân bên 8- 9 cặp

Hoa màu vàng, mọc ở đầu cành hoặc nách lá, đường kính khi nở khoảng 4-4,3 cm Cuống hoa dài 3-5 mm, phủ ở trên 2-3 lá bắc con, có lông Lá đài 5, có lông Tràng hoa gồm 9-10 cánh, các cánh bên ngoài có lông mịn ở mặt lưng, các cánh bên trong hình bầu dục thuôn, có lông mịn, hợp với bộ nhị khoảng 2-3 mm ở gốc Bộ nhị nhiều, dài 1,6-1,7 cm, nhẵn, các chỉ nhị bên ngoài hợp với nhau khoảng 5 mm từ gốc và tạo thành ống ngắn Bộ nhụy gồm 3 lá noãn tạo thành bầu 3 ô, nhẵn, vòi nhụy 3, rời, dài khoảng 1 cm Quả hình cầu dẹp, khía 3 rãnh, đường kính 4,5-4,7 cm, cao 2,5- 2,7 cm Quả 3 ô, 1-3 hạt trong mỗi ô, vỏ quả dày 2-3 mm Hạt dài 2,2-2,4 cm, 2-3 mặt, không lông Phân bố ở Tam Đảo – Vĩnh Phúc [12]

Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh – Trà vàng Tam Đảo: Cây bụi hoặc cây

gỗ nhỏ, cao 2 - 4 m, cành non màu nâu nhạt, có lông mịn, cành già nhẵn Lá có cuống, dài 7-9 mm, nhẵn, phiến lá hình bầu dục thuôn hoặc bầu dục rộng, dài 14,0-15,5 cm, rộng 5,0-7,0 cm, mặt trên phiến lá màu xanh đậm, láng, không lông, mặt dưới màu xanh tía đỏ, không lông, có nhiều điểm tuyến màu nâu đen, gốc lá hình nêm hoặc gần tròn, chóp lá có mũi nhọn, mép lá có răng cưa cùn hay nhọn, cách nhau không đều và thưa dần về phía gốc lá, gân bên 7-9 cặp, lõm sâu ở mặt trên và nổi rõ ở mặt dưới Hoa màu vàng, mọc ở đầu cành hoặc nách lá, đường kính khi nở khoảng 3,5-4 cm Cuống hoa dài 5-7 mm Lá bắc 5 Lá đài 5, hình móng hay gần tròn, có lông ở mặt trong và mép Cánh hoa gồm 11-12 cánh, gần tròn, trứng ngược hoặc bầu dục, dài 1,4-2,2 cm,

cả hai mặt đều có lông, các cánh hoa hợp với nhau và với bộ nhị 1-5 mm ở gốc Bộ nhị cao 1,5-1,7 cm, hợp vòng ngoài khoảng 9 mm, chỉ nhị bên trong rời, có lông ở gốc Bộ nhụy gồm 3-4 lá noãn, 3-4 ô, không lông Vòi nhụy 3 hoặc 4, rời, dài khoảng 2,2 cm, không lông Quả hình cầu dẹt, khía 3 rãnh, đường kính 4 cm, cao 2,3 cm Quả 3 ô, 3

hạt trong mỗi ô, vỏ quả dày 2 mm; Hạt có dạng bán cầu hay nêm, dài 1,5-1,7 cm, vỏ

hạt nhẵn Mùa ra hoa: Mùa đông Phân bố: Vĩnh Phúc (VQG Tam Đảo) [12]

Camellia petelotii (Merr.) Sealy - Trà vàng pêtêlô Sealy: Cây bụi hoặc cây gỗ

nhỏ, cao 3-5 m, cành non màu xám nhạt, nhẵn Lá có cuống, dài 1,3-2 cm, lõm phía trên, nhẵn, lá dạng da, dày, hình bầu dục thuôn, đôi khi hình bầu dục hoặc thuôn, dài 13,5-17 cm, rộng 5-6 cm, mặt trên phiến lá màu xanh đậm, mặt dưới xanh sáng với nhiều điểm tuyến màu nâu nhạt, nhẵn, gốc lá hình nêm hoặc nêm rộng, chóp lá có mũi

nhọn, mép lá có răng cưa nhọn nhưng cách nhau không đều, gân bên 10-12 cặp Hoa màu vàng, mọc đơn độc ở đầu các cành non, đường kính khi nở khoảng 4,7 cm Cuống hoa to, dài 1-1,2 cm, trên mang khoảng 9-10 lá bắc con xếp sít nhau, hình vẩy hoặc hình trứng rộng, cao 1,5-3 mm, rộng 3-5 mm, mép và mặt trong có lông Lá đài 5, hình trứng rộng ngược, cao 6-8 mm, rộng 5-9 mm, có lông như ở lá bắc, lá bắc và lá đài tồn tại khi quả chín Cánh hoa gồm 14 cánh, hình trứng rộng ngược, bầu dục, dài 1,7-3 cm, rộng 1,5-1,8 cm cánh hoa bên ngoài có lông mịn màu trắng ở mặt ngoài, tất cả hợp với nhau và với bộ nhị khoảng 8 mm ở gốc Bộ nhị nhiều, cao khoảng 2,3 cm, hợp vòng ngoài khoảng 1,3 cm, chỉ nhị bên trong rời, có lông Bộ nhụy gồm 3 lá noãn hợp thành bầu 3 ô, cao 2-3 mm, không lông, vòi nhụy 3, rời, dài 1,5-2 cm, không lông Quả hình cầu dẹt, đường kính 4-5 cm, cao 2,8-3,2 cm Hạt dài 1-2 cm, có lông Mùa ra hoa: Mùa đông tới đầu mùa xuân năm sau Phân bố: Vĩnh Phúc, VQG Tam Đảo [12]

Camellia phanii Hakoda et Ninh – Trà vàng Phan Cây gỗ nhỏ, cao 4-5 m

Cành nhỏ màu nâu sáng, không lông Lá bầu dục, có cuống dài 1-1,2cm, không lông, gân bên 8-10 cặp Hoa mọc ở đầu cành hoặc nách lá, đường kính khi nở 4,0- 6,0 cm Cuống hoa dài 1-1,5 cm, phủ ngoài bởi 5-6 lá bắc con hình móng, xếp xoắn, có lông ở mép Lá đài 5, hình vẩy đến gần tròn, cao 7 mm, rộng 10-11 mm, mặt trong có lông mịn Lá bắc và lá đài không rụng ở quả Cánh hoa gồm 14-19 cánh, hình trứng rộng,

có lông ở cả hai mặt, các cánh hoa hợp với nhau và với bộ nhị 2-10 mm Bộ nhị nhiều, cao 2,5 cm, hàn liền ở vòng ngoài khoảng 4/5 chiều dài (2 cm) tạo thành ống chỉ nhị, chỉ nhị bên trong rời, có lông Bộ nhụy gồm 3 lá noãn hợp thành bầu 3 ô, không lông Vòi nhụy 3, rời, dài 2,2-2,5 cm, không lông Quả gần hình cầu, 3 ô, 1-4 hạt trong mỗi

