Nghiên cứu điều chế và xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cao đặc bổ trung ích khí

Trên thị trường hiện nay đã có một số công ty phát triển bài thuốc Bổ trung ích khí để cho ra đời các sản phẩm điều trị trĩ : viên hoàn cứng Tottri Traphaco; viên nang cứng Hermonic Trườ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn tôi đã nhận được sự giúp

đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong lĩnh vực nghiên cứu cùng bạn

bè và gia đình

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau Đại học Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Bùi Hồng Cường, người đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến DS Trần Văn Cương và Công ty cổ phần Dược phẩm VCP, DS Đỗ Trung Hiếu và Công ty cổ phần thương mại Dược phẩm Quốc tế WINSACOM đã cung cấp dược liệu, chất chuẩn và hỗ trợ kinh phí cho tôi thực hiện đề tài này

Tôi xin cảm ơn PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển cùng các thầy cô bộ môn Dược Học Cổ Truyền đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm

Tôi xin cảm ơn ThS Nguyễn Tuấn Anh, DS Bạch Thị Thắm cùng các anh chị trong Phòng Đông dược Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc nhất, tôi muốn gửi tới gia đình, người thân

và bạn bè đã luôn bên cạnh ủng hộ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 01 tháng 04 năm 2019

Hoàng Thị Hảo

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về bệnh trĩ 2

1.1.1 Theo quan điểm y học hiện đại 2

1.1.2 Theo quan điểm y học cổ truyền 2

1.2 Phương thuốc bổ trung ích khí 3

1.2.1 Công thức 3

1.2.2 Công năng chủ trị của phương thuốc 3

1.3 Thông tin cơ bản các vị thuốc 5

1.3.1 Hoàng kỳ 5

1.3.2 Đảng sâm 8

1.3.3 Đương quy 10

1.3.4 Bạch truật 12

1.3.5 Thăng ma 14

1.3.6 Sài hồ 16

1.3.7 Trần bì 17

1.3.8 Cam thảo 19

1.4 Phương pháp điều chế cao đặc 21

1.4.1 Định nghĩa cao thuốc 21

1.4.2 Đặc điểm cao thuốc 21

1.4.3 Yêu cầu chất lượng cao thuốc 22

1.4.4 Phương pháp điều chế cao 22

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu 24

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Thiết bị, máy móc 24

2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Nghiên cứu điều chế cao đặc 25

2.2.2 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc 26

2.3 Xử lí số liệu 31

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Bào chế cao đặc 32

3.1.1 Khảo sát các thông số điều chế cao 32

3.1.2 Khảo sát chỉ tiêu vật lý 34

3.1.3 Xác định hàm ẩm và tỷ lệ cao thu được 34

3.1.4 Xác định pH 35

3.2 Khảo sát chỉ tiêu định tính 36

3.2.1 Định tính các nhóm chất trong cao đặc bằng phản ứng hóa học 36

3.2.2 Định tính cao đặc bằng sắc ký lớp mỏng 37

3.3 Định lượng AGS- IV trong cao đặc bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao 50

3.3.1 Thẩm định phương pháp định lượng 50

3.3.2 Định lượng AGS-IV trong các mẫu cao đặc 57

Chương 4 BÀN LUẬN 59

4.1 Về điều chế dạng cao đặc 59

4.2 Về xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc 59

4.2.1 Về định tính 59

4.2.2 Định lượng AGS-IV 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CAC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AGS-IV Astragalosid IV Ln (C ) Logarit cơ số e của nồng độ ALT Aspartate Amino Transferase Ln (Spic) Logarit cơ số e của diện tích pic AST Alanin Amino Transferase NF- B Nuclear Factor-kappa B

DĐTQ Dƣợc điển Trung Quốc PL Phụ lục

HK Hoàng kỳ

IGF Insulin-like growth factor

Inos Inducible nitric oxide synthase

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả mất khối lượng do làm khô, tỷ lệ cao thu được, thể chất các

mẫu cao 35

Bảng 3.2 Kết quả pH của cao đặc 35

Bảng 3.3 Kết quả định tính bằng phản ứng hoá học 36

Bảng 3.4 Kết quả SKLM định tính Hoàng kỳ, cao và AGS-IV sau khi phun thuốc thử hiện màu 39

Bảng 3.5 Kết quả SKLM định tính Đảng sâm, cao, quan sát ở bước sóng 254 nm 41

Bảng 3.6 Kết quả SKLM định tính Đương quy, cao, quan sát ở bước sóng 254 nm 44

Bảng 3.7 Kết quả SKLM định tính Cam thảo, cao, quan sát ở bước sóng 254 nm 45 Bảng 3.8 Kết quả SKLM định tính Bạch truật, cao sau khi phun thuốc thử hiện màu 46

Bảng 3.9 Kết quả SKLM định tính Trần bì và cao ở bước sóng 254 nm 47

Bảng 3.10 Kết quả SKLM định tính Thăng ma và cao ở bước sóng 366 nm 48

Bảng 3.11 Kết quả SKLM định tính Sài hồ và cao sau khi phun thuốc thử hiện màu 49

Bảng 3.12 Kết quả độ đặc hiệu 50

Bảng 3.13 Kết quả độ thích hợp hệ thống 52

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính định lượng AGS-IV 53

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian 54

Bảng 3.16 Kết quả độ đúng của phương pháp 56

Bảng 3.17 Kết quả định lượng AGS - IV trong các mẫu cao nghiên cứu 57

Bảng 4.1 Một số nghiên cứu định lượng AGS-IV 62

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Các dược liệu trong bài thuốc Bổ trung ích khí 24

Hình 3.1 Sắc ký đồ ĐT Hoàng kỳ, cao và AGS- IV sau khi phun thuốc thử hiện màu 39

Hình 3.2 Sắc kí đồ ĐT Đảng sâm, cao ở bước sóng 254 nm 41

Hình 3.3 Sắc kí đồ ĐT Đương quy, cao ở bước sóng 254 nm 44

Hình 3.4 Sắc ký đồ ĐT Cam thảo, cao ở bước sóng 254 nm 45

Hình 3.5 Sắc ký đồ ĐT Bạch truật, cao sau khi phun thuốc thử hiện màu 46

Hình 3.6 Sắc ký đồ ĐT Trần bì, cao ở bước sóng 254nm 47

Hình 3.7 Sắc ký đồ ĐT Thăng ma, cao ở bước sóng 366 nm 48

Hình 3.8 Sắc kí đồ ĐT Sài hồ, cao sau khi phun thuốc thử hiện màu 49

Hình 3.9 Sắc ký đồ AGS-IV 51

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit cơ số e của nồng độ và logarit cơ số e của diện tích pic của AGS-IV 53

