Thử nghiệm sử dụng phân trùn quế (Perionyx excavatus) làm môi trường cơ bản trong nuôi cấy In Vitro lan thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo):

LỜI MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật đã được sử dụng nhằm sản xuất các thành phần dược liệu quan trọng, để tạo ra được những hợp chất mong muốn người ta

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC & MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỀ TÀI:

THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG PHÂN TRÙN QUẾ

(Perionyx excavatus) LÀM MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY IN VITRO LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

Hoàng Thị Hằng Nguyễn Huỳnh Trâm Anh

ĐỒNG NAI, THÁNG 12 NĂM 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC & MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỀ TÀI:

THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG PHÂN TRÙN QUẾ

(Perionyx excavatus) LÀM MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY IN VITRO LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

Sinh viên thực hiện: Hoàng Thị Hằng

Nguyễn Huỳnh Trâm Anh

Giáo viên hướng dẫn: ThS Đoàn Thị Tuyết Lê

KS Đỗ Tấn Phát

ĐỒNG NAI, THÁNG 12 NĂM 2017

LỜI CẢM ƠN

Đề tài tốt nghiệp này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Kỹ Thuật Hóa Học & Môi trường, Trường Đại học Lạc Hồng dưới sự hướng dẫn của ThS Đoàn Thị Tuyết Lê và KS Đỗ Tấn Phát, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học & Môi trường, Trường Đại học Lạc Hồng

Trong suốt quá trình thực hiện và để hoàn thành bài báo cáo nghiên cứu này, ngoài năng lực và sự cố gắng của bản thân, chúng em đã nhận được sự giúp đỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể

Trước tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đoàn Thị Tuyết Lê và thầy Đỗ Tấn Phát đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ chúng em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài này Cảm ơn thầy cô đã tạo điều kiện cho chúng

em có cơ hội học hỏi thêm những kiến thức mới

Chúng em cũng xin gởi lời cảm ơn chân thành đến ban lãnh đạo khoa Kỹ Thuật Hóa Học & Môi Trường đã truyền thụ kiến thức cho chúng em trong suốt quá trình học tập và tạo điều kiện cho chúng em thực hiện đề tài này

Và cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, giúp đỡ

và động viên chúng em vượt qua những khó khăn trong học tập

Chúng em xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Giới thiệu về phân Trùn Quế 2

1.1.1 Phân loại 2

1.1.2 Sự phân bố của Trùn Quế 2

1.1.3 Đặc tính của Trùn Quế 2

1.1.4 Lợi ích của Trùn Quế 3

1.1.5 Lợi ích của phân Trùn Quế 5

1.2 Giới thiệu về lan Thạch hộc tía 7

1.2.1 Vị trí phân loại 7

1.2.2 Đặc điểm thực vật học của lan Thạch hộc tía 7

1.2.3 Sự phân bố của cây lan Thạch hộc tía 7

1.2.4 Công dụng của cây lan Thạch hộc tía 8

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh cơ quan ở thực vật 9

1.3.1 Vai trò sinh lý của các nguyên tố khoáng thiết yếu 9

1.3.2 Các chất điều hòa sinh trưởng 12

1.3.3 Dịch hữu cơ 13

1.3.4 Trạng thái môi trường 13

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 14

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 15

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 17

2.2 Vật liệu 17

2.2.1 Mẫu nghiên cứu 17

2.2.2 Hóa chất 17

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy 18

2.2.4 Môi trường nuôi cấy 18

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Nội dung thí nghiệm 19

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của phân trùn quế lên sự thay đổi khối lượng tươi của lan Thạch hộc tía 25

3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA lên sự nhân chồi lan Thạch hộc tía 27

3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của hàm lượng sắn dây lên sự nhân chồi lan Thạch hộc tía 29

3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của hàm lượng NAA lên sự ra rễ lan Thạch hộc tía 31 3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của hàm lượng sắn dây lên sự ra rễ lan Thạch hộc tía 34 3.6 Xác định quy trình nhân giống in vitro lan Thạch hộc tía 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT 2,4 – D : 2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid

BA : 6 – benzyladenine

CNSHTV : Công nghệ sinh học thực vật

CNTBTV : Công nghệ tế bào thực vật

IAA : β - indol acetic acid

IBA : Indole – 3 – butyric acid

MS : Môi trường Murashige và Skoog (1962)

NAA : α – naphthaleneacetic acid

PLB : Thể giống protocorm (Protocorm – like body)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân tích hóa học của phân trùn quế 6

Bảng 2.1 Hàm lượng dinh dưỡng khoáng của phân trùn quế Củ Chi 20

Bảng 2.2 Hàm lượng phân trùn quế được sử dụng làm môi trường cơ bản 21

Bảng 2.3 Nồng độ BA, NAA lên sự nhân chồi lan Thạch hộc tía 22

Bảng 2.4 Hàm lượng sắn dây lên sự nhân chồi lan Thạch hộc tía 23

Bảng 2.5 Hàm lượng sắn dây lên sự tạo rễ lan Thạch hộc tía 24

Bảng 3.1 Sự thay đổi hàm lượng và đặc điểm của protocorm trên các môi trường nền bổ sung hàm lượng phân trùn quế khác nhau 25

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA lên sự nhân chồi lan Thạch hộc tía 28

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng sắn dây lên sự nhân chồi lan Thạch hộc tía 30

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng NAA lên sự ra rễ lan Thạch hộc tía 32

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng sắn dây lên sự ra rễ lan Thạch hộc tía 34

DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng phân trùn quế lên sự thay đổi khối lượng tươi

protocorm lan Thạch hộc tía 26

Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA lên sự nhân chồi lan

Thạch hộc tía 28

Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng sắn dây lên sự nhân chồi lan Thạch hộc tía 31 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng NAA lên sự ra rễ lan Thạch hộc tía 32 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng sắn dây lên sự ra rễ lan Thạch hộc tía 34

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Thiết bị dùng trong thí nghiệm 18 Hình 3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng phân trùn quế lên sự thay đổi khối lượng tươi

protocorm lan Thạch hộc tía 27

Hình 3.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA lên sự nhân chồi lan

Thạch hộc tía 29

Hình 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng sắn dây lên sự nhân chồi của lan Thạch hộc tía 31 Hình 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng NAA lên sự ra rễ lan Thạch hộc tía 33 Hình 3.5 Kết quả khảo sát hàm lượng sắn dây lên sự ra rễ lan Thạch hộc tía trên môi

trường cơ bản chứa phân trùn quế 35

LỜI MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật đã được sử dụng nhằm sản xuất các thành phần dược liệu quan trọng, để tạo ra được những hợp chất mong muốn người ta đã sử dụng các loại môi trường nhân tạo nhằm bổ sung các chất dinh dưỡng thiết yếu cho cây và các điều kiện sống khác giúp cho cây có thể sinh trưởng và phát triển, ngoài ra có thể điều khiển được quá trình sống của cây mà vẫn thu nhanh được các sản phẩm có giá trị khác nhau