ô, Vỏ quả dày 4-5 mm Hạt dài 1-1,8 cm, có lông Phân bố ở Thái Nguyên (Tân Thái, Đại Từ) [12]

Camellia hakodae Ninh - Cây gỗ nhỏ, cao 3-4 m Cành non màu nâu nhạt, nhẵn

Lá có cuống dài 8-15 mm, nhẵn, phiến lá hình bầu dục, bầu dục rộng hoặc thuôn, dài 23,5-29 cm, rộng 9-11,5 cm, xanh đậm và láng ở mặt trên, xanh sáng ở mặt dưới với nhiều điểm tuyến màu đen, cả hai mặt đều không lông, lá dạng da, dày, gốc lá hình nêm hoặc tròn, chóp lá có mũi nhọn, mép lá có răng cưa nhỏ cách đều nhau, hệ gân lõm ở mặt trên và nổi rõ ở mặt dưới, gân bên 12-16 cặp Hoa màu vàng, mọc ở đầu

cành hoặc nách lá, đường kính khi nở khoảng 6-8 cm Cuống hoa dài 1-1,2 cm mang 5-6 lá bắc hình móng hoặc hình vẩy, cao 1-4 mm, rộng 2-7 mm, mép và mặt trong lá bắc có lông Lá đài 5, hình vẩy đến gần tròn, cao 4-6 mm, rộng 7-12 mm, mép và mặt trong có lông Tràng hoa gồm 16-17 cánh, gần tròn đến bầu dục, dài 2-5,3 cm, rộng 2,3-3,5 cm, có lông ở mặt trong và thưa dần ở các cánh bên trong Bộ nhị nhiều, cao 4- 4,5 cm, các chỉ nhị vòng ngoài, dính nhau 1,4-2,1 cm, chỉ nhị bên trong rời, có lông

Bộ nhụy gồm 4 hoặc 5 lá noãn hợp thành bầu 4-5 ô, không lông, vòi nhụy 4 hoặc 5, rời, dài 3,2-3,5 cm, không lông Quả gần dạng cầu, đường kính 5-6 cm, cao 4-4,5 cm, 3-4 hạt trong mỗi ô, vỏ quả dày 4,5- 6,5 mm Hạt dài 2,2 cm, có lông Phân bố: Tam Đảo – Vĩnh Phúc [12]

Camellia hirsuta Hakoda et Ninh - Trà vàng nhiều lông: Cây gỗ nhỏ, cao 4-5

m Cành non phủ đầy lông dài Lá có cuống gần tròn, dài 4-8 mm, có lông dày như ở cành, phiến lá thuôn, dài 16-17,5 cm, rộng 4,7-5,5 cm, mặt trên lá màu xanh đậm, có lông dày trên gân chính phía gốc lá, mặt dưới xanh hơi vàng và có lông, đặc biệt dày hơn trên gân chính, gốc lá hình nêm hoặc tim nông, chóp lá có đuôi dài 1,7-2 cm, mép

lá có răng cưa, gốc lá nguyên, hệ gân rõ, gân bên 10-13 cặp Hoa màu vàng nhạt, mọc đơn độc ở đầu cành non, đường kính khi nở 4-5 cm Cuống hoa dài 5 mm, mang 8-10

lá bắc hình móng, cao 1-3 mm, có lông ở mặt ngoài và mép Lá đài 5-6, gần tròn, cao 4- 6 mm, phủ lông dày ở mặt trong và thưa ở phía ngoài Cánh hoa gồm 9-12 cánh, gần tròn, hình trứng ngược hoặc hình trứng, dài 1,2-3,8 cm, rộng 1,2-2,6 cm, các cánh

có lông ở mép, hợp với nhau 2-9 mm ở gốc Bộ nhị nhiều, cao 2,6 cm, chỉ nhị bên ngoài hợp với nhau khoảng 1,1cm ở gốc, chỉ nhị bên trong rời, có lông dày Bộ nhụy gồm 3 lá noãn tạo thành bầu 3 ô, cao 3 mm, có lông dày đặc, vòi nhụy 3, rời, dài 2,2

cm, có lông thưa khoảng 2 mm ở phần gốc Quả hình cầu, có đường kính 2,5-4,2 cm, cao 2,0-2,8 cm, cuống quả còn mang các lá bắc và lá đài tồn tại, vỏ quả dày 2-3 mm, khi khô nứt thành 3-4 mảnh Hạt dạng bán cầu hay hình nêm, 1,6-1,8 cm, màu nâu, nhẵn Mùa ra hoa: Mùa đông đến xuân Phân bố: VQG Tam Đảo Ngoài ra loài này còn gặp ở Đại Từ, Thái Nguyên [12]

Camellia bugiamapensis Orel, Curry, Luu & Q D - Cây bụi, gỗ nhỏ đến nhỡ

lâu năm, phân cành thưa thớt, cao đến 7 m, đường kính gốc thân cây to đến 20 cm

Chồi non nhẵn, có màu xanh nhạt, sau đó chuyển dần từ xám qua màu nâu, nhẵn Cành trưởng thành đồng màu Cuống lá cong hình lưỡi liềm, ngắn và dày từ 1-1,5(2) cm x 0,3 -0,5 cm, mép có màu xanh nhạt, gần giữa có màu xanh, ở những lá già hơn thì có màu nâu, thỉnh thoảng có thể bần, như một rãnh dài chạy dọc theo trục bên Lá non đang phát triển màu xanh nhạt, rất dễ nhận thấy, trơn nhẵn, dạng elip đến ovan và mép

lá có răng cưa không đều Lá trưởng thành hình elip đến ovan, và elip rộng, kích thước

từ 18-27,5 (29,5) x 12-14(15) cm, mép lá có răng cưa bất thường không đều Hoa dường như hình thuôn, mọc ở tận cùng, đơn độc hoặc mọc theo chùm với 3-5 bông nụ Hoa chín hoặc già cỗi sắp tàn có sự tương phản mạnh mẽ của cách hoa bị bẻ gập ra bên ngoài để lộ phần nhị đực Nụ hoa không nhiều lắm, hình cầu không đồng đều, màu vàng tối với những vẩy nổi Hoa có kích thước 4 x 2(2,5) cm, khi chín nhìn toàn bộ hoa như một cái đấu màu vàng rất đẹp, với 9- 11 cánh hoa nổi bật bởi sự bẻ gập cánh hoa và sắp sếp lộn xộn không đều nhau Nhị đực nhiều màu vàng sáng từ 50-100 Quả chín hình cầu không đều nhau Mùa ra hoa từ tháng 12 đến tháng 2 năm sau Phân bố ở Bình Phước [26]