Hình 3.11 Sắc k‎ý đồ của AGS-IV trong các mẫu cao nghiên cứu 58

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh trĩ là một bệnh thường gặp, đứng đầu trong các bệnh lý hậu môn-trực tràng, rất phổ biến trên thế giới với tỷ lệ người mắc bệnh khá cao Nghiên cứu gần đây nhất của Nguyễn Mạnh Nhâm và cộng sự ở 5 tỉnh miền Bắc phát hiện được 1446/2651 người dân mắc bệnh trĩ chiếm tỷ lệ 55% [12] Tuy không gây tử vong và

ít khi có biến chứng nặng nề nhưng bệnh trĩ lại trực tiếp ảnh hưởng tới chất lượng cuộc sống của người bệnh Bổ trung ích khí là một trong các bài thuốc cổ phương được giới thiệu trong y văn dùng điều trị trĩ Lý Đông Viên cho rằng trong các tạng thì tỳ đóng vai trò quan trọng đối với mọi hoạt động của cơ thể con người Sự suy yếu hoạt động của chức năng tạng tỳ dẫn tới trung khí bất túc, khí hư hạ hãm, cũng chính là cơ hội làm cho nhiều bệnh lý khác nhau được hình thành, điển hình như trĩ,

sa trực tràng, sa sinh dục Bài thuốc “Bổ trung ích khí” có tác dụng ôn bổ tỳ vị, ích khí thăng đề, giúp điều trị các chứng sa giáng, khí hư hạ hãm, giải quyết căn nguyên chính gây bệnh

Trên thị trường hiện nay đã có một số công ty phát triển bài thuốc Bổ trung ích khí để cho ra đời các sản phẩm điều trị trĩ : viên hoàn cứng Tottri (Traphaco); viên nang cứng Hermonic (Trường Anh Pharm)… Mong muốn phát huy tính ưu việt của thuốc cổ truyền, tiện dùng cho người bệnh, việc nghiên cứu bào chế và tiêu chuẩn hoá phương thuốc với các dạng bào chế hiện đại là cần thiết, trong đó cao đặc

là dạng bán thành phẩm trung gian để tiếp tục bào chế các thành phẩm, tiện cho việc

sử dụng thuốc

Từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu điều chế và xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cao đặc Bổ trung ích khí” được thực hiện với 2 mục tiêu:

- Nghiên cứu điều chế cao đặc Bổ trung ích khí

- Khảo sát một số tiêu chuẩn định tính, định lượng của dạng cao đặc Bổ trung ích khí

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về bệnh trĩ

1.1.1 Theo quan điểm y học hiện đại

- Bệnh trĩ là những búi mạch máu và mô liên kết hiện diện trong ba cột trong ống hậu môn: trước-bên phải, sau-bên phải và bên trái.[11]

- Cơ chế bệnh sinh: Tấm đệm hậu môn là một cấu trúc bình thường của bề mặt ống hậu môn, có vai trò trong việc ngăn ngừa sự són phân (khi ho, rặn, tấm đệm phồng lên, bít kín ống hậu môn) và sự hình thành cảm giác chủ thể (cảm giác cứng mềm, chất dịch hay hơi ) Bình thường tấm đệm hơi phồng lên ở các vị trí tương ứng với xoang tĩnh mạch trĩ trên (trực tràng trên) và xoang tĩnh mạch trĩ dưới (trực tràng dưới) Các chỗ phồng này được gọi là các búi trĩ Các búi trĩ này luôn hiện diện ở người bình thường, chỉ khi nào các búi trĩ gây ra triệu chứng, và bệnh nhân than phiền về các triệu chứng này, chúng mới được gọi là bệnh trĩ [2]

- Yếu tố nguy cơ: Gắng sức khi đi đại tiện (đây là nguyên nhân quan trọng nhất), thai kỳ, tăng áp lực cơ thắt trong, viêm trực tràng mạn tính [2]

- Điều trị: phụ thuộc và mức độ và triệu chứng của bệnh nhân

Điều trị: đối với trĩ nội độ I và hầu hết đối với trĩ nội độ II bao gồm tăng chế

độ ăn nhiều chất xơ và uống nhiều nước, thuốc làm mềm phân và tránh rặn khi đại tiện Trĩ độ II và III có thể điều trị bằng thủ thuật thắt trĩ bằng vòng cao su [11]

1.1.2 Theo quan điểm y học cổ truyền

- Trĩ là một bệnh mạn tính do các mạch trực tràng hậu môn bị giãn và xung huyết Tĩnh mạch xung huyết thành một búi hoặc nhiều búi, tùy vị trí tĩnh mạch ở trực tràng hoặc hậu môn, được phân chia trên lâm sàng thành trĩ nội hay trĩ ngoại

Theo Y học cổ truyền, khi tỳ vị đã suy yếu thì không vận hóa được thủy cốc, không làm chủ được cơ nhục, không thống nhiếp huyết khiến thấp nhiệt, đàm trọc ứ đọng làm phát sinh các búi trĩ, tạo thành dịch tiết gây ngứa ngáy vùng hậu môn, cơ nhục

bị nhẽo (khí hư gây hạ hãm), nên các búi trĩ cùng khối da, cơ vùng hậu môn sa xuống

- Nguyên nhân gây ra trĩ:

Viêm đại tràng mạn tính gây táo bón, thường xuyên phải rặn nhiều, xơ gan mạn tính gây xung huyết tĩnh mạch, bệnh nghề nghiệp do đứng lâu, ngồi lâu, phụ

nữ đẻ nhiều lần, phụ nữ có thai…

- Phương pháp chữa bệnh:

Dùng thuốc uống trong để chống chảy máu, chống nhiễm trùng, dùng thuốc làm nhỏ búi trĩ Các thủ thuật ngoại khoa để gây hoại tử búi trĩ, rụng và cắt các búi trĩ [19]

1.2 Phương thuốc bổ trung ích khí

1.2.1 Công thức

Phương thuốc xuất xứ từ “Tỳ vị luận” của Lý Đông Viên, một danh y Trung Quốc [7]

1.2.2 Công năng chủ trị của phương thuốc

- Công năng: Bổ trung ích khí, thăng dương, cử hãm

- Giải thích phương thuốc:

Hoàng kỳ ích khí, thăng dương khí làm quân, Đảng sâm, Bạch truật, Cam thảo kiện tỳ ích khí làm thần, cùng được công năng bổ trung ích khí Phối hợp Trần

bì hành khí, Đương quy bổ huyết, đều là các tá dược Thăng ma, Sài hồ thăng cử thanh dương hãm ở dưới, là sứ dược trong bài thuốc bổ khí Xét chung cả bài, vừa

là bổ khí kiện tì để trị gốc của khí hư, lại thăng đề dương khí bị hãm ở dưới, để khiến cái đục giáng xuống, cái trong thăng lên, do đó điều hòa tì vị, tinh khí của gạo nước sinh hóa có nguồn, các chứng hư khí của tì vị sẽ tự hết Mọi thứ thoát xuống,

sa xuống đều tự trở về đúng vị trí [7]

Phương thuốc gồm những nhóm tác dụng chính:

- Bổ khí, kiện tỳ: Hoàng kỳ, Đảng sâm, Bạch truật, Cam thảo

- Bổ huyết: Đương quy

- Hành khí giảm đau: Trần bì

- Thăng đề dương khí bị hãm ở dưới: Thăng ma, Sài hồ

Ngày nay người ta thường dùng bài này để trị sa dạ dày, trĩ, bong sa niêm mạc dạ dày, sa thận, sa tử cung, nhược cơ nặng, viêm gan mạn tính, viêm ruột, đái đục như cháo, trẻ em tiêu chảy, chứng giảm bạch cầu, tiêu chảy lâu ngày, băng lậu huyết rong kinh Dược lí hiện đại nghiên cứu cho thấy bài thuốc này có tác dụng tăng cường miễn dịch, điều chỉnh nhu động ruột, phòng ngừa thiếu máu, tăng cường thể lực [7]

Kết quả luận án tiến sĩ Y học của Trần Thị Hồng Phương về chè tan Bổ trung ích khí gia vị cho thấy thuốc có ít độc tính cấp, phạm vi an toàn rộng, không có độc tính bán trường diễn, có tác dụng cầm máu, giảm đau và chống viêm trên thực nghiệm, tác dụng tốt với các triệu chứng thu nhỏ búi trĩ, giảm táo bón [13]

Một phân tích meta của các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng cho thấy bài thuốc Bổ trung ích khí có tác dụng điều trị hiệu quả trên bệnh nhân người lớn

bị táo bón và không có tác dụng phụ nghiêm trọng nào được xác định [30]

1.3.1.1 Tên khoa học: Radix Astragali membranacei [15]

1.3.1.2 Bộ phận dùng: Rễ phơi hay sấy khô của cây Hoàng kỳ- Astragalus

membranaceus (Fish) Bunge; họ Đậu-Fabaceae [10]

1.3.1.3 Thành phần hóa học

- Hoàng kỳ có cholin betain, nhiều loại acid amin và saccaroza

- Polysacharid: 3 astragalan I, II, III được phân lập từ dịch chiết nước rễ Hoàng kỳ [20], [22]

- Saponin:

Những saponin chính gồm: 9 astragalosid (AGS) và isoastragalosid: AGS (I,

II, III, IV, V, VI, VII); isoastragaloside (I, II) và 2 saponin kiểu olean : AGS VIII và soyasaponin I [20] Ngoài ra còn có acetylastragalosid, astramembrannin II, cycloastragenol, cyclosieversigenis, soyasapogenol B và lupeol [23]

Có 5 saponin chính đó là AGS I, II, IV, và isoastragaloside I, II; tất cả đều

là cycloartanetype triterpenoids [23], [36] Trong đó, AGS- IV là chất chính và

đã được đưa vào kiểm soát trong chỉ tiêu định tính, định lượng dược liệu Hoàng

kỳ [4], [26]

- Flavonoid: calycosin-7-O-β-D-glucosid; calycosin-7-O-β-D-glucosid-6‟-O malonat; ononin; calycosin, (3R)-7,2‟-dihydroxy-3‟,4‟-dimethoxy-isoflavan-7-O-β-D-glucosid; formononetin-7-O-β-D-glucosid-6‟-O-malonat và formononetin; sulfuretin, isoliquiritigenin, pendulon [36] Calycosin-7-O-β-D-glucosid chiếm tỉ lệ cao nhất và cũng được dùng làm chất chỉ điểm trong kiểm nghiệm dược liệu Hoàng kỳ [4], [26]

- Một số thành phần khác: phytosterol; chất dầu bay hơi; aminoacid; các kim loại, hợp chất hữu cơ (choline, betaine, gluconic acid, β-sitosterol); tinh dầu, linoleic acid, α- aminobutyric acid, chất đắng và asparagin [23]

- Khối lượng phân tử : 784.981 g/mol

- AGS - IV thuộc nhóm triterpen saponin, ít tan trong nước [49]

- Trong công thức cấu tạo của AGS - IV không chứa các liên kết đôi liên hợp do vậy hấp thụ UV rất yếu nên thường dùng dertector tán xạ bay hơi (ELSD)

để phát hiện sự có mặt của AGS - IV [1]

- Các phương pháp có thể dùng để định lượng astragalosid: sắc kí lỏng hiệu năng cao dertector tán xạ bay hơi, sắc kí lỏng khối phổ (HPLC – ELSD, HPLC – MS) [51], LC-ESI/MS (phổ khối phun mù điện tử), HPLC-UV [54]

- Dược điển Việt Nam V và Dược điển Trung Quốc quy định hàm lượng

AGS-IV trong Hoàng kỳ không được dưới 0,04% tính theo dược liệu khô kiệt [4], [26]

1.3.1.4 Tác dụng sinh học

- Trên hệ tuần hoàn

Saponin Hoàng kỳ làm tăng sức co bóp cơ tim cô lập của chuột cống trắng [20], giãn mạch ngoại vi làm hạ huyết áp, giãn mạch tim và mạch thận nên cũng ảnh hưởng làm thông tiểu tiện [10], [20]

AGS-IV có tác dụng giảm rối loạn nhịp tim khi tiến hành thử nghiệm trên động vật và trên lâm sàng Mặt khác, AGS-IV có tác dụng bảo vệ tim mạch do làm giảm lượng calci trong tế bào tim [42] Ngoài ra, AGS-IV làm giảm kích thước vùng nhồi máu, giảm chứng loạn nhịp tim và cải thiện chức năng tim tốt trên bệnh nhân có cơn thiếu máu cục bộ [50]

+ Astragaloside IV có thể làm tăng sự tăng sinh tế bào lympho B, lympho T

và sản xuất kháng thể in vitro, in vivo [46]

- Tác dụng chống ung thư

Dịch chiết nước Hoàng kỳ ức chế sự gia tăng và xâm lấn của các tế bào khối

u phụ thuộc liều trong ung thư phổi, ung thư biểu mô tế bào thận và ung thư bàng quang [36]

1.3.1.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: vị ngọt, tính ôn [6]