Từ lâu đời người nông dân đã biết tạo ra phân bón cho cây từ phân thải động vật được ủ hoai mục rồi đem đi bón cho hoa màu giúp cho cây trồng xanh tốt tăng năng suất và cải tạo đất sau mỗi mùa vụ Cây nuôi cấy mô cũng giống như những cây được nuôi trong điều kiện tự nhiên, cũng có thể sử dụng các loại phân bón hữu cơ giàu dinh dưỡng thay thế cho các hợp chất dinh dưỡng vô cơ để sinh trưởng và phát triển trong điều kiện nhân tạo

Phân trùn quế là một loại phân hữu cơ thiên nhiên giàu dinh dưỡng được người dân sử dụng làm phân bón cho cây trồng trong nhiều năm trở lại đây, phân trùn quế có chứa đầy đủ các thành phần dinh dưỡng khoáng thiết yếu mà cây trồng có thể sử dụng trong quá trình sinh trưởng và phát triển đem lại năng suất cao

Chính vì những lý do trên mà đề tài “THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG PHÂN TRÙN

QUẾ (Perionyx excavatus) LÀM MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY IN

VITRO LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” được thực

hiện nhằm thay thế các hợp chất vô cơ mà trước giờ đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và sản xuất với mong muốn giảm hàm lượng hóa chất ở mức tối đa trong quá trình nuôi cấy thu trực tiếp các hợp chất có giá trị dược liệu

Mục tiêu:

- Khảo sát nồng độ phân trùn quế phù hợp làm môi trường cơ bản trong nuôi

cấy in vitro lan Thạch hộc tía

- Xây dựng quy trình nhân giống in vitro lan Thạch hộc tía sử dụng môi

trường cơ bản phân trùn quế

Mục đích: Hướng tới sử dụng nguồn dinh dưỡng hữu cơ trong nuôi cấy in vitro tế

bào huyền phù nhằm mục đích tách chiết các hợp chất thứ cấp có giá trị dược liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về phân Trùn Quế

Loài : Perionyx excavatus

1.1.2 Sự phân bố của Trùn Quế

Perionyx excavatus là một loại giun đất được tìm thấy phổ biến ở một khu vực

rộng lớn ở châu Á nhiệt đới mặc dù nó đã được vận chuyển tới Châu Âu và Bắc Mỹ và một số nước khác [16] Còn có tên khác là trùn Mồi Câu hay trùn Đỏ Thường ẩn náu dưới các hòn gạch, hòn đá, các miếng gỗ hoặc ngay dưới các lớp phân, rãnh nước cạnh các chuồng lợn hoặc chuồng trâu [7] Thường sống trong môi trường có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy, trong tự nhiên ít tồn tại với phần thể lớn và không có khả năng cải tạo đất trực tiếp như một số loài trùn địa phương sống trong đất Trùn quế hiện nay

là một trong những giống trùn đã được thuần hoá, đưa vào nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ

1.1.3 Đặc tính của Trùn Quế

1.1.3.1 Đặc tính sinh học

Trùn quế có kích thước tương đối nhỏ, độ dài vào khoảng 10 - 15 cm, thân hơi dẹt, bề ngang của con trưởng thành có thể đạt 0.1 – 0.2 cm, có màu từ đỏ đến màu mận chín (tùy theo tuổi), màu nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn Cơ thể trùn có hình thon dài nối với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ [12]

Trùn quế là loài trùn đất ăn phân Chúng có thể hoàn toàn sống trong phân mà không cần đất [7] Lượng thức ăn của chúng mỗi ngày được nhiều nhà khoa học ghi nhận là tương đương với trọng lượng cơ thể của nó Sau khi tiêu hóa các vi sinh vật cộng sinh, chúng thải phân ra ngoài, phân này rất giàu dinh dưỡng Phân ra khỏi cơ thể nhưng vẫn còn hoạt động ở “màng dinh dưỡng” một thời gian dài, đó là một trong

những nguyên nhân làm cho phân trùn có hàm lượng dinh dưỡng cao và có hiệu quả cải tạo đất tốt hơn dạng phân hữu cơ phân hủy bình thường trong tự nhiên

1.1.3.2 Đặc tính sinh lý

Trùn quế rất nhạy cảm, chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và biên độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn Nhiệt độ thích hợp nhất với trùn quế nằm trong khoảng từ 20 - 30oC, ở nhiệt độ khoảng 30oC và độ ẩm thích hợp chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh Ở nhiệt độ quá thấp, chúng sẽ ngừng hoạt động và có thể chết hoặc khi nhiệt độ của luống nuôi lên quá cao cũng bỏ đi Chúng có thể chết khi điều kiện khô và nhiều ánh sáng nhưng chúng lại có thể tồn tại trong môi trường nước

có thổi O2

Trùn quế rất thích sống trong môi trường ẩm ướt và có độ pH ổn định Trùn quế

ăn bất kỳ chất thải hữu cơ nào có thể phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm…) Tuy nhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng hơn, giúp cho chúng sinh trưởng và sinh sản tốt hơn Trong tự nhiên, trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rãnh, hoặc nơi có nhiều chất hữu cơ dễ phân hủy và thối rữa như trong các đống phân động vật, các đống rác hoai mục Trùn quế rất ít hiện diện trên các đồng ruộng canh tác dù nơi đây có nhiều chất thải hữu cơ, có

lẽ vì tỷ lệ C/N của những chất thải này thường cao, không hấp dẫn và không đảm bảo điều kiệm ẩm độ thường xuyên [12]

Trùn quế sinh sản rất nhanh Trong điều kiện thuận lợi, chúng tăng theo cấp số nhân Tuy cơ thể chúng không lớn nhưng số lượng nhiều nên sinh khối tạo ra rất đáng

kể [7]

1.1.4 Lợi ích của Trùn Quế

Trùn là loại thức ăn giàu đạm, chất lượng cao để nuôi gia súc, gia cầm và thủy hải sản, làm giảm chi phí thức ăn chăn nuôi Hàm lượng protein thô của trùn chiếm 70% trọng lượng khô, nó tương đương với bột cá, được dùng trong thức ăn chăn nuôi Trùn chứa 12 loại acid amin, nhiều loại vitamin, chất khoáng cần thiết trong chăn nuôi Trùn kích thích sự sinh trưởng tự nhiên, bột trùn không có mùi tanh, hấp dẫn vật nuôi Bảo quản được lâu hơn thức ăn có dùng bột cá (Trại giun quế PHT 2008)

Phân trùn quế là một loại phân hữu cơ thiên nhiên giàu dinh dưỡng Thức ăn chủ yếu của trùn quế là phân động vật, rau củ quả, cây thân thảo và các loại rác hữu cơ

Sau khi chúng tiêu hóa sẽ trở thành phân, có chứa một số acid amin như: tyrozin, arginin, cystin, methionin… (Trại giun quế PHT 2008)