Camellia capitata Orel, Curry & Luu - Cây bụi, gỗ nhỏ đến nhỡ lâu năm, phân

cành thưa thớt, cao đến 5 m Chồi non nhẵn, có màu xanh nhạt, sau đó chuyển dần từ xám qua màu nâu, nhẵn Cành trưởng thành đồng màu Cuống lá màu xanh đậm, cong hình lưỡi liềm, ngắn và dầy từ 1-1,5(1,8) cm x 0,2-0,4 cm, có lông mịn màu trắng, giữa có một rãnh nông chạy dài chạy dọc theo trục bên Lá trưởng thành hình elip đến ovan, thỉnh thoảng hình thuôn đến hình trứng ngược, kích thước 24-27 cm x 10-12 cm Hoa không cuống, hình tròn, thỉnh thoảng không đều như hình vuông, mọc ở tận cùng, dường như đơn độc, không mùi Hoa già cỗi sắp tàn có sự tương phản mạnh mẽ của cách hoa bị bẻ gập ra bên ngoài; lá bắc hoa dễ nhận thấy Nụ hoa nhiều, hình cầu mọc thành từng cụm theo kiểu dạng tán hình cầu không đồng đều chiều dài hơn rộng; Nụ hoa nhô lên trên đỉnh ban đầu với màu đỏ tối với những đường viền mép màu vàng, muộn một chút sau này sẽ chuyển sang màu hơi hơi đỏ nhạt hơn với sắc tố màu vàng Hoa thất thường, dường như hình vuông đường kính 5-5,5 cm màu vàng nhạt hơi đục,

có lớp sáp nhẹ bên ngoài và hơi cứng Hoa chín với 6 cánh hoa xếp thành 2 vòng, với mép cánh hoa bị bẻ gập bên trong Nhị đực lúc đầu màu vàng sáng, sau đó chuyển sang

nâu sáng có hàng 100 cái dài khoảng 1 cm Mùa ra hoa mới ghi nhận trong tháng 11

Phân bố ở Cát Tiên, Lâm Đồng [26]

1.2.2 Đặc điểm phân bố chi Camellia L

*Trên thế giới

Chi Camellia L có khoảng 280 loài, phân bố chủ yếu ở nhiệt đới và á nhiệt

đới, có nguồn gốc ở khu vực miền đông và miền nam châu Á, từ phía đông dãy Himalaya tới Nhật Bản và Indonesia

- Châu Á: Ấn độ, Bangladesh, Đài Loan, Hàn Quốc, Indonesia, Iran, Malaysia, Myanmar, Nepal, Nhật Bản, Sri-lanka, Trung Quốc, Việt Nam

- Châu Phi: Burundi, Ethiopia, Kenya, Maritius, Nam Phi, Uganda

- Nam Mỹ: Argentina, Brazil, Ecuador, Peru

- Châu Đại Dương: Australia, New-Zeland

- Châu Âu: Thổ Nhĩ Kỳ, Liên xô (cũ)

Ở Trung Quốc, các loài Camellia đã được quan tâm bảo tồn và phát triển từ khá

sớm Đến nay có nhiều trung tâm bảo tồn và nghiên cứu phát triển Trà, trong đó có Trà

hoa vàng Vườn ngân hàng gen Camellia Nam Ninh là nơi lưu giữ bộ sưu tập lớn nhất Trà hoa vàng (Camellia chrysantha M.Sealy) trên thế giới Đây là nơi lưu giữ hơn 20 loài Camellia và 15 thứ trà hoa vàng (Camellia chrysantha M.Sealy) nhằm bảo tồn,

nghiên cứu, lai tạo giống và nghiên cứu về trồng trọt Tại đây, có 3000 cá thể được lưu

giữ, từ đó tạo ra 7000 dòng lai từ cây bố mẹ là Trà hoa vàng (Camellia chrysantha M.Sealy) và các loài khác trong chi Camellia L Có 6 loài trong bộ sưu tập được thu

từ Việt Nam, gồm: C chrysantha M.Sealy, C ptilosperma S Ye Liang & Q T Chen,

C tunghinensis H.T Chang, C murauchii Ninh & Hakoda, C impressinervis Hung T

Chang & S Ye Liang và C amplexicaulis (Pitard) Cohen-Stuart Ngoài ra, còn nhiều vườn khác lưu giữ các loài và giống Camellia, bao gồm: Guilin Botanic Garden Yanshan - Quảng Tây (20 loài); The Jinhua International Camellia Species Garden - Chiết Giang (25 loài); The Fangcheng Golden Camellia Nature Reserve and Gene

Bank - Quảng Tây (28 loài và giống Trà hoa vàng); Kunming Institute of Botany - Vân

Nam (25 loài, trong đó có 8 loài từ Việt Nam), bao gồm: C crassiphylla Ninh & Hakoda; C cucphuongensis Ninh & Rosmann; C hakodae.M.Sealy; C rosmannii

Ninh; C vidalii J.C.Rosmann; C dongnaiensis Orel; C luteocerata Orel; C inusitata

Orel, Curry & Luu [12]

*Ở Việt Nam

Việt Nam được các nhà khoa học xác định nằm trong trung tâm đa dạng sinh

học của các loài Trà Đến nay đã xác định có 61 loài Camellia L., thuộc các nhóm: Trà, Hải đường, Trà mi, Sở (Trà dầu), trong đó có 30 loài Camellia L có hoa màu

vàng [12], [24], [36], [46] (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Danh mục các loài Camellia L có hoa vàng ở Việt Nam

1 Camellia aurea Hung T Chang Trà hoa vàng kim VN

2 Camellia crassiphylla Ninh & Hakoda Trà hoa vàng lá dày VN

3 Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann Trà hoa vàng cúc phương VN

4 Camellia dalatensis Luong, Tran & Hakoda Trà hoa vàng đà lạt VN

5 Camellia dilinhensis Ninh & V.D.Luong Trà hoa vàng di linh VN

6 Camellia dormoyana (Pierre) Sealy Trà hoa vàng đo môi VN

7 Camellia euphlebia M.Sealy Trà hoa vàng tiên yên VN, TQ

8 Camellia flava (Pit.) Sealy Trà hoa vàng nhạt VN

9 Camellia chrysantha (Hu) Tuyama Trà hoa vàng VN, TQ

10 Camellia gilbertii (A Chev ex Gagnep.)

11 Camellia hakodae Ninh Trà hoa vàng hako VN

12 Camellia hamyenensis M.Sealy Trà hoa vàng hàm yên VN

13 Camellia hirsute Hakoda & N.Tran Trà hoa vàng nhiều lông VN

14 Camellia huulungensis Rosmann & Ninh Trà hoa vàng hữu lũng VN

15 Camellia impressinervis Hung T Chang & S

16 Camellia kirinoi Ninh Trà hoa vàng kiri VN

17 Camellia limonia C.F.Liang & S.L.Mo Trà hoa vàng da cam VN, TQ

18 Camellia murauchii Ninh & Hakoda Trà hoa vàng murô VN

Ninh

20 Camellia petelotii (Merr.) Sealy Trà hoa vàng petelot VN

21 Camellia phanii Hakoda et Ninh Trà hoa vàng phan VN

22 Camellia quephongensis Hakoda et Ninh Trà hoa vàng quế phong VN

23 Camellia rosmannii Ninh Trà hoa vàng yên tử VN

24 Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda Trà hoa vàng tam đảo VN