1.3.2.1 Tên khoa học: Radix Codonopsis pilosulae [10]

1.3.2.2 Bộ phận dùng: Rễ phơi khô của cây Đảng sâm- Codonopsis pilosula

(Franch.) Nannf , thuộc họ Hoa chuông-Campanulaceae [10]

1.3.2.3 Thành phần hóa học

- Từ dịch chiết nước của rễ Đảng sâm đã phân lập được bốn acetylen mới là: cyclotetradecatrienynone, tetradecenynetriol và 2 acid octenynoic hiếm (2E, 6E)-

octa-2,6-dien-4-ynoic acid, (E)-oct-6-en-4-ynoic; một acid béo ω-hydroxy không

-tetradeca-4,8,12-trien-10-yn-1,6,7-triol, (10E) -12-hydroxydodeca-10-enoic acid, 2‟,3‟-dihydroxy propyl ester, fulgidic acid, và acid pinellic [31]

D,B-friedoolean-5-ene-3-β-ol, α-spinasteron [43]

- Chống loét dạ dày và kích thích chữa lành [31]

Dịch chiết nước Đảng sâm có hiệu quả cao trên loét dạ dày do stress, acid acetic và natri hydroxid, ít có tác dụng đối với các vết loét do pyloroligature và indomethacin gây ra [47]

1.3.2.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị: vị ngọt, tính bình [10], [20]

- Quy kinh: phế, tỳ [10]

- Công năng, chủ trị:

+ Bổ tỳ, kiện vị, bổ phế: Chữa tỳ vị suy kém, phế khí hư nhược dẫn đến thở ngắn hụt hơi, ăn uống không ngon, ỉa lỏng, buồn phiền mệt mỏi, thiếu máu, vàng da [6], [17]

+ Bổ trung ích khí: Dùng tốt trong các trường hợp trung khí bị hư yếu, gây sa

dạ dày, sa ruột, sa tử cung, trĩ, lòi dom, băng huyết, rong huyết [6], [20]

+ Lợi niệu: Phù do thận, viêm thận, nước tiểu có albumin, chân phù đau [6], [20] + Sinh tân, chỉ khát: Khát nước, ốm lâu cơ thể suy nhược [20]

1.3.3.1 Tên khoa học: Radix Angelica sinensis [10], [16]

1.3.3.2 Bộ phận dùng: Rễ phơi hay sấy khô của cây Đương quy-Angelica sinensis

(Oliv.) Diels, thuộc họ Hoa tán-Apiaceae [10], [16]

1.3.3.3 Thành phần hóa học

- Tinh dầu:

Myrcen, β-ocimen, allo-ocimen, β-phellandren, p-cymen, α-pinen, farnesen, bicycloelemen, γ-elemen, cedren, cuparen [20], coniferyl ferulat, 4-hydroxy-3-butylphthalid, o-cresol, tridecan, 3,3‟Z-6.7‟,7.6‟-diligustilid, spinasterol, 5-sethylfurfural, D-limonen, a-phellandren, 6-undecanol, eudesmol, baicalin … [48]

trans-β Các hợp chất phenolic: acetophenon, acid anisic, o,ptrans-β cresol, ethylresorcinol, acid valerophenon, phenol, m,p-ethylphenol, guaiacol, carvacrol, vanilin, acid ferulic [20]

- Các dẫn chất phtalid: senkyunolid A, ligustilid, n-butylphtalid, n-butylidenphtalid [20], Z-ligustilid, Z- butylidenphtalid, levistolid A, riligustilid, tokinolid B, neocnidilid, ansaspirolid, angelicid [48]

- Coumarin: umbeliferon, scopoletin, xanthotoxin, isopimpinelin, bergapten, acuolobin, decursin [20]

- Acid hữu cơ: acid vanilic, acid palmitic, acid linoleic, acid rucotinic, acid sucinic [20], acid protocatechuic, acid phthalic, acid p-hydroxybenzoic, acid ferulic, acid caffeic, acid folic [48]

- Polysaccharid: fucose, galactose, glucose, arabinose, rhamnose và xylose [20], [48]

- Acid amin: alanin, valin, isoleucin, serin, threonin, acid γ-aminobutyric, leucin, leucin, glycin, histidin, methionin, cystidin, uracil, cholin… [20], [48]

- Vitamin: vitamin B1, vitamin B2, vitamin E [20]

- Polyacetylen : falcarinol, falcarindiol, falcarinolon [20]

- Sterol: β-sitosterol, stigmasterol, β-stigmasteryl-β-D-glucosid [20]

1.3.3.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng trên tử cung và các cơ trơn

+ Ức chế sự co của tử cung, làm giãn nghỉ sự căng của tử cung, trực tiếp làm cho hành kinh không đau; gây tăng sinh tử cung [20]

+ Đương quy có tác dụng làm cho ruột trơn và có thể chữa táo bón [10]

- Tác dụng trên cơ tim: Tác dụng trên tim của Đương quy giống tác dụng

1.3.3.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị: vị ngọt, cay, tính ôn [6]

- Quy kinh: tâm, can, tỳ [6]

- Công năng, chủ trị:

+ Bổ huyết, bổ ngũ tạng: Dùng trong bệnh thiếu máu dẫn đến hoa mắt, chóng mặt, da xanh xao, người gầy yếu, chân tay đau nhức lạnh [10], [20]

+ Hoạt huyết, điều huyết, giải uất kết: Là vị thuốc vừa bổ huyết vừa hoạt huyết nên dùng thích hợp cho các trường hợp thiếu máu kèm theo bế kinh, vô sinh, kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh, sa tử cung, chảy máu [20]

+ Hoạt tràng, thông tiện: Tác dụng nhu nhuận đối với vị tràng, dùng thích hợp với chứng huyết hư, huyết táo gây táo bón [6]

- Định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước, hàm lượng không

ít hơn 0,4% tính theo dược liệu khô kiệt

- Định lượng acid ferulic bằng HPLC, hàm lượng không được thấp hơn 0,04% tính theo dược liệu khô kiệt [4]

1.3.4 Bạch truật

1.3.4.1 Tên khoa học: Rhizoma Atractylodis macrocephalae [10]

1.3.4.2 Bộ phận dùng: Rễ phơi hay sấy khô của cây Bạch truật-Atractylodes

macrocephala Koidz., họ Cúc-Asteraceae [20]

1.3.4.3 Thành phần hóa học

- Trong Bạch truật có tinh dầu (1,4%), thành phần tinh dầu chủ yếu gồm: atractylon [10], [20], acetoxy atractylon, hydroxyatractylon, atractylat kali [20], atractylola, vitamin A [10]