Phân trùn chứa một hỗn hợp vi sinh có hoạt tính cao, dễ hòa tan trong nước, chứa hơn 50% chất mùn Do đó, phân trùn không chỉ kích thích tăng trưởng cây trồng, mà còn tăng khả năng cải tạo đất Phân trùn còn chứa các khoáng chất được cây trồng hấp thụ một cách trực tiếp Phân giun là loại phân sạch thiên nhiên quý giá để bón cho hoa, cây cảnh, rau quả trong nông nghiệp sạch, được thị trường rất ưa chuộng

Giá trị dinh dưỡng của trùn quế phơi khô như sau: vật chất khô chiếm 93.62%, protein thô chiếm 59.9%, năng lượng thô chiếm 402.09 kcal/100g, béo thô chiếm 7.43%, canxi chiếm 0.11%, photpho chiếm 0.118% Theo Trần Thị Dân và cs (2006) giá trị dinh dưỡng của trùn quế trước khi chế biến như sau: vật chất khô chiếm 19.24%, protein thô chiếm 13.41%, béo chiếm 1.17%, khoáng tổng số chiếm 1.48% Sau khi phơi, vật chất khô của trùn quế là 88.68%, protein là 57.14%, béo là 4.89%, khoáng tổng số là 7.9% Sau khi rang, vật chất khô của trùn quế là 91.69%, protein là 41.07%, béo là 4.24%, khoáng tổng số chiếm 36.88% Như vậy, trùn quế rất giàu các chất dinh dưỡng, phù hợp để làm thức ăn chăn nuôi, đặc biệt là chăn nuôi gia cầm [12]

Tác dụng dược lý của trùn quế đã được nghiên cứu và đưa ra kết quả tóm tắt [2]: Tác dụng giảm sốt: trong những sách cổ đã chỉ ra rằng giun đất có tác dụng chữa sốt nặng (đại nhiệt) Năm 1914 đã có một tác giả người nhật (Câu Khẩn) chứng minh rằng trong trùn đất có chất trị sốt Đến năm 1915 hai tác giả người nhật bản khác (Điền Trung và Ngạch Điền) đã thí nghiệm trên súc vật và chứng minh rằng chất chữa sốt trong trùn đất là lumbrifebrin

Tác dụng giãn khí quản: năm 1937 Triệu Thừa Cố, Chu Hoàng Bịch và Trường Xương Thiệu đã dùng phổi chuột bạch và thỏ để thí nghiệm và đã chứng minh được rằng trùn đất có tác dụng làm giãn ống phổi (chi khí quản) trước khi thí nghiệm các nhà nghiên cứu đã tiêm vào phổi súc vật histamin hoặc pilocacpin nhằm quan sát sự giãn ống phổi rõ rệt hơn

Tác dụng chống histamin: Triệu Thừa Cố và cộng sự đã dùng thành phần có nito trong trùn đất tiêm vào tĩnh mạch những con vật còn sống để xem tác dụng kháng

histamin của trùn đất thì nhận thất rằng chất lấy từ trùn đất có khả năng bảo vệ không

chết 50% số con vật được tiêm liều độc chết của histamin

Tác dụng hạ huyết áp và ức chế sự co bóp của ruột non: Triệu Thừa Cố và cộng

sự đã từng dùng chất có nito trong trùn đất để thí nghiệm tác dụng hạ huyết áp và ức chế tính co bóp của ruột non và so sánh với chất ademozin thì thất tác dụng tương tự mặc dù tính chất hóa học không giống nhau

Tác dụng phá huyết: theo báo của nhà nghiên cứu Nhật Bản Bát Lộc (1911) thì chất lumbritin có tác dụng phá huyết

1.1.5 Lợi ích của phân Trùn Quế

Phân trùn quế là chất thải được thu hoạch sau khi con trùn quế ăn chất hữu cơ Đây là loại phân tự nhiên tốt nhất, loại phân hữu cơ có hàm lượng dinh dưỡng rất cao Quá trình sản xuất phân trùn quế được gọi là ủ sâu (worm composting)

Phân trùn quế có chứa rất nhiều loại dinh dưỡng khác nhau Phân trùn quế như một môi trường sinh khối, môi trường sống để vi sinh vật phát triển Tạo môi trường xung quanh vùng rễ tốt, giúp cây dễ hấp thụ chất dinh dưỡng và khỏe mạnh hơn, kháng bệnh tốt và lớn nhanh

Phân trùn làm giảm lượng acid carbon trong đất và gia tăng nồng độ nitơ ở trạng thái cây trồng có thể hấp thụ được Chất acid humic ở trong phân trùn có thể giúp cây trồng dễ dàng hấp thụ nhiều hơn bất kỳ chất dinh dưỡng nào khác Chất IAA (indol acetic aicd) có trong phân trùn là một trong những chất kích thích hữu hiệu, giúp cây trồng tăng trưởng tốt [10] Chống sự xói mòn và tăng khả năng giữ nước trong đất Chất mùn trong phân trùn loại trừ được những độc tố, nấm, và vi khuẩn có hại trong đất có thể ngăn ngừa các bệnh về rễ và đẩy lùi nhiều bệnh của cây trồng Phân trùn có tác dụng liều hòa môi trường đất rất tốt, giúp cây phát triển ngay cả khi nồng độ pH trong đất quá cao hoặc thấp Việc nuôi trùn quế lấy phân, chính là việc áp dụng công nghệ xử lý rác thải hữu cơ bằng con trùn quế một trong những công nghệ rẻ tiền nhất Thành phần hóa học

Dựa theo kết quả thử nghiệm thành phần hóa học phân Trùn Quế của công ty cổ phần TRÙN QUẾ CỦ CHI 15/04/2017 thử nghiệm tại TRUNG TÂM DỊCH VỤ PHÂN TÍCH THÍ NGHIỆM TP.HCM

Bảng 1.1 Phân tích hóa học của phân trùn quế

STT/No

Chỉ tiêu kiểm nghiệm/

TCVN 9294: 2012

(*) Phương pháp được VILAS công nhận

1.2 Giới thiệu về lan Thạch hộc tía

Tên khoa học: Dendrobium officinale Kimura et Migo

1.2.2 Đặc điểm thực vật học của lan Thạch hộc tía

Cây lan Thạch hộc tía có tên khoa học là Dendrobium officinale Kimura et Migo

Còn được gọi là Kim thoa Thạch hộc, Thiết bì Thạch hộc, Kim Thạch hộc Thuộc họ lan Orchidaceae