25 Camellia thanxaensis Hakoda & Kirino Trà hoa vàng thần sa VN

26 Camellia tonkinensis (Pit.) Cohen-Stuart Trà hoa vàng bắc bộ VN

27 Camellia tienii Ninh Hải đường hoa vàng VN

28 Camellia vuquangensis Luong, Tran & L T

29 Camellia hatinhensis Luong, Tran & L T

30 Camellia velutina V T Pham, V D Luong

31 Camellia pukhangensis D N Do, D V

1.3 Thành phần hóa học chi Camellia L

Quá trình nghiên cứu về Trà trên thế giới đã được thực hiện từ rất lâu và các thành phần hóa học của lá Trà đã được mô tả tương đối đầy đủ [34] Các kết quả nghiên cứu cho thấy trong Trà có khoảng 120-130 hoạt chất khác nhau, sắp xếp thành các nhóm: nhóm đường; nhóm pectin; nhóm tinh dầu; protein và acid amin; các sắc tố; các chất vô cơ; vitamin; các enzym; chất nhựa; các chất hữu cơ; polyphenol, tanin, flavonoid [7], [17], [39], [48] Trong đó, nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong lá Trà Các polyphenol này chiếm 20 - 35 % trọng lượng trà khô (ở lá búp non) [27]

Đặc điểm chung của polyphenol là trong phân tử có vòng thơm mang một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH) gắn trực tiếp vào vòng benzen Tuỳ thuộc vào số lượng và

vị trí tương hỗ của các nhóm này mà các tính chất lý hoá học thay đổi Thành phần polyphenol của lá Trà rất đa dạng, bao gồm chủ yếu là các flavonoid và tanin

Các hợp chất polyphenol của lá Trà rất khác với các hợp chất polyphenol được tìm thấy trong các loại cây khác Trong đó chiếm đa số là các catechin (catechin (C), epigallocatechin (EGC), gallocatechin (GC), epigallocatechin gallat (EGCG), epicatechin (EC), epicatechin gallat (ECG)…) Ngoài ra trong thành phần polyphenol của Trà còn có một số chất khác với tỉ lệ thấp như các flavonol 12 (quercetin, kaempferol, rutin…), các dẫn xuất glucosid như myricetin-3-glucosid, kaempferol 3-glucosid, myricetin-3–rhamnoglucosid, quercetin-3- hamnoglucosid …[28]

Nhóm hợp chất catechin trong Trà đã được quan tâm nghiên cứu trong thời gian dài [34] Catechin của trà thuộc họ flavonoid, nhóm flavan-3-ol Hàm lượng catechin trong búp trà cao nhất đạt đến khoảng 30% trọng lượng khô Trong các hợp chất catechin được tìm thấy trong Trà xanh, thành phần gallate chiếm đa số (trên 80% tổng catechin) EGCG là thành phần đặc trưng của Trà, có thể chiếm đến 50% tổng khối lượng các hợp chất catechin và khoảng 10% tổng khối lượng khô của trà, tiếp theo là EGC và ECG (chiếm khoảng 10 - 20% tổng catechin) [42] Các hợp chất catechin (C,

EC, GC) còn lại có hàm lượng thấp và không phải là thành phần đặc trưng của trà do

còn được tìm thấy trong Cacao (Theoboma cacao), Nho (Vitis), Táo (Rhamnaceae), Hành (Allium)…

Gần đây, cũng đã có rất nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học được thực hiện trên Trà hoa vàng Nghiên cứu của Song và các cộng sự đã xác định được hàm lượng của polyphenol toàn phần, proanthocyanidin, tanin và flavonoid từ dịch chiết aceton/

EtOH/ nước của 6 mẫu Trà hoa vàng: C impressinervis, C euphlebia, C microcarpa,

C nitidissima, C tunghinensis, C chrysantha bằng phương pháp HPLC và

LC–ESI-MS Nghiên cứu cho thấy các thành phần hóa học trong lá Trà hoa vàng có sự khác biệt rõ rệt so với Trà hoa trắng được báo cáo là rất giàu catechin, bao gồm epigallocatechin gallate (EGCG), epigallocatechin (EGC), epicatechin gallate (ECG), gallocatechin (GC), epicatechin (EC), và catechin [41]

1.4 Về tác dụng, công dụng của chi Camellia L

1.4.1 Công dụng

Trà xanh (Camellia sinensis) đã được sử dụng như là một phương thuốc trong y

học phương đông từ rất lâu Nhiều nghiên cứu chi tiết về Trà đã chỉ ra rằng những tác dụng về mặt dược lý của trà là do sự có mặt rất nhiều của các nhóm hợp chất catechin trong Trà Nhiều công trình đã công bố về tác dụng của Trà và các chất chiết từ Trà lên nhiều bệnh khác nhau như các bệnh ung thư, bệnh về đường tim mạch, bệnh tiểu đường, bệnh Alzheimer, bệnh Parkison, bệnh béo phì, bệnh sỏi thận, bệnh về đường tiêu hóa, bệnh răng miệng… Ngoài ra, Trà còn có tác dụng giảm hàm lượng cholesterol, làm giảm sự nhiễm độc do kim loại, do phóng xạ…[26], [27], [32], [38]

Theo quan niệm của Đông y, Trà (Camellia sinensis) có vị đắng, chát, hơi ngọt,

tính mát, vào kinh can thận, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, kích thích tiêu hóa, lợi tiểu Dùng trong các trường hợp tâm thần mệt mỏi, ngủ nhiều, đau đầu, mắt mờ, sốt, khát nước, ngộ độc rượu [17]

Theo tài liệu Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam [17], Trà (Camellia

sinensis) có tác dụng: chống đái tháo đường, làm tiêu hao năng lượng, chống oxy hóa,

kích thích thần kinh, kích thích não, tăng cường sức làm việc của trí não, tăng cường

và điều hoà nhịp tim, lợi tiểu và kích thích ăn ngon

Ngoài ra, một số giống Trà còn được dùng làm cây cảnh do lá cây thường xanh

và có hoa màu vàng, trắng, đỏ rất đẹp

1.4.2 Tác dụng chống oxy hóa

Có nhiều nghiên cứu đã khẳng định hoạt tính chống oxy hóa chính của Trà xanh

(Camellia sinensis) là do hoạt tính của các hợp chất polyphenol [41] Khi thực hiện