- Các sesquiterpen: α-eudesmol, β-eudesmol [20]

- Các dẫn chất lacton như atractynolid I, II, III [20], juniper camphor [16]

1.3.4.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng chống loét dạ dày:

Bạch truật có tác dụng ức chế rõ rệt loét Shay và loét do nhịn đói, không có tác dụng với loét do histamine [10]

- Hoạt tính chống viêm cấp: Các chất atractylenolid I, II, III có tác dụng

chống viêm và cao chiết nước Bạch truật có tác dụng chống viêm khớp rất rõ [20]

- Tác dụng trên đường huyết

Glucosid kali atractylat chiết từ Bạch truật có tác dụng chọn lọc trên đường huyết, đầu tiên gây tăng, sau đó gây hạ có thể tới mức co giật do đường huyết hạ quá thấp [20]

- Tác dụng bảo vệ hệ thần kinh: Cao chiết ethanol Bạch truật có tác dụng

bảo vệ thần kinh chống lại apoptosis (sự chết theo chương trình) do độc tố kích thích trên tế bào thần kinh vỏ não [29]

1.3.4.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

1.3.4.6 Định tính, định lượng

- Dung môi khai triển: ether dầu hoả-ethylacetat (50:1)

- Dung dịch dược liệu đối chiếu: So sánh với dược liệu Bạch truật chuẩn

- Phát hiện: Phun dung dịch vanillin 1% /acid sulfuric 5%, quan sát ở ánh sáng thường [4]

1.3.5 Thăng ma

1.3.5.1 Tên khoa học: Rhizoma Cimicifugae [10], [21]

1.3.5.2 Bộ phận dùng: Thân rễ khô của cây Thăng ma-Cimicifuga foetida L., họ

Mao lương-Ranunculaceae [10], [21]

1.3.5.3 Thành phần hóa học

- Chất đắng gọi là ximitin với công thức thô là C20H34O7 [10]

- Các triperpen đầu tiên được xác định là cimigenol, cimigenol xylopyranosid và dahurinol, acid ferulic, acid isoferulic [16]

- Các dẫn chất của 9,19 cyclolanostan như : Acetylshengmanol 3-O-β-D-xylopyranosid; 24-O-acetylhydroshengmanol-3-O-β-D-xylopyranosid; shengmanol-3-O-β xylopyranosid [21]

3-O-β-D Các cyclo artan triterpenoid: Cimigenol3-O-β-D 33-O-β-D O3-O-β-D β3-O-β-D D3-O-β-D xylopyranosid (23R, 24S); cimisid A và cimisid B; cimisid C và cimisid D [21]

- Triterpenol bidesmosid: glucosid và 3-xylosyl-24-O-acetylhydroshengmanol-15-glucosid [21]

3-arabinosyl-24-O-acetylhydroshengmanol-15 Các xylosid cimifugosid H1, H2, H3, H4, H5, H6

- Các cimicifugamid isocimicifugamid là các dẫn xuất của cinamamid có cấu trúc là N-(3‟-methoxy-4‟-hydroxyphenethyl)-4-O-β-D-galactopyranosyl ferulamid

và N-(3‟-methoxy-4‟-hydroxyphenethyl)-4-O-β-D-galactopyranosyl isoferulamid

- Các phenolic glycosid: isocimifugamid, cimidahurin, cimidahurinin

- Các hợp chất furochromon như visamminol, visnagin, norvisnagin

- 2 chất màu vàng 3-(3‟methyl-butenylidene)-2-idolinon và đồng phân của

nó cũng được phân lập và xác định thân rễ Thăng ma chứa acid isoferulic [21]

1.3.5.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng trên cơ trơn: Visamminol và visnagin từ Thăng ma có tác dụng

chống co thắt trên hỗng tràng cô lập chuột lang, đạt khoảng 10-30% tác dụng của papaverin hydroclorid [21]

- Tác dụng trên lipid máu: Cyclolanostan triterpen từ Thăng ma làm giảm

nồng độ cholesterol và triglycerid máu của chuột cống trắng có tăng lipid máu gây bởi vitamin D2 và cholesterol [21]

- Cao methanol thân rễ Thăng ma có tác dụng dự phòng tổn thương gan gây

ra bởi CCl4 ở chuột cống trắng [21]

- Tác dụng trên đường huyết: Acid isoferulic, acid isoferuloic từ thân rễ

Thăng ma có hoạt tính chống tăng đường máu ở chuột cống trắng có đái tháo đường

tự phát, tương tự như đái tháo đường type 1 [21]

1.3.5.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị: Vị ngọt, cay, hơi đắng, tính bình hơi độc [10], [21]

Quy kinh: Tỳ, vị , phế, đại trường [10], [21]

- Dung môi triển khai: Toluen-cloroform-acid acetic (6:1:0,5)

- Dung dịch đối chiếu: So sánh với acid ferulic và acid isoferulic chuẩn, dược liệu Thăng ma chuẩn

- Phát hiện: Quan sát ở bước sóng 366 nm

 Định lượng

- Định lượng acid isicrulic bằng HPLC, hàm lượng không được dưới 0,1% tính theo dược liệu khô kiệt [4]

1.3.6 Sài hồ

1.3.6.1 Tên khoa học: Radix Bupleuri [10]

1.3.6.2 Bộ phận dùng: Rễ phơi hay sấy khô của cây sài hồ- Bupleurum sinense

DC và một số cây khác cùng chi cùng họ, họ Hoa tán-Apiaceae [10]

1.3.6.3 Thành phần hóa học

- Saponin: Hàm lƣợng saponin trong rễ là 1,69%

Rễ Sài hồ chứa nhiều saponin và sapogenin triterpen (nhóm olean): saikogenin (A, B, C,D, E, F, G), saikosaponin (A, B1-B4, C, D, E và F) [21]

- Tinh dầu: Hàm lƣợng tinh dầu trong rễ là 0,16% và trong thân là 0,05% Gồm acid pentanoic, acid 2-heptenoic, acid nonanoic, phenol, cresol, ethylphenol, thymol, eugenol, O-methoxyphenol, γ-heptalacton, γ-octalacton, γ-decalacton, γ-undecalacton, vanilin acetat, acid valeric và p-methoxyacetophenon [21]

- Rễ Sài hồ chứa 2 polysaccharid có hoạt tính sinh học là các bupleuran 2II b

và 2II c Ngoài ra còn có spinasterol cùng với β-D-glucopyranosid của spinasterol [21]

α-1.3.6.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng hạ sốt, giảm đau, chống viêm