Cây lan Thạch hộc tía là một loại cây phụ sinh trên những cành cây cao, thân mọc thẳng đứng cao khoảng 0.3 – 0.6m, thân hơi dẹt, phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2.5 – 3.0cm, có vân dọc Lá hình thuôn dài trên có 5 gân dọc, phía cuống tù gần như không cuống, ở đầu hơi cuộn hình móng, dài 12cm, rộng 2 – 3cm Cụm hoa mọc thành chùm từ 2 – 4 hoa trên những cuống dài 2 – 3cm Hoa to màu hồng hay điểm hồng, cánh môi hình bầu dục nhọn, dài 4 – 5cm rộng 3cm cuộn thành hình phễu, ở họng hoa có những điểm màu tím Mùa hoa nở từ tháng 2 đến tháng 4 Nang quả hơi hình thoi, khi khô tự mở quả chứa rất nhiều hạt nhỏ như bụi phấn Mùa quả từ tháng 4 đến tháng 6 [2]

1.2.3 Sự phân bố của cây lan Thạch hộc tía

Lan Thạch hộc tía mọc hoang ở khắp miền rừng núi các tỉnh miền Bắc, sống trên vách đá hoặc thân cây phủ rêu ở độ cao từ 800 – 1000m [9], trong điều kiện tự nhiên nhiệt độ không khí bình quân 12 – 18oC, lượng mưa 900 – 1.500mm có độ ẩm 70% như Trung Quốc, Myanmar, Lào, Ấn Độ, Việt Nam và nhiều nước nhiệt đới, cận nhiệt đới khác [17]

Ở Việt Nam, Thạch hộc tía phân bố khắp ở các tỉnh miền Bắc, nhiều nhất ở miền Trung cây tập trung sống ở dốc núi râm mát, độ ẩm cao và vách đá Thạch hộc tía

thường mọc phụ sinh trên cây gỗ cao lớn hay các vách đá có mọc rêu cao từ 30 – 50cm, thường mọc thành khóm, [2]

1.2.4 Công dụng của cây lan Thạch hộc tía

1.2.4.1 Thành phần hóa học

Theo Dược điển Trung Quốc D officinale có nhiều hoạt tính sinh học quý [9]:

Polysaccharides : (23%)

Alkaloids : (0.02-0.04%)

Amino-acids : (135 mg/g cây khô)

Nhiều kim loại như Sắt : (292 mcg/g)

Có lợi cho dạ dày, làm ẩm phổi, giảm ho, thúc đẩy sản xuất các chất hoạt hóa cho

cơ thể và kéo dài tuổi thọ [23]

Thạch hộc thường được dùng chữa những bệnh sốt nóng, khô cổ, khát nước, người háo, bứt rứt khó chịu Theo đông y, Thạch hộc dưỡng âm sinh tân, dùng trong các bệnh tân dịch bất túc như miệng khô, cổ họng khô hay do tân dịch không đủ mà không muốn ăn, mắt nhìn kém, khớp xương sưng đau hay không có lực Theo tài liệu

cổ, Thạch hộc vị ngọt, nhạt, tính hơi lạnh, vào 3 kinh phế, vị và thận Có tác dụng

dưỡng âm, ích vị sinh tân Dùng chữa bệnh sốt, tân dịch khô kiệt D.officinale đứng

đầu trong sách Thần Nông, công trình dược học đầu tiên của Trung Hoa cổ đại về các cây thuốc quý, được coi là thứ đứng đầu trong chín loại tiên thuốc và đặc biệt là chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp [9]

1.2.4.3 Giá trị kinh tế

Thạch hộc được chế biến thành phong đấu, ở Hong Kong vì số lượng thiếu hụt nghiêm trọng nên nó có giá cực kỳ đắt giá cao nhất từ 12000-30000¥ cho mỗi kg

[21].Giá Thạch hộc hảo hạng cực kỳ đắt nên ở thị trường Trung Quốc có giá từ 30 đến

60 triệu VNĐ/kg, còn ở Đài Loan phong đấu sẽ có giá từ 1.000 – 3.000 USD/kg Giá một cây Thạch hộc tươi ba năm tuổi có giá 25.000 – 35.000 VNĐ, một triệu cây Thạch hộc trồng trên diện tích một ha đất có thể cho thu từ 25 – 30 tỷ đồng trong ba năm Phong đấu (TiepiFengdou) là một trong những thực phẩm chức năng được sản xuất và bán nhiều nhất ở Trung Quốc giá trị sản lượng của Thạch hộc thiết bì đạt hàng

tỷ NDT năm 2011 [9]

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh cơ quan ở thực vật

Trong nuôi cấy in vitro, các yếu tố hóa học và yếu tố vật lý phải được cung cấp

đầy đủ Môi trường dinh dưỡng phải chứa tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước Các nhân tố vật lý như nhiệt độ,

pH, môi trường khí, ánh sáng, cũng phải được duy trì phù hợp với từng loại cây nghiên cứu Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, KnudsonC , Lindemann… Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học gồm: khoáng đa lượng, khoáng

vi lượng và nguồn carbon

1.3.1 Vai trò sinh lý của các nguyên tố khoáng thiết yếu

Các nguyên tố đa lượng

1.3.1.2 Lưu Huỳnh (S)

Dạng lưu huỳnh vô cơ được cây hút chủ yếu là (SO42-) tan trong dung dịch đất Lưu huỳnh vào cây sẽ tham gia hình thành nên một số hợp chất quan trọng, có ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng, quá trình trao đổi chất và hoạt động sinh lý của cây Khi cung cấp đầy đủ lưu huỳnh thì cây sinh trưởng thuận lợi vì quá trình tổng hợp protein bình thường, quá trình trao đổi chất cũng như các hoạt động sinh lý tiến hành tốt Khi cây thiếu lưu huỳnh, biểu hiện các triệu chứng đặc trưng giống với thiếu nitơ

là bệnh vàng lá [6]

1.3.1.3 Kali (K)

Kali trong đất thường ở dạng ion K+, còn ở trong cây kali chỉ tồn tại dưới dạng ion K+ tự do, rất linh động nhưng không có vai trò tham gia cấu tạo nên bất kỳ một hợp chất hữu cơ nào K có tác dụng làm giảm độ nhớt của chất nguyên sinh, tăng mức

độ thủy hóa của keo nguyên sinh tức là làm tăng các hoạt động sống diễn ra trong tế bào

Kali điều chỉnh sự đóng mở của khí khổng Sự đóng mở của khí khổng có vai trò điều chỉnh quan trọng trong quá trình trao đổi nước và quá trình đồng hóa CO2 của lá cây, nên kali có ý nghĩ quan trọng trong tăng năng suất kinh tế Làm tăng tính chống chịu của cây đối với các điều kiện ngoại cảnh bất thuận như tính chống bệnh, tính chống chịu hạn, chịu nóng [6]

Các nguyên tố vi lượng

Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục,… Chúng

có vai trò điều chỉnh các hoạt động sống của cây [6]