đánh giá tác dụng chống oxy hóa (antioxidant) của lá Trà xanh Việt Nam theo khả năng bảo quản dầu hạt cải, các polyphenol thể hiện hoạt tính vượt trội so với các chất chống oxy hóa đối chứng như vitamin C, vitamin E [3]

Hoạt tính chống oxy hóa của các catechin trong trà, tính theo tỷ lệ mol, trong thử nghiệm chống lại sự hình thành các gốc tự do DPPH trong dung dịch nước được xếp theo trật tự giảm dần như sau: epicatechin gallat ≈ epigallocatechin gallat > epigallocatechin > acid gallic > epicatechin ≈ catechin [40] Với hàm lượng catechin

tổng chiếm khoảng 30% khối lượng khô, trà và dịch chiết trà cũng thể hiện tính chống oxy hóa rất mạnh trong các thử nghiệm, kết quả tính toán cho thấy thành phần catechin đóng góp khoảng 70-80% khả năng chống oxy hóa của trà [40]

Gần đây, nhiều nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của Trà hoa vàng đã được thực hiện Lixia Song và cộng sự đã tiến hành đánh giá khả năng chống oxy hóa của polyphenol trong 6 mẫu trà hoa vàng thu hái ở Trung Quốc theo mô hình DPPH, được phân tích bằng phương pháp HPLC cho thấy có phản ứng rõ rệt giữa các thành phần catechin trong trà với DPPH thể hiện rõ khi mà các đỉnh tương ứng tồn tại trong sắc ký

đồ ban đầu của các chiết xuất ban đầu biến mất sau khi thêm DPPH [49]

1.5 Một số nét về cây Trà hoa vàng cúc phương (Camellia cucphuongensis)

1.5.1 Tên khoa học

Cây Trà hoa vàng mọc tại vườn quốc gia Cúc Phương, có tên khoa học là

[Camellia cucphuongensis Tran Ninh & J.C Rosmann] thuộc họ Chè (Theaceae) [13]

1.5.2 Đặc điểm hình thái và phân bố

Cây gỗ nhỏ, cao 3-6m Lá hình bầu dục dài 6-12cm, rộng 2,5-4,5 cm; đỉnh lá nhọn dài khoảng 1,5cm; gốc lá tròn hay hình nêm rộng; chất lá dày, bóng và dai; gân bên 7-9 cặp Hoa màu vàng nhạt, có cuống dài 5-7 mm, có lông Mùa hoa kéo dài từ tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau [13]

Sinh thái

Trà hoa vàng ở vườn quốc gia Cúc Phương thường mọc trong trạng thái rừng

giàu được bảo vệ nghiêm ngặt; chiều cao trung bình của rừng là 15,9m, độ tàn che là 0,73% Trà hòa vàng tại vườn quốc gia Cúc Phương là cây tầng dưới, chiều cao trung bình là 1,63m, đường kính gốc trung bình là 2,35cm Số lượng cây trong trung bình mỗi ha có 320 cây

Thành phần cây bụi với chiều cao trung bình là 1,47m Thảm tươi có thành

zerumbet), Ráy (Alocasia), Thiên niên kiện (Homalomena occulta)…, với chiều cao

trung bình là 0,8m Kết quả điều tra cho thấy Trà hoa vàng ở vườn quốc gia Cúc Phương thường mọc cùng các loài Bứa (G oblongifolia), Cà lồ (C tonkinensis), Gội

(Aglaia), Mạy tèo (Dimerocarpus brenieri), Re (Lauraceae), Sảng (Sterculia

coccinea), Vàng anh (Saraca dives)

Trà hoa vàng ở vườn Quốc gia Cúc Phương sống trong điều kiện khí hậu có

là 1856 mm, lượng mưa lớn hơn lượng bốc hơi

Trà hoa vàng ở vườn Quốc gia Cúc Phương mọc trên đất thịt nhẹ đến thịt trung

bình, độ sâu tầng đất tới 60 cm, đất tầng mặt tương đối xốp, có màu nâu hoặc xám đen

tỉ lệ đá lẫn 10-15%, đất ẩm và chuyển lớp rõ, đất có độ pH là 5,83-5,86 hơi chua, hàm

12,7-14,2 tương đối khá; lượng kali khá từ 8,5-15,1 [10]

Trà hoa vàng ở vườn Quốc gia Cúc Phương có khả năng tái sinh tốt; tái sinh chồi và hạt có tỷ lệ cao

Phân bố: chủ yếu tại vườn Quốc gia Cúc Phương, các vùng lân cận và trong

dân gian

* Ngoài các đặc điểm đã được mô tả ở trên, thì chưa có bất kì nghiên cứu nào về tiêu chuẩn vi học, thành phần hoá học cũng như các tác dụng sinh học có lợi của Trà hoa vàng cúc phương; vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này để góp phần tìm hiểu và khai thác các giá trị của loài Trà hoa vàng này một cách hữu hiệu nhất

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

+ Mẫu để nghiên cứu đặc điểm vi học: mẫu tươi cành, lá được xử lý ngâm trong cồn 60°; mẫu thân lá phơi khô được nghiền mịn

+ Mẫu để nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học: mẫu lá tươi, làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ 50°C, tán thành bột thô, bảo quản trong túi nylon, trong nơi khô, mát

- Tiêu bản thực vật khô Trà hoa vàng cúc phương có cuống lá ngắn, có lông tơ, lá thuôn dài hoặc hình bầu dục, hoa và quả đang được lưu giữ tại Bảo tàng Sinh học, khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với mã số tiêu bản HNU 024061

- Phân tích và chụp ảnh cây, hoa, quả bằng máy ảnh kỹ thuật số Nikon D300s, raynox 250 Kính hiển vi Leica DM500

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

2.1.3 Hóa chất, dung môi

- Các dung môi dùng trong chiết xuất phân lập đạt tiêu chuẩn công nghiệp:

- Các dung môi hóa chất dùng trong phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V

- Thuốc thử dùng trong nghiên cứu định tính: Mayer, Dragendorff, Bouchardat,

natri nitroprussiat, ninhydrin 3%, dung dịch vanillin 10% trong acid sulphuric

- Các chất đối chiếu: Quercetin dihydrate 98% (Sigma), Gallic acid 97,5-102,5% (Sigma)

2.1.4 Máy móc, thiết bị và dụng cụ

- Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột: silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Merck); silica gel pha đảo YMC (0,030 – 0,050mm, Công ty trách nhiệm hữu hạn hóa chất FuJisilisa, Nhật), MCI gel (75-150 µm, 400-600 Ao Pore size, Mitsubishi), sephadex TM LH-20 (Amersham Bioscience, Uppsala, Thụy Sỹ)