Saikosaponin đƣợc coi là thành phần có hoạt tính hạ sốt, chống viêm chủ yếu trong rễ Sài hồ bắc Các hoạt chất hạ sốt là eugenol, acid hexanoic, γ-undecalacton

và p-methoxyacetophenon, các hoạt chất chống viêm là acid valeric, acid nonenoic và p-methoxyphenon [21]

2 Tác dụng an thần: Cả phân đoạn saikosaponin thô và phân đoạn

saikosaponin A đều có tác dụng an thần rõ rệt [21]

- Tác dụng điều hòa miễn dịch

Bupleuran 2II b làm tăng mạnh sự gắn phức hợp miễn dịch vào đại thực bào Saikosaponin D có tác dụng kích thích miễn dịch có thể do làm thay đổi chức năng của tế bào lympho T [21]

- Tác dụng chống loét

Phân đoạn polysacharid (BR-2 100 mg/kg) có hoạt tính chống loét mạnh nhƣ sucralfat [21]

+ Bình can giải uất, ích tinh, sáng mắt: Trị hoa mắt, chóng mặt do can khí uất trệ, sườn đau tức, kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh [6], [10], [21]

1.3.7.1 Tên khoa học: Pericarpium Citri reticulatae [16]

1.3.7.2 Bộ phận dùng: Vỏ quả chín đã phơi hoặc sấy khô hoặc lâu năm của cây

quít- Citrus reticulata Blanco, họ Cam- Rutaceae [16]

1.3.7.3 Thành phần hóa học

-Tinh dầu:

Thành phần chính của tinh dầu là D-limonen; cyclohexadien; β-myrcen; α, α-4- trimethyl-3-cyclohexene-1-methanol; 2-methoxy-4-vinylphenol và α-pinen [28]; γ-terpinen, lina myrcen [37]

1-metyl-4-(1-metyletyl)-1,4 Flavonoid và coumarin:

Người ta đã phân lập được các hợp chất: hesperidin; tangeretin; 4‟,5,6,7 tetramethoxyflavon; 3,3‟,4‟,5,6,7,8-heptmethoxyflavon; sinensetin; 5-O-demethylnobiletin; nobiletin; apigenin; 5-O-desmethyltangeretin; 5,7-dihydroxy-3,3‟,4‟,6-tetramethoxyflavon; pachypodol; 4‟,5,6,7-tetramethoxyflavon; 3‟,4‟,5,7,8-pentamethoxyflavon; agestrcin C; scoparon; isoscopoletin, didymin; methylhesperidin, naringin [27]; 3,5,6,7,8,3‟,4‟-heptamethoxyflavon; 5-hydroxy-6,7,8,3,4-pentamethoxyflavon [37], [56]

- Alkaloid: 2 alkaloid chính trong Trần bì là synephrin và N-methyl tyramin [52]

- Các thành phần khác: inositol, vitamin B, vitamin C, carotenoid, pectin, polysaccharid, thymol, β-sitosterol [52]

1.3.7.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng chống oxy hoá và kháng khuẩn

+ Terpen là thành phần chính trong tinh dầu có hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn Khả năng chống oxy hóa của tinh dầu Trần bì thay đổi theo thời gian lưu trữ, nó có thể liên quan đến việc tăng một số thành phần như α-pinen và β-pinen [28]

- Tác dụng giảm lipid máu và gan

Hesperidin và nobiletin ngăn dự trữ lipid ở gan, hoạt hoá các enzyme oxy hoá acid béo ở gan, làm giảm cholesterol toàn phần, triglyceride, apolipoprotein B [33]

- Tác dụng chống hen

Synephrine trong Trần bì có tác dụng giao cảm, giãn khí phế quản bằng cách

ức chế thụ thể muscarinic và histamin, kích thích thụ thể β-adrenergic và đối kháng giải phóng calci nội bào [39]

- Tác dụng dược lí khác: α-pinene có tác dụng chống ho, đờm, kháng khuẩn và

chống nấm; linalool có tác dụng giảm đau, an thần, chống viêm, kháng khuẩn [37]

1.3.7.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Dung dịch đối chiếu: Dung dịch hesperidin, dược liệu Trần bì chuẩn

- Phát hiện: Phun dung dịch nhôm clorid 1%, quan sát dưới bước sóng 366 nm

 Định lượng

- Định lượng hesperidin bằng HPLC, hàm lượng không thấp hơn 3,5% tính theo dược liệu khô kiệt [4]

1.3.8 Cam thảo

1.3.8.1 Tên khoa học: Radix Glycyrrhizae [10]

1.3.8.2 Bộ phận dùng: Rễ phơi hay sấy khô của cây Cam thảo bắc-Glycyrrhiza

glabra L hoặc Glycyrrhiza uralensis Fisch ex DC [5] Họ Đậu- Fabaceae [10]

1.3.8.3 Thành phần hóa học

- Các saponin: saponin quan trọng nhất là acid glycyrrhizic Các dẫn chất triterpenoid khác như acid liquiritic; acid 18-α-hydroxy-glycyrrhetic; acid 24-hydroxyglycyrrhetic; glabrolid; desoxyglabrolid; isoglabrolid; acid liquiridiolic… [5]

- Các flavonoid: liquiritin và isoliquiritin là hai flavonoid quan trọng [5] Ngoài ra còn có nhiều flavonoid thuộc các nhóm khác: isoflavan (glabridin) [51], [53]; isoflavon (glabron); isoflaven (glabren) [5]

- Các dẫn chất coumarin: umbelliferon; herniarin; liqcoumarin [5]

- Các hợp chất estrogen có nhân sterol với hàm lượng thấp [20]

- Ngoài ra trong rễ Cam thảo còn có 20-25% tinh bột; 3-10% glucose và saccharose [5]

1.3.8.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng long đờm [5], giảm ho, gây trấn tĩnh, ức chế thần kinh trung ương [20]

- Các flavonoid có trong Cam thảo có tác dụng chống oxy hóa, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, giảm tích lũy mỡ bụng, hạ đường huyết [5]

- Tác dụng kháng khuẩn: cao chiết ethanol Cam thảo có tác dụng ức chế các loại tụ cầu vàng, trực khuẩn E.Coli và trùng roi, còn có tác dụng chống viêm [15]

- Glycyrrhizin có tác dụng giải độc với ngộ độc thức ăn hoặc trúng độc một

số thuốc khác: morphin; cocain; strychnin; atropin; độc tố bạch hầu, uốn ván [15]

- Tác dụng oestrogen, tác dụng tương tự cortison của glycyrrhizin trên chuyển hóa chất điện giải, giữ natri và clorid, bài tiết kali, chống viêm, chữa táo bón [20]