1.3.1.6 Sắt (Fe)

Cây hút sắt dưới dạng ion Fe2+, còn dạng Fe3+ gây độc cho cây nên nó phải được khử thành Fe2+ trước khi xâm nhập vào cây Vai trò quan trọng nhất của sắt là hoạt hóa các enzyme nó có mặt trong nhóm hoạt động của một số enzyme oxi hóa khử như catalaza, peroxidaza Nó không tham gia vào thành phần của diệp lục nhưng lại có ảnh hưởng quyết định đến sự tổng hợp diệp lục trong cây Hàm lượng Fe trong lá cây có quan hệ mật thiết đến hàm lượng diệp lục trong chúng [6]

1.3.1.7 Mangan (Mn)

Mn là nguyên tố vi lượng tham gia vào hoạt hóa rất nhiều enzyme của chu trình Krebs, sự khử nitrat và quang hợp Do đó nó ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý quan trong như quang hợp, hô hấp và dinh dưỡng nitơ của cây trồng [6]

1.3.1.8 Đồng (Cu)

Đồng hoạt hóa nhiều enzyme oxi hóa khử và có trong thành phần của thành viên của chuỗi chuyển vận điện tử trong quang hợp Thiếu đồng thưởng hay xảy ra trên đất đầm lầy Và mắc một số bệnh đặc trưng như bệnh chảy gôm hay xảy ra ở cây ăn quả [6]

1.3.1.9 Kẽm (Zn)

Kẽm tham gia hoạt hóa khoảng 70 enzyme liên quan đến nhiều quá trình biến đổi chất và hoạt động sinh lý như quá trình dinh dưỡng photpho, tổng hợp protein, tổng hợp phytohoocmon (auxin) tăng cường hút các cation khác nên ảnh nhiều đến quá trình sinh trưởng của cây

Thiếu kẽm sẽ rối loạn trao đổi auxin nên sinh trưởng bị ức chế, sinh trưởng chậm, lá cây bị biến dạng, ngắn, nhỏ và xoăn, đốt ngắn và biến dạng [6]

1.3.1.10 Bo (B)

Bo có ảnh hưởng rõ rệt lên sinh trưởng của cây, đặc biệt là mô phân sinh đỉnh, có thể liên quan đến vai trò của B trong tổng hợp RNA B ảnh hưởng đến quá trình phân hóa hoa, thụ phấn, thụ tinh và sự đậu quả Khi thiếu B thì chồi ngọn bị chết, các chồi

bên cũng thối dần, hoa không hình thành, quá trình thụ tinh và hậu quả kém, quả rụng,

rễ sinh trưởng kém, lá bị dày lên [6]

1.3.1.11 Molypden (Mo)

Mo có vai trò rất quan trọng trong việc trao đổi nitơ Đặc biệt đối với cây họ đậu

vì nó làm tăng khả năng cố định đạm của các vi sinh vật trong nốt sần Ngoài ra Mo còn có vai trò trong tổng hợp vitamin C và hình thành lục lạp Thiếu Mo sẽ ức chế sự dinh dưỡng đạm của cây trồng nói chung và đặc biệt của các cây họ đậu [6]

Nguồn carbon

Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…một số loại đường như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccharose [14]

1.3.2 Các chất điều hòa sinh trưởng

Còn được gọi là Phytohoocmon, là các hợp chất có khả năng thực hiện được mối tương tác giữa các tế bào, mô và cơ quan Là những chất hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau không những tham gia điều tiết các quá trình sinh trưởng mà còn là tác nhân quan trọng của các quá trình chín, già, hiện tương stress, vận chuyển vật chất và nhiều hoạt động sống khác [8]

Các chất điều hòa sinh trưởng được chia thành hai nhóm chính: chất kích thích sinh trưởng (auxin, cytokinine, gibberelline) và chất ức chế sinh trưởng (ethylen, các chất phenol ) [3]

Auxin: là phytohoocmon đầu tiên trong cây được phát hiện vào năm 1934 Đó là một hợp chất tương đối đơn giản: acid indol-3-acetic (IAA) Các auxin tổng hợp được

sử dụng rộng rãi trong sản xuất như IBA, NAA, 2,4D [6] Auxin được xem là hoocmon hình thành rễ, vai trò của auxin với sự hình thành rễ được chứng minh rõ ràng trong nuôi cấy mô Nếu trong môi trường có bổ xung auxin thì mô nuôi cấy chỉ xuất hiện rễ mà thôi [6]

Cytokinine: là nhóm phytohoocmon thứ ba được phát hiện vào năm 1963 Cytokinine trong cây chủ yếu là chất zeatin Hiệu quả đặc trưng nhất của cytokinine là hoạt hóa sự phân chia tế bào Tỷ lệ auxin/cytokinine rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy Trong môi trường nuôi cấy mô, nếu chỉ có

cytokinine mà không có auxin thì mô nuôi cấy chỉ hình thành chồi, lợi dụng hiệu quả này mà người ta sử dụng cytokinine để tăng sự hình thành chồi trong nuôi cấy mô để tăng hệ số nhân giống [6]

1.3.3 Dịch hữu cơ

Để tăng cao hiệu quả quá trình nuôi cấy, người ta đã bổ sung một số loại dịch chiết hữu cơ như: khoai tây, cà chua, chuối, nước dừa đã được sử dụng và đem lại hiệu quả

Sắn dây

Ở Việt Nam, tinh bột sắn dây từ lâu đã được biết là một loại sản phẩm có giá trị thực và dược phẩm cao Thành phần tinh bột sắn dây nhìn chung khá phù hợp về mặt

dinh dưỡng đối với nhu cầu của cây nuôi cấy in vitro Thành phần bột sắn dây được

liệt kê trong bảng thành phần thực phẩm Việt Nam của bộ Y tế Viện dinh dưỡng chứa các chất như Ca, Fe, P đây là những chất góp phần to lớn trong việc giúp cây sinh trưởng và phát triển [1] Trong bài nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung

tinh bột sắn dây đến sinh trưởng, phát triển và đặc điểm kiểu hình của lan Dendrobium

in vitro, Phạm Thị Lệ Huyền [13], do TS Bùi Minh Trí và Th.S Nguyễn Văn Vinh

Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đồng hướng dẫn, đã khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung tinh bột sắn dây đến sinh trưởng, phát triển và đặc điểm kiểu

hình của lan Dendrobium in vitro Kết quả cho thấy việc bổ sung các tỷ lệ khác nhau

của tinh bột sắn dây có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của lan

Dendrobium trong điều kiện in vitro

Do đó trong đề tài này nhóm nghiên cứ đã áp dụng và sử dụng bột sắn dây để

phục vụ cho thí nghiệm nhân chồi và sự tạo rễ trên cây lan Thạch hộc tía Dendrobium

officinale Kimura et Migo cho các thí nghiệm nhân chồi và ra rễ với các hàm lượng

(0g/l; 5g/l; 10g/l; 20g/l; 30g/l; 40g/l; 50g/l; 60g/l)

1.3.4 Trạng thái môi trường

Thạch (agar) được bào chế từ tảo đỏ, dùng làm chất nền cho môi trường nuôi cấy, cố định cây trong môi trường nuôi cấy Vì có nguồn gốc từ thực vật tự nhiên nên agar không gây độc cho cây Hàm lượng agar được thêm vào môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào phẩm chất của thạch và đối tượng nuôi cấy, thường người ta dùng từ 0.6 –