- Dụng cụ thủy tinh: Cột thủy tinh các loại, pipet, bình định mức, ống nghiệm, bình cầu, cốc có mỏ, ống đong, phễu thủy tinh, ống đựng mẫu NMR…

- Máy cất quay Rotavapor R-220, rotavapor R-200 (Buchi)

- Đèn soi tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR

- Tủ sấy Memmert, binder-FD115

- Máy siêu âm Power sonic 405

- Máy đo điểm chảy Gallenkamp (Sanyo, Nhật Bản)

- Độ quay cực (optical rotation) được đo bằng máy Jasco V-550 UV/Vis spectrometer (Tokyo, Japan)

- Phổ CD được đo trên hệ thống máy Chiralscan Applied photophysics Ltd (Surey, UK)

- Máy đo phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) Agilent 1100 LC-MSD Trap

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM500 FT-NMR Chất nội chuẩn tetramethyl silan

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Giám định tên khoa học và đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu

- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng và phát

triển của cây tại thực địa

- Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu theo phương pháp mô tả phân tích [1], [6] Các đặc điểm chính được mô tả thuộc các nhóm: Dạng sống, thân, lá, hoa, quả, hạt

- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cành, lá, quả và lưu giữ tiêu bản

- Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích đặc điếm hình thái thực

vật, so sánh với các khóa phân loại của chi Camellia L dưới sự hướng dẫn của Ths

Nguyễn Anh Đức (Cán bộ phụ trách Bảo tàng Thực vật – Trường Đại học Khoc học

Tự nhiên) Tên khoa học được xác định theo phương pháp so sánh hình thái, dựa trên khóa phân loại và mô tả loài trong các tài liệu thực vật trong nước và quốc tế, đặc biệt

bộ khóa phân loại chi Camellia L của nhóm tác giả Trần Ninh - Hakoda và Thực vật

chí Trung Quốc [12], [43]

- Nghiên cứu đặc điểm vi học: cắt, làm tiêu bản vi phẫu và soi bột lá, thân Quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh tiêu bản dưới kính hiển vi [15]

2.2.2 Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp bằng phản ứng hóa học

Tiến hành định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho từng nhóm chất theo tài liệu [11], [15]

2.2.2.1 Định tính các hợp chất trong dịch chiết ether dầu hỏa

Cân khoảng 10g bột dược liệu vào túi lọc đã chuẩn bị sẵn rồi cho vào bình chiết Shoxhlet Chiết hồi lưu trên bếp cách thủy với dung môi là ether dầu hỏa trong 3 giờ, thu được dịch lọc

* Định tính chất béo

Nhỏ vài giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ khô thấy để lại vết mờ trên giấy thì phản ứng dương tính

* Định tính caroten

Cho 5 ml dịch chiết vào ống nghiệm, cô trên bếp cách thủy đến cắn Nhỏ vào vài giọt acid sulfuric đặc; nếu thấy xuất hiện màu xanh ve thì phản ứng dương tính

* Định tính sterol

- Phản ứng Liebermann – Burchardt:

giọt acid sulfuric đặc

+ Cách thử: lấy 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào vài giọt thuốc thử đã pha ở trên; nếu thấy xuất hiện màu xanh lục, hồng, cam, đỏ và màu bền là phản ứng dương tính

2.2.2.2 Định tính dịch chiết cồn

Cân 20g bột dược liệu, ngâm với ethanol 96% trong 3 ngày Lấy 15 ml dịch chiết, pha loãng với 20 ml ethanol 96% thu được dịch chiết cồn để làm phản ứng

* Định tính flavonoid

- Phản ứng với kiềm: cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm vài giọt

dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng thêm

- Phản ứng Cyanidin: cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một ít

bột magie kim loại, rồi nhỏ từ từ 4-5 giọt acid HCl đặc Đun nóng trên bếp cách thủy sau vài phút nếu xuất hiện màu tím đỏ thì phản ứng dương tính

phản ứng dương tính

- Phản ứng Diazo hóa: cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, kiềm hóa

bằng NaOH 10%, thêm vài giọt thuốc thử Diazoni, lắc đều, đun cách thủy vài phút Phản ứng dương tính khi dung dịch xuất hiện màu đỏ gạch

* Định tính saponin

- Quan sát hiện tượng tạo bọt: cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm,

thêm 2 ml nước cất Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc trong 5 phút, để yên và quan sát Phản ứng dương tính khi bọt bền sau 10 phút

- Phản ứng Salkowski: cho 5 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, bốc hơi đến

cắn Hòa tan cắn bằng 2 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 1 ml cloroform Dùng

vòng màu đỏ tím, lắc nhẹ dung dịch có màu đỏ thì phản ứng dương tính

- Phản ứng ninhydrin: cho 3 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm vài

giọt thuốc thử ninhydrin 0,5%, đun sôi trong 2 phút Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu tím

* Định tính glycosid tim

Lấy 15 ml dịch chiết cồn cho vào bình nón, thêm vào 4 ml chì acetat 30%, khuấy đều Lọc bằng giấy lọc để loại tủa, thử dịch lọc vẫn còn tủa với chì acetat, cho thêm 1 ml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy và lọc lại tiếp tục thử thấy dịch chiết không còn tủa với chì acetat Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn, lắc kỹ với cloroform (3 lần, mỗi lần 5 ml), gạn lấy lớp cloroform cho vào ống nghiệm lớn khô sạch Loại bỏ

- Phản ứng Baljet: hòa tan cắn trong ống nghiệm 2 bằng 2 ml ethanol 90%, lắc

đều, nhỏ từ từ thuốc thử Baljet mới pha, nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính

-Phản ứng Legal: hòa tan cắn trong 2 ml ethanol 90%, lắc kỹ Nhỏ vào 1 giọt

thuốc thử Natri nitroprussiat 1% và 2 giọt đung dịch NaOH 10% Lắc đều thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính

- Phản ứng Keller – Kiliani: hòa tan cắn trong 2 ml ethanol 90%, lắc đều đến khi

* Định tính acid hữu cơ

dương tính khi xuất hiện bọt khí

* Định tính đường khử

Cho 1 ml dịch lọc vào một ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy 10 phút Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa

* Định tính tanin

xanh nâu nhạt

- Phản ứng với dung dịch chì acetat 10%: cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm

2 giọt chì acetat 10% Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa bông

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 5

giọt dung dịch gelatin 1% Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng

2.2.2.4 Định tính khác

* Định tính alcaloid

Đun cách thuỷ 30 phút Để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH base (thử bằng giấy quỳ) Chiết alcaloid base bằng cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5 ml) Gộp các dịch chiết cloroform

acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 2 ml, để làm các phản ứng sau:

- Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy

xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính

- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat,

nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính

- Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Dragendorff,

nếu thấy xuất hiện kết tủa da cam thì phản ứng dương tính

* Định tính anthranoid

nguồn nhiệt đến sôi Lọc nóng thu được dịch lọc, để nguội Chiết với 5 ml cloroform, thu lấy phần cloroform để làm phản ứng