- Glabridin trong Cam thảo cho thấy hiệu quả in vivo và in vitro trong bảo vệ tế

bào thần kinh [51] ngoài ra còn được dùng phổ biến trong điều trị bệnh tim mạch [53]

1.3.8.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

+ Tả hỏa giải độc: Trị mụn nhọt đinh độc sưng đau [15], [17]

+ Hoãn cấp chỉ thống: Dùng trị đau dạ dày, đau bụng, gân mạch co rút [15], [17] + Điều hòa các vị thuốc trong phương thuốc [17]

1.3.8.6 Định tính, định lượng

 Định tính

- Dung môi khai triển: Ethylacetat– acid formic– acid acetic băng – nước (15:1:1:2)

- Dung dịch đối chiếu: Dung dịch amoni glycyrrhizinat, dược liệu Cam thảo chuẩn

- Phát hiện: Dung dịch acid sulfuric 10%/ethanol, quan sát ở bước sóng 366

nm

 Định lượng

- Định lượng acid glycyrrhizic bằng HPLC , hàm lượng không được thấp hơn 2% tính theo dược liệu khô kiệt [4]

1.4 Phương pháp điều chế cao đặc

1.4.1 Định nghĩa cao thuốc

Cao thuốc là chế phẩm điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp

Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp)

Với một số dược liệu đặc biệt, có chứa các men phân hủy hoạt chất, cần phải diệt men trước khi sử dụng làm nguyên liệu chiết xuất bằng hơi ethanol sôi, hơi nước sôi, hoặc các phương pháp chiết xuất thích hợp khác để bảo vệ hoạt chất trong dược liệu [4]

1.4.2 Đặc điểm cao thuốc

Hầu hết cao thuốc thường tối màu (màu nâu, hoặc nâu đậm), thành phần của cao thuốc rất phức tạp, gồm nhiều nhóm chất khác nhau trong nhiều loại dược liệu,

có cả thành phần vô cơ và hữu cơ, các sản phẩm phân hủy của các chất trong quá trình nấu, cô cao và đã được loại bỏ một phần hoặc hoàn toàn các tạp chất (chất nhày, chất gôm, chất béo, nhựa…)

Cao thuốc thực chất là dịch chiết toàn phần của dược liệu, tác dụng của nó là tác dụng tổng thể của các thành phần trong cao tương tự dạng thuốc sắc Cao thuốc

có thể làm nguyên liệu sản xuất các dạng bào chế mới, tiện cho việc sử dụng như siro, viên hoàn, thuốc mỡ, viên nén, viên nang, thuốc bột, thuốc cốm [4]

1.4.3 Yêu cầu chất lượng cao thuốc

Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao

Độ trong, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã được mô

tả trong chuyên luận riêng, phải đồng nhất, không có váng mốc, không có cặn bã dược liệu và vật lạ

Định tính: Phải có phản ứng định tính của các dược liệu dùng để bào chế cao thuốc Định lượng: Tùy theo từng cao thuốc cụ thể mà có yêu cầu định lượng hoạt chất

trong cao

Tỷ trọng: Tùy theo từng cao thuốc cụ thể mà có yêu cầu về tỷ trọng của cao Mất khối lượng cho làm khô cao đặc không quá 20 %, cao khô không quá 5% Các chỉ tiêu khác: Giới hạn nhiễm khuẩn, dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật,

hàm lượng kim loại nặng [4]

1.4.4 Phương pháp điều chế cao

Phương pháp điều chế cao qua hai giai đoạn, giai đoạn chiết xuất và giai đoạn cô lại các dịch chiết

 Giai đoạn chiết dược liệu bằng dung môi thích hợp

Tùy thuộc bản chất dược liệu, dung môi, tiêu chuẩn chất lượng các thành phẩm cũng như điều kiện quy mô sản xuất, và trang thiết bị, có thể sử dụng phương pháp chiết xuất như: ngâm, hầm, sắc, ngấm kiệt, chiết xuất ngược dòng, chiết siêu âm…

Dược liệu phải được chế biến (thái, bào, sao tẩm ) theo yêu cầu từng loại Lượng dung môi và thời gian chiết xuất tùy loại dược liệu

 Cô cao:

Cao lỏng: sau khi thu dịch chiết, tiến hành lọc, cô dịch chiết bằng các phương pháp khác nhau để thu được cao lỏng có tỷ lệ quy ước (01 ml cao lỏng tương ứng với 01 g dược liệu dùng chế cao Trong trường hợp bào chế cao lỏng

bằng phương pháp ngâm nhỏ giọt thì phải để riêng phần chiết đầu đậm đặc, khối lượng bằng 4/7 lượng dược liệu đem chiết Sau đó cô đặc thành các phần dịch chiết tiếp theo bằng cách đun cách thủy hoặc cô dưới áp suất giảm với nhiệt độ không quá 600C, cho đến khi loại hết dung môi Hòa tan cắn thu được trong dịch chiết đầu đậm đặc và nếu cần thì thêm dung môi để thu được cao lỏng đạt tỷ lệ hoạt chất quy định

Cao đặc và cao khô: đối với cao đặc dịch chiết cô đặc để độ ẩm còn lại không quá 20% Trong trường hợp chế cao khô, tiếp tục sấy khô để độ ẩm còn lại không quá 5% Quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áo suất giảm, với nhiệt độ không quá 600C [9]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các vị thuốc trong phương thuốc do Công ty cổ phần Dược phẩm VCP cung cấp (117 Trần Duy Hưng, Cầu Giấy, Hà Nội), đạt tiêu chuẩn DĐVN V

- Dược liệu chuẩn: được mua tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương ( Thăng ma, Trần bì, Bạch truật, Đảng sâm, Đương quy, Hoàng kỳ) và Viện Dược liệu (Cam thảo), Sài hồ chuẩn được cung cấp bởi Công ty cổ phần Dược phẩm VCP, có phiếu kiểm nghiệm của từng dược liệu

- Cao đặc Bổ trung ích khí:

2.1.2 Thiết bị, máy móc

- Nồi inox Gala Plus

- Bếp hồng ngoại Kangaroo điều chỉnh được nhiệt độ

- Tủ sấy Memmert (Germany)

- Máy đo độ ẩm Precisa XM 120

- Cân phân tích Sartorius BP 221S (Germany)

Hình 2.1 Các dược liệu trong bài thuốc Bổ trung ích khí

- Cân phân tích Metller Toledo

- Máy đo pH

- Máy siêu âm

- Cân kỹ thuật Precisa (Switzeland)

- Máy ảnh Canon 10.0 mega pixel

- Hệ thống thiết bị SKLM hiệu năng cao Linomat 5 (Camag Switzeland)

- Chất chuẩn: Astragaloside IV hàm lượng 98.81% (Chengdu must technology Co.Ltd), LOT 17022804 do Công ty Cổ phần Dược phẩm VCP cung cấp

bio Acetonitril, methanol: Loại dùng cho HPLC của Merk, nước cất 2 lần

- Bản sắc kí lớp mỏng Silica gel 60 F254 của Merck

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu điều chế cao đặc

- Cao được bào chế từ các dược liệu với công thức: (tương đương 2 thang thuốc)

- Dung môi: Áp dụng quy trình điều chế cao đặc với dung môi để chiết xuất

Xác định khối lƣợng cao thu đƣợc, thể chất cao

2.2.2 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lƣợng cao đặc

- Tỷ lệ cao chiết : đƣợc tính theo công thức

H (%) = Khối lƣợng cao khô tuyệt đối

Khối lƣợng dƣợc liệu khô tuyệt đối × 100

2.2.2.4 Nghiên cứu định tính một số thành phần hóa học của cao đặc Bổ trung

ích khí, dược liệu

- Định tính bằng phản ứng hóa học:

Định tính một số nhóm chất chính: flavonoid, saponin, coumarin, polysaccharid, acid amin, polysaccharid trong cao đặc và dược liệu bằng phản ứng hóa học với các thuốc thử chung và thuốc thử đặc hiệu của từng nhóm [14], [3]

 Đối tượng nghiên cứu:

- Cao đặc bài thuốc

- Cao placebo: Chuẩn bị như cao Bổ trung ích khí, nhưng bỏ Hoàng kỳ

 Chuẩn bị các dung dịch thử, dung dịch chuẩn:

- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 5,0 mg AGS - IV chuẩn cho vào bình định mức 5 ml, hòa tan và thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol Từ dung dịch chuẩn gốc này pha dãy chuẩn có nồng độ trong khoảng: 50-750 g/ml

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 7,0 g cao vào bình nón có nút mài

100 ml, thêm 80 ml methanol, khuấy kỹ siêu âm trong 60 phút, lọc, cô dịch lọc đến cắn Hòa cắn trong 30ml dung dịch amoniac 10% (v/v) Để trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc Chuyển dịch chiết sang bình gạn, chiết lần lượt với 30 ml, 20 ml, 20ml n- butanol bão hòa trong nước Tập trung các dịch chiết n–butanol, cô trên cách thủy đến cắn Hòa cắn trong 10 ml methanol, lọc qua màng lọc 0,45µm

- Detector: máy phát hiện tán xạ ánh sáng bay hơi

- Pha động: dung môi pha động là Acetonitril và nước, chương trình gradient:

Tiêm riêng biệt 20 l các dung dịch chuẩn vào máy sắc ký, ghi nhận sắc ký

đồ, diện tích của pic AGS-IV Xây dựng đường hồi qui tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc giữa logarit của diện tích pic và logarit của nồng độ dung dịch chuẩn (g/ml) theo phương trình y = ax + b

Tiêm 20 l dung dịch thử ghi nhận sắc ký đồ, diện tích của pic AGS-IV Nồng độ AGS-IV trong dung dịch thử (µg/ml) theo công thức:

St: Diện tích pic AGS-IV trên sắc ký đồ của dung dịch thử

Ct: Nồng độ của AGS-IV trong dung dịch thử (µg/ml)

a là giá trị hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính

b là bậc tự do của đường hồi quy tuyến tính

mcd: khối lượng cao (g)

H là hàm ẩm của cao (%)

Thẩm định phương pháp định lượng [40]

 Độ đặc hiệu:

* Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích:

 Dung dịch mẫu placebo

 Dung dịch chuẩn AGS-IV

- Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa logarit cơ số e của nồng độ chất chuẩn và logarit cơ số e của diện tích pic thu được trên các sắc ký đồ

* Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,995

- Thực hiện như phần độ lặp lại nhưng vào ngày khác

- Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu ở mỗi ngày và giữa hai ngày

- Xác định tỷ lệ (%) tìm lại được so với nồng độ ban đầu

* Yêu cầu:

- Tỷ lệ thu hồi đạt 95,0-105,0% ở mỗi mức nồng độ

- RSD của tỷ lệ thu hồi tại mỗi mức nồng độ ≤ 2%

Định lƣợng AGS-IV trong các mẫu cao đặc

2.3 Xử lí số liệu

Các số liệu nghiên cứu đƣợc tính dựa vào công thức hoặc sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Bào chế cao đặc

3.1.1 Khảo sát các thông số điều chế cao

- Cân các mẻ cao gồm: 40g Hoàng kỳ; 20g Đảng sâm, 20g Đương quy, 20 g Bạch truật, Trần bì 12g, Thăng ma 6g, Sài hồ 6g, Cam thảo 10g (tương ứng với 2 thang thuốc)

- Khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung môi (DL/DM)

+ Khảo sát các tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/5; 1/7; 1/9 (lượng nước tương ứng là 750 ml; 950 ml; 1200ml)

+ Đổ lượng nước tương ứng với các tỷ lệ, đánh dấu mực nước Đun 3 lần, mỗi lần sôi 90 phút, đảm bảo tỷ lệ DL/DM trong quá trình chiết Rút dịch chiết sau mỗi lần đun, lọc nóng qua vải gạc Gộp các dịch chiết, để lắng qua đêm, gạn, lọc lấy dịch qua vải gạc

+ Cô trực tiếp ở 100oC, trong quá trình cô khuấy để tăng tốc độ bay hơi, đến khi được cao lỏng (khoảng 1:1) Cô cách thủy đến khi đạt thể chất cao đặc

+ Đóng gói trong túi PE kín, ghi nhãn

+ Bảo quản nơi khô, mát

+ Quy trình bào chế được thực hiện lặp lại 3 mẫu đối với mỗi tỷ lệ

- Khảo sát số lần chiết:

+ Cố định tỷ lệ DL/DM là 1/7 Khảo sát số lần chiết là 2 lần, 3 lần, 4 lần, mỗi lần 90 phút kể từ lúc sôi Rút dịch chiết sau mỗi lần đun, lọc nóng qua vải gạc Gộp các dịch chiết, để lắng qua đêm, gạn, lọc lấy dịch qua vải gạc

+ Cô trực tiếp ở 100oC, trong quá trình cô khuấy để tăng tốc độ bay hơi, đến khi được cao lỏng (khoảng 1:1) Cô cách thủy đến khi đạt thể chất cao đặc

+ Đóng gói trong túi PE kín, ghi nhãn

+ Bảo quản nơi khô, mát

+ Quy trình bào chế được thực hiện lặp lại 3 mẫu đối với mỗi tỷ lệ