0.8%, nếu nồng độ thấp 0.4% môi trường mềm loãng, nhất là ở pH, nồng độ cao 1.0% môi trường bị cứng khó cấy và mô khó tiếp xúc với môi trường

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các nghiên cứu về nhân giống in vitro vẫn đang còn hạn chế trong các nghiên

cứu về Lan Thạch hộc tía, chủ yếu là những nghiên cứu về sản xuất các hợp chất có giá trị dược liệu và các dẫn xuất khác của Thạch hộc tía

Năm 2014, trong nghiên cứu “Tác động ngoài sinh của salicylic acid lên sản

phẩm polysaccharides của Dendrobium officinale” của Z Yuan và cộng sự [23] Để sản xuất các polysaccharides hoạt tính từ D officinale thông qua nuôi cấy mô, các tác

động của axit salicylic lên sự tích tụ của polysaccharide được nghiên cứu Salicylic acid (SA) có lợi cho việc tăng các thành phần của polysaccharide Sản xuất polysaccharide cao nhất xảy ra trên môi trường cung cấp 100 μmol·L-1 axit salicylic Sau 30 ngày nuôi cấy, polysaccharide đạt được 10.09% và 15.81% theo phương pháp phenol-sulfuric acid và phương pháp điều chế màu 3.5-dinitrosalicylic (DNS) Thành phần chính của polysaccharide, glucose và mannose, được xác định bằng cách tạo ra từ dẫn xuất trước cột – HPLC (High performance liquid chromatography) Kết quả cho thấy hàm lượng glucose giảm và hàm lượng mannose tăng lên khi nồng độ axit salicylic khác nhau Ứng dụng SA ảnh hưởng đến quá trình sản xuất polysaccharide thay vì sự giảm hoạt động của enzyme chuyển hóa sucrose đã được thay thế bởi SA Các thí nghiệm cho thấy acid salicylic có thể là một hợp chất hữu hiệu để tăng cường

sản xuất các polysaccharide từ D Officinale Polysaccharides được phát hiện là chất

có thể gây ức chế sự sinh trưởng của các tế bào ung thư có tiềm năng rất lớn cho tương lai trong việc điều trị ung thư

Năm 2014, nhóm tác giả Xin Qian, Caixia Wang, Tong Ouyang, Min Tian [23]

đã nghiên cứu sự ra hoa và hạt trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo Mẫu được sử dụng trong bài là chồi lan Dendrobium officinale Kimura et Migo được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0.2mg BA, 0.05mg NAA

Chồi được tái tạo từ protocorm trên môi trường MS cơ bản bổ sung 1.0mg NAA Kết

quả cho thấy rằng, cây con cao 2 – 4 cm được nuôi cấy in vitro được ra hoa với tỷ lệ

cao nhất là 83.2% và tỷ lệ hoa trung bình là 73.6% được nuôi cấy trên môi trường MS với 15% nước dừa và 0.1mg TDZ trong thời gian 9 tuần

Năm 1997, Edwards và cộng sự [16] đã nghiên cứu và tìm ra chu trình sống của

Perionyx excavatus và tiềm năng phân hủy, xử lý chất thải của loài vật này Bài nghiên

cứu này chỉ ra rằng hời gian trưởng thành và tỷ lệ tăng trưởng của loài, dưới mật độ áp suất khác nhau và nhiệt độ từ 15oC đến 30oC, cũng được đánh giá Nhiệt độ tăng lên đến 30oC làm tăng sự phát triển của giun đất và làm giảm thời gian trưởng thành Tuy nhiên, tỷ lệ sinh sản cao nhất xảy ra ở 25oC ở cả dạng rắn và bùn thải Thời gian trung bình để trứng nở giảm và mức độ nở thành công tăng lên khi nhiệt độ tăng lên Trùn đất tăng ở các tỷ lệ tương tự trong các chất rắn của gia súc, chất thải rắn của lợn và bùn thải được tiêu hóa trong cơ thể, nhưng giun đất không phát triển tốt với chất thải rắn của ngựa và chỉ kém phát triển trong các chất thải gà tây

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Chăn nuôi là nghề truyền thống, có vai trò quan trọng trong nông nghiệp nước ta Đạm trùn quế ngày càng được sử dụng nhiều trong chăn nuôi Hàm lượng đạm cao, chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu, giàu khoáng chất là những lý do mà nhiều nhà chăn nuôi xem trùn quế là nguồn thực phẩm bổ sung cao cấp cho nhiều loại vật nuôi Nên các nghiên cứu gần đây thường xuyên được đề cập tới vấn đề sử dụng trùn quế làm thức ăn cho gia súc gia cầm

Năm 2014, trong nghiên cứu “Khảo sát một số điều kiện nhằm nâng cao khả năng tự phân của trùn quế bổ sung thức ăn cho Gà Tàu Vàng thả vườn” của Trần Ngọc Tùng và Phan Ngọc Nhân [15] Với hàm lượng protein cao, có đầy đủ các loại acid amin thiết yếu, dịch thủy phân trùn quế được xem là nguồn đạm cao cấp cho nhiều loại vật nuôi Trong nghiên cứu này tác giả đã tiến hành thử nghiệm trên quy mô phòng thí nghiệm với nhiều phương pháp khác nhau và đã kết luận Trên quy mô thí nghiệm, việc xay nhuyễn trùn quế trước và khuấy trộn trong quá trình tự phân không thích hợp cho việc tự phân của trùn quế Sau 24 giờ tự phân, hàm lượng nitơ tổng số trong dịch lọc đạt 26.50 g/lít, hiệu suất thu nhận đạm hòa tan đạt 90.44% Dịch đạm trùn quế tự phân được bổ sung vào thức ăn cho gà thả vườn với các liều lượng 5%, 10% và 15% Kết quả thử nghiệm cho thấy các nghiệm thức bổ sung 10% và 15% đem lại hiệu quả cao, với mức độ tăng trọng cao hơn lô đối chứng lần lượt 32.4% và 64.8% Hệ số

chuyển hóa thức ăn (FCR) của các nghiệm thức bổ sung 10% và 15% dịch trùn thấp hơn nghiệm thức đối chứng lần lượt 20% và 36%

Năm 2015, Nguyễn Thị Ngọc Dinh và cộng sự đã nghiên cứu về sự “Ảnh hưởng của liều lượng phân giun quế đến sinh trưởng, phát triển và năng suất giống lúa ĐTL2 trong vụ xuân sản xuất theo hướng hữu cơ tại gia lâm, Hà Nội” Thí nghiệm xác định liều lượng phân giun quế thích hợp cho giống lúa ĐTL2 trồng theo hướng hữu cơ được thực hiện trong hai vụ xuân (2013 và 2014) tại Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Thí nghiệm được bố trí theo khối kiểu ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD), gồm 4 mức bón trong vụ xuân 2013 và 5 mức trong vụ xuân 2014; liều lượng phân lần lượt là