- Phản ứng Borntraeger: lấy 1 ml dịch cloroform cho vào một ống nghiệm, thêm 1

ml dung dịch amoniac Lắc nhẹ thấy lớp nước có màu đỏ sim thì phản ứng dương tính

2.2.3 Định lượng polyphenol toàn phần trong lá

Tiến hành định lượng polyphenol toàn phần như tài liệu [11] như sau:

Chuẩn bị mẫu

Dung dịch mẫu chuẩn: Cân 25,0 mg acid galic vào BĐM 25 ml, thêm nước vào

hòa tan và thêm vừa đủ đến vạch (dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1000 µg/ml) Các dung dịch chuẩn khác được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc trong nước đến các nồng độ thích hợp (200 μg/ml, 400 μg/ml, 600 μg/ml,

800 μg/ml, 1000 μg/ml)

Dung dịch mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1,0 g bột dược liệu, cho vào bình

Để nguội, lọc, định mức đến vạch Hút 3 ml dịch lọc vào BĐM 10 ml, thêm MeOH 70% đến vạch được dung dịch mẫu thử

Dung dịch đo quang: Hút lần lượt 100 µl mỗi dung dịch chuẩn/dung dịch

thử/dung môi pha mẫu vào các bình định mức 10 ml đã đánh số thứ tự, sau đó thêm lần lượt 200 µl thuốc thử Folin-Ciocalteau và 1,8 ml nước cất vào mỗi bình, lắc kỹ và

đều, ủ tại nhiệt độ phòng 60 phút, sau đó đem đo độ hấp thụ quang tại cực đại hấp thụ quang đã khảo sát (750,5 nm)

Khảo sát cực đại hấp thụ quang:

Do các polyphenol có các nối đôi, nhất là nối đôi liên hợp nên chỉ hấp thụ tử ngoại ở vùng sóng ngắn 195-210 nm Vì vậy để định lượng được polyphenol bằng phương pháp đo quang, chúng tôi tiến hành phản ứng oxy hóa giữa polyphenol

Sau đó quét phổ trên máy đo quang phổ trong khoảng bước sóng từ 300-800 nm Cuvet thạch anh l=1 cm Dung dịch so sánh là mẫu trắng được làm song song với mẫu thử, chỉ không chứa chất nghiên cứu

Thẩm định và đánh giá phương pháp

Xác định khoảng nồng độ tuyến tính

Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định, được biểu thị bằng phương trình y = ax + b và hệ thống tương quan tuyến tính R

và bổ sung nước cất đến vạch Lắc đều, ủ tại nhiệt độ phòng 60 phút, sau đó đem

đo độ hấp thụ quang tại 750,5 nm

+ Mẫu trắng được chuẩn bị song song, chỉ không chứa chất chuẩn

- Yêu cầu đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan r2

≥ 0,99 [47]

Độ lặp lại của phương pháp

Tiến hành định lượng lặp lại 6 lần mẫu thử theo quy trình:

- Cân chính xác khoảng 1,0 g bột dược liệu, cho vào bình tam giác có nhám,

định mức đến vạch Hút 3 ml dịch lọc vào BĐM 10 ml, thêm MeOH 70% đến vạch

- Hút chính xác 100 µl dung dịch thử ở trên, sau đó thêm lần lượt 200µl thuốc thử Folin-Ciocalteau và 1,8ml nước cất vào mỗi bình, lắc kỹ và để yên 5 phút Tiếp tục

60 phút, sau đó đem đo độ hấp thụ quang tại 750,5 nm, đo 3 lần lấy giá trị trung bình

- Mẫu trắng được chuẩn bị song song, chỉ không chứa dung dịch thử

- Xác định kết quả định lượng tiến hành trong cùng điều kiện

- Tính độ lặp lại

Độ thu hồi

Để xác định độ thu hồi, thực hiện với một dung dịch mẫu đối chiếu acid gallic có nồng độ chính xác 510 µg/ml, thêm lượng acid gallic chính xác 100 µg/ml vào dung dịch trên Sau đó tiến hành đo quang, lặp lại 6 lần

Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):

Để xác định LOD và LOQ, tiến hành chuẩn bị các dung dịch mẫu trắng bằng cách lấy 10 bình định mức cỡ 10ml, cho vào mỗi bình chứa sẵn 1,8 ml nước cất hai lần + 200 µl thuốc thử Folin-Ciocalteau, lắc kỹ, để yên 5 phút Sau đó thêm 4 ml dung

đem các dung dịch trên đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 750,5 nm

LOD= 3x LOQ=10x

Định lượng các mẫu cao chiết

Tiến hành như mô tả ở trên Nồng độ dung dịch đo quang của mẫu thử được tính theo công thức

C = Y-b x H (μg/ml)

Trong đó: a, b: hệ số của phương trình đường chuẩn của acid gallic

Y là độ hấp thụ quang của dung dịch đo quang của mẫu thử ở bước sóng 750,5 nm

H: độ tinh khiết của chất chuẩn (%) Hàm lượng polyphenol toàn phần có trong dược liệu được tính theo công thức:

C: nồng độ dung dịch đo quang của mẫu thử (µg/ml)

V: Thể tích dung môi chiết (V=100 ml)

K: Hệ số pha loãng (K= 1000/3)

a: Độ ẩm dược liệu (%)

2.2.4 Chiết xuất, phân lập 2-3 hợp chất từ phân đoạn tiềm năng

Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết hồi lưu với ethanol 96% Gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao cồn 96%

Cao cồn 96% được phân tán trong nước nóng, chiết lỏng – lỏng với các dung

môi có độ phân cực tăng dần: dichloromethan, ethyl acetat, n-buthanol Dịch chiết của

từng phân đoạn được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được các cao phân đoạn tương ứng: cao dichloromethan, cao ethyl acetat, cao buthanol

Định tính các phân đoạn đã thu được ở trên để lựa chọn phân đoạn giàu flavonoid cho nghiên cứu hóa học tiếp theo Từ phân đoạn đã lựa chọn, tiến hành phân lập các hợp chất

- Phân lập các hợp chất bằng các phương pháp sắc ký cột hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký cột rây phân tử [15]

- Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng [15], quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử vanillin 10%

- Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được xác định dựa trên phổ cộng

hưởng từ hạt nhân, phổ khối…

2.2.5 Nghiên cứu tác dụng sinh học

* Thử tác dụng chống oxy hóa cao chiết ethanol 96% và các phân đoạn của

lá Trà hoa vàng cúc phương bằng phép thử DPPH

2.2.5.1 Chuẩn bị mẫu

* Đối với cao dược liệu

Cân chính xác khoảng 20 mg cao tổng hoặc phân đoạn vào ống eppendorf Hòa tan lượng cao với 1ml methanol Tiến hành pha loãng thành các dãy dung dịch có nồng độ từ 15 µg/ml đến 5000 µg/ml trong methanol