5, 10, 15, 20, 25 tấn/ha và các yếu tố phi thí nghiệm khác đồng nhất Kết quả chỉ ra khi tăng liều lượng phân giun không làm ảnh hưởng đến một số chỉ tiêu sinh trưởng như thời gian sinh trưởng, số lá/thân chính, số nhánh hữu hiệu/khóm, nhưng lại làm tăng một số chỉ tiêu sinh lý như chỉ số SPAD, diện tích lá, khả năng tích lũy chất khô Lượng phân giun quế tăng đã làm tăng năng suất của giống lúa ĐTL2 nhưng khi tăng đến liều lượng 10 tấn/ha và cao hơn thì năng suất khác nhau không có ý nghĩa Hiệu quả kinh tế của công thức bón 10 tấn/ha cao nhất trong vụ xuân 2014 đạt 27.596.000 đ/ha Kết quả thí nghiệm cho thấy, nên bón phân giun quế cho giống lúa ĐTL2 với lượng 10 tấn/ha cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao Bằng phương pháp hồi quy cho thấy năng suất phụ thuộc vào mức bón có phương trình: y = -0.075x2 + 2.472x + 41.01 với R² = 0.522, giải phương trình tối ưu đã xác định được lượng phân bón cho năng suất cao nhất là 16,4 tấn/ha [10]

Năm 2014, nghiên cứu của Nguyễn Thị Sơn và cộng sự [11] đã tìm ra quy trình nhân nhanh giống lan Thạch Hộc Thiết Bì hoàn chỉnh Kết quả nghiên cứu đã chỉ rõ: Nhân giống bằng gieo hạt trên môi trường VW+ 10g sucrose + 6g agar + 100ml nước dừa (ND)/lít môi trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + 100ml

ND + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín/lít môi trường Nhân giống vô tính

thông qua nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ sử dụng đoạn thân in vitro mang 2 mắt

ngủ và nuôi cấy trên môi trường MS + 20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5mg/l α-NAA + 6g agar/lít môi trường Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10g sucrose + 6g agar + 0.3g THT + 0.5 mg/l α-NAA

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Thực Vật (CNTBTV), trung tâm Nghiên Cứu Khoa Học và Ứng Dụng, Trường Đại Học Lạc Hồng

Thời gian: tháng 01 năm 2017 đến tháng 10 năm 2017

2.2 Vật liệu

2.2.1 Mẫu nghiên cứu

Mẫu Lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) do Phòng thí

nghiệm Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, trung tâm Nghiên Cứu Khoa Học và Ứng Dụng, Trường Đại Học Lạc Hồng cung cấp

2.2.2 Hóa chất

• Phân trùn quế của công ty cổ phần TRÙN QUẾ CỦ CHI (địa chỉ 1A đường 29 -

ấp Tân Định – xã tân Thông Hội – huyện Củ Chi – thành phố Hồ Chí Minh)

• Sắn dây nguyên chất (Việt Nam)

• Thiết bị và dụng cụ: tủ cấy (ĐÀI LOAN), autoclave (SANYO - JAPAN), máy

đo pH (HANNA - ROMANIA), ống đong (BOMEX – ĐỨC), pipet (BOMEX- ĐỨC), pecher (BOMEX – ĐỨC)

• Điều kiện thí nghiệm

Nhiệt độ phòng nuôi cấy mô được ổn định ở 26 ± 2oC, sử dụng đèn huỳnh quang, ánh sáng trắng cường độ 1800 – 2000 lux

Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày, độ ẩm không khí 70% - 80%

Giàn nuôi cấy gồm 5 tầng, kích thước mỗi tầng 1.500 x 550 mm, chất liệu nền là kính có độ dày 8 mm, mỗi tầng cách nhau 400 mm, mỗi tầng chứa 65 bình

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy

Thiết bị nghiên cứu: tủ cấy vô trùng, nồi hấp, cân phân tích, máy đo pH,

Hình 2.1Thiết bị dùng trong thí nghiệm

a Nồi hấp khử trùng, b Tủ cấy vô trùng, c Cân phân tích, d Máy đo pH 2.2.4 Môi trường nuôi cấy

Dựa trên cơ sở phân tích thành phần hóa học của phân trùn quế và đáp ứng được đầy đủ các thành phần dinh dưỡng mà nuôi cấy mô cần như: thành phần đa lượng, vi lượng, sắt mà trong bài thử nghiệm này chúng tôi đã sử dụng phân trùn quế làm môi trường cơ bản trong tất cả các thí nghiệm của bài, thay vì dùng các môi trường vô cơ đang được sử dụng rộng rãi hiện nay như: MS, White, Knusond C

Môi trường được điều chỉnh pH = 5.6 – 5.8 Sau đó hấp khử trùng ở nhiệt độ

121OC 1 atm trong 15 phút

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nội dung thí nghiệm

ND1: Ảnh hưởng của phân trùn quế lên sự thay đổi khối lượng tươi của lan Thạch hộc tía

ND2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và hàm lượng sắn dây lên sự nhân chồi của lan Thạch hộc tía

ND3: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và hàm lượng sắn dây lên sự ra

rễ của lan Thạch hộc tía

Xây dựng quy trình nhân giống in vitro lan Thạch hộc tía

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của phân trùn quế lên sự thay đổi khối lượng tươi của lan Thạch hộc tía

Mục đích: Xác định nồng độ phân trùn quế thích hợp để sử dụng làm môi trường

cơ bản

Cơ sở khoa học: So sánh kết quả phân tích thành phần phân trùn quế Củ Chi và thành phần dinh dưỡng khoáng thiết yếu cho cây Nguyễn Kim Khanh [6], đã nhận thấy rằng phân trùn quế có đầy đủ thành phần các chất dinh dưỡng khoáng thiết yếu cung cấp cho cây có thể sinh trưởng, phát triển và đã tiến hành bố trí thí nghiệm dựa vào các chỉ tiêu được tìm thấy

Bảng 2.1Hàm lượng dinh dưỡng khoáng của phân trùn quế Củ Chi

Vi lượng

Fe: 100 ppm Mn: 28 ppm Zn: 110 ppm Cu: 19.5 ppm B: 17.8 ppm Mo: 1.94 ppm

(Theo bảng phân tích thành phần dinh dưỡng phân Trùn quế Củ Chi)

Vật liệu: Protocorm lan Thạch hộc tía

Số lượng: 0.2g mẫu/1 bình

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần

Cách tiến hành: cân 0.2g mẫu protocorm Dendrobium officinale Kimura et Migo cấy

chuyền qua bình 500ml bổ sung 20g/l glucose + 8g/l agar và hàm lượng phân trùn quế theo các tỉ lệ sau:

Bảng 2.2Hàm lượng phân trùn quế được sử dụng làm môi trường cơ bản

Nghiệm thức (NT)