* Đối với chất đối chiếu dương

Cân chính xác khoảng 5 mg quercetin vào bình định mức 5 ml Tiến hành hòa tan và định mức bằng methanol thu được dung dịch chuẩn ban đầu có nồng độ khoảng

1 mg/ml Tiến hành pha loãng bằng methanol thu được dãy dung dịch chuẩn có nồng

Chuẩn bị thuốc thử DPPH: cân chính xác khoảng 8 mg DPPH vào bình định

mức 100 ml, hòa tan và định mức đến vạch bằng MeOH để thu được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 0,2 mM DPPH

Thí nghiệm:

Tiến hành thí nghiệm trên đĩa 96 giếng Thử nghiệm sau đây được thực hiện đối với mỗi nồng độ của mẫu thử:

Giếng methanol: hút chính xác 100 µl methanol

Giếng mẫu thử + methanol: hút chính xác 90µl methanol+ 10µl dung dịch thử Giếng mẫu thử + DPPH: hút chính xác 90µl DPPH + 10µl dung dịch thử Giếng DPPH + methanol: hút 90µl DPPH + 10µl methanol

Để phản ứng 15 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối

Đo độ hấp thụ quang trên máy đọc ELISA ở bước sóng 517 nm

% ức chế phản ứng ở từng nồng độ được tính bằng công thức

% ức chế DPPH

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu thực vật học Trà hoa vàng cúc phương

3.1.1 Đặc điểm hình thái

Hình 3.1 Ảnh chụp cây và một số bộ phận của Trà hoa vàng cúc phương

A Cành, lá và hoa; B Hoa và nụ; C, H Nhị hoa và bao phấn;

Đặc điểm hình thái

Camellia cucphuongensis là loài cây gỗ nhỏ hoặc bụi, cao 3-6 m Cành non màu

nâu nhạt, có lông thưa, cành già màu nâu sẫm, thân nhẵn nhụi (A) Cuống lá dài 2,5 - 5

mm, có lông tơ (L) Lá thuôn đến hình bầu dục hẹp, kích thước 6-15 x 2,7–4,5 cm, mặt

trên màu xanh đậm, không lông, mặt dưới nhạt hơn và có lông thưa; chóp lá có đuôi dài dài khoảng 1,2-1,5 cm, hoặc có mũi nhọn (K); gốc lá gần tròn đến nêm rộng, đôi

khi gần giống hình tim; chất lá dày, bóng và dai; gân bên 7-9 cặp; mép lá có răng cưa thưa, dày, nông và cách đều nhau Hoa mọc ở đầu cành, đơn độc, màu vàng nhạt,

đường kính 4,5 – 5 cm; cuống hoa dài 5-7 mm Lá bắc 5-6, hình trứng, dạng vảy, kích

thước 0,1-0,3 x 0,2-0,4 cm (B) Lá đài có 8 – 9 cánh hình trứng rộng, dạng vảy, kích

thước 0,4–1,0 x 0,6-1,2 cm, có lông mịn Cánh hoa 13 – 15 cánh hình trứng ngược, bầu dục hoặc bầu dục thuôn, kích thước 1,8 – 2,5 x 1,5 - 2,2 cm, có lông, đỉnh tròn

(E) Bộ nhị dài 0,8 – 2,4 cm, hợp vòng ngoài, chỉ nhị bên trong rời, có lông mịn; bao

phấn dài khoảng 2 mm (C, H) Bộ nhụy gồm 5 lá noãn hợp thành bầu trên 5 ô, có lông

tơ (G); vòi nhụy 5, rời, dài 2,5 cm, đầu nhụy dài 4 mm (D, F) Quả hình cầu, đường

kính 3,8 cm, quả khô có màu nâu gỗ hơi đen, 5 ô; vỏ quả dày, có lông Hạt 6 – 8 trong

mỗi ô, hạt có dạng nêm, dài 1,2 – 1,4 cm (I, J)

Mùa hoa kéo dài từ tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau Loài này ưa ẩm mọc trong các thung lũng của rừng nhiệt đới ở độ cao 300-400 m (khu vực gần hồ Mạc thuộc vườn Quốc gia Cúc Phương)

Qua phân tích các đặc điểm hình thái mẫu cây Trà hoa vàng cúc phương (hình

3.1), cùng với việc tham khảo [12], [44], [45], chúng tôi nhận thấy có sự tương đồng

và trùng khớp các cơ quan dinh dưỡng và sinh sản của mẫu nghiên cứu với loài

Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann, do đó có thể nhận định đây là loài Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann thuộc chi Camellia L., họ Chè

(Theaceae)

Đặc điểm vi phẫu lá

Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi thấy các đặc điểm sau (Hình 3.2):

Mặt cắt ngang phiến lá gồm 2 phần: Gân và phiến lá

Phần gân lá lồi cả 2 mặt, mặt dưới lồi rõ Từ dưới lên trên gồm các phần: Biểu

bì dưới (1) gồm một hàng tế bào hình chữ nhật kích thước không đều, có phủ một lớp

cutin mỏng Mô dày (2) gồm 4-5 lớp tế bào hình đa giác, thành dày ở góc, kích thước không đều, xếp sít nhau Mô mềm (3) gồm các lớp tế bào hình tròn, kích thước không đều nhau Mô cứng (5) gồm 2-5 lớp tế bào hình đa giác kích thước không đều nhau sắp xếp tạo thành một cung bao quanh bó libe-gỗ Bó libe-gỗ có gỗ ở trên, libe phía dưới;

libe (6) gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác kích thước đều, xếp lộn xộn thành từng

đám; mạch gỗ (7) hình đa giác hay vuông xếp thành dãy xen lẫn với mô mềm gỗ (tế bào hình vuông hay đa giác) hóa mô cứng Nằm rải rác trong mô mềm là thể cứng (4) kích thước lớn nhánh nhọn, đa hình dạng và các tinh thể calci oxalat (8) hình cầu gai

Phần phiến lá: Biểu bì (1), (9) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật, tế bào biểu bì

trên (9) lớn hơn tế bào biểu bì dưới (1); lỗ khí có thể quan sát được ở biểu bì dưới Mô giậu (10) gồm các tế bào thuôn dài xếp xít nhau Mô khuyết (11) gồm các lớp tế bào đa

giác hoặc tròn, sắp xếp lộn xộn

Hình 3.2 Ảnh vi phẫu lá Trà hoa vàng cúc phương

1 Biểu bì dưới; 2 Mô dày dưới; 3 Mô mềm; 4 Thể cứng; 5 Mô cứng;

6 Libe; 7 Mạch gỗ; 8 Mô dày trên; 9 Biểu bì trên; 10 Mô giậu;