Hàm lượng phân trùn quế

Thời gian: sau 4 tuần nuôi cấy sẽ tiến hành lấy số liệu

Chỉ tiêu theo dõi:

− Khối lượng mẫu/1 bình

2.3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA lên sự nhân chồi lan Thạch hộc tía

Mục đích: Khảo sát nồng độ BA, NAA bổ sung vào môi trường trùn quế lên sự nhân chồi lan Thạch hộc tía

Vật liệu: chồi lan Thạch hộc tía từ thí nghiệm 1

Số lượng: 3 mẫu cấy/1 bình

Cơ sở khoa học: Thí nghiệm được bố trí dựa vào kết quả của Nguyễn Thị Sơn

và cộng sự [11] và Nguyễn Kim Khanh [6], gồm 6 nghiệm thức và được lặp lại 3 lần

Cách tiến hành: các chồi dài 1cm của mẫu Dendrobium officinale Kimura et

Migo được cấy chuyền qua bình 500ml có chứa môi trường phân trùn quế + 20g/l glucose + 8.0g/l agar và bổ sung nồng độ BA, NAA theo các tỉ lệ:

Bảng 2.3 Nồng độ BA, NAA lên sự nhân chồi lan Thạch hộc tía

(mg/l)

NAA (mg/l)

Thời gian: sau 8 tuần nuôi cấy sẽ tiến hành lấy số liệu

Chỉ tiêu theo dõi:

− Chiều cao chồi (cm)

Vật liệu: Chồi lan Thạch hộc tía từ thí nghiệm 1

Số lượng: 3 mẫu cấy/1 bình

Cơ sở khoa học: Thí nghiệm được bố trí dựa vào kết quả của Phạm Thị Lệ Huyền [13] và Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam [17] gồm 4 nghiệm thức và được lặp lại

3 lần

Cách tiến hành: Các chồi dài 1.5cm của mẫu Dendrobium officinale Kimura et

Migo được cấy chuyền qua bình 500ml có chứa môi trường phân trùn quế + 20g/l glucose+ 8.0g/l agar và bổ sung hàm lượng sắn dây theo các tỉ lệ:

Bảng 2.4 Hàm lượng sắn dây lên sự nhân chồi lan Thạch hộc tía

Thời gian: sau 8 tuần nuôi cấy sẽ tiến hành lấy số liệu

Chỉ tiêu theo dõi:

− Chiều dài chồi (cm)

Cách tiến hành: các chồi dài 1.5cm của mẫu Dendrobium officinale Kimura et

Migo được cấy chuyền qua bình 500ml có chứa môi trường phân trùn quế + 20g/l glucose+ 8.0g/l agar và bổ sung nồng độ NAA theo các tỉ lệ: 0.2mg/l, 0.5mg/l, 0.7mg/l, 1.0mg/l

Thời gian: sau 8 tuần nuôi cấy sẽ tiến hành lấy số liệu

Chỉ tiêu theo dõi:

− Tỷ lệ chồi tạo rễ/1bình (%)

Vật liệu: bình chồi ở thí nghiệm 3

Số lượng: 3 mẫu cấy/1 bình

Cở sở khoa học: Thí nghiệm được bố trí dựa vào kết quả của Phạm Thị Lệ Huyền [13] và Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam [17], gồm 4 nghiệm thức và được lặp lại 3 lần

Cách tiến hành: Các chồi dài 1.5cm của mẫu Dendrobium officinale Kimura et

Migo được cấy chuyền qua bình 500ml có chứa môi trường phân trùn quế + 200ml/l

ND + 20g/l glucose+ 8.0g/l agar và bổ sung hàm lượng sắn dây theo các tỉ lệ:

Bảng 2.5 Hàm lượng sắn dây lên sự tạo rễ lan Thạch hộc tía

Thời gian: sau 8 tuần nuôi cấy sẽ tiến hành lấy số liệu

Chỉ tiêu theo dõi:

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của phân trùn quế lên sự thay đổi khối

lượng tươi của lan Thạch hộc tía

Qua quá trình khảo sát sự thay đổi khối lượng tươi của lan Thạch hộc tía, đề tài

đã thu được kết quả như sau:

Bảng 3.1 Sự thay đổi hàm lượng và đặc điểm của protocorm trên các môi trường nền

bổ sung hàm lượng phân trùn quế khác nhau

Đặc điểm protocorm

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng phân trùn quế lên sự thay đổi khối lượng tươi

protocorm lan Thạch hộc tía

Theo bảng 3.1 và biểu đồ 3.1 sau 4 tuần nuôi cấy cho thấy các nghiệm thức được nuôi cấy trên môi trường phân trùn quế đạt tỉ lệ sống sót 100%, các mẫu cấy có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê P<0.05 khi thay đổi hàm lượng phân trùn quế Mẫu cấy trên môi trường phân trùn quế 5%/l cho khối lượng tươi gia tăng cao nhất đạt 0.59g/bình tăng 2.95 lần so với khối lượng mẫu cấy ban đầu, đặc điểm protocorm thu nhận khả quan các cụm protocorm mập và xanh Để lý giải cho kết quả này thì theo

TS Nguyễn Như Khanh [8], Nguyễn Kim Thanh [3], Hoàng Minh Tấn [12] các nguyên tố N, S, P, Ca làm tăng đường kính mạch rây N, P, S, Mg làm tăng hoạt động quang hợp ngoài ra K và B có chức năng điều chỉnh dòng vận chuyển chất hữu cơ, việc kết hợp các thành phần này giúp cho cây phát triển tốt và đạt năng suất cao So sánh với các hàm lượng khoáng này trong bảng phân tích hàm lượng phân trùn quế [14] thì có thể thấy rằng phân trùn quế có đầy đủ các chất cần thiết để cây trồng phát triển tốt Khi tăng hàm lượng phân trùn quế từ 10 – 50%/l thì khối lượng tươi của mẫu cấy giảm, khối lượng tươi gia tăng thấp nhất khi sử dụng phân trùn quế hàm lượng 50% là 0,38g/bình đồng thời đặc điểm protocorm thu nhận có màu vàng xanh và các cụm protocorm không mập điều này có thể giải thích do hàm lượng phân trùn quế quá cao, môi trường có độ cứng cao và độ ẩm thấp dẫn đến việc hạn chế sự hấp thu các chất khoáng, khi thiếu các chất khoáng như Mg, N, P, Fe [3] do đó diệp lục không

Hàm lượng phân trùn quế

Khối lượng protocorm

hình thành hoặc yếu làm cho lá có màu vàng xanh Vậy hàm lượng phân trùn quế được

sử dụng làm môi trường nền trong nuôi cấy in vitro lan Thạch hộc tía là T.Q 5%/l + g/l

3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA lên

sự nhân chồi lan Thạch hộc tía

Qua quá trình khảo sát sự nhân nhanh chồi của lan Thạch hộc tía được bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA cho kết quả như sau: